CAR-T细胞治疗面临的挑战及解决思路

2022-06-12

免疫疗法细胞疗法抗体基因疗法

来源：肿瘤免疫细胞治疗资讯嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）免疫疗法是将患者或异体供者体内分离的T细胞通过基因工程技术进行改造，使其表达嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR），从而特异性识别并杀伤肿瘤细胞的一种过继细胞疗法。CAR-T是近年来癌症免疫治疗领域的重大突破之一，在血液系统恶性肿瘤的治疗中体现了巨大优势，具有广阔的发展前景。本文就CAR-T细胞的基本结构与功能及其在血液系统恶性肿瘤中的应用以及面临的挑战作一综述。01CAR-T细胞的结构与功能CAR-T通过基因修饰技术，将带有特异性抗原识别结构域和T细胞激活信号的遗传物质转导到T细胞内，使T细胞靶向识别肿瘤细胞表面上的相关抗原，从而激活效应T细胞，进而发挥抗肿瘤作用。这种靶向识别过程不依赖于传统的T细胞受体（T cell receptor，TCR）与主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）间的相互作用，避免了肿瘤细胞通过下调MHC表达进行免疫逃逸。CAR-T根据结构可分为胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区通常为靶向识别抗原的单链可变片段（single-chain variable fragment，scFv）。跨膜区通常来源于CD28或CD8，可以影响CARs间的相互作用。胞内区为CD3ζ信号域，包含三个免疫受体酪氨酸激活模体（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs），可通过磷酸化激活启动细胞内信号转导，活化T细胞，促进增殖、细胞因子分泌和细胞毒作用。第一代CARs由scFv和CD3ζ信号域组成，体外具有T细胞杀伤毒性，但在临床试验中没有表现出抗肿瘤效应。第二代CARs在第一代基础上加入了一个来源于CD28或4-1BB的共刺激域，使CAR-T细胞在体内存活时间延长，增殖能力和杀伤毒性也增强。第三代CARs在第一代CARs基础上加入了两个共刺激分子，其抗肿瘤效应进一步提升。第四代CARs又被称为“装甲”T细胞（T cells redirected for universal cytokine killing，TRUCKs），通过基因修饰分泌特定的细胞因子或表达额外的共刺激配体增强CAR-T疗效，同时引入了自杀基因系统控制CAR-T活性，必要时激活以降低细胞毒性。目前全球开展的临床试验主要以CD28或4-1BB共刺激域构成的第二代CAR-T为主。CD28或4-1BB共刺激域对促进CAR-T细胞体内增殖和存活具有重要意义，能显著提高接受CAR-T疗法患者的完全缓解率。研究表明，CD28共刺激域可以诱导更迅速的抗肿瘤反应，但持久性较差；而4-1BB的肿瘤清除速度较慢，但可诱导持续性的高水平反应，但临床研究显示表达CD28共刺激域的CAR-T细胞与表达4-1BB的CAR-T细胞在治疗血液系统恶性肿瘤的临床疗效相似。除了CD28和4-1BB，有关其他共刺激域来源的CAR-T细胞研究也正在积极展开，如OX40（CD137）、ICOS等。02CAR-T细胞的临床应用CAR-T免疫疗法在血液系统恶性肿瘤治疗中取得了突破性进展。目前美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）共批准了四款靶向CD19的CAR-T细胞产品，分别是Tisagenlecleucel（tisa-cel，Kymriah）cel，Kymriah）、Axicabtagene Ciloleucel（axio-cel，Yescarta cel，Yescarta）、Brexucabtagene Autoleucel（brexu-cel，Tecartus）和Lisocabtagene Maraleucel（liso-cel cel，Breyanzi），这些产品主要用于治疗儿童和青年复发/难治性急性B细胞淋巴细胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）和成人特定类型的B细胞非霍奇金淋巴瘤（B cell non-Hodgkin lymphoma，B-NHL），包括复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）、复发/难治性套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）和复发/难治性滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL），且疗效显著。随着大量有关CAR-T临床研究的开展，针对不同靶点的有关CAR-T细胞还有望应用于B-NHL、多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）、慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）、急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）、T细胞淋巴瘤及实体瘤等领域。2.1 B细胞恶性肿瘤 CD19是一种B细胞特异性靶点，广泛表达于几乎所有的B细胞恶性肿瘤。CD19靶向CAR-T疗法在儿童和成人复发/难治性B-ALL、复发/难治性DLBCL、复发/难治性FL和CLL等B细胞恶性肿瘤的临床试验中表现出快速而持久的抗肿瘤效应。CD20表达于除浆细胞外的所有分化阶段的B细胞，CD20靶向CAR-T细胞目前处于早期临床研究阶段，在DLBCL、惰性非霍奇金淋巴瘤患者中有较高的反应率。此外，CD19、CD20双特异性CAR-T细胞在临床试验中表现出低毒性和高效性，可能成为克服抗原下调导致耐药复发的有效手段。CD22是唾液酸黏附素家族成员，为B细胞所特有，在绝大多数B细胞恶性肿瘤中表达。由于接受CD19靶向CAR-T治疗的患者中，约有50%发生耐药复发，且主要机制是抗原丢失导致的免疫逃逸，因此CD22靶向CAR-T细胞的应用可能对CD19靶向CAR-T治疗后复发的患者有效。在一项采用CD22特异性CAR-T细胞治疗B-ALL患者的临床试验中，完全缓解率>70%，其中包括大量CD19靶向CAR-T治疗后复发的患者。2.2 MMB细胞成熟抗原（B cell maturation protein，BCMA）是TNF超家族成员，表达于部分成熟B细胞、浆细胞及几乎所有MM细胞。BCMA靶向CAR-T细胞在MM治疗中表现出令人满意的完全缓解率，但患者在治疗后12个月内易出现复发。Ciltacabtagene Autoleucel（cilta-cel）cel）是一种表达双重BCMA表位的CAR-T细胞，包含一个4-1BB来源的共刺激结构域和一个CD3ζ胞内信号域。有研究显示单次输注cilta-cel cel在复发/难治性MM患者中可产生深度而持久的反应，其中输注1个月内完全缓解率为67%，3个月内为62%。此外，其他潜在治疗MM的靶点还有SLAM7、CD38、CD138、免疫球蛋白κ轻链以及GPRC5D等，这些靶点在临床试验中也初显疗效。2.3 霍奇金淋巴瘤 CD30是TNF受体超家族成员，在Reed-Sternberg细胞中普遍表达，是治疗复发/难治性霍奇金淋巴瘤安全、有效的靶点。在临床Ⅰ期试验中，靶向CD30的CAR-T细胞在经高强度淋巴清除预处理后的复发/难治性霍奇金淋巴瘤患者中表现出显著的抗肿瘤活性和较低的毒性。2.4 T/NK细胞恶性肿瘤针对T/NK细胞淋巴瘤的CAR-T研究目前仍处于早期阶段，发展较缓慢，主要的限制是难以找到合适的靶点回避CAR-T细胞的“自相残杀”。目前处于临床研究阶段的主要靶点为CD5和CD7。其中CD5靶向CAR-T细胞通过下调内源性CD5的表达避免了“自相残杀”，在临床试验中对外周T细胞淋巴瘤（peripheral T cell lymphoma，PTCL）和急性T淋巴细胞白血病（T cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL））患者有效。CD7靶向CAR-T细胞不能显著下调自身CD7的表达，但通过CD7靶向基因破坏可以在不影响抗原识别的情况下使CAR-T细胞抵抗“自相残杀”，从而证实了CD7靶向治疗的可行性。在一项供者来源的靶向CD7的CAR-T细胞临床试验中，CAR-T细胞对复发/难治性T-ALL患者有较高的缓解率和较小的毒性，虽然CD7阳性的T细胞和NK细胞被迅速清除，但CD7阴性的T细胞和NK细胞发生了急剧扩张，且对真菌和病毒刺激具有效应性，表明这些细胞具有免疫保护作用。2.5 AMLAML细胞表面抗原与正常髓系细胞表面抗原共享，因此直接靶向AML抗原会产生对正常髓系细胞的严重毒副作用，从而限制CAR-T细胞的治疗潜力。一项临床前试验利用基因编辑技术将自体CD33敲除的造血干细胞和祖细胞转入动物模型，建立了一个对靶向CD33治疗有抵抗力的造血系统，并使靶向CD33的CAR-T细胞定位到AML。尽管目前难以将研究推进到临床，但这项试验结果提供了一种解决问题的新思路。寻找正常组织耐受的AML靶点的相关研究也在积极展开中。03CAR-T细胞治疗面临的挑战了解CAR-T细胞治疗面临的挑战，明确导致局限性的机制并克服这些障碍，能使CAR-T细胞更好地发挥其潜能，优化治疗策略，改善患者预后。目前发现的可影响CAR-T细胞治疗疗效的几个关键因素包括CAR-T细胞的制造、毒副作用的管理以及耐药复发等。3.1 CAR-T细胞制造中的问题CAR-T细胞制造面临的挑战涉及T细胞的获取、分离筛选、转导、培养扩增、起始T细胞表型选择等多个环节，通过各环节方法的优化，可以实现CAR-T细胞产品更高的临床疗效与更小的毒副作用。目前FDA批准的CAR-T细胞都是自体来源的，没有同种异体排斥和移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）风险，但获取难度较大，且细胞质量往往得不到保障。使用健康捐献者的细胞生产CAR-T产品是解决低质量CAR-T细胞来源问题的一种方案。早期临床研究证实了异基因移植后疾病复发的患者使用供体来源CAR-T细胞的可行性，其GVHD发生风险较低。此外，供者来源的T细胞有助于开发通用的CAR-T产品，这对克服CAR-T细胞来源不足、质量低劣以及生产周期长等现存问题有重要意义，但需要额外的基因修饰来降低免疫排斥和GVHD发生风险。此外，CAR结构往往含有外源序列，由于制备具有一定难度，目前多数CAR-T细胞的scFv是鼠源的，具有免疫原性，在接受治疗的患者中已检测到针对scFv的人抗鼠抗体。已有研究表明CAR-T细胞产品的初始T细胞表型对后续临床反应起重要作用。特定的T细胞表型，如中央记忆型T细胞、干细胞样记忆型T细胞及前体T细胞可能提高CAR-T细胞的扩增能力和持久性。一项对CLL患者的CD19靶向CAR-T细胞治疗的研究发现，与无反应者相比，有应答者的CAR-T细胞群有丰富的记忆T细胞相关基因表达。另一研究团队通过药物调节系统或达沙替尼强制下调CAR蛋白诱导其进入静息状态，从而获得记忆样表型，成功实现了耗竭的CAR-T细胞表型和转录特征的逆转，进而恢复CAR-T细胞抗肿瘤功能。此外，CAR-T细胞的输注时机也对治疗反应有重要影响。通过技术优化缩短CAR-T细胞生产周期，有望减少患者病情延误，使更多患者受益。另外，通常编码CAR结构的基因大多通过逆转录病毒或慢病毒转导到T细胞中，但随着转座子系统的开发，使用转座子替代病毒载体用于CAR-T细胞生产具有更经济的优势，目前睡美人转座子系统已应用于CD19靶向CAR-T细胞的制造。3.2 CAR-T细胞治疗的毒副作用几乎所有接受CD19靶向CAR-T细胞治疗的患者都出现了不同程度的毒副作用，包括细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（immune effector associated neurotoxicity syndrome ，ICANS）等，后者也称神经毒副作用。美国移植和细胞治疗学会（American Society for Transplantation and Cellular Therapy，ASTCT）制定并发布了关于CRS和ICANS的标准化分级建议，对管理和治疗CAR-T毒副作用具有指导意义。CRS的临床症状常始于发热，严重者可导致全身炎症反应、低血压、缺氧和器官功能衰竭。ICANS主要表现为中毒性脑病，严重者可导致癫痫发作、脑水肿和昏迷。发生ICANS的患者多数都有CRS病史，提示CRS可能作为ICANS的启动因素或促进因素。如果能及时发现CRS和ICANS的早期症状并进行有效干预，两者的临床进程都是可逆的，但严重的CRS和ICANS都可能致命。而了解CRS和ICANS的病理生理学机制，有助于靶向药物的开发，在尽可能保留CAR-T细胞抗肿瘤活性基础上抑制其毒性。CRS与多种细胞因子水平升高有关，其中IL-6是介导CRS的重要免疫分子，阻断IL-6受体的托珠单抗是目前治疗CRS的主要手段。临床前试验表明，CRS由CAR-T细胞和宿主细胞组成的多细胞网络触发，其中单核-巨噬细胞系统在激活过程中起核心作用。IL-1是单核-巨噬系统的主要细胞因子产物之一，可能参与CRS的驱动环节，阻断该靶点对缓解CRS有效。TNF、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte/macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）及其他促炎细胞因子也参与CRS过程，可能是潜在的靶点。目前临床上对于低级别CRS主要采取退热和支持性治疗，同时积极防治其他可能导致发热的并发症，如感染。中至重度CRS一般使用托珠单抗，并根据患者情况选择性使用类固醇药物辅助治疗，效果较显著。对于严重CRS患者，一般使用类固醇抑制CAR-T细胞和其他“旁观者”细胞的增殖及细胞因子分泌。需要注意的是，类固醇不能大剂量使用，其对免疫系统的抑制作用会导致CAR-T疗效下降。一些小分子抑制剂如芦可替尼、伊布替尼可广泛抑制多种细胞因子的产生及信号传导，并可与多靶点结合，从而调控CAR-T细胞的免疫功能，降低毒副作用。ICANS的发生机制可能与CAR-T细胞和促炎细胞因子在中枢神经系统的积聚有关。临床前试验观察到脑脊液CAR-T细胞数量和细胞因子水平与ICANS严重程度存在相关性。CD19靶向CAR-T治疗的ICANS发生率高于CD22靶向CAR-T细胞治疗，这可能是因为CD19在人脑中壁细胞有表达。ICANS患者的临床治疗手段是给予类固醇，给药剂量宜取最低，以避免对CAR-T疗效的影响及产生严重的免疫抑制。托珠单抗治疗CRS取得了较好的效果，但对ICANS的作用十分有限，可能与其难以透过血脑屏障有关。毒副作用是目前限制CAR-T疗效的重要因素，阻碍了通过增加CAR-T细胞剂量或提高效应活性增强CAR-T细胞的抗肿瘤作用。高肿瘤负荷、高龄、接受高强度淋巴清除预处理等被认为与免疫毒副作用的发生有关。随着治疗病例的增多和随访时间的延长，更多的毒副作用显现，如噬血细胞性淋巴组织细胞增多症/巨噬细胞激活综合征样毒性反应、B细胞再生障碍性贫血相关的免疫功能受损状态并发致命感染、致命性脑水肿等。现有研究发现，在CAR中加入自杀基因，如诱导型caspase-9或单纯疱疹病毒胸苷激酶是降低CAR-T细胞毒副作用的可能手段，但会造成CAR-T细胞不可逆的清除，降低抗肿瘤疗效。3.3 CAR-T细胞治疗后的耐药复发尽管CAR-T细胞治疗血液系统恶性肿瘤取得了巨大突破，但是在接受CD19靶向CAR-T细胞治疗的患者中，耐药复发比例高达30%~50%，且大部分复发发生在治疗后12个月以内。但是这种复发并不只是针对CD19靶点，其他靶点如CD22、BCMA的相关研究亦证明了耐药复发是CAR-T细胞治疗普遍面临的重大挑战。目前通常将复发事件分为抗原阴性复发和抗原阳性复发两类。抗原阴性复发的主要机制是抗原丢失。目前认识到的抗原丢失机制包括剪接突变、表位隐蔽、靶表位丢失导致细胞谱系改变等。然而，即使抗原未完全丢失，通过免疫调节使抗原表达减少或密度降低也足以使肿瘤细胞逃逸。在一项使用CD22靶向CAR-T细胞治疗白血病患者的临床试验中，发现存在阳性抗原的白血病患者复发，提示CAR-T细胞活性的维持需要达到最低抗原表达阈值。组合多分子靶点CAR-T细胞有望克服抗原丢失或下调机制的肿瘤细胞逃逸。对于CD19靶向CRA-T细胞治疗后复发的患者，CD22是一个理想的靶点，因为大多数CD19阴性患者的CD22表达仍是阳性。在临床试验中，靶向CD22的CAR-T细胞治疗CD19阴性的B细胞淋巴瘤 CD19阴性的B细胞淋巴瘤及白血病复发患者有效，但在序贯免疫治疗过程中也发现了肿瘤细胞下调CD22表达而引起的耐药复发。因此，开发同时针对CD19、CD22双靶向的CAR-T细胞可能在克服耐药问题上具有更大潜力。除了靶抗原的选择，还需要关注CAR-T在免疫突触形成和靶细胞杀伤环节的精确机制。天然TCR可以在低密度水平识别抗原，据此推测CAR与天然TCR间的结构差异可能导致了对抗原识别密度要求的差异。值得注意的是，并不是所有复发患者的CD19都是阴性，这也说明除了抗原丢失、肿瘤细胞逃逸，还有其他因素导致了CAR-T的耐药性。抗原阳性复发的主要原因是CAR-T细胞衰竭，由于长期接触高水平抗原而导致自身功能减退。一般认为CAR-T细胞的抗原非依赖性信号转导与细胞衰竭关系密切，高肿瘤负荷也是导致衰竭的重要因素。免疫检查点阻断技术与CAR-T细胞联合在克服衰竭和增强CAR-T细胞的效应性和持久性上具有发展前景。IL-7受体与CAR共表达可以避免刺激“旁观者”细胞，提高CAR-T细胞的增殖能力、抗肿瘤活性和持久性。CAR-T细胞的CAR结构含有非自身成分，具有免疫原性，可能诱导体液和细胞抗CAR免疫，从而限制疗效，影响CAR-T细胞的增殖能力和持久性。研究表明在输注CAR-T细胞后有5%的DLBCL患者和36.7%的B-ALL患者出现抗CAR抗体水平增加。环磷酰胺或氟达拉滨预处理被认为是降低抗CAR细胞免疫程度的重要因素。开发人源化CAR-T产品是解决这一问题的有效手段，在临床试验中表现出对复发/难治性B-ALL的持久疗效。CAR结构中的共刺激结构域也会影响CAR-T细胞的持久性。通常认为，与4-1BB共刺激域相比，CD28来源的 CARs持久性较差，更倾向于发生衰竭；而含有4-1BB共刺激域的CAR-T细胞有较高水平的抗凋亡蛋白BCL-2和BCL-XL，并可能存在一种促进形成记忆表型T细胞的机制。目前处于临床试验阶段的改进措施包括使用人工抗原提呈细胞激活CAR-T细胞、调控CAR-T表型以及联合抑制免疫检查点分子等，结果值得期待。04改进CAR-T细胞特性的方法4.1 CAR-T细胞设计上的改进4.1.1 CAR结构的改进CAR结构中任何一个部分的微小改变都会对CAR-T细胞的抗肿瘤活性产生影响。有研究发现不同的scFv、铰链区、跨膜区、共刺激域和ITAMs都可以影响CAR-T细胞的效应性。克服抗原丢失最直接的办法是开发多靶向抗原CARs，目前CD20、CD22靶点分别与CD19串联或联合使用的CAR-T细胞在临床试验中表现出一定的安全性和可行性。另一个具有发展前景的多靶点开发方向是对CAR-T细胞进行BiTEs修饰。BiTEs通常由一个CD3靶向scFv和一个肿瘤相关抗原（tumor associated antigen，TAA）靶向scFv通过连接子连接而成，用肿瘤特异性结构域代替scFv的设计也正处于临床前及临床早期评估阶段。其中scFv连接子的长度改变可以影响CAR-T细胞的体内活性。研究发现短链scFv连接子可以通过促进自主共刺激信号增加抗原非依赖性受体信号转导和下游T细胞活化，促进免疫突触形成，增强抗肿瘤效应。双峰驼重链CAR取代传统的scFv，在临床前模型中显示出强大的靶向亲和力和有效性，且由于省去连接子部分而减少了一个免疫原性靶点，因此具有一定优势。用人源化或全人源scFv替代鼠源结构也可以降低CAR的免疫原性，避免宿主免疫排斥，提高CAR-T细胞持久性。共刺激域是CAR-T细胞发挥效应的重要组成部分，但过度的共刺激信号可能会促进衰竭，降低CAR-T细胞持久性。通过突变CD28结构域中的特定位点有利于控制共刺激强度，降低CAR-T毒副作用并提高持久性。调控胞内信号的强度也可以影响CAR-T效应，一种只包含一个ITAM结构的CD3ζ截短信号域CAR-T细胞在动物模型中表现出更好的反应性和持久性。铰链长度和组成的不同也能影响CAR-T细胞与肿瘤细胞的结合及信号传递，对铰链和跨膜区的修饰还可以降低免疫原性、调节细胞因子分泌。4.1.2 基因编辑应用基因编辑技术对CAR-T细胞进行优化具有巨大的发展潜力。CRISPR/Cas9指导的基因组编辑可将CAR基因整合至T细胞受体α链恒定区（T-cell receptor alpha constant domain，TRAC），通过破坏内源性TCR，降低了抗原非依赖性信号转导，提高CAR-T细胞的抗肿瘤活性。破坏内源性TCR的另一个好处是抑制GVHD，这种方法不仅增强了CAR-T细胞在体内的持久性，还有利于通用型CAR-T细胞的构建，克服自体CAR-T细胞生产周期长的问题。程序性细胞死亡受体 1（programmed cell death 1，PD-1）是表达于多种免疫细胞上的免疫检查点分子，在免疫抑制过程中起重要作用。PD-1通过与肿瘤细胞上的程序性死亡配体（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）结合，诱导T细胞功能障碍和衰竭。将CAR-T细胞与PD-1/PD-L1抗体结合是提高CAR-T疗效的一种可行办法。应用分泌PD-1抗体scFv段以及使用CRISPR/Cas9消融PD-1基因CAR-T细胞也显示出通过抑制PD-1而增强CAR-T疗效的可行性。在CD8+CAR-T细胞中过表达碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白（basic leucine zipper ATF-like transcription factor，BATF）和干扰素调节因子4（interferon regulatory factor 4，IRF4）可促进CAR-T细胞存活和扩增，并产生抑制肿瘤复发的长寿记忆T细胞，且该反应依赖于BATF-IRF的相互作用，可能通过改变CAR-T细胞的表型和转录模式，使其远离耗竭状态，增强抗肿瘤效应。4.1.3 同种异体CAR-T细胞使用供者来源的同种异体CAR-T细胞具有很多潜在优势，如有利于产品标准化、提高生产效率、降低制作成本、保证产品质量。目前同种异体CAR-T细胞主要来源于外周血单个核细胞，少数来自脐带血。脐带血来源的T细胞具有独特的抗原幼稚状态，使用脐带血来源的CAR-T细胞可以降低GVHD发生风险。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将CAR插入TRAC，破坏TCR信号转导可以抑制GVHD，为同种异体CAR-T细胞以及通用型CAR-T细胞的发展提供可能性。通过基因编辑构造的UCART19在针对经高强度预处理的复发/难治性 B-ALL多中心临床试验中也表现出安全性和有效性，UCART19输注后通过同种异体干细胞移植巩固治疗可以产生持久疗效。4.1.4 其他效应细胞类型由于自体CAR-T细胞的局限性，其他效应细胞的CAR构建体开发已处于临床前和临床阶段，包括NK细胞、iNKT细胞、γδT细胞、巨噬细胞和树突状细胞等。与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞的安全性更高，不易产生严重毒副作用如CRS、ICANS等，也不会诱发GVHD，这些特征使CAR-NK细胞应用于AML和复发/难治性B细胞恶性肿瘤成为可能。在CAR构建物中加入转基因IL-15有助于提高CAR-NK细胞的持久性和抗肿瘤活性。另一种选择是细胞因子诱导的类记忆型（cytokine-induced memory-like，CIML）NK细胞，可通过IL-12、IL-15、IL-18的预激活增加持久性。这种CIML-NK细胞在临床前试验中对AML异种移植小鼠表现出强大的抗肿瘤作用，在临床试验中也发现能在44%的AML患者中诱导缓解。虽然NK细胞与T细胞可以共享一些信号域和共刺激域，如CD3ζ、4-1BB，但NK细胞更特异性的共刺激域，如DAP10、DAP12和2B4等有助于提高CAR-NK细胞的抗肿瘤效应。已有研究发现使用2B4胞内结构域替代4-1BB的CAR-NK细胞增强了细胞毒作用，这为治疗T细胞恶性肿瘤提供了可能性。4.2 改善CAR-T细胞微环境在进行CAR-T细胞回输前，应用环磷酰胺和氟达拉滨进行预处理，促进体内淋巴细胞衰竭有利于增加CAR-T细胞的效应性和持久性。来那度胺、伊布替尼以及免疫检查点抑制剂与CAR-T细胞疗法联合也可以增强其抗肿瘤效应。但需要注意的是，虽然提高CAR-T细胞活性有利于肿瘤清除，但是CAR-T细胞扩增性、效应性的增强也往往会导致抗原非依赖性信号转导增强，从而促进CAR-T细胞衰竭。在临床前试验中，来那度胺与CAR-T细胞联合使用可以通过增强细胞毒性、促进Th1细胞因子的产生和免疫突触的形成提高CAR-T细胞的抗肿瘤活性。伊布替尼与liso-cel联合使用可以促进CAR-T细胞向记忆样细胞表型转变，提高CAR-T细胞的效应性和持久性。通常认为，CAR-T细胞衰竭是一种不可逆转的T细胞功能低下状态。然而最新研究发现在治疗早期间歇性暂停CAR-T细胞信号可以使细胞保持在分化程度较低的阶段，使衰竭的CAR-T细胞进程逆转，诱导表观遗传重编程。使用酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼阻断近端TCR信号抑制CAR-T细胞活化可以逆转抗原非依赖性信号转导，保留CAR-T细胞的抗肿瘤功能。基于此发现，通过使用达沙替尼间歇治疗调控CAR-T细胞“休息”可能有效缓解CAR-T细胞衰竭，提高CAR-T细胞抗肿瘤能力。免疫记忆对抗肿瘤效应的持久性至关重要。临床前试验发现周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂（cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitor，CDK4/6i）CDK4/6i）能增强CAR-T细胞的效应性与持久性，促进记忆表型分化，诱导对封锁免疫检查点有利的T细胞表型。05小结CAR-T细胞免疫疗法给血液系统恶性肿瘤患者带来了新的希望，让难治性、复发性血液系统恶性肿瘤有了治愈的可能。尽管CAR-T细胞治疗在当下仍然存在诸多挑战，如免疫原性、耐药性、毒性等，但是随着基因编辑技术的发展以及其他免疫靶点药物的开发，通过设计上的不断优化以及与其他免疫疗法的联合使用，相信CAR-T细胞仍然是最有前景的癌症免疫治疗手段之一，并有希望在未来突破实体瘤限制，扩大适应证，治愈更多疾病。