Tisagenlecleucel

摘要：基于动物细胞的表达平台能够生产复杂的生物分子，如重组蛋白和病毒载体。尽管大多数生物治疗药物是在动物细胞系中生产的，但在人类细胞系中的生产也在扩展。使用人类细胞系的一个重要优势是，由此产生的生物治疗药物更有可能携带更多“类人”的翻译后修饰。在人类细胞系中，由于其高转染性、快速生长速率以及在无血清悬浮培养中生长的能力，HEK293细胞被广泛利用。在这篇综述中，我们讨论了HEK293细胞及其亚型在生产生物治疗药物中的使用。我们还比较了它们与其他常用宿主细胞系在每类生物治疗药物中的使用情况，并总结了影响宿主细胞系选择的因素。 1. 引言 复杂生物制药产品的生产在很大程度上依赖于哺乳动物细胞系，其中大部分治疗性生物制药是在中华仓鼠卵巢（CHO）细胞中生产的。使用哺乳动物生产细胞可以实现具有复杂翻译后修饰（PTMs）的生物制品的生产。抗体、生长因子和凝血因子等复杂生物制品需要复杂的PTMs来确保产品的稳定性和效力。然而，并非所有生物制药产品都能在CHO中生产。由于CHO无法满足某些PTMs的要求，一些重组蛋白是在HEK293中生产的，而且大多数治疗性病毒载体也是在HEK293中生产的。自2015年以来，已有七种基于HEK的产品获得FDA批准（表1）。 表1 | 2015年以来在HEK293中生产的FDA批准的生物制品 其中，有六种是细胞和基因疗法（Mullard，2016，Mullard，2017；Mullard，2018；Mullard，2019；Mullard，2020；Mullard，2021），在这些疗法中，HEK293细胞系或其衍生物被用于病毒载体的生产。随着越来越多的细胞和基因疗法正在开发中，我们将看到HEK293在病毒载体生产中的使用相应增长。 2. HEK293细胞及其衍生物 HEK293细胞系是通过将人类胚胎肾细胞与剪切的腺病毒5型DNA进行转化而建立的。自那时以来，已经建立了许多亚型和衍生物，其中HEK293、HEK293-T和HEK293-F经常用于生物制药的生产。HEK293-T是HEK293细胞系的衍生物，通过表达温度敏感的SV40 T抗原突变体而建立。T抗原的表达允许携带SV40复制起点的质粒在转染到细胞时复制。HEK293-F细胞是GIBCO®品牌的细胞，从HEK293克隆而来，并适应了无血清介质中的悬浮培养。在重组蛋白生产中常用的其他值得注意的HEK293衍生物包括HEK293-E和HEK293-6E。通过表达Epstein-Barr核抗原1（EBNA-1），建立了HEK293-E，这允许具有oriP的质粒进行染色体外复制。类似地，通过表达缺少Gly-Gly-Ala域的截断EBNA-1，建立了HEK293-6E细胞系。与HEK293-E相比，HEK293-6E显示出改善的瞬时基因表达和细胞生长。 3. 在HEK293中生产重组蛋白 真核表达系统用于生产具有复杂PTMs的复杂重组蛋白，以确保蛋白质的正确功能。使用HEK293宿主细胞消除了由于非人类PTMs存在而引起的潜在免疫原性问题。它的转染容易和相对较高的蛋白质生产力使其成为科学研究中小规模生产重组蛋白的受欢迎选择，并且它适应悬浮无血清培养的能力促进了它在大规模生物治疗药物生产中的使用。 由于转染容易，HEK293广泛用于瞬时基因表达（TGE）。可以通过使用如磷酸钙或聚乙烯亚胺（PEI）等现成的试剂转染HEK293，快速生产重组蛋白。这种转染过程已在搅拌槽生物反应器中得到证明，并且是实验室到临床前使用快速生产重组蛋白的好方法。HEK293E和HEK293-6E在TGE中广泛使用，因为使用具有Epstein-Barr病毒oriP的质粒显著改善了TGE。然而，TGE在重组蛋白生产中的主要缺点是需要大量的转染级质粒DNA。 稳定生产细胞系被优先用于重组蛋白的大规模生产。最新的HEK生产的重组蛋白治疗药物NUWIQ®是在HEK293F细胞中生产的。NUWIQ®是一种重组凝血因子VIII（FVIII）。它通过将B域删除的人类FVIII表达构建物转染HEK293F细胞而生产。选择稳定转染体后，选择表现出最佳生产的克隆用于使用。 可以通过基因扩增技术增加生产细胞系中的蛋白质产量。在HEK293细胞中已经证明了使用谷氨酰胺合成酶（GS）介导的基因扩增和选择系统，这可以提高重组蛋白的产量。通过将重组人促红细胞生成素与谷氨酰胺合成酶在双顺反子载体中结合，经过甲硫氨酸亚砜（GS抑制剂）的顺序增加后，促红细胞生成素的表达显著提高。基因扩增技术的应用可以扩大人类细胞系，如HEK293在治疗性重组蛋白生产中的使用。 3.1. HEK中重组蛋白生产的未来 宿主细胞对生产的生物治疗药物的糖基化谱有重大影响。在NUWIQ®的情况下，与CHO或BHK生产的rFVIII相比，HEK293生产的rFVIII表现出改善的功能和降低的免疫原性，因为它完全硫酸化，并且不含有抗原性的Neu5Gc或α-Gal表位。与CHO细胞相比，HEK293细胞在谷氨酸的γ-羧化和酪氨酸残基的硫酸化方面具有更大的能力。这些PTMs是分别对Drotrecogin alfa和重组因子IX等治疗性糖蛋白所必需的。 尽管由于特定的PTM要求，一些生物治疗药物仍在如HEK293的人类细胞系中生产，但大多数复杂的重组糖蛋白是在CHO中生产的。在生物制药行业中可用的哺乳动物表达平台中，中华仓鼠卵巢（CHO）细胞用于生产约70%的重组生物制品，特别是单克隆抗体。CHO细胞之所以广泛使用，是因为它们高产，能够在无血清、化学定义的细胞培养介质中悬浮培养。此外，CHO生产的重组蛋白携带类人PTMs，这改善了生物活性并由于缺少α-半乳糖表位而降低了免疫原性。 与HEK相比，CHO细胞不能完全复制人类糖结构。这是因为CHO细胞不表达在人类细胞系中表达的酶β-半乳糖苷α2,6-唾液酸转移酶、α1,3/4岩藻糖转移酶或β-1,4-N-乙酰葡萄糖胺转移酶III。此外，由于它们表达胞苷酸N-乙酰神经氨酸酸水解酶，CHO生产的糖蛋白带有潜在免疫原性的N-羟乙酰神经氨酸。由于具有理想糖基化谱的糖蛋白可以表现出更高的效力、稳定性、半衰期和降低的免疫原性，HEK293作为宿主细胞系的优势在于对生产的生物治疗药物特定糖基化谱的要求。CHO的这种限制可以通过工程改造细胞来克服，使其能够生产具有理想糖基化谱的糖蛋白。所需的和理想的糖基化谱可以通过表达在人类中发现的酶或敲除在人类中不存在的酶来工程改造。随着CHO细胞糖基工程的这些发展，我们预见到HEK293作为治疗性重组蛋白生产的宿主细胞的使用将进一步减少。 4. HEK293中病毒载体生产的前景 HEK293常用于病毒载体的生产。由于存在腺病毒E1A/B基因，它们在病毒载体生产期间提供辅助功能，因此被用于腺病毒和腺相关病毒载体的生产。在逆转录病毒载体生产中，由于细胞系中表达SV40大T抗原，因此使用HEK293T。T抗原的表达允许携带SV40复制起点的质粒在转染到细胞时进行复制。也有报道说，大T抗原的表达改善了慢病毒载体的生产。然而，HEK293T中病毒滴度的提高并不能完全归因于T抗原对质粒复制或转录活性的影响，这表明还有其他间接效应和细胞系的特性，这些特性能够实现高滴度逆转录病毒载体的生产。 早期的病毒载体生产是一个挑战，因为生产是通过在含血清的培养基中短暂转染贴壁HEK293细胞进行的。最近在短暂转染技术、细胞系和培养基开发方面的进步已经证明，可以在化学定义的细胞培养介质中使用无血清悬浮基础转染过程进行病毒载体生产。此外，已经建立了稳定的病毒载体生产细胞系。这些发展一起使得在HEK293细胞中可扩展地生产病毒载体。 4.1. 当前逆转录病毒载体生产技术 逆转录病毒载体是包膜的单链RNA病毒。在这类病毒中，基于小鼠白血病病毒的γ-逆转录病毒（γRV）和基于人类免疫缺陷病毒1型的慢病毒（LV）通常用于基因疗法。这些逆转录病毒根据其基因组组织被广泛分类为“简单”和“复杂”逆转录病毒。简单逆转录病毒包含两组不同的病毒RNA，其中病毒基因组RNA与mRNA不同。在复杂逆转录病毒中，病毒基因组RNA充当mRNA。 由于逆转录病毒载体能够转导广泛的细胞类型，因此是基因转移的最佳工具之一。逆转录病毒转导可以稳定地改变转导细胞，因为逆转录病毒RNA基因组被逆转录病毒逆转录酶转换为DNA后，可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中。由于LV载体表现出比γRV载体较少的有害整合特性，它们在基因疗法中更广泛地使用。γRV和LV都被用于生产嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法。自2017年以来，已有四种FDA批准的CAR-T疗法，包括Yescarta、Kymriah、Breyanzi和Abecma。 对于γRV和LV载体生产，已经开发了不同的包装系统，每一代的开发旨在减少复制能力病毒（RCV）的风险。在γRV生产中，由于病毒基因是非细胞毒性的，已经开发了包装细胞系以促进γRV生产。在第三代γRV包装细胞系中，gag-pro-pol基因和包膜蛋白在不同的表达载体中稳定表达。然后通过转染包装细胞系与单一载体构建体来实现γRV生产，该构建体携带感兴趣的转基因、Ψ包装信号和改良的长末端重复序列（LTR）物种，以进一步最小化RCV形成的风险。 LV基因的细胞毒性使得建立包装或生产细胞系具有挑战性。因此，四质粒短暂转染工作流程在LV载体生产中得到广泛利用。质粒携带：1）Gag-Pro-Pol，编码病毒结构蛋白和酶；2）Rev，表达对病毒基因组核输出至关重要的辅助蛋白；3）Env，编码与细胞受体结合以实现细胞进入的包膜糖蛋白；4）携带感兴趣基因的载体基因组。 逆转录病毒载体通常通过短暂转染贴壁HEK293T细胞生产。然而，从单层烧瓶中扩大生产是耗时的、劳动密集型的，并且需要大面积的工作空间进行细胞培养。为了提高过程的可扩展性，已经开发了几种无血清悬浮基础生产方法。悬浮基础生产方法在体积生产率方面与基于贴壁的生产方法相当（表2和3）。尽管在过程可扩展性方面有所改进，但逆转录病毒载体生产仍然具有挑战性。高质量转染级DNA和试剂的高成本以及批次间变异性和短生产周期导致了生产高滴度和一致性病毒载体的限制。 表2 | 不同γRV生产方法的比较 表3 | 不同LV生产方法的比较 4.1.1. 逆转录病毒载体生产的未来 为了提高γRV和LV生产的可扩展性，已经产生了稳定的生产细胞系。由包装细胞系开发的稳定、适应悬浮的生产商细胞系能够在无血清培养基中生产yRVs，已经开发出来以提高工艺可扩展性。随后，也开发了用于更安全、自灭活（SIN）yRVs的yRVs生产商细胞系。SIN载体最初是通过修改3个病毒LTR的U3序列开发的，这导致在转导细胞中整合时失去病毒增强子和启动子序列。这降低了RCV形成的风险，因为病毒启动子和增强子缺失，从而防止了载体的动员。此外，当与弱内部启动子结合使用以驱动感兴趣基因的表达时，可以降低遗传毒性风险。 由于所需基因的细胞毒性，开发稳定的LV生产细胞系具有挑战性。这可以通过使用细胞毒性较低的病毒蛋白酶突变体或包膜蛋白）或使用可诱导表达系统来克服。Tomás等人开发的LentiPro26稳定慢病毒载体生产细胞系，展示了在长达2个月的时间内稳定、持续的LV生产，同时保持与传统短暂转染基础生产方法相当的体积滴度。Chen等人证明，可以通过转染携带所有所需慢病毒载体组分的单一DNA构建体，快速生成稳定生产细胞系，将LentiPro26系统中生成和鉴定稳定生产克隆所需的时间从6个月缩短到大约4个月。在稳定的γRV和LV生产系统的进一步发展将提高γRV和LV的生产率，以满足这些载体在临床基因疗法应用中不断增长的需求。 4.2. 当前HEK中腺相关病毒生产的技术 腺相关病毒（AAV）是无包膜的单链DNA病毒，已被证明作为基因治疗载体的安全性和有效性。自2012年以来，已有三种批准的rAAV基因疗法，即Glybera、Luxturna和最近批准的Zolgensma。 重组AAV（rAAV）通常通过短暂转染含三个质粒的贴壁HEK293细胞生产，这三个质粒包含：1）腺病毒辅助因子，E4、E2a和VARNA；2）腺相关病毒rep和cap基因；3）由AAV ITR序列包围的货物基因。由于表达腺病毒E1a/b基因，这些基因对AAV生产至关重要，因此最常使用HEK293细胞进行rAAV生产。尽管HeLa细胞系在早期研究中被用于rAAV生产，但由于表达腺病毒病毒辅助基因E1A/B，提高了生产过程中的rAAV滴度，因此通常更倾向于基于HEK293的细胞系。 4.2.1. 基于辅助病毒的rAAV生产/HSV生产系统在HEK293中 rAAV也可以使用辅助病毒生产。野生型AAV需要与腺病毒共感染以进行有效的感染。早期的rAAV生产使用辅助病毒生产系统，通过感染携带AAV rep、cap和货物基因的重组辅助病毒来实现rAAV生产。通常使用两种重组病毒，一种携带rep和cap基因，另一种携带货物基因。这最小化了重组，从而降低了野生型AAV形成的风险。由于需要在纯化过程中将辅助病毒与rAAV分离，并需要证明纯化的缺乏复制能力的病毒，因此不偏爱使用基于辅助病毒的rAAV生产系统。 4.2.2. HEK293中rAAV生产技术的未来 尽管上述治疗的rAAV生产是在基于贴壁的系统中进行的，但最近也开发了基于悬浮的rAAV生产技术。已经在适应悬浮的HEK293细胞系中展示了rAAV生产，产量与现有的基于贴壁的生产系统相当（表4）。随着越来越多的悬浮基础方法被用于临床试验中rAAV治疗的生产，我们预见将从基于贴壁的生产方法转向更可扩展的基于悬浮的生产方法。 表4|不同rAAV生产方法的比较 为了提高rAAV生产的可扩展性，也已经开发了稳定的生产细胞系。CEVEC制药公司开发了ELEVECTA®生产细胞系，其中AAV生产基因在CEVEC的羊膜细胞生产（CAP）细胞中稳定表达，基因表达由可诱导启动子控制。只需诱导即可实现可扩展的rAAV生产，无需使用辅助病毒、转染试剂或质粒。 虽然rAAV通常在基于HEK293的系统中生产，但也开发了显示相当rAAV滴度的杆状病毒基系统。使用杆状病毒表达载体系统进行rAAV生产最初在2002年被描述，其中通过三种重组杆状病毒的共感染实现了rAAV生产，一个Rep-杆状病毒、一个Cap-杆状病毒和一个货物ITR杆状病毒，辅助功能由杆状病毒提供。 OneBac rAAV生产系统旨在通过将生产所需的重组杆状病毒数量从三个减少到一个来提高生产系统的可扩展性。这是通过生成稳定表达AAV rep和cap基因的Sf9细胞系实现的。这导致了一个更具可扩展性的生产系统，并且与基于HEK293的系统相比，滴度有所提高。 尽管所描述的系统展示了Sf9生产的和HEK293生产的rAAVs之间的类似功能，但最近的一项研究识别了两种系统生产的rAAVs之间的差异。在Sf9细胞中生产的rAAV衣壳与在HEK293中生产的衣壳相比，具有不同的翻译后修饰。在HEK293细胞中生产的rAAV基因组表现出增加载体效力的甲基化模式。尽管只测试了AAV1和AAV8血清型，但这表明由于改善的载体效力，更倾向于使用HEK293生产的rAAVs。除非未来评估的血清型显示Sf9生产的rAAVs可能具有改善的载体效力，否则将更倾向于在HEK293中生产rAAV。 4.3.腺病毒载体疫苗和溶瘤腺病毒的生产 腺病毒（AdV）是无包膜的双链DNA病毒。由于它们具有高基因组容量、高转导效率并且是非整合性的，具有高染色体外持久性，因此最初被用作基因治疗载体。然而，由于AdV基因转移后发生致命的全身炎症反应，它们在基因治疗中的适用性受到限制。尽管由于这一不幸事件，AdVs在基因治疗中的使用有所下降，但在期望引起免疫反应的应用中，AdVs的使用有所恢复。诱导强烈免疫反应的能力促进了传染病和癌症免疫疗法疫苗候选物的开发。AdV现在构成了临床试验中大部分病毒载体，其主要应用为疫苗或癌症疗法。 COVID-19大流行推动了腺病毒载体疫苗的快速发展及其最终的紧急使用。在世界卫生组织（截至2021年8月）批准用于紧急使用的三种腺病毒载体疫苗中，Ad5-nCOV和ChAdOX1-nCoV是在HEK293细胞中生产的，而Ad26.COV2-S是在PER.C6细胞中生产的。这些细胞被利用来生产AdV载体，因为需要在生产细胞系中转补病毒载体基因。 第一代AdV载体是通过用表达载体替换E1和/或E3区域生产的。E1基因产物对病毒生产是必要的，在HEK293或PER.C6等生产细胞系中跨补充。E3基因区域的产物对病毒复制并不重要，因此不需要补充。由于其他病毒蛋白的表达，第一代腺病毒载体引发免疫反应。在疫苗的情况下，引发的免疫反应特别有利。 随后的AdV载体涉及去除病毒基因以最小化这些载体在体内使用时引发的免疫反应。在第二代AdV载体中，已经灭活了额外的病毒复制所需基因。病毒生产是在表达E2和/或E4基因产物的细胞系中进行的。最后，在第三类“无病毒腺病毒”中，除了需要用于病毒DNA复制和包装的顺式作用DNA序列外，所有病毒基因都被去除了。对这些AdV生产系统的改进涉及减少序列同源性的修改，从而降低通过随机重组事件产生野生型AdV的风险或修改以最小化病毒传播期间的转基因表达以提高病毒生产。 4.3.1.其他腺相关病毒和腺病毒的生产系统 AdVs和AAVs的生产需要在HEK293细胞中跨补充腺病毒E1基因。然而，由于HEK293细胞是使用剪切的AdV基因组DNA产生的，E1基因携带与野生型AdV高度同源的DNA序列。在HEK293细胞中生产第一代E1缺失的腺病毒载体导致了带有E1序列的RCV的产生，这可能是由同源重组造成的。尽管使用了E1和E3缺失的腺病毒载体，但RCV的形成无法被消除。 为了减少同源性，使用定义的E1基因区域转化细胞系将减少在AdV生产期间通过随机重组事件产生野生型AdV的风险。PER.C6细胞系是通过将人类胚胎视网膜细胞与腺病毒5型E1基因的定义区域转染而建立的，该区域受人类磷酸甘油酸激酶启动子的控制。在PER.C6细胞中生产E1缺失的腺病毒载体没有产生复制能力病毒，允许以成本效益的方式生产AdV载体。 类似于PER.C6细胞，CEVEC的CAP细胞通过含有AdV 5的E1和pIX的载体永生化，目的是在不意外形成RCV的情况下高滴度生产复制缺陷的腺病毒载体。由于减少了意外RCV形成的风险，这些细胞系可能比HEK293更倾向于用于AdV生产。 5.结论 人类细胞系HEK293已成为治疗性病毒载体的主要生产平台。细胞系发展的进步将看到更多的HEK293克隆或衍生物被开发用于在无血清悬浮培养基中生长，用于高滴度病毒载体生产。当前的例子包括Thermo Fisher Scientific提供的商业化LV和AAV载体生产工作流程，其中他们的基于HEK293的病毒生产细胞（VPC）用于LV-MAX™系统和即将推出的VPC 2.0，用于他们的原型AAV-MAX系统中。 病毒载体生产技术的未来倾向于为AAV、LV和yRV生产开发稳定细胞系。这样的工艺使得在生产病毒载体时无需使用转染所需的昂贵试剂。在稳定生产细胞系中，CHO中的工艺发展导致糖蛋白产量提高了10-20倍。HEK293细胞培养基开发和工艺技术的进步可能导致稳定生产系统中病毒载体产量的类似提高。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：病毒载体为真核细胞的改造提供了一种有效手段，它们在学术实验室和工业界中用于研究和临床基因治疗应用现在已非常普遍。慢病毒载体，源自人类免疫缺陷病毒，在过去二十年中已得到广泛的研究和优化。第三代自灭活慢病毒载体最近在多项临床试验中被用来向造血干细胞引入基因，以纠正原发性免疫缺陷和血红蛋白病。这些载体还被用来向成熟的T细胞引入基因，通过传递嵌合抗原受体（CARs）或克隆的T细胞受体来产生对癌症的免疫。使用慢病毒载体工程化的CAR T细胞治疗已在B细胞恶性肿瘤患者中显示出显著的临床成功，从而促成了使用慢病毒载体的第一个基因工程细胞治疗的监管批准。在这篇综述中，我们讨论了几个将对临床医生感兴趣的慢病毒载体方面，包括慢病毒载体发展的概述，病毒载体作为原发性免疫缺陷和癌症治疗的当前用途，慢病毒载体的大规模生产，以及对接受基因治疗产品的患者的长期跟踪。 1. 引言 20世纪70年代分子生物学的出现使得操纵核酸的多种工具得以发展，并彻底改变了现代医学。分子生物学构成了众多生物治疗药物的基础，例如重组酶（如血友病中的因子IX）、单克隆抗体（如曲妥珠单抗）和生长因子（如促红细胞生成素）。基因治疗涉及将编码感兴趣基因的DNA传递到细胞中，以治疗疾病为目的，扩展了分子生物学的力量，有可能纠正由遗传缺陷引起的疾病（例如，由于β-珠蛋白基因缺陷引起的β-地中海贫血）。除了纠正遗传缺陷外，基因治疗还可以赋予细胞或生物体在自然状态下不存在的能力。使用基因工程T细胞的过继细胞疗法是最引人注目的例子之一。使用合成基因，如嵌合抗原受体（CAR）或克隆的T细胞受体（TCR），可以使T细胞具有识别其内源性TCRs自然不识别的抗原的能力。这种方法甚至在对其他现有治疗高度耐药的晚期B细胞恶性肿瘤患者中也能产生强大的临床反应。通过γ-逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒进行的基因治疗因其自然能力进入细胞并传递遗传物质而具有吸引力。γ-逆转录病毒和慢病毒是逆转录病毒的亚型，它们包含一个RNA基因组，该基因组通过病毒编码的酶——逆转录酶在转导的细胞中转换为DNA。尽管在研究环境中使用γ-逆转录病毒载体更为常见，但使用慢病毒载体进行基因治疗的临床试验数量正在增加。本综述讨论了慢病毒载体的发展，并从安全性角度总结了它们当前的临床研究。 2. 慢病毒载体发展史 2.1. 慢病毒生物学 对于逆转录病毒和慢病毒的生存和功能所必需的基本基因是gag、pol和env基因；gag编码结构蛋白，pol编码逆转录和整合到宿主细胞基因组所需的酶，env编码病毒包膜糖蛋白。所有逆转录病毒都有相似的生命周期。生命周期始于成熟的病毒通过直接膜融合或通过包膜内糖蛋白与其在目标细胞表面的相应受体结合所促进的受体介导的内吞作用进入细胞。这一初始融合步骤之后是脱壳过程；在这个阶段，几种病毒蛋白（包括一些Gag亚基）从病毒核心中解离出来。病毒RNA通过一个复杂的多步骤逆转录过程转化为前病毒双链DNA。然后前病毒DNA与病毒蛋白复合，以促进核输入和整合到宿主基因组中。整合过程由关键病毒蛋白（如整合酶）和内源性宿主细胞转录因子（如LEDGF）协助。野生型慢病毒的整合前病毒基因组依赖宿主机制来启动和完成组装传染性颗粒所需的病毒蛋白的转录和翻译。然后病毒后代通过称为出芽的过程离开细胞，其中病毒颗粒从质膜释放到细胞外空间，与其他经常出芽的病毒不同。像许多包膜病毒一样，慢病毒利用所需的内体分选复合物进行运输途径来执行复杂的出芽过程，并将病毒颗粒释放到细胞外空间。在出芽过程中，宿主细胞中存在的内源性膜蛋白可以并入病毒颗粒的包膜中，如MHC分子，这可能影响释放后病毒颗粒的后续处理。病毒出芽和随后的病毒传播过程对野生型慢病毒的生命周期至关重要，但对于理解复制无能的重组慢病毒载体的基本特征并不相关。逆转录病毒生命周期的两个独特步骤，逆转录和整合，是慢病毒载体功能的核心。脱壳后，剩余的病毒核酸和蛋白复合物通常被称为逆转录复合物（RTC）。这个RTC被积极运输到染色体DNA上，那里可能会发生整合。在迁移过程中，病毒RNA在RTC内通过逆转录过程转化为双链病毒DNA。这个过程始于转移RNA与病毒RNA基因组5'端的引物结合位点结合（图1）。 图1 逆转录步骤。该图示说明了将HIV的单链RNA(ssRNA)基因组转换为双链DNA(dsDNA)所涉及的步骤。RNA以红色显示，DNA以黄色表示[1]。转运RNA(tRNA)引物(蓝色椭圆)与引物结合位点(PBS)[2]进行碱基配对。使用逆转录酶(RT; 紫色椭圆)启动逆转录，从tRNA引物开始，复制基因组5'端的U5和R序列。在这个阶段，形成了RNA/DNA双链，并且RT酶的核糖核酸酶(RNase)H活性降解了已被复制的病毒RNA(虚线红色)[3, 4]。负链DNA已通过病毒RNA两端都存在的R序列转移至病毒RNA的3'端，负链DNA合成继续进行。HIV-1基因组有两个RNase H抗性多嘌呤序列(PPTs)[5]。这两个PPT作为正链DNA合成的引物。一个正链在U3处启动，另一个在中央PPT处启动(cPPT)[6]。正链和负链DNA随后延长，最终形成了一个完整的病毒RNA副本，其5'和3'端都有额外序列，使得病毒DNA在两端都有相同的U3RU5副本。在U3处启动的正链取代了从cPPT启动的正链的一部分，形成一个称为中央翻盖(cFLAP)的小翻盖。LTR 长末端重复序列。 当负链病毒DNA由逆转录酶的聚合酶活性合成时，病毒RNA被同一酶的RNAse H活性降解。这个过程产生了一个短片段的负义单链DNA，通常被称为强停复制DNA（sscDNA）。这个sscDNA片段随后被转移到病毒RNA的3'端，作为合成负链病毒DNA的引物。在这个过程中，对病毒生命周期至关重要的长末端重复序列（LTR）中的U3RU5序列得以恢复。正链病毒DNA的合成是通过RNase H抗性多嘌呤序列启动的，一个靠近3' LTR，另一个是中心多嘌呤序列。总之，整个过程使用多个引物步骤，从而获得病毒RNA的完整DNA副本。这个病毒DNA在LTR两端都有一个与U3RU5序列相同的副本。当逆转录接近完成时，该复合物可以被称为前整合复合物（PIC）。由于可能存在多个引物事件来合成正义链，可能会形成重叠正义链DNA的翻盖。人们认为这些翻盖很可能在整合过程后被宿主DNA修复酶修复。尽管中心多嘌呤序列（或它们产生的DNA翻盖）对逆转录过程并不重要，但对病毒载体的研究表明它们的存在增强了病毒载体的效力。这可能是由于第二链合成的增强速率，这也可能保护RTC免受先天限制因素的侵害，如载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽样酶（APOBEC）。然而，也有研究表明这种三链DNA翻盖可能也增强了核输入。逆转录是在细胞质还是细胞核中完成尚不清楚。RTC的确切组成可能允许更有效的逆转录。衣壳似乎保护病毒核酸免受先天传感器的侵害；同时，它提供了一个结构，允许更有效的逆转录，错误率更低。逆转录在细胞系中比在无细胞系统中更准确，但转录速率要慢得多（70 nt/min vs. 1000 nt/min）。这个速率在原代细胞中更慢，如巨噬细胞和静止的T细胞，它们的核苷酸库更低。将RTC从细胞包膜运输到细胞染色质的过程是积极的，需要能量，并且尚未充分研究；然而，对整合过程的最新研究揭示了几种宿主-病毒相互作用，可能促进了这一过程。其中一个模型表明，衣壳蛋白在病毒生命周期的早期阶段具有基本作用，通过使用环孢素A，剪切和聚腺苷酸化特异性因子6（CPSF6），Nup358和TNPO3来协调衣壳脱壳、DNA合成和整合的协调过程，促进逃避先天反应和插入到首选的染色质区域。 整合的步骤包括（1）锚定（2），3' 处理/切割精确数量的末端核苷酸（3），链转移，以及（4）DNA修复。γ-逆转录病毒（小鼠白血病病毒[MLV]）和慢病毒（人类免疫缺陷病毒[HIV]）之间的重要差异在设计使用逆转录病毒的基因治疗载体时应予以考虑。在大多数逆转录病毒中，整合过程并非随机。每个逆转录病毒类别都有其特征性的偏好。γ-逆转录病毒MLV倾向于在转录起始位点附近插入，而慢病毒HIV则更倾向于在转录单元内插入。α逆转录病毒禽肉瘤白血病病毒对转录单元有较轻微的偏好。β逆转录病毒小鼠乳腺肿瘤病毒没有明显的偏好。像MLV这样的γ-逆转录病毒只有在核膜溶解后才能进入染色质。MLV的锚定机制导致插入位点位于增强子内，并涉及p12 MLV蛋白与BRD2,3,4（bromodomain和外部结构域蛋白2、3和4）之间的相互作用。同样，似乎那些由于缠绕在核小体上而高度弯曲的DNA序列也受到青睐。慢病毒具有与其独特的能力相关的额外选择标准，即通过完整的核膜的核孔进行转位。γ-逆转录病毒必须在有丝分裂期间进入宿主基因组，此时核膜被解体，而慢病毒可以通过核孔的主动运输进入染色体。尽管核输入的过程仍然不甚了解，但认为PIC中的病毒蛋白，如衣壳，以及逆转录宿主基因组的元素对于通过核孔的运输是必要的。此外，Yamashita等人的精妙研究表明，HIV的衣壳蛋白（而不是MLV）使HIV能够通过核孔进行转位。在非分裂细胞中，靠近核孔也在整合位点选择中起作用。异染色质倾向于与核膜相关，而活跃转录的基因更靠近核孔。核孔内的几种宿主蛋白（Nup153, Nup98, Nup358, CPSF6和TPR）似乎在HIV的输入中起作用。宿主蛋白LEDGF, BAF和HMG都与HIV-1的PIC相关。LEDGF与PIC和表观遗传（H3K36me3）标记相互作用，导致更倾向于在转录单元内进行整合。这些慢病毒的独特特性可能具有优势，因为某些基因治疗平台针对的是静止的细胞类型，例如长期造血干细胞（HSCs）。多年来，该领域的共识是HIV不感染生命周期G0阶段的静止CD4 + T细胞，但可以感染激活的CD4 + T细胞。大约在同一时间，对患者细胞的研究表明，静止的CD4 + T细胞含有HIV DNA。因此，假设感染的静止CD4 + T细胞的来源是被感染并返回到静止状态的激活T细胞。这些静止的CD4 + T细胞对HIV感染有抵抗力是令人困惑的，尽管它们表达了HIV融合所需的受体（CD4和CXCR4或CCR5），但与激活的CD4 + T细胞相比，这些静止的CD4 + T细胞中的逆转录水平在接种后不久（<24小时）测量病毒中间体时低几个数量级。随着时间的推移，人们认识到静止CD4 + T细胞中核苷酸的低水平和限制因子的高表达水平减慢了逆转录的速度，直接感染静止CD4 + T细胞的潜力降低，但并未阻止最终逆转录产物随后在静止CD4 + T细胞中积累2至3天，而在激活的T细胞中为8至12小时。慢病毒载体感染静止细胞的另一个挑战是静止的CD4 + T细胞与常用的病毒包膜G蛋白——泡状口腔病毒（VSV-G）融合效率不高。VSV-G受体介导的内吞作用不会导致静止CD4 + T细胞的有效感染，因为内吞作用有限。使用几种细胞因子（如白细胞介素7）的治疗克服了这一限制，并增强了细胞存活，因为G0 T细胞在HIV感染后也容易很快死亡。了解这些限制因子的影响将很重要，因为这些慢病毒生物学的细微差别在基于这些载体的基因治疗开发过程中需要考虑。 2.2.  慢病毒载体 第一代慢病毒载体包含了HIV基因组的大部分，包括gag和pol基因，以及几种额外的病毒蛋白。第一代慢病毒载体的设计中包括了另一种病毒的包膜蛋白，最常见的是VSV-G。VSV-G识别一种普遍表达的受体，最近被确定为低密度脂蛋白（LDL）受体，允许慢病毒载体转导广泛的细胞。VSV-G基因编码在与其他慢病毒基因不同的质粒上。慢病毒辅助基因vif、vpr、vpu和nef，以及调节基因tat和rev被包括在第一代慢病毒载体中。vif、vpr、vpu和nef为慢病毒在体内的复制提供生存/适应优势，但它们对体外病毒的生长并不必需；tat和rev对病毒复制是必需的。 随后开发了更安全的第二代慢病毒载体，这些载体缺乏辅助毒力因子vif、vpr、vpu和nef。去除辅助基因并未抑制遗传物质向宿主细胞的转移。 第三代慢病毒载体通过将病毒基因组分割成不同的质粒，进一步提高了安全性，使得重组病毒的产生更加不可能（图2）。在第三代系统中，gag和pol基因被编码在与rev或env基因不同的质粒上，从而产生了由三个独立的质粒组成的载体，这些质粒包含包装所需的必要病毒序列。由于在含有转基因的构建物的上游LTR中设计了一种持续活跃的启动子，第三代慢病毒载体中去除了tat基因，因为它的功能不再必要。在病毒基因组的3' LTR中引入缺失，以创建自灭活（SIN）慢病毒载体，破坏了LTR的启动子/增强子活性，进一步提高了安全性。 图2 第三代慢病毒载体。第三代慢病毒载体由两个独立的包装质粒组成，一个编码gag和pol，另一个编码rev。还有一个质粒编码来自VSV-G的包膜蛋白。编码感兴趣基因的质粒包含已经改变为自灭活（SIN）的慢病毒LTR序列，以防止重组。LTR 长末端重复序列，VSV 泡状口腔病毒。 第三代SIN慢病毒载体中使用的内部启动子的选择也很重要。最初的研究使用了巨细胞病毒立即早期基因启动子，它在大多数活跃分裂的细胞系中显示出强大的表达。然而，启动子在原代细胞中的活性差异很大，如CD34 + 干细胞和T细胞，与T细胞激活相比，巨细胞病毒启动子在活性上显示出更大的变化，与持续活跃的细胞启动子（如延伸因子1-α）相比。 尽管大多数当前的基因治疗方法在转导前激活T细胞进行分裂，但HIV-1转导G0期非分裂T细胞的能力依赖于PIC通过完整的核膜的导入，为基因治疗提供了一些理论上的优势。当细胞在其静止的非激活状态下被转导时，细胞可能保留更大的功能潜力。例如，幼稚T细胞具有非常长的间期半衰期，人类的估计约为3.5年。同样，HSCs也观察到缓慢的细胞周期，长期重归潜能与细胞周期呈负相关。通过转导非分裂的T细胞或干细胞，基因修饰细胞的持久性可能会增加。 针对非分裂细胞也可能降低致癌潜力。鉴于大多数逆转录病毒载体针对转录单元，当转导分裂细胞时，插入到参与细胞分裂的转录单元的机会增加。这由临床数据表明，唯一的插入性突变病例报告在基因修饰的增殖性HSCs中，而不是静止的细胞类型。然而，致癌潜力可能高度依赖于背景，特别是接受治疗的患者中预先存在的遗传异常。尽管如此，由于其整合模式靠近原癌基因，γ-逆转录病毒已经显示出相当大的白血病风险。慢病毒载体也可以插入到癌基因附近，并且在至少一个使用非灵长类慢病毒衍生载体转导胚胎细胞的模型中已经注意到肿瘤形成。然而，现有的临床数据表明，新一代载体大大减少了插入性突变的风险，因为在涉及遗传修饰HSCs或非分裂T细胞的基因治疗试验中，至今没有报告白血病发生的病例。 在使用慢病毒载体进行肾上腺脑白质营养不良的基因治疗试验中观察到具有共同整合位点的细胞扩增。在感染HIV-1的患者中也观察到高度扩增的CD4 + T细胞克隆。然而，克隆整合位点扩增似乎与致癌选择无关。 长距离染色质相互作用也被证明对由逆转录病毒载体引起的肿瘤形成有贡献[55]。Montini等人展示了通过交换逆转录病毒和慢病毒LTRs的区域，当携带来自逆转录病毒的强大启动子/增强子元件时，慢病毒载体可以诱导插入性突变。在模型系统的并行比较中，自灭活（SIN）慢病毒载体被证明比γ-逆转录病毒载体具有更低的插入性肿瘤形成风险，并且在小鼠模型中，临床相关的SIN慢病毒载体表明，通过包含工程化染色质绝缘体盒，可以降低慢病毒载体的基因毒性潜力。然而，正如已经讨论的，当慢病毒载体整合在已知的癌基因内时，克隆扩增可能会发生；因此，使用慢病毒载体时的突变风险可能较低，但并未消除。为测试逆转录病毒和慢病毒载体的致癌潜力而开发的检测方法可能会进一步提高设计临床用载体的安全性。 3.  慢病毒载体的大规模生产用于临床应用 慢病毒载体的生产主要围绕使用一种细胞系，通常称为包装细胞，来生产病毒载体颗粒。大规模生产载体始于培养足够数量的这些包装细胞，如HEK293T细胞系的衍生物（图3）。 图3 大规模载体生产的概述。慢病毒载体的生产始于在采用良好生产规范的设施中培养包装细胞系。这些细胞被转染构成第三代慢病毒载体的质粒，并且生产载体的细胞在培养中被扩增。从细胞和培养碎片中纯化载体，并进行过滤以确保无菌，单个等分被冷冻保存。 包装细胞的小样本在培养中扩展数天后，然后通过瞬时转染含有生产慢病毒载体所需蛋白质编码的质粒DNA。这些核心包装质粒包括包膜蛋白（最常见的是VSV-G）、HIV-1 gag和pol基因产物以及HIV辅助蛋白，如Rev。将这些质粒与含有感兴趣基因的慢病毒载体基因组共转染，为细胞系生产功能性载体颗粒提供了所有必要的组分。在数天的过程中，包装细胞产生慢病毒载体颗粒，可以从培养基中收获。经过流过滤，澄清的载体经过处理以去除污染的DNA产品，使用各种方法如梯度纯化或色谱法纯化病毒产品。纯化后，洗脱的分数经过一系列过滤步骤进行灭菌和去除任何剩余的细胞碎片。产品的纯度至关重要；包装细胞的碎片很容易与载体产品一起收集，这些杂质可能会在体外和体内引起炎症反应。一旦生成，据报道，当在-80°C下冷冻保存时，载体库存可以保持稳定长达9年。 在临床环境中使用载体的生成需要采用现行良好生产规范（cGMP）来确保生产高质量载体，这些载体经过验证具有明确的身份、纯度和效力。载体生产所需的步骤并不复杂；然而，与生产逆转录病毒载体相比，生产符合cGMP的慢病毒载体生产系统已被证明更具挑战性。尽管慢病毒载体生产与γ-逆转录病毒载体生产有许多相似之处，但一个关键的区别是，目前缺乏稳定转染核心包装质粒的包装细胞系，这显著影响了生产过程的一致性并增加了慢病毒载体的成本。每次载体生产批次需要瞬时转染三到四个不同的质粒，这引入了在大规模、cGMP生产过程中不受欢迎的变异机会。过去尝试生产与γ-逆转录病毒载体生产中使用的相当的稳定慢病毒包装细胞系大多失败，并且是载体开发的主要研究领域。最近，有报道称一种生成临床级稳定包装细胞系的方法，这些细胞系持续生产慢病毒载体。这种策略使用了Cre重组酶介导的将密码子优化的HIV-1 gag-pol构建物插入到293FT细胞中的一个持续表达的位点。然后，剩余的载体组分被转染到一个表达高水平gag-pol的克隆中。这种方法解决了先前研究中发现的慢病毒载体生产的关键问题，即质粒转染gag-pol盒没有诱导持续的高水平表达。稳定包装细胞系的可用性可能会加速新基于慢病毒载体的基因疗法的开发和生产，以及降低基因疗法这一关键组成部分的成本。然而，由包装所用的其他病毒蛋白（即Rev或VSV-G）表达引起的毒性仍然是一个挑战。 4.  慢病毒载体的临床应用 慢病毒和逆转录病毒载体是目前正在开发的重要技术，用于许多需要转移遗传物质的临床应用（图4）。 图4 慢病毒载体的关键临床应用。a 矫正原发性免疫缺陷。使用病毒载体传递共同的γ链（γc），恢复X1型SCID（严重联合免疫缺陷）患者的免疫功能。b 传递肿瘤特异性T细胞受体（TCR）。慢病毒载体可以用来体外向患者的T细胞中引入能够识别黑色素瘤抗原的MART-1 TCR。这些经过改造的T细胞现在能够识别黑色素瘤细胞，作为癌症治疗被输回给患者。c 嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗。通过三个不同的域（抗原识别、共刺激信号和T细胞信号）工程化的CAR，可以使用慢病毒载体引入T细胞。表达修改后受体的细胞能够识别感兴趣的抗原，并利用T细胞的强大细胞毒性活动攻击肿瘤细胞。目前，大多数临床试验中的CAR T细胞治疗针对的是CD19抗原，这是一种在B细胞和B细胞恶性肿瘤上表达的蛋白。SCID：严重联合免疫缺陷。 由于慢病毒载体能够更有效地转导非增殖或缓慢增殖的细胞，如CD34 + 干细胞，因此它们已成为临床应用的特别吸引人的选择。在临床环境中使用慢病毒载体的首个应用是使用一种条件复制能力的慢病毒载体，该载体编码针对HIV包膜基因的反义RNA。这个载体被用来转导成熟的外周血T细胞，用于治疗自然HIV感染。在这个试验中没有报告可归因于慢病毒载体的不良事件，其中包括一些患者的长达8年的随访。此外，整合位点分析显示，如预期的那样，更倾向于在转录基因内整合，预充细胞产品和植入T细胞的整合位点分布没有显著变化。基于慢病毒载体的基因转移进入CD34 + HSCs已在治疗几种遗传疾病中得到应用，包括β-地中海贫血、X-连锁肾上腺脑白质营养不良、脑硫脂沉积病和Wiskott-Aldrich综合征。在这些试验中没有报告与载体相关的不良事件。在β-地中海贫血患者中使用β-球蛋白转导HSCs的初步研究中，一名βE/β0-地中海贫血患者实现了输血独立。有趣的是，这种反应与一个主要的髓系克隆的相对增加有关，该克隆带有HMGA2基因位点内的慢病毒载体插入。目前尚不清楚这一主要克隆内的插入是否仅仅是巧合，或者是由于HMGA2基因的失调导致的增殖增强而被选中。几项使用慢病毒载体修改HSCs的研究仍在继续（表1），需要更长时间的随访才能充分确立慢病毒载体在这种治疗环境中的安全性。 表1 使用慢病毒载体修改造血干细胞的正在进行的临床试验 ADA（腺苷脱氨酸酶）是一种对维持免疫系统功能至关重要的酶。SCID（严重联合免疫缺陷）是一种导致免疫系统严重受损的遗传性疾病。ADA缺乏症是SCID的一种类型，称为腺苷脱氨酸酶缺乏性SCID。 慢病毒载体在体外基因转移到造血干细胞（HSCs）的安全性仍然是一个有待解决的问题；然而，该领域现在已经积累了超过10年的使用慢病毒载体将基因转移到成熟T细胞的经验。最近在利用基因修饰T细胞的癌症免疫治疗方面取得了一些进展。一种方法涉及通过将肿瘤特异性TCR转导到患者自身的T细胞中，产生细胞毒性T细胞。目前，正在进行的1期和2期临床试验正在使用已经转导表达肿瘤抗原NY-ESO-1、MART-1、WT-1等的自体T细胞。在一个使用慢病毒载体转移针对由NY-ESO-1和LAGE-1共享的肽段的TCR作为治疗多发性骨髓瘤患者的试验中，20名患者中有16名观察到临床反应，安全问题最小。此外，慢病毒载体在转导针对Melan-A/MART-1抗原的TCR的T细胞方面，比逆转录病毒载体展现出更好的转导效率，并且正在进行使用慢病毒转导表达MART-1的T细胞治疗转移性黑色素瘤的2期试验。在使用TCR修饰细胞的一些试验中，已经观察到由转移的T细胞引起的不良反应；然而，目前还没有报告将慢病毒载体在这些研究中使用导致的不良反应。 在使用TCR重新编程T细胞的类似方法中，通过慢病毒和逆转录病毒载体将靶向B细胞标记CD19的CARs引入T细胞，在B细胞恶性肿瘤患者中产生了值得注意的临床反应。使用CD19靶向CAR T细胞治疗B细胞急性淋巴细胞性白血病的临床试验已经显示出高疗效，对复发或难治性疾病患者的持久完全反应率超过60%。此外，在非霍奇金淋巴瘤患者中观察到大约40%到70%的完全反应率。已经提出了一些关于CAR T细胞治疗的安全问题；然而，与TCR一样，CAR T细胞治疗的不良反应似乎是机制性的，而不是使用病毒载体的结果。 CD19 CAR T细胞治疗的一个重要的靶向副作用是B细胞缺乏，这与长期CAR T细胞持久性相关。由于慢病毒载体的整合性质以及T细胞克隆在过继转移后的持久性，经过慢病毒载体修饰的T细胞似乎能够在治疗后持续存在并诱导持续的B细胞缺乏超过5年。这些经过慢病毒载体工程改造的T细胞的半衰期目前尚不清楚，但可能是终身的。同样重要的是要认识到，接受基于慢病毒载体的基因治疗的个体在某些HIV检测平台上也可能表现出阳性测试，这取决于所使用的载体结构和检测试剂。因此，将这些与自然HIV-1感染区分开来将很重要，并且需要更广泛的检测。 除了将细胞在体外修改后回输到患者体内，慢病毒载体也直接在体内用于治疗目的。一项基于非灵长类慢病毒载体的1/2期研究，该载体基于马传染性贫血病毒（EIAV）表达参与多巴胺代谢的三个基因，证明了局部慢病毒基因传递到中枢神经系统的安全性，并有一些临床效益的证据。慢病毒载体的体内基因传递也在临床上应用于眼睛。这些方法面临许多障碍，包括效率、需要组织特异性启动子和免疫原性。后者特别重要，因为免疫原性可能与传递的基因以及载体组分有关。如前所述，慢病毒载体包膜在出芽过程中捕获包装细胞系的膜蛋白。已经描述了对载体包膜内HLA I类蛋白的异体免疫反应，并且可能限制载体存活。基因编辑包装细胞以产生缺乏HLA I类蛋白的细胞系可以增强慢病毒载体在血清中的稳定性。除了载体基因组工程外，表面工程对于这些载体在体内的成功应用可能至关重要。 5.  慢病毒载体的使用在监管方面的考量 在使用γ-逆转录病毒或慢病毒载体的治疗中，存在一个理论上的潜力，即在载体生产过程中可能发生重组事件，导致复制能力型逆转录病毒或慢病毒（RCRs/RCLs）的出现。如果载体中存在RCRs/RCLs，由于病毒复制和插入宿主DNA的潜力，患者中插入性突变的发生率可能会增加。因此，美国食品药品监督管理局（FDA）、欧洲药品管理局和大多数监管机构要求对载体产品以及患者进行RCRs/RCLs的广泛检测。对包装细胞系、纯化的载体产品以及在输注给患者之前的基因修饰细胞治疗产品进行RCRs/RCLs的检测。常用的检测载体或细胞产品的方法是S+L−检测，该检测涉及将测试样本与能够使病毒复制的细胞系一起孵育。可以通过聚合酶链反应或血清学检测监测患者的RCRs/RCLs，FDA建议在患者接受基因治疗后的第一年每3个月监测一次重组病毒。有人建议，由于重组病毒生成的可能性不大、检测的高成本和劳动量，应该重新修订对RCRs/RCLs的严格检测要求。第三代自灭活（SIN）慢病毒载体系统由于病毒基因组被分割成不同的质粒，使得RCLs的生成非常不可能。 由于RCRs/RCLs和继发性恶性肿瘤的理论可能性，美国和欧洲的卫生当局要求对使用病毒载体的细胞和基因治疗研究进行长期跟踪。跟踪要求因国家而异；在美国，建议在患者接受基因治疗后至少每年监测一次，持续15年。最近FDA批准的tisagenlecleucel（CTL019；Kymriah）所需的长期市场后监测部分是由这些理论担忧驱动的。然而，患者跟踪的最佳持续时间取决于几个因素，包括载体持久性和转基因表达。除了监测患者的继发性恶性肿瘤和RCRs/RCLs外，还应检查患者是否有新的发生或现有神经、风湿或自身免疫性疾病的恶化。FDA还要求参与使用病毒载体的临床试验的患者接受有关其作用机制和DNA整合可能影响的信息，包括延迟恶性肿瘤的风险。为了帮助建立跟踪程序并收集接受基因治疗的患者的数据，正在进行针对特定基因治疗产品的患者的跟踪的临床试验。 6.  未来的方向和挑战 几个正在进行的研究领域旨在通过新的病毒载体设计进一步提高基因治疗。非整合慢病毒载体（NILVs）已被研究作为避免插入性突变的手段。NILVs缺乏病毒整合酶蛋白，能够转导分裂和非分裂细胞，病毒基因组作为游离基因体存在于细胞中，而不是整合到宿主基因组DNA中。预计NILVs的非整合基因组结构在分裂细胞中的基因表达可能是短暂的。虽然这在某些应用中可能不受欢迎，但这种稀释效应在某些情况下可能有用，例如CAR T细胞，其中长期表达遗传有效载荷可能不是必需的。 NILVs已被有效地用作疫苗策略，在临床前模型中产生细胞和体液免疫以及抗肿瘤免疫。NILVs也可以与锌指核酸酶共转导到细胞中，这些酶促进编码在载体中的DNA与宿主DNA的特定位点的重组。在一项临床前研究中，锌指核酸酶被用于T细胞中，用NILV引入的肿瘤特异性TCR替换内源性TCR。以这种方式替换内源性TCR可以消除由内源性TCR介导的非靶向活性，从而提高安全性。为了在分裂细胞中允许长期表达，开发了一种双重NILV载体系统，包括噬菌体phiC31的整合酶。 已经研究了两种使用慢病毒载体的癌症疫苗：树突细胞疫苗和癌细胞疫苗。加载肿瘤抗原肽的树突细胞可以用作针对表达该抗原的癌症的疫苗。其中一种树突细胞疫苗，Sipuleucel-T，已被FDA批准作为前列腺癌治疗。慢病毒载体已被研究作为在树突细胞中表达肿瘤抗原或修改共刺激信号的方法，以进一步提高其效力。慢病毒载体也已被用于在树突细胞中恒定激活MAP激酶途径，这在小鼠中增强了抗肿瘤反应。 另一种疫苗方法是使用已经表达相关肿瘤抗原的癌细胞，而不是必须加载肽的树突细胞。一项关于B细胞淋巴瘤细胞的研究，这些细胞通过慢病毒转导共刺激蛋白和白介素-12，表明使用这些修饰细胞作为疫苗可以在小鼠模型中增强对亲本淋巴瘤细胞系的免疫原性。慢病毒载体也被用来将K562红白血病细胞系转化为人工抗原呈递细胞，这些细胞可以用于体外T细胞扩增，可能还可以用于体内疫苗接种，类似于之前报道的GVAX。尽管需要更多的研究来确定使用慢病毒载体开发的癌症疫苗的临床效果和安全性，但这些方法可能会为患者带来新的治疗方法。 慢病毒载体也被用来传递基因组编辑的组成部分，如用于簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas9系统的引导RNA。CRISPR-Cas9系统使用RNA序列引导Cas9核酸酶创建精确的双链断裂，然后可以通过同源重组来实现基因删除或点突变。一项研究使用慢病毒CRISPR引导RNA库在胚胎干细胞中引入目标突变，随后对表型突变体的鉴定证明了这种方法作为使用RNA干扰进行基因筛选的替代方法的有效性。围绕基因组编辑的非目标效应放大存在一些担忧，因为由于病毒整合导致基因组编辑机械的持续表达。为了克服这些潜在的限制，Chen等人描述了一种通过共表达识别CAS9本身的引导RNA来限制编辑持续时间的方法，目标是摧毁表达盒。如果这种系统提供了比NILVs或AAV载体更短的CRISPR表达窗口，它可能是有利的。通过NILVs的短期传递也可能绕过这些挑战。慢病毒载体也常被用于研究环境中通过表达短发夹RNA或反义RNA来改变基因表达。这些方法大多仍处于开发的早期阶段，需要进一步的研究来确定慢病毒载体是否可以作为传递这些基因组编辑工具的治疗平台。 7.  结论 使用慢病毒载体的基因治疗已成为几种疾病的有希望的治疗选择。第一种慢病毒转导的细胞治疗，tisagenlecleucel（CTL019，Kymriah），于2017年8月在美国获批，用于治疗儿童和年轻成人的急性淋巴细胞性白血病。几种基于慢病毒载体工程细胞的额外细胞治疗正处于后期开发阶段。特别是第三代SIN慢病毒载体，在将基因转移到干细胞和T细胞时已证明其安全性。尽管慢病毒载体存在插入性肿瘤发生的潜在理论可能性，但使用自然HIV或慢病毒载体的基因治疗中尚未报告病例。继续跟踪已经接受基于慢病毒载体的基因治疗的患者仍然必要，以了解这些载体的长期安全性和有效性。还需要额外的基础和临床研究来提高转导效率和生产。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。