IFNγ

关注小药说药，一起成长！ 前言 基于T细胞的免疫疗法的出现显著改变了癌症患者的治疗模式。尽管取得了成功，但目前批准的免疫治疗方案仍然存在局限性。因此，需要对T细胞活化和抑制的分子机制有更深入的了解，以合理地扩大改善免疫治疗的靶点和可能性。 免疫信号通路下游的蛋白质泛素化对于几乎所有免疫反应，特别是T细胞激活的正调节和负调节至关重要。大量研究表明，泛素化通过控制蛋白质的功能、定位和稳定性发挥多种细胞和分子作用，对泛素依赖性通路的调节可以显著改变T细胞的活化并增强抗肿瘤反应。因此，人们正在积极开发有选择性地利用泛素相关酶用于癌症治疗的技术，靶向泛素化为推进T细胞免疫治疗提供了巨大的可能性。 蛋白质泛素化 泛素化是一种翻译后修饰，泛素是一种由76个氨基酸组成的小蛋白质，通常由一条泛素链与底物蛋白质内的赖氨酸残基共价连接。泛素化通过各种方式影响蛋白质功能，例如通过影响蛋白质稳定性、周转率、细胞定位，以及诱导影响与其他蛋白质相互作用的构象变化。 该过程由E1泛素激活酶启动，该酶使用ATP激活，然后将泛素单体转移到E2泛素结合酶。泛素最终在E3泛素连接酶的作用下从E2转移到底物。 泛素化是多方面的，底物蛋白可以仅用一个泛素（单泛素化）、多个单泛素（多个单泛素化）或多泛素链（多泛素化）标记。由于泛素本身有七个赖氨酸（Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48和Lys63）和一个N端甲硫氨酸残基（M1），可以进行泛素化，因此可以形成几种结构不同的同质/同型、混合/异型和分支多泛素链。 泛素化除了是通过蛋白质体降解蛋白质的主要调节器外，实际上是几乎所有细胞信号级联的多功能调节器。泛素化蛋白质的命运取决于添加的泛素数量和形成泛素连接的泛素氨基酸。通过这种方式，并且由于拓扑结构不同链的多种可能性，泛素构成了一种高度通用的信号。 单泛素化和多泛素化参与膜受体的内吞作用，以及蛋白质降解、定位和蛋白质-蛋白质相互作用，这些类型的链也与TGF-β信号传导有关。在同型多泛素链中， Lys48和Lys63连接的链是最丰富，它们分别驱动蛋白酶体降解和调节多种细胞信号事件。Lys11连接链调节细胞周期和线粒体自噬，M1连接链对炎症固有反应至关重要，特别是调节NF-κB信号。 由Lys6-、Lys27-、Lys29-、Lys33泛素连接链调节的细胞过程仍然不太清楚。Lys27连接链似乎对调节先天免疫、细胞周期和线粒体功能非常重要。Lys6链似乎参与DNA修复和线粒体自噬，而Lys29链与Wnt信号以及蛋白毒性应激和细胞周期相关。Lys33链在高尔基体后转运和T细胞受体（TCR）调节中起着关键作用。 此外，非常重要的是，泛素在底物上的组装可以通过去泛素化酶（DUB）的作用逆转，去泛素化酶水解并从底物上去除泛素，使泛素化成为一种瞬时修饰，DUB对于维持生理性泛素平衡是必不可少的。这种平衡的失调与人类疾病的发病机制有关，特别是癌症、感染、神经退行性变和免疫紊乱，因此，DUB已开始作为基于抑制剂的治疗成为有吸引力的药物靶点。 TCR/CD3激活中的泛素途径 E3连接酶 E3泛素连接酶Casitas B系淋巴瘤（Cbl-B）是最具特征的E3连接酶，是T细胞活化的主要参与者。在T细胞激活时，它在免疫突触处被招募到TCR中，在TCR下游发挥多种抑制机制。 Cbl-b通过其多个蛋白质相互作用结构域与关键TCR信号体分子（如LCK、SLP76、ZAP70、Vav1、PKCθ和PI3K）相互作用。Cbl-b与E3连接酶Itch协同作用，能够介导TCR-ζ的Lys33连接的多泛素化，其不针对TCR受体进行降解或内吞，而是阻止其磷酸化并进一步与下游ZAP70激酶结合。通过这些相互作用，以及一些信号体成分的泛素化，Cbl-b强烈抑制T细胞活化。Cbl-b敲除小鼠具有过度活跃的T细胞，其激活不需要CD28，此外，Cbl-b基因敲除小鼠中从未描述过自身免疫损伤。因此，Cbl-b具有多个检查点抑制作用和极小的自身免疫毒性，是未来靶向癌症免疫治疗的有力候选。 与淋巴细胞无能相关的基因（GRAIL）是一种跨膜E3连接酶，定位于内体，也对T细胞活化起负调节作用。TCR介导的T细胞活化促进GRAIL的表达，而GRAIL反过来又阻碍T细胞活化。机制上，GRAIL通过非降解泛素链稳定和激活Rho-鸟嘌呤解离抑制剂（RhoGDI），导致细胞骨架重排和IL-2分泌缺陷。 NRDP1是另一种损害TCR信号的E3连接酶。T细胞激活后，NRDP1将Lys33多聚泛素非降解链添加到ZAP70激酶。Lys33连接的泛素链有助于招募Sts1和Sts2磷酸酶，最终使ZAP70去磷酸化和失活。 除了作用于近端信号体外，E3连接酶还通过进一步作用于下游抑制T细胞活化，控制导致T细胞活化转录因子核易位的关键转导事件。例如，在TCR/CD28连接后，E3连接酶Pellino1（PELI1）通过用Lys48多泛素链标记c-Rel来阻止NF-κB通路，导致其蛋白酶体降解。 DUBs 去泛素化酶A20和CYLD，在调节天然免疫细胞中的NF-κB信号中具有重要作用，也能显著改变T细胞功能。外周T细胞中A20的条件性缺失导致CD8+T细胞具有增强的NF-κB信号，即使在低抗原剂量下也能更有效地被激活，以产生更高水平的IL-2和IFN-γ。 CYLD可以通过NF-κB损害T细胞活化，它是通过将CBM复合物下游TAK1激酶的Lys63泛素链进行去泛素化。CYLD缺陷小鼠出现结肠炎，T细胞频率和活化增加。 使用类似的作用机制，去泛素酶USP18对TAK1的去泛素化抑制TCR。USP18的基因缺失导致T细胞中NF-κB和NFAT的过度激活和IL-2的过度产生。相反，去泛素酶USP9X和USP12通过从BCL10中去除抑制性泛素链来积极调节NF-κB通路，从而阻断CBM信号复合物的组装。因此，缺乏USP9X或USP12的T细胞在TCR激活时表现出较低水平的NF-κB激活，以及增殖和细胞因子生成减少。 TCR内化 TCR信号幅度和持续时间由细胞膜受体的内化、再循环和降解的平衡决定。在抗原刺激下，TCR/CD3复合物是泛素化的，而泛素化对于表面受体的内化至关重要。据报道，Cbl-b可单独或与E3连接酶c-Cbl联合促进TCR的内化，Cbl-b还干扰激活和聚集，从而破坏免疫突触的稳定性，进一步减弱TCR信号。 类似地，E3连接酶GRAIL可以通过蛋白酶体多泛素化和降解CD3ζ分子来下调表面TCR/CD3复合物的表达。最近的研究表明，用于CAR-T治疗的CAR受体的表面表达也受到泛素介导的内吞和降解的影响。注入患者体内的CAR-T细胞持续性差是这种肿瘤免疫疗法的主要限制。最近的一项研究能够通过对细胞质结构域的所有赖氨酸残基进行突变来提高CAR的稳定性，这有效地绕过了CARs的泛素化依赖性溶酶体降解，因此，这些CAR-T细胞改善了CAR的持久性和来自内体的信号传导，同时增强了效应器功能，从而在小鼠模型中产生持久的抗肿瘤免疫反应。 共刺激受体下游的泛素途径 CD28 E3连接酶Cbl-b是CD28介导的信号传导的主要抑制剂，从机制上讲，E3连接酶Cbl-b通过结合和泛素化PI3K的p85β亚单位来抑制CD28依赖的PI3K途径。 E3连接酶不仅能阻碍CD28信号传导，而且能促进CD28信号传导。例如，TCR/CD28激活NFAT涉及E3连接酶TRAF6。TRAF6被招募到免疫突触与支架蛋白LAT相互作用，并通过Lys63泛素化增强LAT磷酸化和TCR信号。 为了充分激活T细胞，CD28共受体必须克服Cbl-b抑制。CD28信号通过触发Cbl-b的翻译后修饰来阻断Cbl-b抑制途径，最终导致其蛋白酶体降解。其中E3连接酶NEDD4发挥着重要作用，据报道NEDD4在CD28共刺激下结合并泛素化Cbl-b进行蛋白酶体降解。 其他共刺激受体 与CD28类似，肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族成员的共刺激受体4-1BB、CD40L、OX40和GITR与TCR协同促进T细胞活化，尤其是增殖和细胞因子的产生。作为TNFRs，它们缺乏内在的酶功能，依赖于几种E3连接酶，包括TRAF（TRAF1/2/3）、cIAP1/2和LUBAC，在导致NF-κB活化的信号转导级联中引导大量Lys63、Lys48和线性泛素化事件。去泛素酶A20、CYLD和OTULIN可以清除这些泛素化事件以阻止NF-κB的活化。 抑制性受体下游泛素途径 CTLA-4 到目前为止，没有任何E3直接泛素化CTLA-4的报道，也没有CTLA-4中泛素化位点的记录。然而，CTLA-4缺陷型T细胞的泛素修饰总体上显著减少，这有力地表明了泛素化事件在CTLA-4途径中的重要性。此外，实验证据表明，主要CTLA-4抑制功能由关键的T细胞抑制性E3连接酶介导，该连接酶也调节T细胞活化，即Cbl-b、ITCH和GRAIL。 此外，Cbl-b、ITCH和GRAIL是T细胞无能的基本驱动因素，而且这三种E3连接酶还通过调节Treg的发育和功能发挥重要的免疫抑制作用。Cbl-b和ITCH参与TGF-β介导的Foxp3调节，缺乏这两种E3连接酶都会损害TGF-β诱导的Foxp3+Tregs（iTreg）的发育，导致iTreg低表达，功能缺陷。 PD-1 与CTLA-4不同，一些报告强调了泛素化在PD-1/PD-L1系统中的关键作用。对于T细胞上的PD-1受体，Cbl-b也作为PD-1抑制途径的关键介质显著参与，缺乏Cbl-b的T细胞对PD-1抑制具有抵抗力。没有Cbl-b，PD-1在抑制IFN-γ产生或诱导T细胞活化后的细胞死亡方面效率低下。 另一种Cbl E3连接酶c-Cbl也影响PD-1，但与Cbl-b相反，它是一种负性调节因子。c-Cbl与PD-1的胞质尾部结合，并作为E3连接酶，泛素化PD-1进行蛋白酶体降解。因此，c-Cbl减少提高了CD8+T细胞和巨噬细胞中PD-1的表达。 同样，E3连接酶FBXO38通过介导PD-1降解来控制T细胞抗肿瘤反应。从机理上讲，FBXO38通过在Lys233处添加Lys48多聚泛素链来标记PD-1进行降解。缺乏FBXO38的黑色素瘤和结直肠癌小鼠模型具有更高的肿瘤负荷，这与肿瘤浸润性T细胞中PD-1的高表达有关。 PD-L1 PD-L1的肿瘤水平是肿瘤免疫的重要决定因素。几项研究已确定癌细胞利用EGFR信号稳定PD-L1表达以逃避T细胞免疫。E3连接酶识别并泛素标记PD-L1进行蛋白水解，主要依赖于糖原合成酶激酶3（GSK3α/β）。GSK3β磷酸化PD-L1的C端结构域，以招募E3连接酶β-TrCP用于PD-L1泛素依赖性降解。而EGFR信号通过诱导GSK3β磷酸化位点附近的PD-L1大量糖基化来对抗GSK3β/β-TrCP/PD-L1降解途径。 另一项研究进一步表明GSK3α/ARIH1是另一种诱导PD-L1蛋白水解的激酶/E3连接酶对。E3连接酶ARIH1识别S279/S283处PD-L1的GSK3α依赖性磷酸化，随后PD-L1 Lys48泛素化和降解。最近，还发现EGFR通过额外干扰膜结合MARCH8 E3连接酶增加PD-L1水平，该连接酶也以PD-L1为降解靶点。最后，c-Cbl过表达，单独或与Cbl-b联合，也可以降低STAT3/AKT/ERK磷酸化，从而下调PD-L1表达并增加抗肿瘤反应。 Cullin3 SPOP和TRIM21E3连接酶通过泛素化依赖性降解进一步破坏PD-L1的稳定性，它们的作用再次依赖于激酶，特别是细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4和CDK5。然而，CDK4通过稳定Cullin3 SPOP协助PD-L1降解，而CDK5则消极干扰TRIM21对PD-L1的作用。 此外，PD-L1也因其他几种去泛素化酶而稳定，即OTUB1、USP9X、USP7。这些研究具有潜在的治疗意义，因为它们证明，抑制或清除这些DUB中的任何一种都可以重新激发小鼠的抗肿瘤反应，并使癌细胞对T细胞杀伤敏感。 泛素依赖途径肿瘤药物的开发 到目前为止，针对泛素依赖的途径主要是基于小分子抑制剂，这些小分子可以通过直接结合或变构作用阻断泛素相关酶的催化结构域，或阻止其与底物或其他调节蛋白结合。目前，已经开发了200多种化合物，其中许多化合物正在进行癌症治疗的临床前和临床试验。 大多数基于泛素的小分子化合物被设计成靶向癌细胞中必需的泛素途径。随着以T细胞为基础的肿瘤免疫治疗的出现，针对选择性E3和DUB的靶向抑制已有研究，其中关键的细胞内检查点T细胞抑制剂Cbl-b具有巨大的潜力。已有研究利用RNA干扰成功地下调了T细胞中的Cbl-b水平，这在不同的过继性T细胞转移肿瘤模型中产生了出色的体外和临床前结果，并且癌症患者对其耐受性良好，目前已进入临床试验（NCT02166255和NCT03087591）。此外，针对IAPs、MDM2和USP7的小分子已经进行了临床前试验，并证明单独使用或联合使用时，至少部分增强体内抗肿瘤免疫。 调节癌细胞中PD-L1降解的泛素化依赖途径也正在进行测试。例如，一种竞争性棕榈酰化抑制剂（CPP-S1），以防止PD-L1棕榈酰化，进而促进PD-L1泛素介导的降解。控制PD-L1泛素化和降解的EGFR信号通路也通过不同的方式在体内被有效阻断，包括EGFR小分子抑制剂、铜螯合剂和靶向CSN5的小分子，都显著增强T细胞抗肿瘤反应。 基于邻近性的治疗方法，包括PROTAC或分子胶技术，也正在迅速发展，以针对几种特定肿瘤蛋白质的蛋白酶体降解，目前有十几项临床试验正在验证这些基于泛素化技术的治疗潜力。 小结 数据表明，调节几种泛素依赖性途径，特别是所涉及的泛素依赖性酶，可以释放强烈、持久和靶向的抗肿瘤反应。目前，泛素领域也取得了巨大进展，开发出了多种新技术和新方法，可以专门针对几乎所有泛素依赖的酶，或者利用它们针对感兴趣的底物蛋白，包括肿瘤蛋白。展望未来，相信这些重要的泛素依赖途径的调节很快将成为改善靶向肿瘤免疫治疗的可行替代方案。 参考文献： 1.Ubiquitination in T-Cell Activation andCheckpoint Inhibition: New Avenues for Targeted Cancer Immunotherapy. Int J MolSci. 2021 Oct; 22(19): 10800. 公众号内回复“疫苗篇”或扫描下方图片中的二维码免费下载《小药说药疫苗篇》的PDF格式电子书！ 公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

关注小药说药，一起成长！ 前言 遗传和表观遗传变化都是癌症发生、肿瘤进展和转移的重要因素。从广义上讲，癌症的发病率与生物/遗传年龄直接相关。DNA甲基化是一种重要的表观遗传调控机制，在生命周期中不断变化，是“表观遗传衰老”过程的重要组成部分。值得注意的是，最近的研究已经证实表观遗传衰老在肿瘤发生中起主要作用。 表观遗传学改变通过影响广泛组织学中的多种致癌基因与抑癌基因途径，以及通过影响免疫细胞（如T细胞和NK细胞）的激活、分化和功能从而促进癌症的发生。事实上，最近的一项研究表明，正是组织环境诱导的表观遗传编程启动了肿瘤发生，这些发现为表观遗传药物的应用提供了强有力的理论基础，不仅可以作为癌症治疗药物，还可以用于预防癌症，因为它们可以协同靶向“正常”细胞，包括免疫细胞和癌前细胞。 基于表观遗传学的治疗旨在调节影响免疫细胞、其他正常细胞和/或癌细胞中各种信号通路的转录编程，从而影响这些细胞群体的命运。表观遗传药物是作用于细胞表观基因组以发挥其功能的化学物质，这些药物包括DNA甲基转移酶（DNMT）、DNA去甲基酶、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）、组蛋白乙酰转移酶（HATs）、组蛋白甲基转移酶（HMT）、组蛋白去甲基酶（HDMs）和其他相关酶的抑制剂。此外，microRNA（miRNA）和长非编码RNA（lncRNAs）也是多种关键生物过程的重要表观遗传介质，包括致癌和免疫反应，这是有效癌症治疗的两个关键靶点。 表观遗传途径 DNA甲基化 DNA甲基化作为一种主要的表观遗传学标记，可通过有丝分裂遗传，并参与稳定基因转录抑制，尤其是当其位于哺乳动物基因转录起始点附近时。研究的最深入的DNA共价修饰是5-甲基胞嘧啶（5mC），这是一种由DNMT催化的标记。 在哺乳动物基因组中，5mC主要存在于CpG二核苷酸中，人类基因组中2800万CpG二核苷酸中70–80%的CpG被甲基化。在哺乳动物中，发现了三种活跃的DNMT，分别命名为DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。 组蛋白乙酰化 组蛋白可以经历多种形式的翻译后修饰（PTMs），包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化以及ADP核糖基化、磺酰化和瓜氨酸化。这些组成所谓的“组蛋白密码”，调节染色质结构、重塑酶的募集和基因活动的调节。 组蛋白赖氨酸残基的乙酰化影响基因组的组织和功能。组蛋白H3和H4的乙酰化由两组酶决定：HATs和组HDAC。这两组酶决定组蛋白的乙酰化状态，并以可逆方式工作。 在人类中，有18种HDAC酶分为四类：Rpd3样蛋白的I类（HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8）；类Hda1蛋白的II类（HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9和HDAC10）；Sir2样蛋白的III类（SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7）和第四类蛋白质（HDAC11）。这些酶及其在癌症中的功能已被广泛研究。 组蛋白甲基化 组蛋白甲基化是表观遗传修饰的第三种主要类型。为了完成这一可逆过程，涉及两大类催化甲基加成的酶：蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）和组蛋白赖氨酸甲基转移酶（HKMT）。癌症环境中的关键赖氨酸和精氨酸甲基转移酶包括zeste同源物2（EZH2）、G9a、DOT1L以及PRMTs 1和5。另一组称为组蛋白去甲基酶的酶逆转这一过程。 组蛋白磷酸化 磷酸化是另一种高度动态的组蛋白PTM形式。它发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上，主要发生在组蛋白N端尾部，受激酶和磷酸酶的竞争作用控制。作为“组蛋白代码”的重要组成部分，PTM在DNA损伤修复、染色质致密化、转录调控以及包括肿瘤发生和癌症进展在内的一系列生物学过程中起着关键作用。 肿瘤微环境的表观遗传调节 肿瘤微环境（TME）由多种细胞类型组成。除肿瘤细胞外，TME还包含多种非上皮细胞类型，包括构成血管系统的细胞（内皮细胞、周细胞和平滑肌细胞）、参与免疫监测的细胞（淋巴细胞、巨噬细胞和肥大细胞）以及基质细胞（即成纤维细胞），这些细胞在细胞外基质（ECM）中，分泌一系列可扩散生长因子、细胞因子和趋化因子。人们早就认识到，癌症发生促进以促血管生成生长因子表达、ECM表达改变、成纤维细胞增殖加速和炎性细胞浸润增加为特征的基质变化。 TME的表观遗传改变控制着组织缺氧状态，并在细胞对缺氧的反应和癌细胞代谢中起着关键作用。表观遗传调控因子可与缺氧诱导转录因子（HIF）家族基因协同工作，在HIF依赖性启动后很长时间内维持缺氧适应的细胞表型。表观遗传变化稳定HIF与其转录靶点的结合，从而影响直接HIF反式激活后的组蛋白去甲基化酶活性，并最终导致缺氧TME中组蛋白修饰和DNA甲基化的整体模式，JMJD1A表达的低氧上调作为信号放大器促进低氧基因表达，最终促进肿瘤生长。 巨噬细胞是TME中的关键固有免疫细胞，它们在TME中调节原发性肿瘤生长、血管生成、转移扩散和肿瘤对介入治疗的反应。在巨噬细胞中，缺氧减弱了Jumonji组蛋白去甲基化酶活性的表达，导致组蛋白H3K9甲基化增加和趋化因子表达降低，从而导致TME内免疫景观的变化。 免疫细胞的表观遗传调节 表观遗传机制在免疫细胞分化和功能中发挥关键作用，确保在不同组织微环境条件下免疫细胞中恰当的基因表达模式。重要的是，表观遗传机制在TME内的免疫细胞和基质细胞类型中起着决定性作用。 固有免疫细胞（髓系细胞和NK细胞） 髓系细胞在适应性免疫系统识别癌细胞中发挥重要作用，并协调炎症和保护性抗肿瘤免疫反应的启动。这些细胞包括粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、DC和MDSC。 DC细胞启动并协调针对感染和疾病的适应性免疫反应，它们是免疫记忆和免疫耐受发展的核心。树突状细胞迅速整合来自其组织微环境的信号，并相应地对这些信号作出反应，这种动态变化依赖于DC细胞染色质结构的表观遗传变化。 在巨噬细胞中，其功能极化状态需要对靶基因表达进行精确的时间和情境调节。在M1和M2极化期间，表观遗传变化在改变细胞信号和特征基因图谱中发挥作用。 MDSCs在肿瘤形成过程中被诱导，它们介导有效的肿瘤促进活动。研究表明，在肿瘤相关培养基存在的情况下，MDSCs的基因组中存在广泛的去甲基化和某些特殊位点的DNA甲基化，这些和免疫抑制特征的特异性基因增加有关。此外，许多研究表明，组蛋白修饰的表观遗传途径调节MDSCs的各个方面。例如，HDAC11是一种新的表观遗传调节因子，在肿瘤相关的MDSC中调节细胞的扩增和功能。 NK细胞在免疫监视和消除应激、感染或转化细胞方面发挥着重要作用。对于NK细胞，H3K4me3去甲基化酶Kdm5a是细胞激活所必需的。此外，慢性刺激的NK细胞在被肿瘤靶点重新激发时表现出功能紊乱，这些无能的NK细胞表现出特定的表观遗传重编程模式，DNA甲基化发生全基因组改变。 CD4+T细胞 表观遗传学机制在Th1和Th2细胞的细胞分化和功能中起着关键作用。STAT4和STAT6转录因子在辅助性T细胞分化过程中的表观遗传修饰和转录调节中起着调控作用。研究发现，STAT4在促进活跃的表观遗传标记方面具有更为显著的作用，而STAT6在对抗抑制性标记方面具有更为显著的作用。 对于T滤泡辅助细胞（Tfh）细胞，已经证明VHL-HIF-1α轴在通过糖酵解表观遗传重编程启动Tfh细胞发育过程中起着重要作用。EZH2是一种HMT，催化H3K27me3并主要通过HMT活性影响Th1、Th2和Treg细胞。研究表明，EZH2敲除会损害Tfh分化和转录编程的激活。 Treg细胞 Treg细胞的发育严重依赖于FoxP3，FoxP3的表达是最佳Treg抑制活性所必需的，过去几十年的研究表明，增强子区CpG岛的DNA甲基化控制着T细胞中FoxP3的表达。此外，TET-甲基胞嘧啶双加氧酶对Treg细胞的功能稳定性也至关重要。一系列研究证明了TET在维持Treg细胞中稳定的FoxP3表达中的关键作用。 EZH2在Treg细胞中的重要性也得到了证实。EZH2对Treg的分化和T效应细胞的扩张都至关重要，通过遗传或药理学手段破坏Treg细胞中的EZH2活性，导致肿瘤浸润性Treg细胞获得促炎功能，重塑TME，增强CD8+和CD4+效应T细胞的募集和功能，从而消除肿瘤。 CD8+T细胞 基因表达的表观遗传调控在获得和维持CD8+T细胞的效应器功能，以及记忆性CD8+T细胞对抗原再激发的快速而稳健的反应中起着关键作用。表观遗传机制也影响CD8+T细胞的干性及其命运。 组蛋白乙酰化通过效应分子的差异表达促进CD8+T细胞快速而稳健的记忆反应。与原始CD8+T细胞相比，记忆CD8+T细胞中效应基因H3赖氨酸9乙酰化（H3K9Ac）显著提高。此外，HDAC3已被确定为CD8+T细胞效应器分化和细胞毒性潜能的表观遗传调节因子。 肿瘤细胞和免疫分子的表观遗传调节 癌细胞的代谢重编程是公认的癌症标志，这已成为调节抗肿瘤免疫反应的关键免疫抑制机制。代谢重编程和表观遗传重编程是相互关联的，并且在很大程度上，代谢状态决定了癌症的表观遗传学。 糖酵解或氧化磷酸化等代谢途径在炎症和组织修复过程中调节巨噬细胞功能，α-酮戊二酸通过代谢和表观遗传重编程协调巨噬细胞活化至M2表型。糖酵解增强也被确定影响骨桥蛋白基因表达的表观遗传修饰。最终，TME内的代谢条件加强了癌细胞和免疫细胞的表观遗传重编程，导致免疫抑制性微环境，然而，这些表观遗传修饰表现出可通过表观遗传调节剂纠正的可塑性。 在分子水平上，已知与免疫功能（STING）、CD8+细胞毒性T细胞（GzmB、IFN-γ、IL-2、IL-12）和FOXP3+Treg细胞相关的关键效应分子通过表观遗传途径进行调节。事实上，许多细胞因子和趋化因子在癌症中通过表观遗传途径调节。 免疫检查点分子（ICMs）包括程PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3以及TIGIT。这些分子及其受体在癌细胞和免疫细胞表面的表达，或其可溶性分泌形式，可帮助肿瘤细胞逃避免疫监视。表观遗传机制在调节TME中ICMs及其受体的表达中起着关键作用。作为一个具体的例子，LAG-3 DNA甲基化与肿瘤和免疫细胞中该免疫检查点分子的表达相关，影响透明细胞肾细胞癌中免疫细胞浸润的命运。 表观遗传靶向药物 表观遗传药物经常与其他免疫刺激剂联合使用，以实现五个目标：1）癌细胞生长停滞；2）诱导肿瘤细胞死亡（通过凋亡、坏死、自噬）；3）促进肿瘤相关新抗原的表达以提高免疫细胞识别能力；4.）缺氧逆转和肿瘤血管生成抑制；以及5）TME中免疫细胞（DC、T细胞等）功能的调节。 目前，大量涉及表观遗传调控途径的小分子酶抑制剂或激活剂正被开发用于临床。许多表观遗传药物已获得监管机构批准用于治疗人类恶性肿瘤。 2004年，FDA批准5-azaC（商品名Vidaza）用于骨髓增生异常综合征（MDS）的所有五个阶段，随后于2006年批准了5-aza-dC。这两种药物目前代表了干细胞疗法不适用时MDS的一线疗法。它们也被应用于慢性粒单核细胞白血病（CMML）和AML的治疗。 一些HDAC抑制剂（HDACi）也已获得FDA批准用于临床。Vorinostat和romidepsin是这类药物中最早被批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）的药物。SAHA，也称为Zolinza或Vorinostat，于2006年获得FDA批准，目前是CTCL患者的第三线治疗选择。Romidepsin是2009年FDA批准的第二种HDAC抑制剂。随后，Belinostat和Panobinostat以及Chidamine均被批准用于治疗复发或难治性外周T细胞淋巴瘤（PTCL）或多发性骨髓瘤。 FDA药品批准的第三波浪潮发生在过去几年中。2017年和2018年，异柠檬酸脱氢酶1和2（IDH1/2）抑制剂Enasidenib和Ivosidenib分别被批准用于治疗复发或难治性AML。最后，在2020年，FDA加速批准了tazemetostat，一种EZH2的抑制剂，用于治疗上皮样肉瘤和复发/难治性滤泡性淋巴瘤。 表观遗传药物的临床前景 到目前为止，除了少数类型的实体瘤、T细胞淋巴瘤、上皮样肉瘤和难治性滤泡性淋巴瘤外，表观遗传学药物在晚期肿瘤中通常无法证明足够的疗效，从而无法获得FDA或其他监管机构的批准。 然而，一些关于实体瘤的临床研究显现出有希望的前景。首先，Tazemetostat是第一类抑制剂的代表，对两种实体瘤有效。单药治疗显示出有临床意义的、持久的反应，并且在经多次治疗的复发性或难治性滤泡性淋巴瘤患者或晚期上皮样肉瘤患者中普遍具有良好的耐受性。 其次，两种或两种以上的表观遗传药物的组合可能是提高治疗抗肿瘤疗效的一个很好的选择。在一项研究中，证明了azacitidine和romidepsin与IFN-α的联合具有很高的治疗潜力，其靶向的是结直肠癌最具侵袭性的细胞成分（即转移细胞和癌干细胞），并调节关键的生存和死亡途径（包括肿瘤ICD）。在另一项研究中，研究人员评估了使用azacitidine和entinostat对复发性转移性非小细胞肺癌患者的联合治疗，在一些难治性NSCLC患者中显示出客观、持久的反应。 此外，在临床前研究中，已报道EZH2抑制剂可增强ICIs的抗肿瘤反应。在一个病例报告中，一名使用EZH2抑制剂（tazemetostat）治疗的SMARCB1阴性脊索瘤患者对放疗的持续全身反应超过2年。功能分析显示，CD8+ T细胞和Treg细胞的肿瘤内和间质浸润显著增加，与T细胞上PD-1和LAG-3检查点分子的表达增强有关。这些结果表明EZH2抑制促进持续的抗肿瘤免疫反应，导致免疫检查点激活。新出现的临床数据也表明，表观遗传药物和ICIs的联合疗法有望用于一系列实体癌患者。 目前，有多项表观遗传药物和ICIs联合治疗的临床试验正在进行中。 小结 令人信服的证据表明，表观遗传调控影响癌细胞、免疫细胞、基质细胞、癌细胞和免疫细胞之间的相互作用以及免疫TME的状态。因此，作为一种干预手段，表观遗传调节本身可以诱导强大的抗肿瘤免疫。 因此，进一步增强免疫治疗效果的一个合理策略是将某些表观遗传调节因子与一种或多种经典免疫治疗方案相结合，如癌症疫苗、ICIs、溶瘤病毒、CAR-T细胞、TCR-T细胞或其他新型免疫刺激剂。表观遗传药物可以诱导ICD并使肿瘤由冷变热，它们可能与其他免疫治疗方案产生协同作用。未来，这些联合治疗方案可能在临床研究中显示出良好的应用前景。 参考文献： 1.Epigenetic modulation of antitumor immunityfor improved cancer immunotherapy. Mol Cancer. 2021; 20: 171. 公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！ 公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

关注小药说药，一起成长！ 前言 在过去的十年里，免疫疗法的出现确实彻底改变了癌症治疗的模式。许多靶向程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）或其配体（PD-L1）的治疗药物已被监管机构批准作为单一治疗药物，或与化疗和其他靶向药物联合使用。在临床研究中，PD-L1免疫组织化学（IHC）和肿瘤突变负荷（TMB）是迄今为止发现的主要预测性生物标记物，然而，PD-L1 IHC仍然是临床实践中用于告知免疫检查点抑制剂（ICI）治疗的主要辅助诊断试验。 PD-L1在肿瘤细胞和肿瘤浸润性免疫细胞表面表达，在多种肿瘤类型的研究已经确定了PD-L1水平与单药抗PD-1/PD-L1治疗的临床益处之间的关联。虽然PD-L1高表达的患者通常能获得最大的临床益处，但肿瘤低或无PD-L1表达的患者也依然能受益，这促使我们需要进一步探索不断进化的癌症基因组变化与浸润性免疫细胞亚型之间的因果关系。 考虑到PD-L1作为单一生物标记物的局限性，我们需要了解复杂的肿瘤微环境（TME），以开发更好的生物标记物和诊断方法，更准确地预测临床效益，至关重要的是，更有针对性地对肿瘤产生有效的免疫反应。 预测性生物标志物 PD-L1 IHC 与突变的二元性不同，PD-L1是一种线性生物标记物，因此可以在多个表达阈值下进行评估。由于肿瘤细胞和免疫细胞上PD-L1表达的复杂生物学特性，已批准的PD-L1 IHC分析不仅采用不同的表达阈值，而且采用不同的评分方法。PD-L1评分算法具有分析特异性、适应症依赖性，并且根据治疗路线而变化。有些检测仅对肿瘤细胞表达进行评分（忽略免疫细胞），而有些检测仅对免疫细胞的PD-L1进行评估（忽略肿瘤细胞），其它检测则对肿瘤和免疫细胞的PD-L1同时进行测量。下表显示了非小细胞肺癌（NSCLC）中使用的主要PD-L1 IHC分析的截止值。需要注意的是，这些经验证的截止值的批准和用途是特定于国家的。 PD-L1的表达是动态的，在肿瘤类型、肿瘤部位，甚至在同一肿瘤标本中表现出显著差异。肿瘤细胞中PD-L1的表达受基因组、表观遗传学和转录机制的调控。肿瘤细胞上的PD-L1与NSCLC中CD8+T细胞浸润程度之间的强相关性很可能是由于对炎症信号（如IFN-γ）反应中的转录调节，这些炎症信号是由活跃的抗肿瘤免疫反应产生的。 PD-L1的非均匀表达（通常局限于免疫浸润区域）表明，由于TME内相关细胞因子的高局部浓度，PD-L1被适应性诱导，并进一步突出了肿瘤内的异质性。PD-L1的肿瘤内异质性和可塑性可能会影响患者的管理决策，此外，由于采样可能会产生假阴性得PD-L1 IHC结果。活检的位置和已进行过的治疗是PD-L1表达的重要参数。由于临床原因，在治疗开始时获得新的活检可能不可行，但由于免疫反应的可塑性，尤其是PD-L1，存档肿瘤标本不一定反映复发或转移性病变中的TME。 多种免疫细胞类型，主要是巨噬细胞、树突状细胞（DC），以及T细胞、NK细胞和B细胞，可表达PD-L1。目前尚不清楚哪些特定免疫群体或免疫细胞的空间特征与临床最相关。需要使用多重IHC技术进一步描述肿瘤细胞与特定免疫细胞亚群的空间相互作用，以确定是否需要继续将免疫细胞分类为一个更广泛的类别，这需要更细致、更复杂的分析。 其它生物标志物 临床试验表明，具有大量效应T细胞的肿瘤对ICI治疗更为敏感。有研究使用以IFN-γ为中心的基因表达特征来显示使用抗PD-1抗体pembrolizumab治疗的黑色素瘤患者的总体应答率（ORR）和无进展生存率（PFS）的相关性。与这些发现一致，在NSCLC中进行的IMpower150试验报告了一种T效应细胞（Teff）基因表达特征，由PD-L1、CXCL9和IFN-γ组成，当比较atezolizumab联合化疗比较单独化疗时，该特征对PFS有益。 此外，具有高突变负荷的肿瘤患者从CI治疗中获得了更大的临床益处。TMB和PD-L1 IHC的一致性研究似乎表明，这些生物标记物是正交的，并独立预测CI治疗的益处。因此，pembrolizumab最近获得了监管部门的批准，用于治疗先前治疗后有进展且无替代治疗方案的不可切除或转移性高TMB实体瘤。 随着对更具预测性的生物标志物的研究不断深入，有必要摆脱单一分析方法，整合负责进行免疫反应的各种生物过程。初步的探索性分析表明，联合生物标志物可以转化为临床益处。在Checkmate-026和Checkmate-227研究中，肿瘤表达高水平PD-L1并具有高组织TMB状态的患者从抗PD-1抗体nivolumab治疗中获得最大益处。OAK研究也报告了类似的结果。 免疫效应细胞的表型多样性 许多研究已经描述了肿瘤浸润淋巴细胞及其空间分布与治疗效益之间的关系。识别各种免疫效应细胞的空间分布需要通过功能分析来补充，如激活标记物和抗原反应性，通过分析肿瘤样本中CD8+T细胞TCR序列的内在抗肿瘤反应性，表明识别自体肿瘤的能力仅限于少数肿瘤浸润CD8+T细胞。更复杂的是，肿瘤不同区域（中心与边缘浸润）的CD4+和CD8+T细胞群中可能存在显著的TCR异质性，异质性的程度具有预后意义。 通常，三种不同的CD8+T细胞群体可根据共同的转录谱识别： 表达CC-趋化因子受体7（CCR7）和转录因子7（TCF7）的原始或记忆细胞； 穿孔素1（PRF1）、颗粒酶A（GZMA）和GZMB阳性的细胞毒性细胞；以及 “功能失调”的多样性细胞群体，其特征是与耗竭状态相关的标记物，如PD-1（PDCD1）、LAG3和TIM3（HAVCR2）。 这三个群体的相对比例似乎高度可变，不仅在不同的肿瘤类型中如此，在相同组织学的肿瘤中也是如此。转录谱和TCR测序信息已被用于确定肿瘤内CD8+细胞表型是否发生改变。初步模型表明，TME诱导的表型异质性功能失调细胞群从幼稚的CD8+细胞进化而来，而后者以不依赖TME的方式产生细胞毒性细胞。“功能失调”细胞库中的细胞在多大程度上可以转化为“细胞毒性”状态目前尚不清楚，然而，了解这一点对于设计促进和触发这种转变的疗法非常重要。 此外，在几项研究中已经鉴定出对肿瘤表达的新抗原具有特异性的肿瘤内CD8+T细胞，但其只是表型异质性总群体的一小部分。有趣的是，CD39似乎能够区分肿瘤特异性（高CD39）和旁观者（低CD39）CD8+T细胞。其他表型和功能分析显示，CD39+亚群共表达CD103以及PD-1、TIM3和CTLA-4，这些标记通常与耗竭状态相关。CD39和CD103的共同表达依赖于通过TCR的长时间刺激和TGF-β的暴露。有趣的是，高水平的CD39+CD103+双阳性细胞似乎转化为鳞状细胞头颈癌患者的生存益处。 免疫效应细胞的空间分布 最新的研究分析了CD8+T细胞和MHCII类表达细胞（最可能的抗原呈递细胞）之间的空间关系。在肾细胞癌患者中，TCF1+/CD8+T细胞优先共定位于MHC II类表达细胞的区域，而TCF1−/CD8+细胞在整个肿瘤中呈弥散分布。TCF1+/CD8+细胞的发生率也与DC的发生率相关，而TCF1−/CD8+细胞没有表现出这种相关性。有趣的是，含有TCF1+/CD8+T细胞和表达MHC II类APC高密度区域的肿瘤具有更好的临床疗效，APC密集区可能为干细胞样CD8+T细胞分化为能够维持抗肿瘤免疫反应的效应细胞提供了肿瘤内环境。 很明显，成熟、活跃的树突状细胞向肿瘤床的肿瘤浸润增加了免疫激活和活性免疫效应细胞的募集。准确识别和量化DCs具有重要价值，然而，标记物如CD11c、CD11b、CD163和MHC-II不是DC特异性的，并且在其他细胞类型如巨噬细胞上表达。DC可以促进或抑制新生免疫反应的观察结果进一步增加了复杂性，因为目前还没有有效的标记来区分两种DC状态。 在肿瘤进展过程中，TME转变为一种主动保护肿瘤细胞免受免疫攻击的环境，被认为具有肿瘤保护功能的TME细胞包括T调节细胞（Treg）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）和髓系抑制细胞（MDSCs）。 肿瘤保护作用通常通过分泌的细胞因子和趋化因子介导，这些细胞因子和趋化因子可防止免疫效应T细胞侵入肿瘤床或使这些细胞功能失效，例如，TGF-β。TGB-β抑制剂和抗PD-L1抗体的联合治疗可导致Teff的肿瘤内渗透，将表型从“排除”改变为“炎性”，减少转移并提高长期生存率。 MDSC是中性粒细胞和单核细胞样髓样细胞的异质群体，越来越多地被认为是各种癌症免疫抑制的关键介质。在癌症患者中，循环MDSC数量的增加与晚期临床分期、转移性疾病发病率的增加和免疫抑制相关。除了免疫抑制功能外，MDSC还可以通过与肿瘤细胞和周围基质的复杂串扰积极塑造肿瘤微环境，从而增加血管生成、肿瘤侵袭和转移。 肿瘤细胞的内在抗性 目前，我们对于肿瘤免疫治疗的不同反应和耐药机制的了解仍然有许多空白。虽然我们希望找到一颗灵丹妙药，但可能的事实是，有许多机制有助于产生抵抗。虽然肿瘤抑制因子（如p53）的突变增加了突变负荷，有助于放大新抗原的数量，并使肿瘤对免疫系统更敏感，但这些突变也可以驱动抗原呈递途径和关键细胞机制的突变，从而触发转录和代谢变化，进而对肿瘤浸润性免疫细胞产生间接影响。  肿瘤抗原呈递机制的一个关键组成部分是MHC I类分子，它由HLA I类（HLA-I）亚单位和β2微球蛋白（β2M）组成。MHC-I的下调存在于多种肿瘤类型中，可能通过多种机制发生，包括基因突变、表观遗传沉默、转录变化和翻译后修饰。 MHC-I的下调如何影响TME？研究发现，HLA-I阳性表达与免疫浸润密度相关，与PD-L1状态无关。所有HLA-I+/PD-L1+的肿瘤都有高度的CD8+T细胞浸润，而HLA-I缺失与肿瘤内T淋巴细胞数量减少相关，其空间局限于肿瘤周围的基质。而HLA-I-/PD-L1-的肿瘤较大，CD8+T细胞密度较低。这项研究表明，肿瘤免疫逃逸表型结合了两种独立的免疫逃逸机制：HLA-I的丢失和PD-L1的上调。 新辅助治疗中获得经验 最近对早期疾病免疫治疗的探索为了解TME及其在治疗反应中的变化提供了新的机会。新辅助研究特别丰富，因为治疗前经常收集诊断性活检，并可与新辅助治疗后立即进行的手术切除进行比较。 ABACUS试验是一项单臂2期研究，研究膀胱切除术前atezolizumab的新辅助治疗。升高的PD-L1水平（SP142；IC≥5%）,基线Teff基因表达和上皮内CD8+T细胞与临床益处相关。有趣的是，与术前相比，在治疗后肿瘤样本中观察到上皮内CD8+T细胞和PD-L1+免疫细胞的数量增加，并且这种增加在应答者中比在复发患者中更为明显。在治疗后样本中发现，TGF-β、成纤维细胞活化蛋白和细胞周期基因升高与耐药性相关。 PURE-01研究报告了类似的结果，膀胱上皮癌患者在根治性膀胱切除术前接受了三个周期的pembrolizumab。与PD-L1状态较低的患者相比，PD-L1 IHC升高的患者（22C3；CPS≥10%）获得了更高的病理完全缓解率。与治疗前活检相比，治疗后切除的PD-L1 CPS水平升高，TMB水平降低。此外，与治疗前样本相比，治疗后样本中的免疫相关基因（包括与IFN-γ信号、抗原呈递和T细胞功能相关的基因）也有所增加。 NABUCCO研究评估了III期尿路上皮癌切除术前使用ipilimumab和nivolumab的效果。与ABACUS和PURE-01研究相比，治疗结果与肿瘤内CD8+T细胞浸润或Teff信号的基线状态无关。相反，研究观察到，在获得完全应答的患者中，TMB升高与DDR基因改变频率升高之间存在一种趋势。无法获得完全应答的患者在基线样本中富含TGF-β基因表达特征，表明可能存在耐药机制。此外，还研究了TIL密度与反应之间的相关性，有趣的是，基线TIL与疗效之间没有相关性，但在治疗后获得CR的患者中观察到TIL富集。 这些观察结果并非膀胱癌所独有。NEOSTAR试验评估了nivolumab或nivolumab加ipilimumab作为可手术NSCLC患者的新辅助治疗。获得影像学或主要病理学反应的患者总体上比基线肿瘤样本的PD-L1更高。与单独使用nivolumab治疗相比，nivolumab加ipilimumab治疗后TIL、组织驻留记忆T细胞、TEFF和效应记忆T细胞的频率更高。 总体来说，基线PD-L1似乎可以预测ICI的反应。TMB、TIL和DDR等作为生物标志物也似乎很有希望，但需要进一步评估和验证。治疗方案的差异以及患者群体的异质性可能导致不同试验结果的不一致。随着新辅助免疫治疗和化疗-免疫治疗联合方案获得监管部门的批准，识别经验证的生物标记物以预测免疫反应对于帮助作出治疗决定至关重要。 小结 随着从化疗向靶向治疗和免疫治疗的过渡不断发展，研究人员将采用更复杂的临床试验设计，如靶向治疗和免疫治疗的联合，不同CI药物的联合，并且更加关注生物标记物的设计，这些生物标记物对预测单药或多药治疗方案的反应或耐药性具有更高的敏感性。 未来，很可能需要多参数的方法来确定最有可能对ICI治疗有反应的患者，开发基于组织的强大复合技术非常重要。这有助于更准备地描述TME的特征，并分析肿瘤和效应免疫细胞之间以及效应细胞和APC之间的相互作用。相关标记物的表达谱可能提示效应细胞的激活、抑制或耗竭状态，并提示耐药机制。 参考文献： 1.Microenvironmental regulation of tumourimmunity and response to immunotherapy. J Pathol. 2021 Jul; 254(4):374–383. 公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！ 公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。