CD244

在肿瘤和病原体抗原长期的刺激下，免疫系统的防御功能会变得低效，免疫细胞变得疲劳逐渐失去效应功能，称为免疫细胞耗竭。免疫细胞的耗竭受多因素调控，导致功能下降。而且耗竭状态常与无能、衰老、抑制状态有重叠部分，也伴随着这些状态的表型特征。三种免疫细胞耗竭表型总的来看，发生耗竭时细胞整体特征有：功能下降、受体平衡打破、代谢改变以及转录和表观遗传改变。1. NK细胞先天免疫主导者，同时具备适应性免疫细胞的特征。其表面表达多种激活与抑制受体，受体信号的相对平衡整合决定了NK细胞的效应功能。1）表达升高的分子抑制受体能够在免疫细胞发挥完效应后将其抑制，以维持正常免疫功能。耗竭的NK细胞上抑制受体表达水平升高：KLGR1，通过抑制AKT磷酸化，抑制NK细胞增殖。TIGIT，是共抑制或免疫检查点受体，能够抑制NK细胞活性。其他表达升高的抑制受体：KIRs、CD94/NKG2A、LIR、CD96、TIM-3、LAG-3也表达升高。2）表达降低的分子激活受体表达降低，如：NKG2D，能够结合细胞应激产生的配体，在多种癌症中表达降低。DNAM-1，DNAX辅助分子，特异性识别配体，调控NK细胞功能。D16，能够结合抗体Fc段，在乳腺癌患者NK细胞表达降低。细胞增殖相关分子表达降低：Ki67是增殖相关蛋白，其表达减少影响有丝分裂，使NK细胞增殖能力降低。Eome和T-bet是T-box转录因子，对NK细胞分化、成熟、功能至关重要。细胞因子及细胞毒素分泌减少：LAMP-1、IFNγ、TNF-α、PFP、Granzyme的分泌减少，使NK细胞功能受损。NK细胞耗竭并非单一受体改变导致，而是多种因素共同整合所介导。更详细的内容请参考NK细胞耗竭2. B细胞B细胞耗竭的本质是慢性、潜伏期病原体感染抑制了B细胞的功能。抑制效果甚至能在病原体消除后长期存在。（如丙型肝炎病毒感染将B细胞从基因水平转变为低增殖、低功能性丙肝抗原特异性B细胞）1）表达升高的分子B细胞耗竭同样有抑制受体表达升高：FCRL4、Siglec-6，在HIV感染后表达升高，通过诱导B细胞过度激活而导致耗竭。CD95，也称为Fas、FasR或凋亡抗原APO-1，可以介导凋亡，过度表达也与抗原型B细胞应答降低有关。FCRL4，能够抑制BCR介导钙动员及胞内蛋白的磷酸化，对BCR信号负性调控。还有其他表达升高的激活受体：LILR、CD38、CD70、CD32b（FcγRIIB）、CD85d、CD85j、CD86、PD-1粘附分子受体：CD11c趋化因子受体：CXCR3、CCR62）表达降低的分子激活受体表达降低：CD21，静息B细胞表达，是2型补体受体或补体C3d受体，能够介导B细胞与HIV-1的互相作用。在感染HIV后其表达降低，形成CD27-/CD21low组织样记忆(TLM)B细胞，相比正常B细胞的增殖能力减弱。其他激活受体：CD25、BAFF-R粘附分子受体：CD62L趋化因子受体：CXCR4、CXCR5、CCR7B细胞耗竭除了最常见的如HIV的慢性病毒感染之外，在寄生虫感染患者病例中也能观察到。3. T细胞T细胞耗竭是由慢性感染或癌症、以及高度炎症状态刺激引起的功能降低。耗竭的T细胞在生理状态上是完整的，并可通过检查点受体阻断等外部途径恢复功能。1）表达升高的分子抑制受体表达升高，且与耗竭的严重程度成正比：近年来越来越多的抑制受体被发现，如：KLRG1，同样抑制T细胞增殖。以及PD-1、LAG-3、BTLA、CD244、CD160、TIM-3、CTLA-4Treg细胞通过分泌各种细胞因子，介导T细胞耗竭，如：其分泌的IL-10可以通过STAT3或APC直接或间接作用于T细胞，减弱T细胞活化。2）表达降低的分子主要是细胞因子及毒素类物质分泌降低，如：IL-2、IFNγ、TNFα、PFP、Granzyme更详细的内容请参考T细胞耗竭（Exhaustion）不同免疫细胞耗竭表型共同点不同细胞耗竭状态下可有相同分子改变T细胞和NK细胞耗竭状态：TIGIT、LAG-3、TIM-3表达升高，INF-γ、TNF-α、PFP、Granzyme分泌减少三种免疫细胞耗竭状态下均可见PD-1表达异常升高。小结NK/B/T细胞耗竭是一种多状态叠加，是由抗原持续、长期、过度刺激引起，导致激活和抑制受体平衡破坏、细胞因子及细胞毒素分泌异常。而且耗竭也并非单纯的二元化状态，而是根据刺激因素的综合强度而表现出的不同严重程度。当单一疾病（癌症或病原体感染）引起 poly-lymphocyte exhaustion时，将是非常凶险的。了解不同免疫细胞耗竭分子的异同，有助于针对疾病制定最合适的治疗策略。参考资料Kaiser M et al. Immune Aging and Immunotherapy in Cancer. Int J Mol Sci. 2021 Jun 29;22(13):7016.Judge SJ et al. Characterizing the Dysfunctional NK Cell: Assessing the Clinical Relevance of Exhaustion, Anergy, and Senescence. Front Cell Infect Microbiol. 2020 Feb 13;10:49. doi: 10.3389/fcimb.2020.00049. PMID: 32117816; PMCID: PMC7031155.Moir S et al. Evidence for HIV-associated B cell exhaustion in a dysfunctional memory B cell compartment in HIV-infected viremic individuals. J Exp Med. 2008 Aug 4;205(8):1797-805.Pawelec G. Is There a Positive Side to T Cell Exhaustion? Front Immunol. 2019 Jan 29;10:111. doi: 10.3389/fimmu.2019.00111. PMID: 30761152; PMCID: PMC6362299.Illingworth J et al. Chronic exposure to Plasmodium falciparum is associated with phenotypic evidence of B and T cell exhaustion. J Immunol. 2013 Feb 1;190(3):1038-47.

中文摘要近年来，过继性细胞免疫疗法在肿瘤治疗方面展现出了显著的临床效果。T细胞和自然杀伤（natural killer，NK）细胞是临床常用的过继性免疫细胞，并且在淋巴瘤等恶性肿瘤的治疗中已经取得了良好的效果。通过对免疫细胞进行基因工程改造引入嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）催生了CAR-T和CAR-NK细胞疗法。CAR-T和CAR-NK细胞可高效识别肿瘤抗原且肿瘤细胞杀伤效果较好，在多种癌症研究中均有满意的结果，已经成为一个炙手可热的领域。此文对基于CAR修饰的免疫细胞疗法的发展与应用进行概述，并针对其挑战与未来发展进行了讨论。正文1细胞免疫治疗肿瘤生物治疗是一种新兴肿瘤治疗模式，主要包括肿瘤免疫治疗、溶瘤病毒治疗、干扰小RNA技术疗法等。肿瘤免疫治疗通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫应答，从而控制与清除肿瘤，比传统的肿瘤治疗方法更加安全并且具有特异性，对晚期肿瘤具有显著的疗效。肿瘤免疫治疗包括4大类：过继性细胞免疫疗法、肿瘤疫苗、非特异性免疫刺激以及免疫检查点单克隆抗体。其中过继性细胞免疫疗法是目前研发热点，也是肿瘤治疗研究中开展最广泛、最深入的领域之一，其具体过程是通过对自体或异体免疫细胞进行体外激活或基因修饰，扩增出足够的具有抗肿瘤活性的免疫细胞后回输给患者。过继性免疫细胞主要包括T细胞、自然杀伤（natural killer，NK）细胞、肿瘤浸润淋巴（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）细胞、淋巴因子激活的杀伤（lymphokine-activated killer，LAK）细胞、细胞因子诱导的杀伤（cytokine induced killer，CIK）细胞、巨噬细胞和树突状细胞（dendritic cell，DC）等几大类。将免疫细胞的杀伤活性与抗体的特异性相结合，通过对免疫细胞进行基因工程改造引入嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）使其靶向表达特定抗原的肿瘤细胞，推动了CAR-T和CAR-NK细胞疗法的发展。CAR是CAR-细胞的核心部分，它使细胞能够不依赖于HLA而通过CAR结构识别更广泛的肿瘤靶抗原。CAR基本结构包括肿瘤相关抗原结合域、通常来自单克隆抗体的抗原结合区域的单链抗体（single chain variable fragment，scFv）、胞外铰链域、跨膜域和胞内信号域。scFv可以与肿瘤细胞表面表达的肿瘤相关抗原紧密结合，这决定了 CAR结构的特异性。铰链域是细胞外区和跨膜域之间的连接序列，它给予CAR充分的定向性和灵活性来与肿瘤抗原结合，会影响CAR-细胞的活性。跨膜域位于铰链和胞内信号域之间，包括CD3 HLA-A2或CD28。胞内信号域的结构决定了CAR-细胞激活信号的强度，其中包含免疫受体酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）。目前最经典的胞内结构域是CD3 ITAM的激活区。为了提高CAR修饰的效应细胞的增殖和细胞毒作用，可在胞浆尾部加入共刺激蛋白受体，如CD28、4-1BB、CD134、ICOS等。针对CAR结构的研究除了选取合适的靶向位点scFv，很多研究专注于作为CAR-细胞功能关键区域的胞内信号域，目前已经发展了4代。第1代CAR介导的细胞激活仅通过CD3ζ链完成，抗肿瘤活性有限。第2代CAR在胞内结构域中增加了1个新的共刺激信号，包括1条CD3ζ链和1个共刺激分子对CD3ζ链的信号进行放大，并与其具有相同的抗原特异性，增加了细胞增殖、细胞因子分泌和抗凋亡蛋白的分泌。广泛使用的共刺激分子有 CD28、4-1BB和 CD134（OX40）等。第3代CAR包括1条CD3ζ链和2个或2个以上不同的共刺激分子，使其抗肿瘤效应进一步提高。第4代CAR则通过基因修饰分泌特定的细胞因子或表达额外的共刺激配体增强CAR-细胞的疗效，同时引入了自杀基因系统控制CAR-细胞活性，必要时激活使CAR-细胞凋亡，防止对自体造成损害。CAR结构在免疫细胞中的广泛应用，引导免疫细胞特异性靶向识别肿瘤抗原并介导免疫细胞的激活，从而提高了过继性免疫疗法的适用性和有效性。CAR-细胞对血液肿瘤的治疗具有良好的效果，在实体肿瘤的治疗上也取得了一定的进展，表1中列出了近期CAR-细胞治疗的临床研究。本文对CAR-细胞疗法发展与现阶段应用进行概述，并对不同种类的CAR-细胞治疗的特点及优势进行总结，分别介绍了各自的潜力及应用，并针对其挑战与未来发展进行了讨论。2CAR修饰的T细胞2.1CAR-T细胞概述T细胞在细胞介导的免疫应答中起着关键作用，参与监测和杀死肿瘤细胞或潜在的恶性细胞。基于T细胞的过继免疫疗法治疗恶性肿瘤，特别是血液病癌症效果显著。这种新出现的治疗包括3个模型：TIL、T 细胞受体（T cell receptor，TCR）修饰的T细胞（TCR-T）和CAR-T。与CAR-T疗法相比，前两种技术并没有对T细胞本身进行大的修饰，疗效并不显著，较低的成功率以及对疫苗的依赖也限制了它们的发展。作为一种很有前途的过继免疫治疗方案，CAR-T细胞疗法已接受了超过25年的时间考验，能够识别和消除特定的癌细胞，独立于 MHC。现阶段全球范围已开展的临床试验以第2代CAR-T为主，以CD28或CD137共刺激域构成。一般认为，CD28所传递的活化信号，相较于CD137更强，可使T细胞在较短时间内达到很高的杀伤活性；而CD137所传递的活化信号则会维持得更久。此外，由于CAR-T细胞常常无法进入肿瘤内部，因此主要用于治疗血液系统肿瘤，在实体瘤的治疗中还未见显著的成效。第4代CAR-T细胞在CAR的设计中添加了细胞因子或者趋化因子的受体结构，从而增加T细胞在肿瘤组织中的浸润，以达到增强杀伤实体瘤的效果。2.2CAR-T细胞在抗肿瘤治疗中的应用美国FDA共批准了 5款CAR-T细胞产品上市，分别是瑞士诺华公司的Kymriah用于治疗急性B 淋巴细胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）、美国吉利德公司的Yescarta用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）以及Tecartus用于治疗套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）、美国百时美施贵宝公司的Breyanzi用于治疗复发或难治性（ralapsed/refractory，R/R）大 B 细胞淋巴瘤（R/R large B cell lymphoma，R/R LBCL）、美国百时美施贵宝公司和Bluebird Bio公司共同研发的Abecma用于治疗多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）。中国有2款CAR-T细胞产品获批上市，分别为上海复星凯特生物科技有限公司的阿基仑赛注射液用于治疗成人R/R LBCL、上海药明巨诺生物科技有限公司的瑞基仑赛注射液用于DLBCL。上述产品中除Abecma为APRIL靶点外，其余都是CD19靶点。随着大量临床研究的开展，针对不同靶点的CAR-T细胞还有望应用于急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）、慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）、B细胞淋巴瘤（B cell lymphoma，BCL）、MM及实体瘤等。目前治疗ALL，特别是高病死率的R/R B-ALL最适合的方法就是CAR-T细胞治疗，其中最有效的是抗CD19抗体CAR，CD19是B细胞的重要生物标志物，在B-ALL中有较高的表达。尽管CD19是CAR-T细胞治疗ALL的理想靶点，但研究发现“抗原逃逸”是免疫疗法发展的潜在障碍，当务之急是进行优化，包括识别其他靶点。CD22是CAR-T细胞的另一个潜在靶点，2种不同的抗CD22药物已经在临床试验中用于治疗B-ALL，以弥补抗CD19治疗的不足。由于CLL发病机制导致早期免疫缺陷，因此CAR-T细胞治疗的疗效受到来自CLL患者的T细胞体外扩增困难及体内增殖反应的限制。Ibrutinib是一种不可逆的布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂，它不仅可以避免对T细胞的负面影响，还可以提高其抗肿瘤能力。有研究表明，5个周期的Ibrutinib治疗增强了靶向CD19的第2代CAR-T细胞（CTL019）的扩增，并降低了程序性细胞死亡蛋白1在T细胞上的表达；同时增加了 B细胞中CD200的表达，而CD200/CD200受体在调节抗肿瘤免疫方面发挥重要作用。CAR-T细胞是治疗R/R B细胞非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）的最新免疫疗法，除抗CD19 CAR-T细胞外，4次跨膜蛋白CD20出现在90%以上的BCL中，是公认的NHL治疗靶点。目前，第1代抗CD20 CAR-T细胞治疗已经在一些研究中使用。CD30是TNF受体（TNF receptor，TNFR）超家族的成员，也可以作为淋巴瘤治疗的潜在靶点。在霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）中，它是Ki-1抗体的抗原，与里德-斯德伯格细胞结合。CD30阳性淋巴细胞主要分布在淋巴组织的滤泡区周围，而在生发中心不常见。对于淋巴瘤，CD30在经典的HL、间变性大细胞淋巴瘤、DLBCL、原发性纵隔BCL和外周T细胞淋巴瘤中表达。有研究报道，靶向CD30的CAR-T细胞在经高强度淋巴清除预处理后的R/R HL患者中表现出显著的抗肿瘤活性和较低的毒性。MM是一种骨髓来源的难治性恶性肿瘤，由于骨髓瘤的异质细胞遗传学和分子异常原因，这种疾病仍然无法治愈。膜蛋白CD138属于硫酸肝素蛋白聚糖的Syndecan家族，在恶性和分化的浆细胞表达，也存在于肿瘤、成熟的上皮细胞和其他正常组织中。由于CD138在几乎所有MM患者中都有表达，因此被用作主要诊断标志物。临床试验结果显示，使用第2代抗CD138 CAR-T细胞治疗5例难治性MM患者后，4例病情稳定，1例晚期浆细胞白血病患者外周血骨髓瘤细胞减少，这表明CAR-T细胞已经进入骨髓。由此可见，抗CD138 CAR-T细胞治疗MM具有良好的耐受性和潜在的抗肿瘤免疫效果。2.3CAR-T细胞面临的挑战CAR-T细胞治疗面临的主要问题是如何提高过继性细胞的有效性和持久性，以及减少治疗的不良反应。为了增强治疗效果，可以通过添加新的共刺激域或CAR部分来提高CAR-T细胞的有效性和持久性。糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白（glucocorticoid-induced TNFR-related protein，GITR）即CD357和4-1BB都是核因子-κB诱导的TNFR超家族成员，而GITR是组成性表达于T细胞的共刺激分子，添加该结构域或结合CD28和4-1BB可以进一步增强T细胞的作用。对于淋巴瘤、MM和其他类型的恶性肿瘤中存在的抗原逃逸或多种肿瘤抗原共存现象，重建CAR部分是一种新的方法。双特异性CAR-T细胞是很有前途的治疗方法，它包括2种形式：（1）1个CAR由2个不同的scFv组成（TanCAR），或者2个不同的CAR在1个T细胞上连接不同的scFv（双信号CAR）；（2）依次或同时注入不同类型的CAR-T细胞池。此外，使用带有趋化因子基因的溶瘤病毒招募CAR-T细胞，可延长它们的持久性并直接攻击肿瘤细胞。这是一种很有前景的方法，可用于血液系统恶性肿瘤的检测。溶瘤病毒可以感染宿主，复制并破坏某些肿瘤细胞，而不伤害正常细胞。有证据表明，肿瘤细胞可以通过MHCⅠ在其细胞质中整合呈递新病毒蛋白，被CD8+ T细胞识别和摧毁。使用黏液瘤病毒、5型腺病毒和柯萨奇病毒A组21型等病毒杀灭这种类型的肿瘤细胞的应用已在MM中报道。在CAR-T细胞治疗过程中，避免失控的T细胞增殖、细胞因子风暴或靶向/非靶向肿瘤效应至关重要，可以激活自杀基因（也称为消除基因）系统来破坏注入的CAR-T细胞，调节CAR-T细胞的扩增并限制毒性。目前，单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦自杀基因治疗在同种异体造血干细胞背景下已经显示了其安全性和有效性；其他非免疫原性自杀系统，如经过修饰的内在凋亡途径中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（caspase 9，Cas9）也已经被开发出来。然而，这种自杀策略是通过彻底消除CAR-T细胞来缩短治疗时间。“可转换的”CAR-T细胞弥补了这个缺陷，通过在scFv和T细胞表面之间插入一个小的分子复合物来启动细胞功能并通过停止添加它来关闭细胞功能。另一种切换细胞开启和关闭的方法是设计可溶性细胞间分子，包含肿瘤抗原特异性抗体，通过改变中间分子的浓度来改变细胞功能。CAR-T细胞治疗在治疗恶性血液病，特别是ALL、CLL和淋巴瘤取得了很大的进展，而有效性、细胞持久性和不良反应成为广泛应用的瓶颈，需要更加创新的实验室研究来加强该疗法的有效性。3CAR修饰的NK细胞3.1CAR-NK细胞概述NK细胞是机体内天然免疫系统的核心细胞。与T细胞不同，NK细胞对靶细胞的识别不依赖于MHC的表达，而是依赖于其表面杀伤细胞激活受体和杀伤细胞抑制受体（killer inhibitory receptor，KIR）间的动态平衡。当NK细胞表面的KIR识别出自身MHCⅠ的时候，NK细胞会主动失活，保护宿主细胞不受误攻击；在MHCⅠ改变、缺失或表达较低的肿瘤细胞中，KIR介导的抑制作用减弱，NK细胞以“缺失自我标记”为靶点对肿瘤细胞造成杀伤。NK细胞的杀伤作用主要体现在，NK细胞可以直接释放穿孔素和颗粒酶B，执行诱导靶细胞凋亡的作用；同时，NK细胞可以分泌大量细胞因子，如TNF-a、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、IFN-γ、IL-3等，对靶细胞起到直接作用，或激活其他种类的免疫细胞对靶细胞进行攻击；NK细胞还能表达Fas配体和TNF相关调亡诱导配体，使靶细胞进入程序性凋亡；最后，NK细胞通过其表面CD16与靶细胞表面的抗原决定簇特异性结合从而发挥抗体依赖的细胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）作用。除了具有强大的杀伤功能外，NK细胞还具有很强的免疫调节功能，分泌多种共刺激分子，募集和激活其他免疫细胞，如DC和巨噬细胞，间接帮助消灭靶细胞，从而调节机体的免疫状态和免疫功能。目前NK细胞所用CAR结构大多沿用自CAR-T细胞。大多数CAR-NK细胞使用CD3-ITAM作为信号转导区域进行信号转导，并利用CD3-ITAM启动NK细胞杀伤。CD3ζ二聚体可以传递来自CD16的信号，从而有助于ADCC作用。除单一的CD3型ζ链之外，胞内信号区还包括共刺激结构域，如CD28、CD137（4-1BB）或CD244（2B4）等分子，具有很好的信号转导效应，有助于CAR-NK细胞的杀伤作用。不同的共刺激分子对NK细胞的作用也不同，如在ALL异种移植小鼠模型中，CD244对CAR-NK92细胞的刺激作用强于CD137，可以募集并激活酪氨酸激酶启动激活信号，可能更适合作为CAR-NK细胞的胞内信号域。与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞具有多种优势。首先，NK细胞易分离，寿命较短，体内转移的CAR-NK细胞不易过度增殖，导致移植物抗宿主病（graft versus-host disease， GVHD）的风险低。其次，NK细胞分泌的细胞因子主要包括IFN-γ和GM-CSF，比活化CAR-T细胞释放的细胞因子如TNF-а、IL-6、IL-2、IL-8 等更加安全，这些由CAR-T细胞产生的促炎细胞因子可能导致细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）和神经毒性。除了以CAR依赖的方式杀伤肿瘤靶细胞外，CAR-NK细胞还能以CAR非依赖的方式消除癌细胞，发挥自身天然的杀伤肿瘤细胞的活性，如通过激活NK细胞受体NCR、NKG2D、共刺激受体DNAM-1（CD226）和某些激活的KIR（KIR2DS1、KIR2DS4和KIR2DL4 ）等上调被激活。其次，CAR-NK细胞可以通过表面的CD16介导ADCC作用清除肿瘤细胞。CAR-NK细胞拥有CAR依赖和NK细胞受体依赖的双重杀伤机制，可以有效根除一些不表达CAR所靶向抗原的异种肿瘤。最后，NK细胞可从PBMC、NK细胞系和诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）等中直接获取，价格更加便宜。CAR-NK细胞中的NK细胞可以从多种来源大规模生产，包括NK-92细胞系、外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）、脐带血（umbilical cord blood，UCB）、CD34+ 造血祖细胞（hematopoietic progenitor cells，HPC）和iPSC。目前大多数CAR-NK细胞的临床试验使用的NK92细胞系在体外具有无限的增殖能力，对反复冻存、解冻的敏感性降低，使生产时间更短，成本更低。然而，NK92细胞系为肿瘤细胞系，具有潜在致瘤风险，缺乏CD16和NKp44的表达，且在输注前需要辐照而失去体内扩增潜力。PBMC是NK细胞的重要来源，GVHD风险低，可以从健康捐赠者PBMC中分离出足够数量的NK细胞，其中90%是成熟表型的CD56dimCD16+ NK细胞，细胞毒作用更强但增殖能力下降，且这种来源的CAR-NK细胞无需辐照处理。同样的方法也适用于从UCB分离NK细胞。UCB的优势是可以选择具有特定HLA类型和特定NK细胞受体特征的供者。然而，UCB单位体积有限，NK细胞数量较少、表型不成熟，黏附分子CD16、穿孔素和颗粒酶B的表达减少，NKG2A等抑制受体表达增加，使获取足够数量的临床级NK细胞成为挑战。同时，PBMC和UCB来源的CAR-NK细胞由不同供者提供，使产品很难标准化。从CD34+ HPC中分化NK细胞是获得大量临床级成熟NK细胞的另一种途径。CD34+HPC可以从骨髓、胚胎干细胞或UCB中分离，在培养系统中扩增和分化为成熟的NK细胞。除上述来源外，iPSC由于可以更有效地设计以稳定表达CAR而成为新兴的CAR-NK细胞来源，从单个CAR-iPSC细胞出发就足以分化为大量高度同源的CAR-NK细胞产品用于临床，为CAR-NK细胞提供了一种可再生的来源。然而，与UCB NK细胞类似，iPSC来源的NK细胞通常表型不成熟。3.2CAR-NK细胞在抗肿瘤治疗中的应用使用非CAR工程化的NK细胞进行免疫治疗已显示出良好的效果，而用基因工程化的CAR-NK细胞可以提高临床疗效。在恶性淋巴肿瘤的临床研究中，CD33和CD19是CAR-NK细胞疗法最常见的靶点。Tang等首次将CAR-NK-92细胞应用于临床试验。他们构建了包含CD28和4-1BB共刺激分子在内的第3代慢病毒载体，并在CD33的scFv和CD28之间插入Fc片段来检测转导的CAR-NK细胞。用上述构建的CD33-CAR载体转导经改造的能够表达IL-2的NK-92-MI细胞，并确认转导效率达90%以上。经过符合GMP级生产要求的细胞转导与培养后，CD33-CAR-NK-92细胞在体外对人早幼粒白血病细胞系HL-60展现了良好的杀伤作用。接着，他们对3例R/R急性髓系白血病（acute myloid lymphoma，AML）患者进行挽救化疗，没有观察到明显的不良反应，证明以5×109个CD33-CAR-NK-92细胞剂量进行输注并辐照是安全的。输注后，患者的血液中能够检测到CAR-NK-92细胞。Liu等对11例R/R NHL或CLL患者进行了UCB来源的HLA不相合的抗CD19-CAR-NK细胞治疗。将携带抗CD19、CD28跨膜区和CD28ζ信号内域的scFv的逆转录病毒载体与人IL-15基因和可诱导的Cas9自杀基因结合，导入UCB来源的NK细胞。体外扩增CAR-NK细胞，并在淋巴清除化疗后对患者进行一次性输注，未观察到明显的GVHD和CSF。在接受治疗的11例患者中，8例恶性肿瘤有一定程度的缓解，其中7例得到完全缓解。输注后的CAR-NK细胞可以扩增并维持一定水平至少12个月。这些已应用于临床的CAR-NK细胞治疗方案展现了 CAR-NK细胞对B细胞系恶性肿瘤的抗癌作用是有效且安全的，且疗效均强于非CAR-NK细胞治疗。临床前研究表明CAR-NK细胞具有很强的抗肿瘤功能，但在实体瘤中的临床应用尚处于起步阶段。目前有多项临床前试验研究CAR-NK细胞疗法治疗多发性实体瘤的疗效，如神经母细胞瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤和乳腺癌等。Liu等用表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）作为治疗三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）的靶点，研究了EGFR-CAR-NK细胞在体内外对TNBC细胞的杀伤作用。将抗EGFR scFv的DNA片段克隆至带有CD8较链、CD28跨膜区域、4-1BB和CD3ζ胞内信号域的第3代CAR慢病毒载体中，并转导NK细胞。结果表明，EGFR-CAR-NK细胞可以被表达上调的TNBC细胞激活，并在体外特异性地触发TNBC细胞的裂解，并对小鼠体内乳腺癌细胞来源的异种移植和患者来源的异种移植肿瘤均有抑制作用。除此之外，EGFR-CAR-NK细胞可通过同时触发TNBC细胞凋亡来提高疗效，表明EGFR-CAR-NK细胞对治疗TNBC是有潜力的治疗策略。Cao等也以间皮素（mesothelin，MSLN）作为治疗胃癌的靶点，将抗MSLN 的 scFv （NKG2D跨膜区，结合 2B4-CD3 胞内信号结构域）克隆到慢病毒载体中，并转导NK-92细胞得到MSLN-CAR-NK细胞。结果表明，MSLN-CAR-NK细胞在体外对MSLN阳性的胃癌细胞具有特异性杀伤作用。此外，与非CAR工程化的NK-92细胞和CD19-CAR-NK细胞相比，MSLN-CAR-NK细胞可分泌更强的细胞因子，并可以有效清除小鼠体内皮下和腹膜肿瘤模型的胃癌细胞，对异种移植的胃癌具有较强的抗肿瘤和NK细胞浸润能力，显著延长了小鼠的存活时间，证明针对胃癌的MSLN靶点是非常具有潜力的。CAR-NK细胞具有很大的临床应用潜力，进一步的研究正在将CAR-NK细胞治疗的临床前结果转化至临床。3.3CAR-NK细胞面临的挑战CAR-NK细胞疗法是近年来发展起来的一种治疗肿瘤的免疫治疗方法，尽管在临床前研究中取得了不错的进展，但CAR-NK疗法的临床应用仍处于起步阶段，并面临着一些挑战。我们希望通过对当前挑战进行阐述，并讨论未来的改进方法，以改善临床环境下的CAR-NK的治疗结果。NK细胞的扩增是CAR-NK细胞生产的重要步骤之一，需要大量的CAR-NK细胞才能达到最佳的临床疗效，因此产生足够数量的NK细胞仍然是CAR-NK疗法的主要挑战。多种细胞因子，如IL-2、IL-15、IL-12、IL-21和IL-18等已被用于体外扩增原代NK细胞，但效果有限，而在开发出合适的人造APC（artificial APC，aAPC）后可以特异性并大量扩增NK细胞。Shah等使用以K562为基质表达膜结合型IL-21的aAPC在14 d的NK细胞共培养中，使UCB NK细胞的平均扩增倍数达到了2 389倍，而仅添加IL-2的NK细胞在14 d的培养中平均扩增倍数只有20倍，表明aAPC在NK细胞扩增中具有显著的促进作用。而在Denman等的研究中，膜结合型IL-21的K562还可以延缓NK细胞的端粒缩短，而端粒缩短情况也被认为是限制NK细胞分裂能力的重要因素之一。为获得足够数量的NK细胞用于CAR转导，需要开发更多、更有效的临床级别体外扩增方法。除了扩增的挑战外，CAR-NK细胞的CAR结构以及转导过程仍面临诸多问题，同时也有很多研究正在努力解决这些挑战。由于CAR结构最先用于T细胞，而针对NK细胞的CAR最优结构的设计尚未被系统地研究。CAR结合表位的位置及其与NK细胞表面的距离可能影响与抗原的结合、免疫突触的最佳形成和CAR-NK细胞的激活，同时不同来源的NK细胞对共刺激信号要求也不尽相同。Li等通过表达特制的CAR结构，能促进由iPSC分化的NK细胞的激活，这种含跨膜NKG2D和胞内2B4结构域的构建体比CAR-T构建体性能更好。因此，针对NK细胞独特的激活受体和信号激活蛋白而定制的基于NK细胞的CAR结构潜力巨大。除此之外，目前所开发的CAR大多针对癌细胞上差异表达的非突变自身抗原，导致CAR可能与正常组织上表达的抗原非特异性结合，对健康组织也造成损害。针对这一问题，可以导入自杀基因，如诱导型Cаs9，控制CAR活性剂量；也有研究指出，如果2个单独的结构或2个胞外结构域以串联形式结合，产生双特异性CAR，细胞毒性会有效降低；split CAR构造，使用小分子的二聚化以形成功能单元。而在转导过程中，目前主流的导入CAR的方式为逆转录病毒转染。但这种方法依赖宿主细胞的分裂，NK细胞在未激活时转导效率会下降。同时，逆转录病毒转染后可能存在遗传毒性，并可能触发相关机制使NK细胞凋亡。针对这一问题，有研究指出可以使用RNA工程，NK细胞的存活率和转染效率会更高。CAR-NK细胞治疗作为一种新的过继免疫治疗手段具有巨大的潜力和可行性，但仍存在许多问题需要解决。如果这些问题得到解决，CAR-NK细胞疗法将成为对抗肿瘤的强大手段。4以iPSC为平台生产CAR-T/NK细胞4.1iPSC概述2006年，山中伸弥团队在小鼠胚胎和成人成纤维细胞中诱导多能性的4个转录因子一Oct3/4、Sox2、Klf4和cMyc，实现了体细胞向多能干细胞的重编程。iPSC可在体外无限扩增，并且理论上可分化成任何细胞类型，在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似，同时避开了伦理问题，在疾病模拟、药物筛选和细胞治疗中有着巨大的应用前景，是细胞疗法的理想细胞来源。iPSC体外培养时如果通过构建合适的环境，模拟体内发育过程，理论上可分化成任何细胞类型，包括T细胞和NK细胞。iPSC衍生的T/NK细胞能够为临床治疗提供同质且基因明确的细胞群体，消除了使用外周血或UCB来源的T/NK细胞时供者间的差异。此外，通过使用各种基因编辑技术，如病毒载体、转座子或成簇规律间隔短回文重复序列Cas9系统，可以对未分化的iPSC进行遗传操作以产生均一的目标细胞群细胞如CAR-T/NK细胞，这些优势使iPSC衍生的细胞成为“现货型”细胞疗法的理想细胞群。4.2iPSC衍生的CAR-T/NK细胞在抗肿瘤治疗中的应用2013年，Sadelaint团队用编码二代抗CD19-CAR的慢病毒载体转导外周血淋巴细胞来源的iPSC，收获的iPSC-CAR-T细胞表现出与CAR-TCR-γẟ外周血淋巴细胞类似的抗肿瘤活性。Kanfman团队用iPSC生产的NK细胞表达的激活和抑制受体与外周血NK细胞相似，并且在体外和体内都表现出强大的抗肿瘤和抗病毒活性。为了提高CAR-NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，2018年，Kanfman团队构建了具有NK细胞特异性激活域（NKG2D-2B4ζ）的CAR-NK细胞并以PiggyBac转座子为载体将其编码基因整合至iPSC，所收获的NK-CAR（NKG2D-2B4ζ）-iPSC-NK 细胞显示出与外周血NK细胞和未修饰的iPSC-NK细胞相似的表型，并且比 T-CAR（CD28-41BBζ）-iPSC-NK细胞表现出更高的抗肿瘤活性。美国Fate Therapeutic公司以iPSC为平台生产的CAR-NK细胞和CAR-T细胞产品均已进入Ⅰ期临床研究。FT596是由iPSC衍生的CAR-NK细胞产品，除了表达靶向B细胞抗原CD19的CAR，FT596还表达高亲和力且不可清除的CD16受体以增强ADCC，及IL-15受体融合蛋白以增加CAR-NK细胞的体内存活时间。目前公布的Ⅰ期临床试验结果显示，在接受FT596治疗的14例R/R BCL患者中，10例（71%）患者获得客观缓解，其中7例（50%）获得完全缓解。安全性方面，数据显示FT596疗法耐受性良好，未观察到神经毒性综合征、GVHD等。除了FT596外，该公司的FT500、FT516、FT538和FT576均为由iPSC衍生的NK细胞产品且都已进入Ⅰ期临床研究。FT819是首个由iPSC衍生的CAR-T细胞产品，除了表达靶向B细胞抗原CD19的CAR，FT538完全消除了内源性TCR的表达以及GVHD。临床数据显示，FT819在体内对表达CD19的白血病和淋巴瘤细胞系具有抗原特异性的细胞毒性，与健康的供体来源的CAR-T细胞相当；骨髓评估显示，FT819能够在体内持续存在并继续表现出肿瘤清除能力。iPSC细胞系作为一种可再生细胞来源，能够大规模生产高质量的同种异体CAR-T/NK细胞，具有更高的产品一致性、现货供应和更广泛的患者可及性，有望成为未来细胞疗法领域的重要方向。4.3iPSC衍生的CAR-T/NK细胞面临的挑战iPSC衍生的NK细胞和T细胞在近几年发展迅速，提供了可以即取即用的产品，能够极大降低肿瘤免疫治疗的成本，形成一种可以提前生产、储备，具有可预期疗效的免疫细胞治疗产品。iPSC衍生的细胞治疗产品从科研端走向临床仍面临着诸多新的挑战。其中，能够在临床应用需要克服的重要挑战之一是确立符合临床使用要求的有效细胞分化策略。虽然在基础科学研究中，已经有多项实验报道可以将iPSC成功分化为T细胞和NK细胞，然而很多分化方案仍然使用了血清和滋养层细胞，存在外源因子污染的安全性风险，不符合各国药典规则。iPSC的分化策略直接影响到最后生成的T细胞或者NK细胞的表型是否与人体中自然产生的细胞相同，不同企业或机构最后生产出的细胞产品性状很可能大不相同。此外，iPSC具有无限增殖的潜力，如果未分化的iPSC被输入到患者体内，可能具有产生肿瘤的潜力。因此，需要设定安全检查或者基因工程改造策略，将这一风险最小化。目前，对iPSC衍生的细胞治疗的功能陈述还没有建立统一的标准，如何规范基于iPSC衍生的细胞治疗产品工艺的稳定性也是目前亟需解决的问题。5CAR修饰的其他免疫细胞由于肿瘤微环境（tumor micro-environment，TME）和缺乏特异性靶向肿瘤抗原，CAR-T细胞在实体瘤中的应用仍然受到严重限制，除了 NK细胞，目前针对许多实体瘤的新策略是将CAR应用到巨噬细胞、DC和CIK细胞中。巨噬细胞M1表型具有促炎和抗肿瘤活性，在2类实体瘤异种移植小鼠模型中，CAR-巨噬细胞靶向MSLN或人表皮生长因子受体2，在人红白血病细胞中表现出抗肿瘤吞噬活性，降低了肿瘤负荷，并延长了总生存期；TME中的另一个关键作用细胞是起APC作用的DC，它可以启动幼稚T细胞并重新激活记忆应答，并与细胞毒性CD8+细胞交叉呈递，促进更强的抗肿瘤应答，Suh等用4-1BB抗CD33的CAR转导了 DC，在AML模型中对其进行了测试，经CAR-T/CAR-DC治疗的小鼠AML的负担明显减少，存活率也随之增加；CIK细胞也是备受关注的一类效应细胞，其具有经典NK细胞以及CD4+和CD8+ T细胞的共同特征，可以通过多种受体识别病原体，人表皮生长因子2-CAR-CIK细胞可完全消除人肺泡横纹肌肉瘤，而野生型CIK细胞仅能实现部分肿瘤生长抑制，而且使用CAR-CIK细胞没有严重CRS或GVHD的迹象。癌症的免疫编辑和耐药性在抗癌免疫疗法中十分常见，许多癌症通过失去MHCⅠ抗原呈递机制来逃避免疫控制，高达50%的ALL和LBCL患者中都发现CD19丢失引发的免疫逃逸，这些患者在抗CD19 CAR-T细胞治疗后复发。与自体CAR-T细胞产品中的主要细胞类型αβ T细胞不同，γẟ T细胞具有先天和适应性免疫系统的特性，它们可以以不依赖MHC的方式发挥作用，具有多种杀伤机制，并将抗原交叉呈递给αβ T细胞，靶向二唾液酸神经节苷脂2（ disialoganglioside 2，GD2）的γẟ CAR-T细胞能够向肿瘤细胞迁移和抗原交叉呈递，并增强了GD2在癌细胞系中的特异性杀伤，在另一项研究中，Rozenbaum等证明γẟ CAR-T细胞能够靶向那些失去C19（即抗原阴性）的CD19白血病细胞。记忆性T细胞和Treg作为免疫细胞，因其不会引起GVHD，也被CAR修饰后用于免疫治疗。Fernandez等构建表达NKG2D的CAR-记忆性T细胞，可以靶向清除表达NKG2D配件的骨肉瘤细胞，也是一种很有前途的骨肉瘤免疫治疗方法；Treg是一种能抑制传统T细胞和其他免疫细胞功能的T细胞亚群，针对其免疫抑制特性，目前也已开发CAR-Treg疗法治疗移植排斥以及一系列自身免疫性疾病。6展望过继性细胞免疫治疗是近年来发展迅速的一种个性化免疫治疗方法。而通过基因工程改造的方式对过继性免疫细胞进行CAR修饰，进一步提高了其识别肿瘤抗原的能力和对肿瘤细胞的杀伤效果。其中CAR-T细胞治疗在治疗恶性血液病特别是ALL、CLL和淋巴瘤方面取得了很大的进展，但有效性、细胞持久性和不良反应成为这种方法广泛应用的瓶颈。因此很多研究尝试用CAR修饰其他免疫细胞来代替T细胞，从而提高对实体瘤的治疗效果，同时减轻不良反应。其中，CAR-NK细胞由于杀伤能力强，导致移植物抗宿主病的风险低，同时只会引起较轻的细胞因子风暴和神经毒性不良反应，是除CAR-T细胞外研究最多的CAR修饰的免疫细胞。其他相关技术如以iPSC为平台生产T/NK细胞，CAR修饰应用到巨噬细胞、DC细胞和CIK细胞中以治疗实体瘤等方面均取得了较大突破。CAR修饰的免疫细胞治疗研发具有广泛的应用前景，但有很多问题需要解决才能用于临床治疗，需要进行更多的创新工作研究。作者徐瑞升  陈玉莹  李奇林  谭文松  蔡海波华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237通信作者：蔡海波，Email：caihaibo@ecust.edu.cn引用本文：徐瑞升，陈玉莹，李奇林，等.  基于嵌合抗原受体修饰的免疫细胞疗法发展与应用的研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(5): 273-282.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20221125-00081识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：基于嵌合抗原受体（CAR）免疫疗法的过继细胞治疗取得了巨大进展，美国食品和药物管理局批准了五种用于血液系统恶性肿瘤的CAR T疗法。然而，实体瘤的CAR免疫疗法明显落后。CAR免疫疗法在实体瘤中的一些主要障碍包括CAR T细胞制备、缺乏肿瘤特异性抗原、CAR-T淋巴细胞运输和渗透到肿瘤部位的效率低下、免疫抑制肿瘤微环境（TME）、治疗相关毒性和抗原逃逸。CAR自然杀伤（NK）细胞比CAR T细胞有几个优势，因为NK细胞可以由预先存在的细胞系或异基因NK细胞制备不需要进行主要组织相容性复合体（MHC）的配型；可以通过CAR依赖性和CAR非依赖性途径杀死癌症细胞；并且毒性较小，尤其是在细胞因子释放综合征和神经毒性。至少有一项临床试验显示了CAR-NK细胞治疗的疗效和耐受性。巨噬细胞是主要的免疫调节因子，可以有效地渗透到肿瘤中，并大量存在于TME中。免疫抑制性M2巨噬细胞与促炎性M1巨噬细胞在吞噬靶细胞方面有一样的效果。并且还可以诱导M2巨噬细胞分化为M1型。因此，开发用于癌症免疫治疗的CAR巨噬细胞以克服与CAR T/NK治疗相关的一些主要障碍，特别是在实体肿瘤中，具有重大的意义。尽管如此，CAR-NK和CAR 巨噬细胞都有其自身的局限性。这篇综合性综述文章将讨论CAR-T和CAR-NK治疗的现状和主要障碍，接下来将讨论将CAR巨噬细胞发展为癌症特异性吞噬细胞、抗原提呈物、免疫刺激物和TME修饰物的结构和前沿研究。背景：免疫疗法最近已经彻底改变了癌症治疗的方法，是继手术、放疗和化疗之后癌症治疗的第四个基石。这对于无法治愈的转移性肿瘤来说更是如此，现在在经历免疫治疗后一部分患者可以达到长期缓解甚至治愈。目前，免疫疗法研究探索并利用免疫系统的各个方面，其中最成功的案例是免疫检查点抑制剂（ICIs）和嵌合抗原受体（CAR）T细胞的过继细胞疗法（ACT）。其他免疫疗法方法主要在临床前研究和临床试验中。对于免疫检查点抑制剂，有1种抗体是针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白（CTLA-4）、6种PD-1抗体和PD-L1抗体已经被FDA批准针对超过15种不同类型的恶性肿瘤。相比之下，到目前为止，只有5种CAR-T疗法被批准用于治疗B细胞来源的血液恶性肿瘤。目前超过700个CART疗法的临床试验在clinicaltrails.gov上注册，其中许多试验集中于实体肿瘤。这篇综述文章讨论了CAR-T和NK细胞治疗的现状及其局限性，然后是新兴的CAR-巨噬细胞的治疗。CAR 结构初始T细胞的激活需要两个信号，一个是通过T细胞受体（TCR）与主要组织相容性复合体（MHC）上的抗原结合的第一信号；另一个是通过CD28的共刺激信号。TCR由两条高度可变的链组成通常为α和β链，有少数的T细胞是γ和δ链。这两条链形成抗原识别和结合位点，并由非常短的细胞质位点。除此之外，TCR与6个CD3受体（CD3εγ, CD3εδ andCD3ζζ）结合形成四种CD3受体蛋白（CD3δ,CD3γ, CD3ε and CD3ζ,），来形成1个八聚体的复合物。CD3的胞内结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序（ITAM），在TCR接合过程中传递主要信号。TCR-CD3复合物的主要信号和CD28与B7.1（CD80）或B7.2（CD86）结合的共同信号激活T细胞。CAR是一种合成的细胞表面受体，通常不依赖于MHC就可与靶细胞表面抗原结合将细胞毒性细胞与靶细胞结合。它的主要功能比如第一代CAR是替代TCR-CD3复合物并传递T细胞激活的主要信号；第二代和第三代CAR主要替代TCR-CD3复合物的信号和CD28的共刺激信号。CAR通常由四个区域组成：细胞外抗原结合区域、间隔或者铰链区、跨膜区和细胞内信号区域。抗原结合区域通常由抗体的重链（VH）和轻链（VL）通过链接器链接，形成单链片段可变区（ScFv），并决定其抗原结合特异性。有时，可以用一种与靶细胞上的受体结合的天然蛋白质或者肽来代替单链抗体。单链抗体识别并结合细胞表面标位来决定靶标特异性和TCR识别通过MHC呈递抗原的形式是不同的。铰链区域是一个间隔区域，它暴露了CART细胞表面的抗原结合区域，以便抗体与目标抗原结合。临床上常使用的铰链区通常来源于CD8、CD28或者IgG。铰链区域的长度根据经验由靶抗原的位置决定，靠近细胞膜的抗原需要较长的铰链，暴露在细胞表面的抗原需要较短的铰链。跨膜结构域的主要功能是将CAR固定在免疫细胞膜上。然而一些研究表明，该区域可以影响CAR的表达、稳定性、二聚化和信号转导。细胞内信号域在CAR的领域被广泛研究，以用来产生具有最活跃的抗肿瘤的CAR免疫细胞。当CAR参与时，细胞内信号域会传到信号激活免疫细胞攻击目标细胞。第一代CAR-T包含一个CD3ζ信号域。由于T细胞活化需要TCR-CD3和CD28两个信号通路的信号，因此第一代CART细胞治疗在过继转移后的疗效和持久性有限。未提高抗癌活性，设计了第二代CAR-T细胞。除外CD3ζ信号域外还包含一个共刺激域。两个最常用的胞内信号结构域是CD28和4-1BB(CD137)。FDA批注的axicabtagene ciloleucel和brexucabtagene autoleucel 均使用了CD28的结构域，两者都是针对CD19靶点的CAR-T。FDA批准的靶向CD19的lisocabtagene maraleucel和tisagenlecleucel，以及靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的idecabtagene vicleucel均使用4-1BB的共刺激域。其他细胞内共刺激域如OX40、CD27、和诱导性T细胞共刺激域（COS）也在临床前研究中进行了测试，与CD28和4-1BB结构域的效果差不多。其中一些共刺激域可能对CAR-T细胞有更好的有益效果，有一项研究表明CD27共刺激结构域比CD28共刺激域在体内更能增强CAR-T的持久性。它们在CAR T细胞中的活性尚未在大型临床试验中得到验证。已经发现细胞内CD28和4-1BB结构域对CAR T细胞的分化和代谢有不同的影响。4-1BB和CD3ζ可联合诱导中枢记忆T细胞的分化和持续性，增加线粒体的生物合成，促进脂肪酸氧化和氧化代谢；CD28和CD3ζ结合诱导记忆细胞分化和糖酵解。为了利用不同性质的共刺激域并增强CAR T细胞的疗效，第三代CAR T治疗被设计在CD3ζ并联设置两个共刺激域。结合CD28和4-1BB可以使得CAR T细胞能靶向低亲和力的目标抗原，增强增殖能力，增强中央记忆细胞的分化，提高体内的抗肿瘤活性。一个包含可变数量共刺激域的CAR构建库测试时发现包含两个共刺激域的CAR T细胞。DAP10和CD27在体内取得最好的抗肿瘤活性。除外CAR的基本结构，生物工程的最新进展使进一步武装CAR免疫细胞成为可能，其可以增强抗肿瘤的功能并降低毒性。如CAR-T细胞上表达趋化因子受体，以促进趋化并向肿瘤微环境浸润；促炎性细胞因子的表达可以克服免疫抑制TME；敲除抑制性受体可以防止CAR-T细胞衰竭；双CAR-T细胞可以产生靶向两个抗原并克服抗原逃逸；自杀或抑制基因可以用来预防或减少毒性，包括靶向性、非肿瘤效应及细胞因子释放综合征。CAR-T治疗的现状到目前为止， FDA已经批准了五种CAR-T细胞。5个B细胞表面标记物， 4个靶向CD19，1个靶向B细胞成熟抗原(BCMA) (表1和图1)这五种药物均已被批准用于复发或难治性血液恶性肿瘤的治疗:B细胞来源的淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。第一个FDA批准的CAR-T疗法是Tisagenlecleucel，75例复发或难治性B细胞前体急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿和年轻成人患者。在3个月内，总缓解率为81%，其中完全缓解(CR)为60%，不完全血液恢复(CRi)为21%。75例患者中55例(73%)出现3级或4级tisagenleckel相关不良事件。3级和4级细胞因子释放综合征(CRS)分别发生在21例和25%的患者中， 75例患者中有35例(47%)住进重症监护病房(ICU)进行治疗。基于该试验， CAR-T疗法于2017年8月30日获得FDA批准，用于治疗年龄≤25岁的B细胞前体ALL患者，且难治性或二次或以后复发。Tisagenlecleucel于2018年5月1日获批，用于治疗复发或难治的大B细胞淋巴瘤，包括弥漫大b细胞淋巴瘤(DLBCL)、高级别B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤引起的DLBCL，基于多中心试验。在92例可评估的患者中，最佳的总缓解率为52%，其中CR为40%，部分缓解(PR)为12%。63%发生3级或4级不良事件，怀疑与tisagenlecucel有关。Axicabtagene ciloleucel(Yescarta™)于2017年10月18日成为FDA批准的第二种CAR-T疗法，用于治疗大B细胞淋巴瘤，包括DLBCL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、高级别B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤引起的DLBCL，经过至少两行系统治疗。一项有101名患者参加的多中心ZUMA-1试验显示， 18个月时客观缓解率(CR54%)为82%，总生存率为52%。约13%的患者发生3级或以上CRS。2021年3月5日， axicabtageneciloleucel也被批准用于复发或难治性滤泡性淋巴瘤，基于单臂、开放标签的ZAMA-5试验，经过两个或多个系列的全身治疗。91%的患者达到了缓解，约8%的患者出现了3级或3级以上的CRS。中位随访时间为14.5个月，在18个月时， 74%的患者持续缓解。基于一项单臂、开放标签的ZUMA-2试验， FDA于2020年7月24日批准了第三个靶向CD19的CAR-T疗法Brexucabta或难治性套细胞淋巴瘤。在这个多中心II期试验中，74名患者被纳入， Brexucabtageneautoleucel生产了71名患者，给药68名患者。总体而言缓解率为93%，缓解率为67%。12个月时，总生存率为83%。约15%的患者发生3级或以上CRS。Lisocabtagene maraleucel (Breyanzi™)是最近批准的针对复发或难治性大B细胞淋巴瘤的CD19靶向CAR-T治疗，经过两个或多个系列的系统治疗，包括未指定的大B细胞淋巴瘤(包括由惰性淋巴瘤引起的大B细胞淋巴瘤)、高级B细胞淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤3b阶段。在这项多中心TRANSCEND试验中，有192名可评估患者参与，客观缓解率为73% (50×106、100×106和150 ×106给药方案分别为68、74和73%)，CR为53% ((50 ×106、100 ×106和150 ×106给药方案分别为60、52和51%)，中位缓解持续时间为17个月。3级或以上CRS发生在约2%的患者中。Idecabtagene vicleucel (Abecma®)是唯一的FDA-批准的CAR-T治疗不针对CD19。它针对多发性骨髓瘤(MM)细胞的BCMA靶点，并于2021年3月26日获得FDA批准，用于复发或难治性MM，经过4个或更多系列的系统治疗，包括免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和基于KarMMa研究的抗CD38单克隆抗体。在128名接受治疗的患者中，总有效率为73%(150×106、300×106和450×106给药方案分别为50、69和82%)，CR为33% (150×106、 300×106和450×106给药方案分别为25、29和39%)。约2%的患者中发生了3级或以上CRS。到目前为止，已经有超过700个恶性肿瘤的临床试验被注册。此外，CAR-T细胞疗法正在探索用于其他疾病，如自身免疫疾病和病毒感染)。表1 FDA近期批准的CAR-T治疗图1 FDA批准CAR-T治疗的时间线CAR-T细胞在癌症免疫治疗中的局限性许多因素导致了CAR-T治疗的失败，如患者的疾病进展、单采时T细胞数量不足、推迟的CAR-T生产、CAR-T细胞未满足回输剂量、固有的T细胞缺陷等。下面是与CAR-T细胞生产和治疗相关的因素。抗原选择尽管CAR-T治疗取得了巨大的成功，但仍存在一些明显的局限性。到目前为止，所有FDA批准的CAR疗法都以B细胞的标记物为靶点。CAR-T细胞治疗实体瘤落后于血液瘤的原因是多样的。缺乏癌症特异性的靶点是主要的障碍之一。尽管CD19靶向CAR T治疗会导致B细胞再生障碍，但静脉注射免疫球蛋白补充剂可以很容易地补偿大多数B细胞功能。实体瘤中很少存在这种不影响正常功能的特异性抗原。在实体肿瘤中，靶向肿瘤相关抗原的CAR-T细胞的临床试验，如被T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MART1)和糖蛋白100(gp100)，表明确实发生非靶向肿瘤的副作用，有时不能轻易逆转。这种毒性可能发生在没有或只有最低的抗肿瘤活性的情况下，甚至当靶向被认为在健康成人组织中不表达的癌症睾丸抗原时，也可导致死亡。CAR-T细胞转移和浸润到肿瘤中的效率低下转移和渗透到肿瘤部位是静脉注射CAR-T细胞的要克服的下一个主要障碍。粘附分子异常表达的异常脉管系统降低CAR-T细胞附着的附着、迁移和浸润;密集的细胞外基质，包括癌症相关的成纤维细胞(CAFs)，为CAR-T细胞进入肿瘤部位创造了一个物理屏障;紊乱的细胞因子表达会优先吸引被抑制的免疫细胞。目前已经探索了各种策略来增加T细胞对肿瘤的浸润。比如CAR-T与另一种靶向CAFs的CAR-T治疗相结合，或将CAR-T细胞与细胞因子受体结合，结合到肿瘤中上调的细胞因子上。然而，这些策略有时是有代价的，因为这些目标通常存在于机体中。一项临床前研究表明，靶向CAFs的CAR-T细胞能够识别多能骨髓基质细胞，这导致小鼠产生恶病质和死亡，这些研究提醒人们不要在人类患者中使用这种策略。恶性的肿瘤微环境进入TME后，免疫抑制环境会抑制CAR-T细胞的功能。在某些癌症中尤其如此，如胰腺癌，细胞和基质成分都为癌症免疫治疗创造了不利的微环境。细胞成分如肿瘤相关的巨噬细胞(TAMs)，调节性T -细胞(Treg)，骨髓源性抑制细胞(MDSCs)和肿瘤相关的成纤维细胞(TAFs)可以直接抑制CAR-T功能，有助于免疫抑制细胞因子和代谢微环境抑制CAR-T细胞功能。血管内皮生长因子(VEGF)在肿瘤新生血管中起着至关重要的作用。最近发现VEGF几乎可以影响免疫系统的各个方面，导致抗肿瘤免疫的抑制。此外，转化生长因子β（TGF-β）、IL-4、IL-10等也会使得T细胞功能障碍，促进免疫抑制细胞的浸润。许多策略已经存在并用在TME下促进CAR-T的治疗，例如将CAR T疗法与ICIs或其他免疫刺激疗法相结合，使CAR T细胞对免疫抑制细胞因子不敏感。抗原逃逸T细胞发挥抗癌活性，抗原丢失和下调是治疗失败的重要机制。尽管有很高的初始缓解率，但7~25%的患者接受靶向CD19的CAR-T治疗后， CD19表达减少的恶性肿瘤复发。靶向两种不同抗原的CAR-T构建或连续的CAR-T治疗正在积极地进行，以尽量减少抗原逃逸和下调。CAR-T细胞扩增和持久性不足除了靶向抗原的逃逸， CAR-T细胞扩张和体内持续存在被认为是长期缓解的关键。特别是那些需要长期治疗的恶性肿瘤，如ALL。对于其他恶性肿瘤，如非霍奇金淋巴瘤，短时间的强化化疗无需巩固和维持治疗就足以诱导缓解。在后一种情况下，尽管CAR-T细胞未被检测到， B细胞在抗cd19CAR-T治疗后恢复，但完全缓解持续存在。缺乏CAR- T细胞持久性可能与宿主对CAR-T细胞的抗转基因免疫反应有关。在这种情况下，基于氟达拉滨的淋巴消耗状态治疗可以减少抗转基因免疫反应，改善CAR-T细胞的扩张和持久性，并增强CAR- T细胞的疗效。更常见的是，CAR-T细胞扩增和持久性的缺乏是由直接与CAR-T细胞相关的因素引起的。人们设计和研究了各种策略来增强CAR-T细胞的扩展和持久性:CAR-T细胞构建、亲本T细胞选择、 T细胞培养条件、药物操作、修饰CAR-T基因表达和代谢、逆转T细胞衰竭、促进记忆表型发展等。关于CAR-T结构，大多数临床测试和FDA批准的CAR-T细胞产品含有CD3ζ一个共刺激域，通常是CD28或4-1BB。临床前研究和一些临床观察表明，共刺激结构域可以影响CAR-T细胞的表型和体内持续时间， 4-1BB结构域持续时间更长，为168天。而CD28为基础的CAR-T细胞治疗约持续30天。体外培养、激活和扩增不仅能引导T细胞转导CAR-T基因，扩大到产生足够的CAR-T细胞用于临床应用，而且对维持CAR-T功能和输注后的持久性也至关重要。体外培养导致T细胞终末分化，倾向于激活诱导细胞死亡(AICD)和衰竭，可影响体内扩张和持久性。优化培养条件可促进记忆型CAR-T细胞的发育和体内扩展和持久性。全身毒性CAR-T细胞治疗有很高的反应率，特别是在耐药或者难治的疾病中，但也与较高的副作用率相关。全身细胞因子毒性发生在急性期，当CAR-T细胞被激活并释放细胞因子作为CAR-T细胞与抗原结合的生理反应。所有有效的CAR-T治疗都观察到严重甚至致命的影响。对于大多数患者，它表现为与发热、低血压、缺氧和与高水平炎症细胞因子相关的多器官衰竭相关的CRS。一些患者也可发展为免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)。ICANS具有明显的神经学表现，继发于脑脊液细胞因子水平升高和血脑屏障破坏，表现为失语症、精神状态改变、震颤、癫痫和头痛。各种方法已经被采用，其中一些已经转化为临床应用。糖皮质激素和抗白细胞介素-6 (IL-6)抗体西妥昔单抗是最常用的药物干预。其他几种方法正在积极探索以控制或改善全身细胞因子的毒性，如根据肿瘤负荷量身定制CAR-T细胞剂量，修改CAR-T构建，在CAR-T细胞中加入关闭开关或自杀基因。在CAR-T细胞治疗后，偶尔会发生噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)/巨噬细胞活化综合征(MAS)。基于一项多中心调查，大约3.5%(7/201例)的患者接受CAR-T细胞治疗后发生HLH/MAS。主要临床表现为发热、肝脾肿大、肝功能异常、血细胞减少、高脂血症铁蛋白水平，高甘油三酯血症和低纤维蛋白原血症。有时表现与CRS相似。HLH/MAS有几种诊断标准以HLH2004为临床最常用。以皮质类固醇为基础的免疫抑制治疗是主要的治疗方法，但仍有较高的死亡率。CAR-T细胞治疗实体肿瘤的特殊考虑目前，超过70%的CAR-T细胞临床试验集中于血液恶性肿瘤，超过40%的CAR-T细胞治疗CD19，而不到30%的CAR-T细胞治疗实体肿瘤。CAR-T在实体肿瘤中的治疗遇到了上述所有的挑战。在设计实体肿瘤的CAR-T治疗时需要特别考虑。首先，靶抗原的选择至关重要。目标抗原列表和一些临床试验实例可以在之前的综述中找到，并正在扩大。在CAR-T治疗中，理想的目标抗原是那些仅表达在恶性细胞上的肿瘤特异性抗原。事实上，除了癌症新抗原和可能的表皮生长因子受体变异III(EGFRvIII)，几乎所有其他在实体肿瘤CAR-T治疗中使用的抗原都是由正常细胞共享的。在血液系统恶性肿瘤中靶向非癌症特异性抗原的主要优势是:1)在正常细胞被破坏的情况下存在挽救性补救，如图所示，免疫球蛋白补充靶向B细胞标记物的CAR-T治疗(CD19和BCMA);2)细胞更新快，有新的细胞来补充。因此，在血液系统恶性肿瘤的靶内，肿瘤外的副作用通常是可控的。相反，在实体肿瘤中靶向肿瘤相关抗原(TAAs)通常与更显著的副作用相关，因为通常难以修复实体器官中正常细胞的肿瘤外损伤。已经设计了几种策略来解决实体肿瘤和血液病中肿瘤特异性抗原的缺乏。一种是将主要和共刺激信号域分成两种不同的CARs。因此，除非靶细胞同时表达靶抗原，否则这些分裂细胞和CAR-T细胞不会被强烈激活。一个类似的分裂和方法是合成Notch(synNotch)受体系统，在该系统中，第一个目标抗原的结合触发CAR的表达， CAR的表达可以被附近表达第二个目标的细胞激活并杀死。另一种方法被称为非方法，如在分裂、通用和可编程（SUPRA）CAR系统中所见，在该系统中，CAR可以与TAA结合并激活CAR T细胞，但第二种抗原（通常是在正常细胞上表达的抗原）的存在可以竞争CARTAA结合，并阻止CART细胞激活。一些其他的方法也被探索过，比如微调CAR亲和力，以实现靶抗原过度表达的癌症细胞而非低抗原表达的正常细胞激活CAR T细胞，靶向癌症细胞中异常糖基化，并使用靶向癌症新抗原的T细胞受体。在实体肿瘤的CAR-T治疗中，抗原异质性也是一个需要考虑的关键因素。在FDA批准的CAR-T疗法中，靶向抗原CD19和BCMA是在恶性细胞的干细胞中表达的发育性生物标记物。在实体肿瘤中，这种发育性抗原/生物标志物与正常细胞共享，因此，针对这些抗原可能导致严重的靶向性、非肿瘤毒性。对于非发育性生物标志物，异质性表达在癌细胞中很常见。为了克服靶抗原的异质性，人们提出了双特异性或多特异性CAR，其中一个CAR可以识别多个靶抗原。另一种方法是将几个靶向不同抗原的CARs导入相同的T细胞中。在这两种方法中，靶向性和非肿瘤性都是一个主要问题，因为很少有肿瘤特异性抗原存在。CAR-T细胞浸润肿瘤和保留细胞毒性是实体肿瘤的主要障碍。在CAR-T细胞直接与靶细胞接触的白血病或淋巴细胞在淋巴器官中正常流动和积聚免疫反应的淋巴瘤中，这两个障碍就不那么重要了。目前正在探索几种增强CAR-T细胞在实体肿瘤中的活性的方法。一种方法是增强CAR-T功能，并添加分子武装这些细胞以增强抗肿瘤活性。例如，用趋化因子受体武装CAR-T细胞可以通过上调目标趋化因子来增强T细胞向肿瘤的浸润。TGF-β 是TME抗癌免疫的主要负调控因子。在CAR T细胞中敲除TGF-β 可以增强其抗癌活性。然而，一种更常见的方法是将CAR-T细胞与另一种药物结合，以克服障碍并提高疗效。有人提出了一种基于药理学的抗癌药物排名，这可能会指导免疫疗法联合的发展。CAR NK细胞解决与CAR T治疗相关的未满足需求NK细胞是先天免疫系统的一组细胞毒性淋巴细胞，可以对非自身细胞产生快速反应。与识别MHC上呈递的抗原的T细胞不同，NK细胞可以在没有MHC的情况下直接识别靶细胞。事实上，MHC与NK细胞上的杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）结合，抑制NK细胞的功能。此外，与可以释放炎症细胞因子并导致CRS和神经毒性的CAR T细胞的参与和激活不同，NK细胞具有不同的细胞因子谱。因此，目前正在积极探索NK细胞作为过继细胞治疗的替代方法(表2)。表2 CAR T，NK和巨噬细胞的比较CAR-NK细胞相对于CAR-T细胞的一个主要优势是免疫细胞的来源。由于同种异体反应性和移植物抗宿主病(GVHD)， CAR-T治疗需要使用自体T细胞。由于这些患者通常在接受CAR-T治疗之前接受了大量治疗，他们中的许多人在外周血中T细胞计数较低。因此，获因此，采集足够的自体T细胞会显著延迟治疗，有时不可能采集足够的细胞用于CAR T制备。在一项研究中，22.5%(16/71)的患者使用低于目标的CD3+ T细胞的自体淋巴细胞来生产CAR-T细胞。冗长而繁琐的CAR-T制造过程使得更多的患者要么不适合治疗，要么在参与治疗过程后出现疾病进展。例如，在导致FDA批准的ALL的tisagenlecucel的I期试验中， 83名患者中只有54名患者接受了CAR-T细胞输注， 9名患者在治疗前病情进展或死亡， 15名患者接受了其他治疗。由于NK细胞不通过MHC途径激活，并且降低了异源反应的风险， CAR-NK细胞的制造不需要自体NK细胞。它可以使用现有的NK92细胞系、脐带血和诱导多能干细胞(iPSCs)。事实上，有5项临床试验使用NK-92细胞系在人类患者身上进行。在一项使用脐带血开发的HLA-不匹配CAR-NK疗法的试验中，11例患者中没有一例出现GVHD。因此，CAR-NK治疗的一个主要优势是，“现货的”准备使用的CAR-NK细胞可以通过批量生产生产，并在任何时候注入患者。CAR-NK治疗相对于CAR-T治疗的第二个主要优势在CRS和神经毒性。CAR-T细胞激活导致大量炎症细胞因子的释放，导致CRS和神经毒性。在使用tisagenlecucel治疗ALL的I期试验中，85%(45/53)的患者发生了3级或以上毒性的CRS，26%(14/53)的患者发生了3级或以上毒性， 41.5%的患者发生了3级或以上神经毒性。其他CAR-T治疗也观察到类似的毒性。在11例使用来自脐带血的HLA未配对的 anti-CD19 CARNK细胞治疗的患者中，没有一例出现CRS或神经毒性。CAR-T和NK细胞之间这两种毒性的差异可能是由于细胞激活时释放的细胞因子的差异。CAR-T细胞的活化导致炎症细胞因子的释放，如肿瘤坏死因子α，IL-1β，IL-2和IL-6等，而接受CAR-NK治疗的患者这些炎症细胞因子并没有增加。CAR-NK细胞释放不同类型的细胞因子，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。第三，除了CAR途径外， NK细胞还有多种靶向和消灭癌细胞的机制(图2)。NK细胞是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性的关键媒介，NK细胞表达的CD16能够识别IgG结合在肿瘤细胞上的Fc部分并杀死癌细胞。此外， NK细胞可以激活，通过接触和/或脱离癌细胞在细胞表面激活和抑制杀伤igg样受体(KIRs)。激活型和抑制性KIRs分别通过ITAMs(免疫受体酪氨酸基激活基序)和ITIMs(免疫受体酪氨酸基抑制基序)传递信号。应激细胞和癌细胞下调MHCI类表达并脱离抑制性KIRs，或上调应激诱导的分子，如MICA/MICB (MHCI类链相关蛋白A/B)，激活KIRs，使得NK细胞的激活以杀死目标细胞。第四， NK细胞的寿命有限。NK细胞的平均寿命约为2周。这意味着，在靶向非肿瘤毒性发生的情况下，它可以随着CAR的消失而自我限制。然而，这也创造了一把双刃剑，反复输注CAR-NK细胞可能需要延长缓解期。CAR结构的比较到目前为止，大多数CAR-NK细胞研究使用的CAR-T细胞使用的相同的CAR-T细胞结构，具有与第一代CAR-T细胞相同的细胞内CD3ζ域，或CD3ζ加一个共刺激域4-1BB，与第二代CAR-T细胞使用的一样(图1)。添加4-1BB共刺激域显著改善NK细胞激活，细胞毒性和细胞因子的产生，如干扰素-γ 和粒细胞-巨噬细胞集中性刺激因子。由于NK细胞有自己相互关连的激活和抑制受体来控制NK细胞的激活和细胞毒性，因此有人提出，利用NK细胞特异性的细胞内信号域，如适配器分子DAP10或含ITAM的信号域，如DAP12和2B4，可以提高细胞毒性。2B4属于信号淋巴细胞活化分子(SLAM)家族受体，通过SLAM相关蛋白(SAP)在NK细胞中转导活化信号。2B4与CD48结合在靶细胞上诱导NK细胞活化，增加细胞毒性和干扰素-γ产生。与含有4-1BB-CD3ζ 的CAR-NK细胞相比，含有2B4- CD3ζ的CAR-NK细胞具有更好的细胞毒性、干扰素γ的产生和体内抗肿瘤功效。为了进一步优化NK细胞CAR-T的构建，Li等人将一个CAR-T细胞构建与九个不同的CAR-NK细胞进行了比较，这些细胞包含四个不同的跨膜结构域和不同的细胞内信号域，并靶向相同的间皮素抗原。CAR-NK细胞包含NKG2D跨膜结构域， 2B4共刺激结构域和CD3ζ 信号域，表现出强烈的抗原特异性细胞毒性。CAR-NK细胞由携带该构建物的人iPSC发展而来，具有典型的NK细胞表型，具有显著的抗肿瘤活性，并延长了在体内的生存时间。CAR-NK细胞治疗的现状到目前为止，至少有24个CAR-NK细胞的临床试验已经计划或正在进行中。恶性肿瘤、靶抗原和临床试验信息见表3和补充信息1。这些临床试验均处于I/II期试验阶段。使用“嵌合”和“NK”这两个关键词， PubMed仅确定了一项临床试验(表4)。Liu等人发表了一项针对cd19阳性淋巴类肿瘤的CAR-NK细胞I期临床试验。在这个试验中，一个类似的CAR-T细胞结构被用来建立CAR-NK细胞与抗cd19单链抗体抗原结合的细胞外域和CD3ζ 作为细胞内信号域。此外， CAR-NK细胞表达白细胞介素-15以增强CAR-NK细胞在体内的扩张，而rimiducid诱导的caspase-9作为一种安全措施，在发生严重不良事件时可触发CAR-NK细胞凋亡。11名b淋巴恶性肿瘤患者被纳入试验。这些患者在入组前接受了四种治疗线的中位数。CAR-NK细胞来自部分HLA匹配的脐带血标本(前9例患者)或没有考虑HLA匹配的脐带血标本。11例患者均未出现CRS、神经毒性、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症或移植物抗宿主病。在这些患者中没有观察到炎症细胞因子的增加。11例患者中有8例(73%)获得客观缓解，包括7例CRs(3例CLL和4例淋巴瘤)， 1例CLL Richter's转化患者的高级别淋巴瘤完全缓解。CAR-NK细胞可以持续至少12个月。表3 CAR NK细胞的临床试验表4 一期靶向CD19的CAR NK的临床试验总结CAR-NK细胞的局限性虽然CAR-NK细胞治疗比CAR-T细胞治疗的优势是显而易见的，正如上面讨论的，显著的局限性也存在。几乎所有与CAR-T治疗相关的限制也适用于CAR-NK细胞，从目标抗原选择，抗原异质性， CAR-T设计，制造到输注后挑战，如NK细胞迁移到肿瘤部位，敌对的肿瘤微环境。目前正在进行积极的研究，以改善CAR-NK的制造和储存，特别是“现成的”CAR-NK细胞，优化CAR-NK的结构，以增加CAR-NK渗透到肿瘤中，并保持免疫抑制TME的细胞毒性，并最大限度地减少靶向性和非肿瘤毒性。此外， NK细胞的半衰期较短(< 10天)，这是CAR-NK治疗中的一把双刃剑。这在发生严重毒性的情况下具有优势，但也产生了一个挑战，可能需要反复给药，以实现持久的反应。重新编程CAR-NK细胞，使其具有记忆细胞特性，并在体内长期存活，以进行持续的免疫监测和预防癌症复发是目前一个积极探索的领域。此外，与T细胞相似， NK细胞在细胞表面同时具有活化和抑制KIRs。有核细胞上普遍表达的MHC分子可抑制NK细胞功能。CAR-巨噬细胞来解决与CAR-T和CAR-NK治疗相关的未被满足的需求CAR-T治疗已经在血液系统恶性肿瘤中取得了很高的成功，但它还没有在实体肿瘤中取得成果，即使具有很强的临床前研究。血液病和实体恶性肿瘤之间存在着一些明显的区别。例如，在B细胞恶性肿瘤中观察到的CD19在实体肿瘤中存在罕见的靶抗原。这种显著的差异也可能是继发于血液肿瘤和实体肿瘤之间潜在的生理差异。当考虑癌症免疫周期时， CAR-T细胞绕过了该周期的前三个步骤:癌症抗原释放和呈现， T细胞启动和激活。然而， CAR-T细胞的有效性仍然受抗癌免疫的最后四个步骤的控制，即T细胞转移(步骤4)和渗透(步骤5)到肿瘤，识别(步骤6)和杀死肿瘤(步骤7)。如上所述，这四个步骤为T细胞创造了巨大的障碍。例如，许多实体瘤是免疫“冷”瘤，免疫细胞很少渗入TME。由于TME具有免疫抑制作用，即使在那些有显著免疫细胞浸润的癌症中，免疫细胞也不能消灭癌细胞。尽管CAR-NK细胞相对于CAR-T细胞有一些优势，但与CAR-T细胞相关的大多数障碍也适用于CAR-NK细胞。NK细胞通常不是TME中主要的免疫细胞群。武装CAR-NK细胞可以解决一些障碍。例如，在CAR-NK细胞中加入IL-15可以显著增强CAR-NK细胞在体内的扩张和持久性，提高小鼠模型的抗肿瘤活性和总生存期。由于迄今为止只有一项I期临床试验报道，尚不清楚用细胞因子武装CAR-NK细胞是否可以推广到其他恶性肿瘤。NK细胞一旦进入肿瘤部位，具有免疫抑制作用的TME可以抑制NK细胞的功能。由于与CAR-T和CAR-NK细胞治疗相关的障碍，最近CAR-巨噬细胞已经成为一种替代疗法。CAR巨噬细胞和CAR-T细胞有许多共同的特点和障碍，如特异性抗原的需求，抗原逃逸和下调，以及全身细胞因子的毒性。然而， CAR巨噬细胞在实体肿瘤的其他两个主要障碍上比CAR-T细胞具有独特的优势:免疫细胞贩运和渗透到TME，以及免疫抑制TME(表2)。由于免疫细胞向TME转运和浸润，巨噬细胞在许多肿瘤中大量存在，而T细胞浸润较差。新鲜冷冻肿瘤切片显示，巨噬细胞在许多癌症类型中占肿瘤浸润细胞的大多数，在黑素瘤、肾细胞癌和结直肠癌中高达50%。TME巨噬细胞的浸润是继发于肿瘤部位分泌的许多细胞因子。缺氧诱导肿瘤细胞和间质产生细胞因子，如CCL2 (C-C motif chemokine ligand 2)、 CXCL12 (CX-C motif chemokine ligand 12)、 CSF1 (ColonyStimulating Factor 1)和VEGF招募巨噬细胞。一旦被募集到缺氧的TME中，这些可溶性因子的受体就会被下调，从而将巨噬细胞锁定在TME中。此外，巨噬细胞可以直接感知缺氧状态及其代谢产物，如低pH，并迁移到TME中。TME的另一个特点是免疫抑制微环境，这对T细胞来说是一个主要障碍，而对巨噬细胞来说则不是。由于这种环境，渗透到肿瘤部位的T细胞往往发展衰竭表型，有时不能被免疫检查点抑制剂逆转。巨噬细胞的情况可能并非如此。巨噬细胞大致分为两大类，经典活化的促炎M1巨噬细胞和交替活化的抗炎M2巨噬细胞。TAMs，尤其是M2 TAMs，被广泛认为是TME的中枢免疫抑制细胞群之一。甚至M2巨噬细胞虽然抑制了其他免疫细胞的功能，但仍具有吞噬功能。事实上， M2巨噬细胞比M1巨噬细胞具有更高的吞噬能力。此外，巨噬细胞具有较高程度的表型可塑性，可以对环境刺激作出反应，改变表型。CAR巨噬细胞中的CAR结构CAR -T细胞中的CAR-巨噬细胞具有与CAR-T细胞相同的结构，具有细胞外抗原结合域、铰链区、跨膜域和细胞内域(图1)。它们在细胞内信号域上有所不同。CAR-T巨噬细胞可以直接使用CD3ζ 胞内区域，就像CAR-T细胞使用的那样，CAR-T细胞包含基于免疫受体酪氨酸的激活基模(ITAMs]。在CAR-T细胞中， ITAMs在CAR结合时被Src家族激酶磷酸化，与串联的SH2 (tSH2)激酶ZAP70结合，并激活CAR-T细胞发挥细胞杀伤作用。巨噬细胞不表达ZAP70。它们表达另一种含有tSH2结构域的激酶Syk，可以结合CD3ζ并在巨噬细胞中转导吞噬信号。除了CD3ζ，其他含有itam的细胞内结构域，如Fc受体的γ亚基(FcRγ )和多个表皮生长因子样结构域蛋白10(Megf10)，也被使用，并可诱导类似CD3ζ 的吞噬作用。FcRγ 转化巨噬细胞中抗体依赖细胞吞噬(ADCP)的典型信号转导。Megf10在巨噬细胞吞噬凋亡细胞中发挥着重要作用。与第二代和第三代CAR-T细胞相似，一个额外的信号域增强了吞噬作用。含有CD3结构域而没有共刺激结构域的CAR-T细胞，正如第一代CAR-T细胞所见，其体内活性有限。因此，所有FDA批准的CAR-T产品都包含一个共刺激的细胞内结构域，要么是CD28，要么是4-1 BB(表1)。在CAR-巨噬细胞中也观察到类似的结果。此前有报道称，磷脂肌醇3-激酶(PI3K)信号通路对大颗粒吞噬作用十分重要。CD19 PI3K招募域与CAR -FcRγ 的串联融合使目标全细胞的吞噬能力增加了三倍。CAR-巨噬细胞的现状到目前为止， CAR-巨噬细胞研究主要处于临床前阶段，一项I期试验正在进行中，该试验使用自体CAR-巨噬细胞靶向HER2过表达的实体肿瘤(表5)。Morrissey等人系统分析了可用于构建靶向CAR-巨噬细胞的CD19-和CD22-的胞内结构域。CAR-巨噬细胞含有任何含有ITAM的细胞内结构域，CD3ζ，FcRγ或Megf10，具有相当的吞噬效率，而含有Bai1和MerTK细胞内结构域的CAR-巨噬细胞不能结合到目标珠。大多数CAR-巨噬细胞只内在化目标细胞的碎片，类似于trogocytosis或啃噬活细胞的现象。全细胞吞噬少见。阻断“don’t eat me”信号CD47或CAR的抗体含有FcRγ-PI3Kk招募域，增强了整个细胞的吞噬作用，但在孵育4-8小时后，仍只有不到10%的巨噬细胞包含整个细胞。Klichinsky等人报道了CD3ζ-based anti-HER2 CAR-巨噬细胞的产生和表征。在本研究中，一个复制无能腺病毒载体被用来高效和可复制地将CAR传递到巨噬细胞。腺病毒感染诱导CAR-巨噬细胞M1分化，并使TME向促炎状态倾斜，而不是与大多数肿瘤相关的抗炎M2状态。此外，腺病毒转导的CAR-巨噬细胞作为专业的抗原呈递细胞，除了靶向抗原外，可以交叉呈递肿瘤来源的抗原，从而更有效地激活T细胞。与这些体外发现一致，这些CAR-巨噬细胞显著延长了携带肿瘤植入物的小鼠的生存时间，并减少了肺转移。L.Zhang等人报道的一项研究通过诱导多能干细胞(iPSCs)来源的CAR-巨噬细胞解决了生物工程巨噬细胞用于癌症免疫治疗的低效问题。在本研究中，利用非整合的episomal载体编码重编程因子来诱导iPSC克隆。然后含有CD86和FcRγ 细胞内结构域的CAR被转导到iPSC诱导的巨噬细胞中。这些iPSC衍生的CAR-iMACs巨噬细胞(CARiMACs)具有M2表型。然而，在与目标细胞相遇时，这些CARiMACs可以吞噬目标癌细胞，并向促炎M1状态倾斜。体内研究表明， CARiMACs可以扩展、持久并发挥其抗肿瘤活性。W.Zhang等人利用CAR-巨噬细胞来解决细胞外基质(ECM)引起的肿瘤免疫细胞浸润不足。ECM为T细胞渗透到肿瘤部位并发挥其抗癌免疫功能创造了一个物理屏障。CAR-T细胞靶向癌症相关的成纤维细胞或基质降解酶，肝素酶，可以促进免疫细胞浸润和增强抗癌免疫。在Zhang的CAR-巨噬细胞中，靶向HER2的scFv是结合到铰链区域和CD147跨膜和细胞内结构域，生成CAR-147巨噬细胞。CD147通过基质金属蛋白酶（MMPs)的表达对ECM重构至关重要。由于CD147不转导吞噬信号， CAR-巨噬细胞与靶细胞的结合显著上调了某些MMPs的表达，但不影响其他巨噬细胞功能，如吞噬、活性氧(ROS)的产生和炎症细胞因子的分泌。与体外实验结果一致， CAR-147巨噬细胞上调少量MMPs的表达，显著降低肿瘤中胶原含量，诱导CD3+ T细胞浸润，抑制肿瘤生长。Niu等人报道了一项使用CAR-巨噬细胞靶向表达ccr7的免疫抑制细胞进行癌症免疫治疗的研究。这个组以前发现脂滴高-(LDhi)免疫抑制细胞表达cc趋化因子受体7(CCR7)，在肿瘤组织中积累，抑制抗癌免疫。因此， CAR巨噬细胞被设计表达CCR7自然配体CCL19 (C-C Motif Chemokine ligand19)作为细胞外结构域，以靶向表达CCR7的免疫抑制细胞。为了开发一个最佳的CAR结构，我们使用并比较了以下细胞内结构域:TLR2, TLR4, TLR6,MerTK，或经典的CAR- t激活域，4-1BBCD3ζ。含有MerTK或CAR-m(MerTK)的CAR-巨噬细胞在体外具有最强的吞噬和细胞杀伤活性。由于CCR7也在毛囊和肠绒毛中表达，当使用大剂量CAR-M(MerTK)时，观察到靶向非肿瘤毒性。低剂量时，能诱导CD3+T细胞向肿瘤浸润，增加促炎细胞因子的产生，抑制肿瘤生长，延长总生存期，减少转移，且毒性小。表5 近期CAR-巨噬细胞研究CAR-巨噬细胞的临床发展现状进展到目前为止，只有一项CAR-巨噬细胞的I期临床试验(Clinicaltrials.gov标识号:NCT04660929)。如上文所述，本临床试验是基于Klichinsky等人开发的CAR-巨噬细胞。本试验使用嵌合腺病毒载体Ad5f35修饰的CAR-巨噬细胞，并携带靶向HER2的单链抗体。腺病毒感染诱导巨噬细胞分化为促炎性M1样表型。该临床试验于2021年2月开始。到目前为止，还没有报告结果。第二项CAR-巨噬细胞研究也被注册(Clinicaltrials.gov标号:NCT05007379)。这是不是临床试验。本研究是一项观察性研究，目的是确定CAR-巨噬细胞在来自100名患者的患者源性类器官中的抗肿瘤活性。CAR-巨噬细胞的局限性CAR-巨噬细胞仍处于初期阶段，仅启动了一项临床试验，尚无结果报道。因此，许多限制还有待揭示。类似于CAR-T和NK细胞，CAR-巨噬细胞将需要经过7个步骤沿着癌症免疫周期来实现细胞毒性作用。巨大的努力正在优化CAR-巨噬细胞的结构，制造，储存，肿瘤浸润，和保留细胞毒性在TME。重复给药可能需要维持足够的CAR-巨噬细胞水平，以进行积极的癌症监测。使用巨噬细胞进行ACT治疗的一个主要优点是它有向肿瘤迁移和浸润的倾向。随着促炎型M1和抗免疫型M2表型间分化的可塑性，巨噬细胞向肿瘤的高浸润和向M2表型分化可促进肿瘤的生长和转移。M1表型的分化和保留正在研究中。结论综上所述， ACT联合CAR-T治疗已取得了较好的疗效迄今为止， FDA批准的5种CAR-T疗法在血液系统恶性肿瘤方面取得了巨大进展。实体肿瘤的CAR-T治疗由于缺乏癌症特异性抗原、 CAR-T细胞迁移到肿瘤部位的效率低、免疫抑制TME等原因而滞后。CAR-NK细胞也被研究并转化为临床试验。CAR-NK细胞有几个优点。有限的NK细胞寿命意味着更低的靶向/非肿瘤毒性风险;NK细胞释放的不同细胞因子谱降低了细胞因子释放综合征和神经毒性的风险；和降低的异源反应性的风险，允许使用NK细胞系生成现成的异源CAR-NK细胞。巨噬细胞是TME主要的浸润细胞之一。即使是免疫抑制的M2巨噬细胞也具有很强的吞噬活性。最近， CAR-巨噬细胞正在被探索作为一种替代方法的ACT。一项针对HER2表达实体肿瘤的CAR-巨噬细胞的临床试验正在进行中，临床前研究已经显示出有希望的抗肿瘤活性。未来的CAR-巨噬细胞治疗仍然需要克服CAR-T治疗遇到的一些其他障碍。由于肿瘤相关的巨噬细胞是TME的主要细胞类型和主要的免疫调节因子，因此开发CAR是一个主要的研究方向巨噬细胞不仅是一种吞噬机制，更重要的是，它是一种抗原呈递剂、TME修饰剂和免疫刺激剂，以促进抗肿瘤免疫。由生物制品圈&抗体圈主办的“2023生物制品工艺发展大会”将于9月22-23日在上海举办，本次大会将主要聚焦生物制品前沿技术、CMC、生产、工艺等热点话题进行探讨交流，涉及人用疫苗、兽用疫苗、抗体药、细胞治疗、基因治疗等生物制品领域。届时将邀请生物制品领域经验权威的专家进行报告，欢迎各界同仁参会学习交流。1.会议名称：2023生物制品工艺发展大会2.会议时间：2023年9月22-23日（周五、周六）3.会议地点：上海（酒店定向通知）4.主办单位：生物制品圈、抗体圈5.媒体支持：药时空、药创客、细胞基因研究圈6.报名方式及费用：扫描识别下方二维码进行报名登记。转发分享福利：生物医药研发企业、科研院校和监管机构人员，前100位报名人员转发分享至朋友圈本通知可免费参会（不含餐饮）报名后，加微信13585867695发截图给工作人员即可。组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。各类商务合作咨询：13585867695（同微信）大会日程识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。