基因治疗CMC避坑指南 | 专题二：病毒载体的生产上下游工艺的选择

2024-06-19

基因疗法临床申请

众所周知，近年来基因治疗迅猛发展，已有数十款药物陆续上市。国内的研发管线也在爆发中，陆续有产品进入IND/BLA的审批阶段。FDA在药品审批时需要申请人提供基因治疗产品完整的CMC信息。CMC信息涵盖保障产品安全、鉴别、纯度、规格、效价这些质量属性。我们发现临床研究的各个阶段都有可能因为CMC问题导致hold，BLA阶段也会因为CMC问题导致退审。例如在Zolgensma的 BLA中，一共收到了64份IR，其中CMC相关共有38份，涵盖生产工艺、分析方法、稳定性等各个方面。据了解全球范围内因为CMC问题被延迟审批的占比在80%左右。比例之高令人咋舌，也让行业从业人员愈发重视CMC。然而中国的基因治疗行业发展还处于早期阶段，CMC人员缺乏专业的知识体系和经验，对技术和法规的把握都不够，给项目推进到商业化带来潜在巨大风险。为此，同写意联合基因治疗专业CDMO行诚生物赋能行业，推出【基因治疗CMC避坑指南】系列内容，旨在帮助行业人员系统学习CMC各个板块内容，快速补齐CMC短板，避免在CMC问题上踩坑走错路走弯路。系列内容将分别从以下四个模块十个专题详细阐述：基因治疗工艺开发 1.病毒载体的生产细胞选择及变更 2.病毒载体的生产上下游工艺的选择 3.质粒生产的污染及交叉污染风险解析分析方法开发 4.rAAV载体的基因组滴度测定及方法变更 5.生物活性分析方法的建立，验证及变更 6.复制型腺相关病毒rcAAV的检测及验证 7.阶段性适应的检测方法的建立，验证及方法变更质量控制和申报要求 8.阶段适应性的质量体系建立 9.基因治疗产品药学部分注册申报资料和技术要求 CDMO选择 10.基因治疗CDMO选择指南（关注我们，及时学习后续更新内容）专题二病毒载体的生产上下游工艺的选择已上市基因治疗产品在递送载体层面以病毒载体为主。可放大的，可重复的，稳健的上游和下游生产工艺对病毒载体的产品质量，安全性和有效性至关重要。病毒载体的生产工艺应考虑药物临床前，临床和商业化各个阶段的需求，选择适合于产品开发，来源清晰，满足法规要求的耗材和硬件。本期内容就将探讨病毒载体的生产上下游工艺选择。内容主要以AAV为例，介绍与生产上下游工艺选择相关的考量因素，相信对大家会有帮助。以最为常用的基因治疗载体rAAV病毒载体为例，一般的病毒载体生产上游的主要单元操作包括细胞扩增，病毒包装，病毒收获和深层过滤；下游纯化的主要单元操作包括粗纯，精纯和原液制备，流程如下所示：在进行病毒上下游工艺开发及物料选择时应考虑如下因素： 01 QTPP (目标产品质量概况)的确立 QTPP的确立是药物开发的基础，它前瞻性总结理想的制剂质量特征，确保预期质量，也兼顾制剂的安全性和有效性。QTPP包括：确定适应症，病毒载体类型（AAV, Lentivirus, Adv, HSV等），作用机理，给药方式（喷雾，涂抹，局部注射或全身给药等），剂型（喷雾剂，药膏，溶液或冻干粉末等），制剂浓度等信息。QTPP与产品质量，安全性，有效性息息相关，进而对下游生产工艺的选择产生重大影响。 02 病毒载体的类型常用的病毒载体有慢病毒（LV）、腺病毒（Ad）和腺相关病毒（AAV）、痘病毒和单纯疱疹病毒等。不同的病毒载体有不同的物理性质和生化特征。比如是否带有包膜（AAV及AdV为典型的非包膜病毒，Lentivirus及HSV为典型的包膜病毒），颗粒半径大小（AAV直径为20-25nm，AdV直径为70-90nm。Lentivirus直径为80-120nm, HSV直径为110-200nm），等电点范围（大多数病毒pI均小于7，偏酸性），对pH，离子强度，温度的敏感性等（与非包膜病毒相比，包膜病毒更容易受到酸碱，盐浓度，温度和剪切力等外界因素的影响）。在选择和设计制备工艺的时候，应充分考虑工艺参数，物料，操作方式，中间体控制等因素对于病毒理化特征的影响，最大程度地开发能够保证病毒质量的工艺流程。 03 细胞复苏与扩增上游生产阶段的细胞复苏与扩增目的是积累足够的细胞量用于病毒生产，是大规模病毒生产的起始步骤。首先，应特别注意细胞复苏的操作流程和过程控制。冻存管中的细胞通常保存在含有DMSO的培养基中（一般为5-10%），整个细胞解冻和接种的工艺时间应严格控制，尽量避免因复苏过程操作不当影响起始的细胞状态。细胞复苏后的活率和细胞密度也应设定一定的控制范围，保证细胞扩增可以按照预设的计划进行。后续的细胞培养需要设计高效且稳定的传代策略，既能保证以较小的传代次数积累到想要的细胞量，又能预留一些空间给正常的细胞生长波动，或者当一些非正常的工艺偏差（如摇床断电，培养液损失等）发生时。细胞传代依然可以进行下去。悬浮细胞在扩增阶段一般采用摇瓶在37°C摇床中培养的形式。对于部分敏感和不稳定的细胞株，摇瓶的种类大小，装料体积，以及摇床的转速和轴距需要在工艺开发阶段摸索清楚。对于易结团的细胞株，建议控制每一代培养的细胞终浓度不要过高，以免影响到计数的准确度和传代工艺的稳定性。当需要积累大量的细胞用于病毒包装时，可选用一次性摆床反应器（Wave Bioreactor）。摆床反应器需重点优化培养过程中的摆速和角度，以及通气的速率和PID控制，以保证细胞能够承受的剪切力条件下，实现培养液的充分混合以及高效的气体交换。 04 病毒包装生产细胞培养系统分贴壁细胞或悬浮细胞，早期获批的部分AAV, LV产品的包装采用贴壁细胞，但目前的趋势是越来越多的AAV, Lentivirus的包装主要采用悬浮系统，HSV仍然采用贴壁生产；病毒包装系统的主要生产平台包括哺乳动物细胞（HEK293，BHK细胞），昆虫细胞（sf9细胞）；从包装的方式来说，AAV，LV可采用质粒的瞬转或外源辅助病毒感染生产，目前也有稳转的包装细胞株和生产细胞株等方式。在生产过程中选择合适的生产系统将直接决定最终的工艺表现和产品的质量控制。对于最常用的AAV 病毒载体，目前最主流的生产系统为HEK293细胞三质粒瞬时转染的方法和SF9细胞杆状病毒感染的方法。国外上市的AAV 基因治疗药物均采用这两种系统制备。对于瞬时转染的体系，需重点优化三质粒的摩尔比例，质粒的添加量，转染试剂的种类和添加量，细胞密度等技术参数，因为这些参数都可以直接影响到病毒产品的产量和纯度（空壳率）。转染过程对生产操作提出了很高的要求，不仅要严格控制质粒转染的工艺操作（如DNA与转染试剂混合时间，转染时的细胞密度等），还需充分考虑工艺放大后的影响（限制瞬时转染体系规模的主要因素就是转染工艺）。对于辅助病毒的体系，需重点优化辅助病毒添加的MOI, 细胞密度以及病毒的收获时间等工艺参数。辅助病毒的方法相对来说受生产规模的影响较小，但仍需关注工艺放大过程中对于细胞生长状态和代谢的影响。AAV的生产采用悬浮培养的细胞株是工艺发展的必然趋势。无论是瞬时转染的体系还是辅助病毒的体系，都需在大规模生物反应器中完成病毒包装。因AAV生产的规模一般不会太大，所以建议采用一次性的生物反应器进行GMP生产。病毒包装所需要的最佳细胞密度一般不会太高，对于在工艺放大过程中的生物反应器控制挑战不会太大。但仍应特别注意反应器控制参数（如pH，DO，转速，气体控制等）对于细胞生长，活率和代谢的影响，尤其是转染前后应保证最佳的细胞状态。 05 细胞裂解与病毒收获 AAV病毒包装完成后，需进行细胞裂解，才能将病毒颗粒释放到上清中。少量的上游培养液可采用冻融的方式进行细胞裂解，大规模生产中现在通常采用化学裂解的方法，主要依赖非离子型去垢剂，如Tween 20，Triton X-100（注意EMA及NMPA法规建议不使用Triton X-100做为细胞裂解剂）等。细胞裂解是否充分直接决定了病毒收获的效率，因此裂解试剂的选择，浓度，和裂解时间都需要一定的工艺优化。细胞裂解后，会有大量的细胞内核酸杂质与病毒产品一并释放到上清液中。一般在收获过程中会添加全能核酸酶对核酸杂质进行消化处理，这样可以有效地提升深层过滤的工艺表现，以及后续纯化步骤对于杂质的去除效率。核酸酶的处理时长建议不要太短（一般2h以上），尤其在大规模生产中，核酸酶处理不充分会降低病毒收获步骤的得率。前些年，Benzonase是最广泛应用的全能核酸酶。目前市面上出现了多款表现优异的全能核酸酶产品可供选择。如需进一步提高核酸消化效率，新型的耐高盐核酸酶也是不错的选择。酶处理结束以后，可调节收获液渗透压，并进行深层过滤去除杂质和降低浊度。深层过滤的滤膜种类，载量和顶洗等需要经过细致的优化，以尽可能避免AAV病毒载体在收获过程中的损失。 06 澄清料液的浓缩和换液（TFF1）通常澄清收获液中病毒滴度较低，为提高上样载量，降低层析工艺时间，去除部分过程相关杂质以及调整病毒所处缓冲液环境，在层析前会采用切向流过滤的方式对澄清收获液进行浓缩换液。切向流过滤主要有三种形式：板膜，中空纤维和卷膜，板膜为开放流道，放大时多采用多块堆积的方式，金属板夹内部设有流道，不易清洁，给微生物负荷带来挑战；中空纤维具有剪切力可控，不需要外部夹具支持，使用简单等特点，非常适合病毒产品的浓缩换液，但很难线性放大，并且对液体传输设备要求较高，滞留体积也需要考虑；卷膜是一种非常新颖的切向流过滤形式，具有即拆即用，一次性使用无需清洁验证等特点，可用于原液的缓冲液交换和浓缩。切向流过滤膜材质，市场上主流有PES, mPES, RC等材质，材质的差异带来的非特性吸附不同及清洁试剂的选择。孔径或MWCO（截留分子量）也从微米，数kDa到纳米不等。以AAV的澄清料液的TFF为例，可以选择中空纤维或者板膜，材质以mPES为主，MWCO可选择100 kDa或300 kDa，不同供应商MWCO测试方法可能有差别，建议平行对比收率，通量及杂质去除率加以评估。在TFF工艺开发过程中，需要优化的参数集中在剪切力（进口端流速），跨膜压与通量之间的关系，探索剪切力和工艺时间对病毒活性的影响，当然渗滤缓冲液的选择也非常关键。总体而言，基于QTPP中病毒载体种类，给药方式，适应症等信息，生产规模，选择适合的TFF形式，材质及孔径为工艺开发和将来放大生产指明方向。 [Royce J, Liderfelt J, Robinson C. Filtration Methods for Use in Recovery Processes. Biopharmaceutical Processing, 2018:295-315. 07 病毒的捕获及粗纯（Capture）与单抗药物纯化相比，病毒纯化并没有平台工艺，不同的病毒类型，甚至是同一种病毒的不同血清型，纯化工艺也可能千差万别。随着细胞基因治疗的兴起，病毒捕获技术也随之更新换代：从离子交换捕获到亲和层析捕获（纯化效果好，操作简单），从针对单一AAV血清型的亲和填料到适合广谱AAV血清型的亲和填料（工艺平台性增强），从纳米抗体配基到多肽或重组蛋白配基，从不耐碱清洁到耐0.5M NaOH再生（更好的清洁效果，有效降低生物负载，防止交叉污染；使用寿命长，生产成本低），从有机合成基架到交联琼脂糖基架（生物兼容性更优），从常规颗粒填料到膜层析、整体柱（病毒粒径大，常规颗粒填料开孔小或无开孔，病毒只能与填料外部配基相互作用，载量一般较低；膜层析及整体柱的孔径或流道内径大，液体流通平流为主，保留时间短，配基利用率高）等。最新的进展既包括基架的改变也有配基物化性质的提升。以AAV亲和为例，国外供应商包括Cytiva, Thermo fisher, Repligen等公司，有血清广谱型亲和填料，也有血清专一性的亲和填料。国外也公司推出了LV的亲和层析填料，国内也有部分公司推出了AAV亲和层析填料，纯度和收率都不输于国外品牌。在AAV亲和生产工艺开发过程中，可以根据病毒血清型和平台特点，选择不同的亲和层析填料，工艺参数的优化主要集中在上样保留时间，洗杂缓冲液，洗脱缓冲液，包括pH，盐的种类，添加剂等。参数优化可以通过高通量筛选平台完成，基于载量，收率，杂质水平，洗脱缓冲液对活性的影响等来确定亲和填料和相应参数。QTPP中预设的适应症，适应人群，给药方式，剂量等决定了未来生产规模，生产频次等，这些与填料寿命和成本相关，应在早期开发中根据需求设计。 08 病毒的精纯（Polishing）在病毒的捕获及粗纯过程步骤中，大部分过程相关杂质被去除，比如培养基组分，HCP，HCD，裂解试剂，核酸酶等，但产品相关杂质，如空壳病毒，部分包装病毒及病毒聚集体依然存在。为了提高药物安全性，产品相关杂质需要在精纯步骤中去除，残留量必须控制在一定水平。以AAV为例，在精纯过程中主要去除空壳病毒，部分包装病毒和进一步去除过程相关杂质，市面上主流的精纯方法为超速离心和离子交换层析：超速离心主要利用空满壳病毒，杂质之间的沉降系数差异进行分离，已有成熟工艺，适合所有AAV血清型，易于平台化，但是硬件投入大，劳动密集，属于Scale out放大，主要适用于POC研究，PCC确立等项目早期开发阶段等，虽然目前已经商业化的大部分AAV产品纯化采用了超速离心，由于新的层析技术的不断涌现提高，未来的主流趋势是采用层析的纯化方法，如离子交换层析纯化rAAV利用空满壳病毒的等电点差异进行分离，越来越多的文献和专利报道离子交换在AAV精纯中的应用：几乎所有的血清型都有对应的离子交换层析精纯方法。由于离子交换层析的优异的放大性和可控的成本逐渐成为主流，从工艺开发水平上来说，开发稳定，可重复，可线性放大的工艺对产品开发方或CDMO提出了更高的要求。在离子交换层析工艺开发中，主要涉及到填料的选择。首先利用高通量筛选平台，根据填料的载量和相应洗脱产物纯度来初步确定填料种类，然后考察平衡缓冲液条件，上样条件，洗杂条件，洗脱条件等，优化参数主要为：pH，电导，缓冲剂种类，添加剂等。最后根据载量，收率和纯度确定离子交换填料工艺参数。与前面类似，结合QTPP中预设参数，应在早期开发中根据需求来设计筛选参数并不断提升。值得注意的是，在早期开发过程中，对滴度，空满壳，活性和关键残留水平的检测十分重要，过程中收集并分析大量的数据可以不断提升设计，持续优化，对工艺的提升，开发稳定，可重复，可线性放大的，成本可控的工艺提出了更高的要求。 09 病毒精纯产物的浓缩换液（TFF2）在下游生产工艺开发过程中，原液的制备（Drug Substance, 简称DS）是非常关键的一环。根据QTPP的预设，产品需要达到一定浓度，并且能够在临床阶段保持稳定和活力。与抗体或重组蛋白药物相比，一般来说病毒载体产品DS体积小，可以直接选择中空纤维柱或者卷膜进行浓缩换液，与TFF1比较类似，但也有不同，在TFF2中增加了对于过程的监控以及终浓度的控制。在TFF2工艺开发过程中，通常可以考察剪切力，工艺时间对病毒粒径和浓度的影响。另外，制剂缓冲液筛选也应该与工艺开发同步进行，主要通过滴度，粒径分布以及Potency实验考察稳定性及活性，提前开展预设浓度最差条件的考察。综上所述，病毒载体的生产上游和下游工艺应基于QTPP的预设参数，根据病毒的自身特征和将来放大规模进行合理的选择。同时，上游和下游生产工艺的选择与开发，与研发，QC和临床等部门高度相关。病毒载体上下游生产工艺也面临诸多挑战，比如工艺放大困难，产量难以满足需求，项目开发周期长，纯化得率低，空壳及部分包装病毒去除，核酸残留等。行诚生物对上游和下游生产工艺进行整体考虑，通过高通量筛选平台，进行全模块优化，能够快速的对AAV项目进行生产工艺开发，确认，转移和生产放大，上游产量在多个AAV血清型实现>1E12vg/mL, 终产品空壳率小于5%，目前已在在多个项目中得到验证。基因治疗CMC避坑指南系列文章 1.基因治疗CMC避坑指南｜专题一：病毒载体的生产细胞选择及变更关于同写意同写意论坛是中国新药研发行业权威的多元化交流平台，二十年来共举办会议论坛百余期。“同写意新药英才俱乐部”基于同写意论坛而成立，早已成为众多新药英才的精神家园和中国新药思想的重要发源地之一。同写意在北京、苏州、深圳、成都设立多个管理中心负责同写意活动的运营。尊享多重企业/机构会员特权 ● 分享庞大新药生态圈资源库； ● 同写意活动优享折扣； ● 会员专属坐席及专家交流机会； ● 同写意活动优先赞助权； ● 机构品牌活动策划与全方位推广； ● 秘书处一对一贴心服务。入会请联系同写意秘书处同写意创新链盟机构（上下滑动查看更多）立迪生物 | 森西赛智 | 汇芯生物 | 申科生物 | 方拓生物 | 东抗生物 | 科盛达 | 依利特 | 翊曼生物丨锐拓生物丨复百澳生物丨圆因生物丨普洛斯丨华润三九丨皓阳生物丨人福医药丨广生堂药业丨澳宗生物丨妙顺生物 | 荣捷生物丨行诚生物 | 宜联生物 | 生命资本 | 恒诺康丨益诺思 | 深圳细胞谷丨佰诺达生物 | 沃臻生物 | 金仪盛世 | 朗信生物 | 亦笙科技 | 中健云康 | 九州通 | 劲帆医药 | 沙砾生物 | 裕策生物 | 同立海源 | 药明生基 | 奥浦迈 | 原启生物 | 百力司康 | 宁丹新药 | 上海细胞治疗集团 | 滨会生物 | FTA | 派真生物 | 希济生物 | 优睿赛思 | 血霁生物 | 优睿生物 | 邦耀生物 | 华大基因 | 银诺生物 | 百林科医药 | 纳微科技 | 可瑞生物 | 夏尔巴生物 | 金斯瑞蓬勃生物 | 健元医药 | 星眸生物 | 格兰科医药 | 莱羡科学仪器 | 明度智云 | 玮驰仪器 | 康源久远 | 易慕峰 | 茂行生物 | 济民可信 | 欣协生物 | 泰楚生物 | 泰澧生物 | 谱新生物 | 思鹏生物 | 领诺医药 | 宜明生物 | 爱科瑞思 | 阿思科力 | 博格隆生物 | 百吉生物 | 迈邦生物 | 多宁生物 | 万邦医药 | ASCT | 为度生物 | 比邻星创投 | 赛桥生物 | 吉美瑞生 | 荣泽生物 | 科金生物 | 汉超医药 | 康日百奥 | 汉腾生物 | 力品药业 | 安必生 | 博瑞策生物 | 中盛溯源 | 深研生物 | 东方略 | 赛赋医药 | 克睿基因 | 安润医药 | 镁伽科技 | 科锐迈德 | 和元生物 | 申基生物 |楷拓生物| 森松生命科技 | 凯理斯 | 尚德药缘 | 晟国医药 | 健新原力 | 纽福斯 | 华东医药 | 士泽生物 | 影研医疗科技 | 新格元生物 | 依生生物 | 腾迈医药 | 汉欣医药 | 恒驭生物 | 盛诺基 | 序祯达生物 | 乐纯生物 | 速石科技 | 耀海生物 | 新合生物 | 华龛生物 | 恺佧生物 | 成都凡微析 | 正帆科技 | 大橡科技 | 博雅辑因 | 因美纳 | 博雅控股集团 | 近岸蛋白 | 依科赛生物 | 利穗科技 | 东南科仪 | 倍谙基 | 辉诺医药 | 圣诺制药 | 埃格林医药 | 科镁信 | 爱思益普 | 复星医药 | 齐鲁制药 | 捷思英达丨荣昌生物丨泽璟制药丨奕安济世丨礼新医药丨维立志博丨派格生物丨赛生药业丨呈源生物丨启德医药丨双运生物丨宝船生物丨曙方医药丨澳斯康生物丨普莱医药丨维健医药丨海昶生物丨征祥医药丨智核生物丨望石智慧丨博生吉医药丨南京诺丹丨四星玻璃丨艾米能斯丨霁因生物丨普瑞康生物丨映恩生物丨康哲生物丨霍德生物丨海慈药业丨沃生生物丨睿健医药丨矩阵元丨斯微生物丨则正医药丨预立创投丨东立创新丨博安生物丨伟德杰生物丨星奕昂生物丨耀乘健康科技丨琅钰集团丨康德弘翼 | 原力生命科学丨上海科洲丨特瑞思丨药源丨健艾仕生物丨冠科美博丨微境生物丨天境生物丨合源生物丨泛生子丨创胜集团丨加科思药业丨丹诺医药丨凌科药业丨偶领生物丨凯斯艾生物丨成都圣诺丨松禾资本丨清普生物丨和其瑞丨开拓药业丨科兴制药丨玉森新药丨水木未来丨分享投资丨植德律所丨奥来恩丨乐明药业丨东曜药业丨君圣泰丨海创药业丨天汇资本丨再鼎医药丨济煜医药丨百英生物丨基石药业丨君实生物丨Sirnaomics,Inc.丨亦诺微丨博腾股份丨思路迪诊断丨艾博生物丨普瑞金生物丨未知君生物丨尚健生物丨阿诺医药丨有临医药丨赛业生物丨睿智医药丨博济医药丨晶泰科技丨药明康德丨创志科技丨奥星集团丨苏雅医药丨科贝源丨合全药业丨以岭药业丨科睿唯安丨DRG丨博瑞医药丨丽珠医药丨信立泰药业丨步长制药丨华素制药丨众生药业丨上海医药丨高博医疗集团丨药渡丨君联资本丨集萃药康丨诺思格丨精鼎医药丨百利药业丨Pfizer CentreOne丨默克中国创新中心丨奥来恩丨瑞博生物丨新通药物丨广东中润丨医普科诺丨诺唯赞丨康利华丨国信医药丨昆翎丨博纳西亚丨缔脉丨一品红丨和泽医药丨博志研新丨凯莱英医药丨汉佛莱丨英派药业丨京卫制药丨海思科药业丨宏韧医药丨开心生活科技丨哈三联丨Premier Research丨宣泰医药丨先声药业丨海金格丨普瑞盛医药丨Informa丨科特勒丨谋思医药丨HLT丨莱佛士丨辉瑞丨科林利康丨冠科生物丨科文斯丨卫信康丨龙沙（Lonza）丨美迪西丨阳光诺和丨润东医药丨勃林格殷格翰（中国）丨艾苏莱生物丨领晟医疗丨驯鹿医疗丨燃石医学丨中肽生化丨鸿运华宁丨泰格医药丨易迪希丨希麦迪丨百奥赛图丨迪纳利丨青云瑞晶丨鼎丰生科资本丨中源协和丨维亚生物丨青松医药丨中科谱研丨长风药业丨艾欣达伟丨鼎康生物丨中晟全肽丨海步医药丨勤浩医药丨奥萨医药丨太美医疗科技丨生特瑞丨东富龙丨Cytiva丨优辰实验室丨苏桥生物丨君达合创丨澎立生物丨南京澳健丨南京科默丨东阳光丨亚盛医药丨杰克森实验室丨上海科州丨三优生物丨三迭纪丨泰诺麦博丨Cell Signaling Technology丨PPC佳生丨澳斯康丨先为达丨智享生物丨锐得麦丨宜明昂科丨明济生物丨英百瑞丨六合宁远丨天津天诚丨百拓生物丨星药科技丨亓上生物丨真实生物丨引光医药丨方达医药丨高博医疗集团丨赞荣医药丨国投创新丨药明生物丨康哲药业丨高特佳投资丨普瑞基准丨臻格生物丨微谱医药丨和玉资本 | 倚锋资本