Onasemnogene abeparvovec

摘要：基于动物细胞的表达平台能够生产复杂的生物分子，如重组蛋白和病毒载体。尽管大多数生物治疗药物是在动物细胞系中生产的，但在人类细胞系中的生产也在扩展。使用人类细胞系的一个重要优势是，由此产生的生物治疗药物更有可能携带更多“类人”的翻译后修饰。在人类细胞系中，由于其高转染性、快速生长速率以及在无血清悬浮培养中生长的能力，HEK293细胞被广泛利用。在这篇综述中，我们讨论了HEK293细胞及其亚型在生产生物治疗药物中的使用。我们还比较了它们与其他常用宿主细胞系在每类生物治疗药物中的使用情况，并总结了影响宿主细胞系选择的因素。 1. 引言 复杂生物制药产品的生产在很大程度上依赖于哺乳动物细胞系，其中大部分治疗性生物制药是在中华仓鼠卵巢（CHO）细胞中生产的。使用哺乳动物生产细胞可以实现具有复杂翻译后修饰（PTMs）的生物制品的生产。抗体、生长因子和凝血因子等复杂生物制品需要复杂的PTMs来确保产品的稳定性和效力。然而，并非所有生物制药产品都能在CHO中生产。由于CHO无法满足某些PTMs的要求，一些重组蛋白是在HEK293中生产的，而且大多数治疗性病毒载体也是在HEK293中生产的。自2015年以来，已有七种基于HEK的产品获得FDA批准（表1）。 表1 | 2015年以来在HEK293中生产的FDA批准的生物制品 其中，有六种是细胞和基因疗法（Mullard，2016，Mullard，2017；Mullard，2018；Mullard，2019；Mullard，2020；Mullard，2021），在这些疗法中，HEK293细胞系或其衍生物被用于病毒载体的生产。随着越来越多的细胞和基因疗法正在开发中，我们将看到HEK293在病毒载体生产中的使用相应增长。 2. HEK293细胞及其衍生物 HEK293细胞系是通过将人类胚胎肾细胞与剪切的腺病毒5型DNA进行转化而建立的。自那时以来，已经建立了许多亚型和衍生物，其中HEK293、HEK293-T和HEK293-F经常用于生物制药的生产。HEK293-T是HEK293细胞系的衍生物，通过表达温度敏感的SV40 T抗原突变体而建立。T抗原的表达允许携带SV40复制起点的质粒在转染到细胞时复制。HEK293-F细胞是GIBCO®品牌的细胞，从HEK293克隆而来，并适应了无血清介质中的悬浮培养。在重组蛋白生产中常用的其他值得注意的HEK293衍生物包括HEK293-E和HEK293-6E。通过表达Epstein-Barr核抗原1（EBNA-1），建立了HEK293-E，这允许具有oriP的质粒进行染色体外复制。类似地，通过表达缺少Gly-Gly-Ala域的截断EBNA-1，建立了HEK293-6E细胞系。与HEK293-E相比，HEK293-6E显示出改善的瞬时基因表达和细胞生长。 3. 在HEK293中生产重组蛋白 真核表达系统用于生产具有复杂PTMs的复杂重组蛋白，以确保蛋白质的正确功能。使用HEK293宿主细胞消除了由于非人类PTMs存在而引起的潜在免疫原性问题。它的转染容易和相对较高的蛋白质生产力使其成为科学研究中小规模生产重组蛋白的受欢迎选择，并且它适应悬浮无血清培养的能力促进了它在大规模生物治疗药物生产中的使用。 由于转染容易，HEK293广泛用于瞬时基因表达（TGE）。可以通过使用如磷酸钙或聚乙烯亚胺（PEI）等现成的试剂转染HEK293，快速生产重组蛋白。这种转染过程已在搅拌槽生物反应器中得到证明，并且是实验室到临床前使用快速生产重组蛋白的好方法。HEK293E和HEK293-6E在TGE中广泛使用，因为使用具有Epstein-Barr病毒oriP的质粒显著改善了TGE。然而，TGE在重组蛋白生产中的主要缺点是需要大量的转染级质粒DNA。 稳定生产细胞系被优先用于重组蛋白的大规模生产。最新的HEK生产的重组蛋白治疗药物NUWIQ®是在HEK293F细胞中生产的。NUWIQ®是一种重组凝血因子VIII（FVIII）。它通过将B域删除的人类FVIII表达构建物转染HEK293F细胞而生产。选择稳定转染体后，选择表现出最佳生产的克隆用于使用。 可以通过基因扩增技术增加生产细胞系中的蛋白质产量。在HEK293细胞中已经证明了使用谷氨酰胺合成酶（GS）介导的基因扩增和选择系统，这可以提高重组蛋白的产量。通过将重组人促红细胞生成素与谷氨酰胺合成酶在双顺反子载体中结合，经过甲硫氨酸亚砜（GS抑制剂）的顺序增加后，促红细胞生成素的表达显著提高。基因扩增技术的应用可以扩大人类细胞系，如HEK293在治疗性重组蛋白生产中的使用。 3.1. HEK中重组蛋白生产的未来 宿主细胞对生产的生物治疗药物的糖基化谱有重大影响。在NUWIQ®的情况下，与CHO或BHK生产的rFVIII相比，HEK293生产的rFVIII表现出改善的功能和降低的免疫原性，因为它完全硫酸化，并且不含有抗原性的Neu5Gc或α-Gal表位。与CHO细胞相比，HEK293细胞在谷氨酸的γ-羧化和酪氨酸残基的硫酸化方面具有更大的能力。这些PTMs是分别对Drotrecogin alfa和重组因子IX等治疗性糖蛋白所必需的。 尽管由于特定的PTM要求，一些生物治疗药物仍在如HEK293的人类细胞系中生产，但大多数复杂的重组糖蛋白是在CHO中生产的。在生物制药行业中可用的哺乳动物表达平台中，中华仓鼠卵巢（CHO）细胞用于生产约70%的重组生物制品，特别是单克隆抗体。CHO细胞之所以广泛使用，是因为它们高产，能够在无血清、化学定义的细胞培养介质中悬浮培养。此外，CHO生产的重组蛋白携带类人PTMs，这改善了生物活性并由于缺少α-半乳糖表位而降低了免疫原性。 与HEK相比，CHO细胞不能完全复制人类糖结构。这是因为CHO细胞不表达在人类细胞系中表达的酶β-半乳糖苷α2,6-唾液酸转移酶、α1,3/4岩藻糖转移酶或β-1,4-N-乙酰葡萄糖胺转移酶III。此外，由于它们表达胞苷酸N-乙酰神经氨酸酸水解酶，CHO生产的糖蛋白带有潜在免疫原性的N-羟乙酰神经氨酸。由于具有理想糖基化谱的糖蛋白可以表现出更高的效力、稳定性、半衰期和降低的免疫原性，HEK293作为宿主细胞系的优势在于对生产的生物治疗药物特定糖基化谱的要求。CHO的这种限制可以通过工程改造细胞来克服，使其能够生产具有理想糖基化谱的糖蛋白。所需的和理想的糖基化谱可以通过表达在人类中发现的酶或敲除在人类中不存在的酶来工程改造。随着CHO细胞糖基工程的这些发展，我们预见到HEK293作为治疗性重组蛋白生产的宿主细胞的使用将进一步减少。 4. HEK293中病毒载体生产的前景 HEK293常用于病毒载体的生产。由于存在腺病毒E1A/B基因，它们在病毒载体生产期间提供辅助功能，因此被用于腺病毒和腺相关病毒载体的生产。在逆转录病毒载体生产中，由于细胞系中表达SV40大T抗原，因此使用HEK293T。T抗原的表达允许携带SV40复制起点的质粒在转染到细胞时进行复制。也有报道说，大T抗原的表达改善了慢病毒载体的生产。然而，HEK293T中病毒滴度的提高并不能完全归因于T抗原对质粒复制或转录活性的影响，这表明还有其他间接效应和细胞系的特性，这些特性能够实现高滴度逆转录病毒载体的生产。 早期的病毒载体生产是一个挑战，因为生产是通过在含血清的培养基中短暂转染贴壁HEK293细胞进行的。最近在短暂转染技术、细胞系和培养基开发方面的进步已经证明，可以在化学定义的细胞培养介质中使用无血清悬浮基础转染过程进行病毒载体生产。此外，已经建立了稳定的病毒载体生产细胞系。这些发展一起使得在HEK293细胞中可扩展地生产病毒载体。 4.1. 当前逆转录病毒载体生产技术 逆转录病毒载体是包膜的单链RNA病毒。在这类病毒中，基于小鼠白血病病毒的γ-逆转录病毒（γRV）和基于人类免疫缺陷病毒1型的慢病毒（LV）通常用于基因疗法。这些逆转录病毒根据其基因组组织被广泛分类为“简单”和“复杂”逆转录病毒。简单逆转录病毒包含两组不同的病毒RNA，其中病毒基因组RNA与mRNA不同。在复杂逆转录病毒中，病毒基因组RNA充当mRNA。 由于逆转录病毒载体能够转导广泛的细胞类型，因此是基因转移的最佳工具之一。逆转录病毒转导可以稳定地改变转导细胞，因为逆转录病毒RNA基因组被逆转录病毒逆转录酶转换为DNA后，可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中。由于LV载体表现出比γRV载体较少的有害整合特性，它们在基因疗法中更广泛地使用。γRV和LV都被用于生产嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法。自2017年以来，已有四种FDA批准的CAR-T疗法，包括Yescarta、Kymriah、Breyanzi和Abecma。 对于γRV和LV载体生产，已经开发了不同的包装系统，每一代的开发旨在减少复制能力病毒（RCV）的风险。在γRV生产中，由于病毒基因是非细胞毒性的，已经开发了包装细胞系以促进γRV生产。在第三代γRV包装细胞系中，gag-pro-pol基因和包膜蛋白在不同的表达载体中稳定表达。然后通过转染包装细胞系与单一载体构建体来实现γRV生产，该构建体携带感兴趣的转基因、Ψ包装信号和改良的长末端重复序列（LTR）物种，以进一步最小化RCV形成的风险。 LV基因的细胞毒性使得建立包装或生产细胞系具有挑战性。因此，四质粒短暂转染工作流程在LV载体生产中得到广泛利用。质粒携带：1）Gag-Pro-Pol，编码病毒结构蛋白和酶；2）Rev，表达对病毒基因组核输出至关重要的辅助蛋白；3）Env，编码与细胞受体结合以实现细胞进入的包膜糖蛋白；4）携带感兴趣基因的载体基因组。 逆转录病毒载体通常通过短暂转染贴壁HEK293T细胞生产。然而，从单层烧瓶中扩大生产是耗时的、劳动密集型的，并且需要大面积的工作空间进行细胞培养。为了提高过程的可扩展性，已经开发了几种无血清悬浮基础生产方法。悬浮基础生产方法在体积生产率方面与基于贴壁的生产方法相当（表2和3）。尽管在过程可扩展性方面有所改进，但逆转录病毒载体生产仍然具有挑战性。高质量转染级DNA和试剂的高成本以及批次间变异性和短生产周期导致了生产高滴度和一致性病毒载体的限制。 表2 | 不同γRV生产方法的比较 表3 | 不同LV生产方法的比较 4.1.1. 逆转录病毒载体生产的未来 为了提高γRV和LV生产的可扩展性，已经产生了稳定的生产细胞系。由包装细胞系开发的稳定、适应悬浮的生产商细胞系能够在无血清培养基中生产yRVs，已经开发出来以提高工艺可扩展性。随后，也开发了用于更安全、自灭活（SIN）yRVs的yRVs生产商细胞系。SIN载体最初是通过修改3个病毒LTR的U3序列开发的，这导致在转导细胞中整合时失去病毒增强子和启动子序列。这降低了RCV形成的风险，因为病毒启动子和增强子缺失，从而防止了载体的动员。此外，当与弱内部启动子结合使用以驱动感兴趣基因的表达时，可以降低遗传毒性风险。 由于所需基因的细胞毒性，开发稳定的LV生产细胞系具有挑战性。这可以通过使用细胞毒性较低的病毒蛋白酶突变体或包膜蛋白）或使用可诱导表达系统来克服。Tomás等人开发的LentiPro26稳定慢病毒载体生产细胞系，展示了在长达2个月的时间内稳定、持续的LV生产，同时保持与传统短暂转染基础生产方法相当的体积滴度。Chen等人证明，可以通过转染携带所有所需慢病毒载体组分的单一DNA构建体，快速生成稳定生产细胞系，将LentiPro26系统中生成和鉴定稳定生产克隆所需的时间从6个月缩短到大约4个月。在稳定的γRV和LV生产系统的进一步发展将提高γRV和LV的生产率，以满足这些载体在临床基因疗法应用中不断增长的需求。 4.2. 当前HEK中腺相关病毒生产的技术 腺相关病毒（AAV）是无包膜的单链DNA病毒，已被证明作为基因治疗载体的安全性和有效性。自2012年以来，已有三种批准的rAAV基因疗法，即Glybera、Luxturna和最近批准的Zolgensma。 重组AAV（rAAV）通常通过短暂转染含三个质粒的贴壁HEK293细胞生产，这三个质粒包含：1）腺病毒辅助因子，E4、E2a和VARNA；2）腺相关病毒rep和cap基因；3）由AAV ITR序列包围的货物基因。由于表达腺病毒E1a/b基因，这些基因对AAV生产至关重要，因此最常使用HEK293细胞进行rAAV生产。尽管HeLa细胞系在早期研究中被用于rAAV生产，但由于表达腺病毒病毒辅助基因E1A/B，提高了生产过程中的rAAV滴度，因此通常更倾向于基于HEK293的细胞系。 4.2.1. 基于辅助病毒的rAAV生产/HSV生产系统在HEK293中 rAAV也可以使用辅助病毒生产。野生型AAV需要与腺病毒共感染以进行有效的感染。早期的rAAV生产使用辅助病毒生产系统，通过感染携带AAV rep、cap和货物基因的重组辅助病毒来实现rAAV生产。通常使用两种重组病毒，一种携带rep和cap基因，另一种携带货物基因。这最小化了重组，从而降低了野生型AAV形成的风险。由于需要在纯化过程中将辅助病毒与rAAV分离，并需要证明纯化的缺乏复制能力的病毒，因此不偏爱使用基于辅助病毒的rAAV生产系统。 4.2.2. HEK293中rAAV生产技术的未来 尽管上述治疗的rAAV生产是在基于贴壁的系统中进行的，但最近也开发了基于悬浮的rAAV生产技术。已经在适应悬浮的HEK293细胞系中展示了rAAV生产，产量与现有的基于贴壁的生产系统相当（表4）。随着越来越多的悬浮基础方法被用于临床试验中rAAV治疗的生产，我们预见将从基于贴壁的生产方法转向更可扩展的基于悬浮的生产方法。 表4|不同rAAV生产方法的比较 为了提高rAAV生产的可扩展性，也已经开发了稳定的生产细胞系。CEVEC制药公司开发了ELEVECTA®生产细胞系，其中AAV生产基因在CEVEC的羊膜细胞生产（CAP）细胞中稳定表达，基因表达由可诱导启动子控制。只需诱导即可实现可扩展的rAAV生产，无需使用辅助病毒、转染试剂或质粒。 虽然rAAV通常在基于HEK293的系统中生产，但也开发了显示相当rAAV滴度的杆状病毒基系统。使用杆状病毒表达载体系统进行rAAV生产最初在2002年被描述，其中通过三种重组杆状病毒的共感染实现了rAAV生产，一个Rep-杆状病毒、一个Cap-杆状病毒和一个货物ITR杆状病毒，辅助功能由杆状病毒提供。 OneBac rAAV生产系统旨在通过将生产所需的重组杆状病毒数量从三个减少到一个来提高生产系统的可扩展性。这是通过生成稳定表达AAV rep和cap基因的Sf9细胞系实现的。这导致了一个更具可扩展性的生产系统，并且与基于HEK293的系统相比，滴度有所提高。 尽管所描述的系统展示了Sf9生产的和HEK293生产的rAAVs之间的类似功能，但最近的一项研究识别了两种系统生产的rAAVs之间的差异。在Sf9细胞中生产的rAAV衣壳与在HEK293中生产的衣壳相比，具有不同的翻译后修饰。在HEK293细胞中生产的rAAV基因组表现出增加载体效力的甲基化模式。尽管只测试了AAV1和AAV8血清型，但这表明由于改善的载体效力，更倾向于使用HEK293生产的rAAVs。除非未来评估的血清型显示Sf9生产的rAAVs可能具有改善的载体效力，否则将更倾向于在HEK293中生产rAAV。 4.3.腺病毒载体疫苗和溶瘤腺病毒的生产 腺病毒（AdV）是无包膜的双链DNA病毒。由于它们具有高基因组容量、高转导效率并且是非整合性的，具有高染色体外持久性，因此最初被用作基因治疗载体。然而，由于AdV基因转移后发生致命的全身炎症反应，它们在基因治疗中的适用性受到限制。尽管由于这一不幸事件，AdVs在基因治疗中的使用有所下降，但在期望引起免疫反应的应用中，AdVs的使用有所恢复。诱导强烈免疫反应的能力促进了传染病和癌症免疫疗法疫苗候选物的开发。AdV现在构成了临床试验中大部分病毒载体，其主要应用为疫苗或癌症疗法。 COVID-19大流行推动了腺病毒载体疫苗的快速发展及其最终的紧急使用。在世界卫生组织（截至2021年8月）批准用于紧急使用的三种腺病毒载体疫苗中，Ad5-nCOV和ChAdOX1-nCoV是在HEK293细胞中生产的，而Ad26.COV2-S是在PER.C6细胞中生产的。这些细胞被利用来生产AdV载体，因为需要在生产细胞系中转补病毒载体基因。 第一代AdV载体是通过用表达载体替换E1和/或E3区域生产的。E1基因产物对病毒生产是必要的，在HEK293或PER.C6等生产细胞系中跨补充。E3基因区域的产物对病毒复制并不重要，因此不需要补充。由于其他病毒蛋白的表达，第一代腺病毒载体引发免疫反应。在疫苗的情况下，引发的免疫反应特别有利。 随后的AdV载体涉及去除病毒基因以最小化这些载体在体内使用时引发的免疫反应。在第二代AdV载体中，已经灭活了额外的病毒复制所需基因。病毒生产是在表达E2和/或E4基因产物的细胞系中进行的。最后，在第三类“无病毒腺病毒”中，除了需要用于病毒DNA复制和包装的顺式作用DNA序列外，所有病毒基因都被去除了。对这些AdV生产系统的改进涉及减少序列同源性的修改，从而降低通过随机重组事件产生野生型AdV的风险或修改以最小化病毒传播期间的转基因表达以提高病毒生产。 4.3.1.其他腺相关病毒和腺病毒的生产系统 AdVs和AAVs的生产需要在HEK293细胞中跨补充腺病毒E1基因。然而，由于HEK293细胞是使用剪切的AdV基因组DNA产生的，E1基因携带与野生型AdV高度同源的DNA序列。在HEK293细胞中生产第一代E1缺失的腺病毒载体导致了带有E1序列的RCV的产生，这可能是由同源重组造成的。尽管使用了E1和E3缺失的腺病毒载体，但RCV的形成无法被消除。 为了减少同源性，使用定义的E1基因区域转化细胞系将减少在AdV生产期间通过随机重组事件产生野生型AdV的风险。PER.C6细胞系是通过将人类胚胎视网膜细胞与腺病毒5型E1基因的定义区域转染而建立的，该区域受人类磷酸甘油酸激酶启动子的控制。在PER.C6细胞中生产E1缺失的腺病毒载体没有产生复制能力病毒，允许以成本效益的方式生产AdV载体。 类似于PER.C6细胞，CEVEC的CAP细胞通过含有AdV 5的E1和pIX的载体永生化，目的是在不意外形成RCV的情况下高滴度生产复制缺陷的腺病毒载体。由于减少了意外RCV形成的风险，这些细胞系可能比HEK293更倾向于用于AdV生产。 5.结论 人类细胞系HEK293已成为治疗性病毒载体的主要生产平台。细胞系发展的进步将看到更多的HEK293克隆或衍生物被开发用于在无血清悬浮培养基中生长，用于高滴度病毒载体生产。当前的例子包括Thermo Fisher Scientific提供的商业化LV和AAV载体生产工作流程，其中他们的基于HEK293的病毒生产细胞（VPC）用于LV-MAX™系统和即将推出的VPC 2.0，用于他们的原型AAV-MAX系统中。 病毒载体生产技术的未来倾向于为AAV、LV和yRV生产开发稳定细胞系。这样的工艺使得在生产病毒载体时无需使用转染所需的昂贵试剂。在稳定生产细胞系中，CHO中的工艺发展导致糖蛋白产量提高了10-20倍。HEK293细胞培养基开发和工艺技术的进步可能导致稳定生产系统中病毒载体产量的类似提高。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：腺相关病毒(AAV)是基因治疗中最强大的载体之一。该载体的实验特性显示了其效率和可接受的安全性，这解释了科学家们在研究和治疗广泛疾病中增加使用它的原因。这些研究需要使用功能性、纯净且高滴度的载体颗粒。事实上，当前对AAV结构和基因组的了解有助于提高AAV载体的可扩展生产。在这篇综述中，我们总结了通过修改AAV基因组或细胞内生物过程来优化可扩展AAV生产的最新研究。 1. 引言 腺相关病毒（AAV）是一种能够感染人类和其他灵长类动物的小病毒。它们是非包膜病毒，属于依赖性细小病毒属，属于细小病毒科。这种小（20纳米）病毒最初在1965年被Atchison等人在腺病毒（Ad）制剂中作为污染物发现。已知有几种自然AAV血清型，其中AAV2是最被充分研究和最常用的。这些血清型在它们的衣壳结构上有所不同，导致它们在宿主生物体中的趋向性和免疫原性也有所不同。AAV有一个相对简单的基因组，是一种非致病性病毒，这就是为什么AAV载体是基因治疗中很有前景的病毒载体。此外，AAV在整合到宿主基因组中的频率较低，这表明其在临床研究中的安全性。AAV载体的另一个优点是它们能够提供稳定的转基因表达，这种表达在一些体内实验中可以持续超过一年。AAV已经被用于治疗中枢神经系统和视网膜退行性疾病，各种类型的肌营养不良症，以及心脏、肺和肝脏疾病。除了自然AAV血清型外，重组AAV（rAAV）血清型也包括在治疗不同疾病的前临床和临床试验中，例如血友病B。第一种基于AAV的基因治疗药物Glybera是针对脂蛋白脂肪酶（LPL）缺乏症患者。Glybera于2012年获得欧洲药品管理局（EMA）的批准，但后来在2017年因商业失败退出市场。当前基于AAV的基因治疗市场有两种FDA批准的基于AAV的基因治疗：1）Luxturna（voretigene neparvovec），2017年批准用于治疗Leber先天性黑蒙症，随后在2018年11月获得欧洲委员会的批准，2）Zolgensma，2019年批准用于治疗脊髓性肌肉萎缩症。这些药物的批准对基于AAV的基因治疗领域产生了巨大影响。此外，AAV也被研究作为癌症治疗的基因治疗工具。通过修改AAV衣壳以实现对癌细胞的更高转导效率是使用AAV载体靶向癌细胞的策略之一。另一种策略是使用AAV载体的自杀基因治疗方法。这种方法通过传递转基因到癌细胞来触发细胞死亡过程。AAV载体也用于称为DREADDs（仅由设计药物激活的设计受体）技术的非侵入性化学遗传技术。这项技术在行为神经科学中得到了广泛应用，其中AAV传递的DREADDs在体内调节G蛋白偶联受体（GPCR）活性。这种GPCR调节有助于研究人员理解大脑活动与行为以及神经疾病发病机制之间的联系。AAV-DREADDs已成功用于在小鼠模型中进行酒精消费研究和体外细胞神经网络研究。同样，AAV载体在不同的光遗传学方法中被用于治疗不同的视网膜退行性疾病和青光眼；所有正在进行的视网膜基因治疗临床试验都是基于AAV递送。AAV载体在光遗传学中的另一个应用示例是使用AAV载体进行聋沙鼠和老鼠模型中的听力恢复研究。AAV载体在不同科学领域中的应用强调了优化AAV生产的重要性，以满足研究需求。使用基于AAV的基因治疗的临床和前临床研究的数量不断增加，需要使用成本效益的方法进行AAV生产。为了优化AAV生产，已经进行了许多研究，包括上游和下游阶段。上游优化包括质粒修改，使用不同的细胞系和转染方法。目前，组装AAV颗粒最广泛使用和可用的方法是转染贴附的HEK293细胞培养。然而，即使在高比例的转染中，生产病毒颗粒的难度和效率不足，已成为研究其他组装系统的推动力。目前主要使用的是1）HEK293悬浮培养，2）SF9昆虫细胞与重组杆状病毒（rBV）表达载体，3）稳定的生产HeLa细胞，以及4）使用复制缺陷的单纯疱疹病毒（HSV）的平台。然而，每个平台在安全性、灵活性和多功能性方面都有缺点和限制。例如，尽管悬浮培养很容易扩展，但并非所有细胞在转染期间都接受到最佳数量和比例的质粒，这可能导致全衣壳的比例下降。使用昆虫细胞Sf9和rBV的结果与野生型病毒蛋白的比例不同。此外，在非哺乳动物细胞中组装的AAV的翻译后衣壳修饰和病毒DNA甲基化与在HEK293中组装的AAV不同，可能导致治疗副作用。在生产细胞系的情况下，为每种血清型和转基因创建新的亚克隆既耗时又具有制造挑战。因此，尽管这些系统看起来非常有前景，但需要进行许多优化以克服现有的困难，并创建一个健壮且通用的平台。另一种解决方案可能是通过修改AAV的基因组和结构来改善生产，例如增加产量、纯度和有效性。然而，由于AAV的详细生物过程尚未完全理解，仍然存在限制。在我们的综述中，我们专注于2020年至2023年在AAV基因组修改领域的最新同行评审文章，以提供新的和最新的信息和结果，这些可以用来实现更好的AAV生产产量，提高纯度、安全性和有效性。我们还提到了早期年份的文章，以提供一个完整的概述，说明已经做了什么。 2.  关于AAV的简要背景 AAV颗粒由一个4.7-kb的单链DNA基因组组成，被包装在直径约为260A的病毒衣壳中。这个大约3.8MDa的二十面体衣壳由60个亚基组成，这些亚基由3种不同的病毒蛋白（VPs）组成，它们仅在N-末端有所不同（图1）。 图1. AAV基因组由ITRs所夹，编码Cap和Rep AAV基因。 AAV的小包装能力被认为是使用AAV载体进行基因治疗的主要限制之一。AAV基因组由两个反向末端重复序列（ITRs）所夹，每个ITR大约为145bp长（图2）。 图2. 野生型ITR结构。 ITRs在AAV复制、转录调控和基因组包装中起着主要作用。AAV基因组包含两个主要的开放阅读框（ORFs），受3个启动子的控制（图1）。第一个ORF位于Cap基因中，通过不同的起始密码子编码三种病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3（分别为87 kDa、72 kDa、62 kDa）。Cap ORF还编码组装激活蛋白（AAP）、膜相关辅助蛋白（MAAP）和X蛋白，这些蛋白参与AAV生命周期，特别是在增加AAV2自主DNA复制（无辅助因子）方面，在分化的角质形成细胞中，这是其天然宿主组织，以及在Ad5感染的293细胞中AAV2 DNA复制。第二个ORF，Rep ORF的转录是在P5和P19起始位点启动的，它通过转录本的替代剪接导致AAV的四种非结构蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）的表达。大型Rep（Rep78和Rep68）已被证明具有位点特异性[5]和链特异性核酸酶活性，DNA-RNA和DNA-DNA解旋酶活性，以及DNA结合功能，所有这些似乎都是病毒复制和位点特异性整合到宿主基因组所必需的。小型Rep（Rep52和Rep40）对基因组包装是必需的。尽管这些Rep蛋白对复制很重要，但它们不足以产生有效的感染。AAV需要与辅助病毒共感染，无论是腺病毒（Ad）还是单纯疱疹病毒（HSV），才能有效感染。AAV感染过程的第一步是与细胞表面受体结合。AAV2、AAV3和AAV6与肝素硫酸蛋白多糖（HSPG）结合。AAV1、AAV4、AAV5和AAV6的其他细胞表面受体是唾液酸，而AAV9是N-末端的半乳糖，而AAVrh10与末端半乳糖的细胞表面糖链结合。AAV与细胞受体的结合是由与细胞表面的附着蛋白结合开始的，其中KIAA0319L（称为AAVR）是众所周知的。不同类型的附着蛋白和受体与不同的血清型相关，受体结合的这种多样性在血清型之间定义了不同血清型的不同的趋向性。尽管关于所有AAV血清型、细胞受体和蛋白之间相互作用的数据不多，但这些数据可以用来优化特定AAV血清型的生产细胞系。使用对血清型不利的细胞系进行特定血清型的AAV生产过程可能有帮助；通过这种方式，我们可以减少新产生的载体重新转导到生产细胞中，这可能导致更高的病毒滴度。AAV感染的下一步是向细胞核的内吞作用。定义了不同的AAV内吞途径。例如，AAV2感染具有CLIC/GEEC内吞作用的所有特征，这是一种非衣蛋白依赖性内吞途径，而AAV5感染途径主要是通过衣蛋白包被的小泡向高尔基体。AAV内体逃逸可以通过该隔室内部的pH值下降介导，这导致暴露在衣壳蛋白VP1（VP1u）独特的N-末端隐藏的磷脂酶A2（PLA2）结构域。之后，AAV颗粒进入核孔复合体，基因组释放发生在核进入期间或核内，并定位在与常染色质共定位的核周围，那里发生活跃的转录和DNA修复。对于野生型AAV，如果存在辅助病毒，基因组复制就会开始。事实上，这种复制是由AAV编码的Rep蛋白、辅助病毒编码的蛋白、宿主细胞复制蛋白RPA、RFC、PCNA和DNA聚合酶delta介导的；AAV ITRs作为转录的起始点，开始将单链AAV转换为双链AAV。这是AAV转导中的一个限速步骤，这就是为什么使用自互补AAV（scAAV）基因组可以绕过第二链的合成，同时逃避单链DNA降解，这使得scAAV载体能够快速启动转基因表达。然而，由于强大的基因表达，通过scAAV传递的转基因产物比通过单链AAV载体传递的转基因引起更强的免疫反应。脱壳后，单链基因组转化为双链的多聚体环状串联体形式，在有丝分裂后细胞中长期存在。值得注意的是，dsDNA转换后短时间内载体基因组的不稳定导致基因表达的显著丧失。这些步骤中的损失有助于整体效率的载体在每次转导事件中所需的VGP剂量。AAV脱壳和向核仁运输的详细机制仍然值得关注，因为这些步骤可以影响AAV新颗粒的合成和病毒基因组包装的效率。这就是为什么理解这些潜在机制至关重要，特别是在AAV载体生产协议和体内AAV趋向性研究中。 3. AAV基因组和结构的改造，以实现可扩展、优化的AAV生产 3.1. 病毒滴度、转基因表达和包装 在临床前和临床阶段测试基于AAV的基因疗法需要大规模生产，与体外实验相比，需要显著更高的载体颗粒滴度。目前，通过使用不同的细胞系、组装系统、转染类型和下游阶段优化，正在增加AAV产量。然而，基于rAAV基因组或结构改造的其他几种方法可以用来获得更纯净、功能更完善的AAV病毒颗粒的更高滴度。以下各节讨论了这些方法的示例。 3.1.1. ITRs结构改造 ITRs序列的变化可以显著影响AAV的复制和包装，从而更有效地生产病毒颗粒或改进载体变体。通过ITR序列改造，发明了自互补AAV（scAAV），这是治疗脊髓性肌肉萎缩症的重要成分，名为Zolgensma。这种结构是通过从其中一个ITR中移除trs获得的（表1），从而防止Rep68/78切割，结果是通过改变的内部ITR链接的复制载体基因组。将复制的基因组传递到细胞核促进自退火，形成双链DNA结构，无需完成第二链。因此，感兴趣的基因的转录，以及编码蛋白的表达，开始得更早，并保持在更高水平。 表1：ITR改造及其对AAV生产的影响。灰色字母，ITR结构中删除的核苷酸。红色字母，ITR序列中修改的核苷酸。更改是相对于野生型ITR的。 另一种修改ITR序列的方法是移除或突变非必要的ITR结构元素。大多数尝试改变ITR序列都导致了病毒基因组复制和/或包装的破坏。然而，一些ITR序列的删除，甚至只含有一个ITR结构的AAV基因组，并不会影响包装AAV基因组的能力。2017年，Zhou等人继续研究ITR区域删除对rAAV包装和表达的影响。提出BB’和CC’区域可能对rAAV复制和包装并不重要，创建了一个修改后的ITR（ITRΔBC rAAV）（表1）。研究表明，这两个ITR中的这些区域的删除并不影响包装，但将rAAV滴度降低了75%。Rep结合元素（RBE）和可被Rep68/78识别的trs在AA’区域的存在解释了rAAV包装的保存。ITRΔBC rAAV滴度降低的原因可能与缺乏RBE’有关，RBE’也对大Rep蛋白的相互作用至关重要，导致ITRs的解旋和在trs上形成“茎-环”结构。rAAV质粒中缺乏RBE’导致与野生型相比复制率较低，这与ITRΔBC rAAV的病毒基因组DNA复制减少8倍一致。因此，这可能是病毒滴度降低的原因。令人惊讶的是，ITRΔBC rAAV系统的转基因表达高于野生型，无论是体外还是体内。研究表明，在末端以T形发夹构象限制的具有回文末端重复的DNA分子容易受到共济失调毛细血管扩张突变（ATM）介导的基因表达丧失。删除BB’和CC’区域导致用一个简单的U形发夹替换了转录上沉默的T形发夹，不受ATM依赖性沉默的影响。因此，ITRΔBC的U形HP末端保持完整，不受ATM的影响，可能导致rAAV表达增加，这与由于ATM功能丧失导致的rAAV转导增强的报告一致。此外，Mre11（MRN）复合体，在AAV感染期间也识别并与AAV ITRs相互作用，限制了AAV转导。在MRN抑制剂存在的情况下，观察到转导效率的变化，与具有wt ITR的rAAV相比，ITRΔBC rAAV总是较低，表明BB’和CC’区域的删除降低了MRN复合体对AAV表达的抑制作用。 基于ITR和启动子结构的相似性，最新的ITR序列改造在2020年由Earley和同事发现，他们发现了多个转录起始位点（TSS），主要集中包含RBE的40 bp区域。ITR序列中TSS的存在，除了高含量的胞嘧啶和鸟嘌呤（64-70%）和高CpG二核苷酸频率（83-95%）外，类似于转录活跃的CpG岛（CGI），这是脊椎动物中最常见的启动子类型。可以假设ITRs作为CGI型启动子，可能在野生型AAV的生命周期中发挥作用。此外，未甲基化的CGIs是免疫刺激物，消除它们可以导致基因治疗的免疫反应减少。在最近的一项研究中，Pan实验室发现，完全没有CpG基序的ITRs（表1）将载体产量降低了约3倍，但有助于与野生型ITRs相同的基因组包装水平。没有CGIs的载体滴度较低可以通过减少载体基因组的复制来解释，这是可以预测的，因为CGIs通常是复制的起点。令人惊讶的是，野生型ITR载体和无CpG ITR载体在体内显示出相似的转基因表达水平和载体基因组的拷贝数。 3.1.2. MAAP改造 2021年，Galibert等人更详细地研究了MAAP2在AAV生产中的生物学。结果表明，MAAP的截断和失活导致Rep和AAP蛋白的表达水平更高。全长MAAP的存在展示了VP蛋白的特定降解产物。至少缺少MAAP蛋白C-末端最后10个氨基酸的缺失减少了衣壳的降解，并增加了衣壳蛋白的表达，而其他截断形式的MAAP完全阻止了AAV2衣壳的降解，这导致某些变体组装的衣壳增加了3.5倍。可以假设MAAP以某种方式影响衣壳降解和VPs的稳定性。也可以假设，由于截断形式或失活的MAAP导致AAP表达增加，这种蛋白直接导致防止VPs的降解并增加它们的稳定性。 3.1.3. AAP的作用 2010年，在AAV2基因组中发现了组装激活蛋白（AAP）。它是Cap基因蛋白之一，来自一个额外的嵌套的替代ORF（ORF2）和在非传统翻译起始位点的翻译启动。这项研究表明，这种23 KDa蛋白在将新合成的VPs共转运到核仁，它所在的位置，并在衣壳组装中发挥积极作用。 尽管AAP2的研究表明这种蛋白对衣壳组装至关重要，但这种趋势只是偶尔观察到。对不同AAV血清型的分析表明，AAP的需求根据病毒血清型显著变化。2017年，Grosse等人和Early等人证明，AAP的缺失将病毒颗粒的滴度降低了大约2.5到3000倍，与野生型相比，这些研究揭示了AAV4、AAV5和AAV11在衣壳组装中独立于AAP。2018年的进一步研究表明，血清型对AAP的依赖可以分为三类：（i）AAP独立，（ii）AAPC - 独立，或（iii）AAP依赖（表2）。 表2：AAV血清型对AAP的依赖性。绿色框表示AAP独立血清型（AAP的完全缺失导致约1%的WT滴度）。黄色框表示AAPC独立血清型（AAP C末端三分之二的缺失导致超过WT滴度的10%）。红色框表示AAP依赖血清型（AAP的完全缺失导致约1%的WT滴度）。 2017年，Grosse等人证明，在没有AAP的情况下功能性载体颗粒的生产（通过转导后GFP表达细胞的数量确定）可以通过不同血清型的转AAP的共表达来恢复（图3A）。有趣的是，与几种AAP血清型的共表达使AAV3的产量增加了约1.5倍，这表明AAV3组装直接依赖于AAP的保留。此外，AAP4和AAP5更有效地恢复了AAV4和AAV5的生产，可能由于这些血清型的衣壳和AAP序列与其他血清型有显著差异。有趣的是，AAP在AAP表达AAV变体中的过度表达并不增加功能性颗粒的产量，无论是野生型还是嵌合变体。因此，如果人工AAV变体不产生功能性颗粒或产量低，这并不一定与AAP的改变有关。相反，这可能反映了衣壳在组装成不能被AAP克服的病毒粒子方面的固有缺陷。这与另一项实验一致，在该实验中，通过DNA重组创造了八个不同血清型（主要是AAV2、8和9）的嵌合衣壳AAVDJ，进行了重组AAP的共表达（图3B）。结果表明，AAPDJ恢复了这三种没有AAP的AAV的生产，几乎与每种AAP本身相同。此外，它还成功地与其他血清型一起工作，除了AAV4和AAV5。此外，对60种不同的嵌合AAP的后续研究表明，它们至少保留了一些活性来恢复AAP敲除突变体。因此，在嵌合AAV生产期间生成嵌合AAP很可能不是限制因素。 图3. 10种缺乏AAP的辅助质粒与10种AAP变体的反式互补。 然而，在2018年，Viney和同事研究了AAV嵌合衣壳，其中VP3序列来自AAV6，VP1和VP2来自不同的血清型。他们发现，尽管这些嵌合体平均病毒滴度比野生型AAV6低3个对数，但它们显示出比野生型AAV6更高的转导能力（从1.5到2个对数）。假设这可能是由于AAP序列变化导致的AAP敲除引起的，恢复了野生型AAP6 N-末端的关键氨基酸序列（第13至27个氨基酸）。结果，它导致了病毒滴度的完全恢复，并将转导效率降低到野生型AAV6的水平。此外，AAP基因改变的嵌合体表现出所有三种衣壳蛋白表达减少。尽管不可能否认AAP在稳定衣壳生产中的基本作用，是否额外表达AAP会影响嵌合衣壳的组装和功能需要进一步研究。需要对各种血清型的AAP进行额外研究，以更好地了解AAV组装的生物学，并进一步应用这些知识生产重组病毒颗粒。 3.2. AAV生产动态的改造；满的与空的衣壳 3.2.1. AAV复制和包装的动态 了解AAV生产过程中的生物学过程有助于优化生产条件和材料，以获得更好的产量。2021年，Nguyen等人首次提出了基于机制的rAAV生产的动力学模型。他们在HEK293细胞上制作了模型。根据这个模型和文献数据，AAV DNA复制在细胞中大约在转染后12小时开始，比衣壳组装晚得多。复制在24小时达到峰值，并在48小时内达到稳定。相比之下，衣壳形成在转染后的头几个小时开始，并在24小时减少。结果，首先制作的衣壳在没有DNA的情况下离开细胞核，并且由于缺乏可用的衣壳，AAV基因组的包装受到限制。这就是为什么最初点上DNA复制动力学的变化可能影响完整病毒粒子的生产。为了促进DNA复制和衣壳形成，Rep和Cap蛋白可能被分割成两个不同的质粒，以确保Rep基因的早期表达。2016年，Emmerling和同事描述了一个具有分裂和修改的Rep和Cap基因的系统。他们已经证明，与标准质粒相比，这个系统允许滴度增加两倍多。此外，缩短的辅助质粒（10 236 bp而不是15 263 bp）显著增加了载体产量（2.7 × 10^5 VG/cell），这被解释为在短质粒的情况下，转染效率的增加和所需基因的拷贝数每给定量转染DNA的增加。 3.2.2. Rep基因改造 AAV2的Rep基因被广泛用于生产不同AAV血清型的载体，效率各异。使用与所生产血清型相对应的Rep基因代替Rep2可能会增加完整病毒颗粒的数量。使用AAV1、6或8的Rep基因显示出低或缺失的VP表达，以及与Rep2构建相比，剪接Rep蛋白Rep68和Rep40的蛋白表达减少，这可能由于位于Rep基因3'端的Cap基因启动子p40的不同活性，或由于mRNA剪接阶段的某些机制。为了恢复衣壳和Rep蛋白的表达，将AAV2 Rep的3'端（负责锌指结构的部分）引入到AAV1或AAV6中。令人惊讶的是，这种策略在AAV8中不起作用，VPs的表达是通过使用编码DNA结合域的AAV1 Rep的3'端区域恢复的。基于这些结果，Mckenna和同事创建了由AAV1、AAV2、AAV6和AAV8域组成的嵌合Rep基因，具有AAV2 Rep基因的共同3'端。这些嵌合组合增加了几个测试血清型的总衣壳比例2-4倍。因此，使用嵌合Rep基因而不是标准AAV2 Rep生产病毒颗粒可能是减少空病毒比例，从而提高转导效率的有希望的方法。 3.2.3. MAAP的作用 作为病毒出细胞因子，MAAP也可能在AAV生产动态中发挥作用。在2021年发表的一项研究中，Elmore和同事进行了一系列实验，证明MAAP8表达的减少导致病毒分泌延迟2天，而总病毒滴度变化最小。MAAP表达对AAV动态的影响影响了从细胞裂解物和培养基（上清液）中收集组装好的AAV载体的时间点。 3.3. 减少AAV生产污染物 3.3.1. P5启动子改造 除了Rep基因改造在减少空衣壳比例中的作用外，一些改造还可以帮助去除组装病毒中的非病毒DNA杂质。在2022年，Brimble和同事确定了从Rep-Cap生产质粒的上游AAV P5启动子包装的污染物序列到rAAV载体中。在这项研究中，研究人员证明，与P5启动子相关的DNA污染物可以在体外和体内有效转录和翻译。污染物还可以在小鼠中建立抗原特异性的CD8+ T细胞免疫。因此，这些污染物对AAV载体在基因治疗中的使用效率产生负面影响。包装这些污染物的可能原因是Rep结合位点（RBS）和P5启动子的Rep切割位点的接近，这可能是包装P5附近杂质序列的原因（图4）。尽管在体内P5启动子的活性已在肝细胞中显示，但仍需要研究其他组织中的这种活性。这在新的AAV衣壳工程中尤其重要，因为血清型对器官的转导效率可能如此之高，以至于这些污染物可能造成严重的负面影响。 图4. P5启动子结构和修改后的启动子结构。 为了解决这个问题，通过在P5的Rep切割位点和RBS之间通过大约5bp或100bp的间隔序列物理分离，获得了一个修改后的启动子。在同一研究中，测试了在大规模AAV生产中分离Rep切割位点和RBS的系统的效率。结果表明，该系统导致了更低的污染物，并且具有相同的病毒滴度，这些载体在小鼠中注射时与使用传统P5质粒生产的载体一样有效。 因此，总的来说，这个系统提供了Rep-Cap质粒污染的减少，无论使用的血清型和转基因如何，同时保持病毒滴度。因此，Rep基因改造可以显著提高生产的病毒载体的质量。 3.3.2. ITR改造 使用带有一份AD序列的PCR扩增转基因（表1）代替载体质粒也是有效包装rAAV的，这允许更长的转基因（约230个核苷酸），并且还减少了病毒颗粒中的DNA污染物量。这种rAAVs（rAAV-L-AD/DA）的包装效率变得比rAAV-pAD更高，并且污染物的辅助和包装质粒骨架也被发现在不足的水平，这意味着L-AD不与质粒重组形成嵌合产品。rAAV-L-AD在体外提供了约70%的转导效率（10^5 VG/cell），而rAAV-pAD的转导效率可以忽略不计，因为带有非载体基因组和空颗粒的病毒颗粒与完整颗粒竞争受体结合，抑制了其转导效率。 3.3.3. MAAP改造以减少污染物 MAAP对生产质粒包装的影响也被发现。在转染后72小时，观察到野生型AAV2被抗生素抗性基因污染的水平为3.5%。MAAP表达缺失导致污染达到47%，与AAV基因组相比。此外，在没有MAAP的情况下，大部分污染物DNA来自AAV2基因组质粒。MAAP可能负责通过AAV ITR的D序列识别AAV基因组，这并不参与形成Holliday结构。只有在C-末端显示与野生型相似污染水平的稳定截断形式的MAAP。此外，这种变体有助于增加含有AAV基因组的病毒颗粒的水平。因此，MAAP在AAV生物学和病毒颗粒生产中起着重要作用，因此是研究和优化组装过程的有希望的对象。 4.  结论 AAV对器官和组织具有不同的天然趋向性，这使得它们适用于与不同疾病相关的研究。AAV载体是感染包括啮齿动物、家兔、狗、小型猪和非人灵长类动物在内的许多动物模型的极好工具。这些模型使研究人员能够为他们的研究找到最佳动物模型，并帮助测试不同的基因治疗方法、载体效率和安全性、基因治疗试验的寿命、所传递载体和转基因的免疫原性，以及基因治疗程序后可能的副作用。必须指出的是，对于一些AAV血清型，其趋向性在物种之间不同，这使得将治疗从临床前转移到临床试验变得具有挑战性。对使用AAV作为疾病治疗平台的兴趣日益增加，这使得改进载体以实现更高的转导效率、更特定的趋向性、更少的免疫反应和更稳定的转基因表达变得至关重要。正如本综述前文提到的，对AAV基因组进行特定改造可以帮助提高产量，获得更高的滴度和更少的污染物。这些改造还可以提高基因治疗的安全性，因为增加满/空衣壳的比例将减少载体剂量的免疫原性，并使其更集中，从而更具功能性。所有提到的改造在建立了合格的可扩展AAV生产后，可以有效地用于体内研究。在过去十年中，关于AAV基因组的发现数量显著增加。然而，AAV的机制和基本生物学以及基因组改造后对载体生产力和完整性的影响仍需要完全理解。AAV基因组的改造是在AAV生产级联中应用的广泛变化的一部分，从上游到下游阶段。进一步了解最近发现的MAAP和X蛋白、REP和AAP的嵌合结构，以及AAV在颗粒组装期间的生物学过程，将有助于更有效、更快速地优化AAV载体生产，达到寻找不同疾病最有效基因治疗载体的最终目标。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。