抗体偶联药物之靶点特异性选择

2024-06-06

抗体药物偶联物

抗体偶联药物（ADCs）是一种将特异性的单克隆抗体与毒素小分子相结合的药物，是近年来发展迅速且前景广阔的生物制药领域。ADC与靶点结合后，通过抗原介导的内吞作用将细胞毒性药物递送到肿瘤细胞，然后在晚期溶酶体中通过酶催化(如组织蛋白酶B)释放细胞毒性药物。ADC靶点的选择一直是研究者关注的重要内容。据统计，ADC的靶点主要为肿瘤相关抗原(TAAs)，如HER2、CD30等。这些抗原不仅在肿瘤细胞表面高表达，而且在其他体细胞表面也有一定程度的表达。因此，ADC在杀灭肿瘤细胞的同时，也能杀灭部分正常细胞。例如，靶向Her2的ADC可能导致心脏毒性。因此，这类ADC靶点必须面临脱靶问题。而肿瘤特异性抗原(tsa)不存在上述问题，如细胞外区突变的膜蛋白、多肽-主要组织相容性复合体(pMHC)等。它们可以特异性地将肿瘤细胞与正常细胞区分开来，使ADC能够特异性地靶向并杀死肿瘤细胞。同时，对单克隆抗体的特异性和亲和力要求很高。因此，本文将根据肿瘤特异性的程度分别介绍肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原，并重点介绍肿瘤特异性抗原。表1.FDA批准上市的ADC靶点 1. 肿瘤相关抗原肿瘤相关抗原(TAAs)是一类在肿瘤中高表达的蛋白质细胞并且在正常体细胞中低表达或正常表达，其中较常见的抗原有HER2、CD30、CA125等，常用于临床诊断和肿瘤类别。 1.1. 与细胞增殖相关的膜蛋白人表皮生长因子受体2 (Human epidermal growth factor receptor 2, HER2)是表皮的一员生长因子受体家族，由ERBB2基因编码，位于细胞膜上。据报道，HER2蛋白在乳腺癌、胃癌等肿瘤细胞中高表达。对于乳腺癌，HER2蛋白的表达是影响其预后的重要因素。体内25% ~ 30%的乳腺癌患者受到肿瘤细胞HER2基因过表达的影响。这些肿瘤细胞不仅具有很强的增殖能力，而且容易对某些化疗药物产生耐药性。目前上市的靶向HER2的单克隆药物包括曲妥珠单抗(Herceptin®)和帕妥珠单抗(Perjeta®)，主要基于阻断HER2二聚化。曲妥珠单抗(Trastuzumab)的T-DM1 (Kadcyla®)(图1)于2013年被批准用于治疗晚期her2阳性转移性乳腺癌 her2阳性转移性乳腺癌。但也可引起肺毒性(间质性肺疾病，包括局部急性肺炎、急性呼吸窘迫综合征)、输液相关反应、过敏反应、血小板减少、神经毒性以及注射部位溢液(红肿、疼痛等)。图1. T-DM1（Kadcyla®）结构图 1.2. 癌胚抗原滋养层糖蛋白(Trophoblast glycoprotein, TPBG)又称5T4，是一种典型的癌胚蛋白抗原，表达于肿瘤细胞和胚胎细胞表面很少表达于其他正常体细胞表面。其中，5T4抗原在结直肠癌、胃癌、卵巢癌和其他肿瘤。研究表明，5T4在胃癌组织中的表达结直肠癌和胃癌分别达到85%和81%。因此，5T4作为抗体药物或ADC的潜在抗原已受到研究者的广泛关注。 1.3. 白细胞分化抗原白细胞分化抗原是细胞系的细胞表面标记（包括血小板、血管内皮细胞等），在正常分化成熟、不同阶段和激活过程中出现或消失。其中，抗体药物靶点的选择中，分化簇(CD)更为常见。其中之一是CD30，它广泛表达于霍奇金淋巴瘤细胞，并且是已上市的ADC本妥昔单抗 (Adcetris®)的靶点。此外，CD33和CD22是另外两种已上市ADC(奥加伊妥珠单抗和吉妥珠单抗奥唑米星)的靶点。 2. 肿瘤特异性抗原仅存在于细胞膜上的膜蛋白或膜蛋白复合物肿瘤细胞表面被定义为肿瘤特异性抗原，可作为特异性区分肿瘤细胞和正常体细胞的潜在标志物。因此，我们认为肿瘤细胞表面突变的膜蛋白复合物和肿瘤细胞表面胞外区突变的膜蛋白可作为肿瘤特异性抗原。如图2所示，突变的胞内蛋白通过蛋白酶降解并由主要组织相容性复合体(MHC)ⅰ类分子呈递含有突变氨基酸的多肽到细胞表面，形成突变的pMHC；而胞外突变膜蛋白直接定位于细胞膜。两者都是基于突变的氨基酸形成肿瘤特异性抗原，成为抗体或ADC的潜在靶点。接下来，将重点详细介绍上述两种肿瘤特异性抗原。图2 由突变基因形成的突变膜蛋白和突变pMHC 2.1. 肿瘤特异性pMHC pMHC由3部分组成：MHC的 I类分子、β2-微球蛋白(β2M)、以及由8 ~ 11个氨基酸组成的抗原肽，如图3所示。其中，MHC 的I类分子由α1、α2、α3三个结构域组成。α3结构域位于细胞膜上，α1和α2结构域位于细胞膜外。抗原肽位于α1和α2结构域的两个大α螺旋上，在主槽内；β2-微球蛋白与MHC的I类分子的α1和α3结构域相互作用。在细胞中，一些翻译后被错误折叠和修饰的新蛋白质，以及一些与泛素连接的蛋白质，被蛋白酶体降解，产生一系列长度从3个氨基酸到21个氨基酸不等的多肽。这些长度为8-11个氨基酸的多肽通过多肽转运体转运到内质网。经进一步N端修饰后，与MHC的I类分子和β2-微球蛋白结合形成pMHC，经高尔基体转运至细胞膜。图3.pMHC 结构 2.1.1. 肿瘤特异性pMHC作为抗体药物靶点的研究肿瘤突变抗原是一类仅在肿瘤细胞中表达的突变抗原。因此，靶向肿瘤突变抗原的药物可以从根本上区分肿瘤细胞和正常体细胞，最大限度地减少药物脱靶引起的毒副作用。pMHC可为抗体药物提供肿瘤特异性突变靶点。Skora利用噬菌体展示技术筛选出针对人类白细胞抗原(HLA)-A*02/克尔斯特鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS) G12V突变型和HLA-A *03/EGFR L858R突变型pMHC的scFv，并在细胞水平分析和评价其特异性和亲和力。结果表明，scFv能与仅含1个突变氨基酸的突变型pMHC特异性结合，亲和力为48.65 nmol/L，而野生型pMHC无亲和力。这一结果充分证明了单克隆抗体能够区分只有一个氨基酸差异的pMHC，由肿瘤特异性突变肽组成的pMHC有望成为一种很有前景的抗体和ADC靶点。 2.1.2. 肿瘤特异性pMHC作为抗体药物的潜在靶点费城染色体是一种特殊的慢性染色体异常髓系白血病(CML)细胞，导致融合基因BCR-ABL的形成。在费城染色体阳性(ph +)细胞中，有三种不同融合蛋白b2a2, e1a2和b3a2是由剪接变异体分别产生的。来源于这些融合蛋白连接的几个新肽与MHC I亚型具有高亲和力。与HLA-A03结合的多肽KQSSKALQR具有体外免疫原性。采用串联纳米喷雾质谱检测K562细胞(ph+)；Cyto对HLA-B08结合肽GFKQSSKAL具有特异性的毒性T淋巴细胞(CTLs)CML患者与健康供者之间已分离，但阳性频率低于HLA-A03结合肽这意味着肿瘤负荷可能会影响产生肿瘤的能力特定的CTL。对于HLA-A02结合肽SSKALQRPV, Yotnda提高了其表达水平特异性CTL成功裂解靶HLA-A02转染的CML细胞。更重要的是，Kessler从三种融合蛋白和系统检测体外蛋白酶体消化后的降解肽质谱分析，最终鉴定出AEALQRPVA为一种多肽HLA-B61具有CTL表位。 B-raf V600E突变来源于第600位点的氨基酸替换（缬氨酸到谷氨酸）。据报道，37-50%的黑色素瘤存在V600突变，其中约80-90%的突变为V600E。B-raf的V600E突变增加了激酶活性和侵袭性，也导致黑素瘤细胞凋亡减少。由于V600E突变在黑素瘤细胞内的高频表达，被广泛认为是T细胞的潜在免疫治疗靶点。利用突变肽刺激黑色素瘤患者来源的CD4+ (CD4+) T细胞和CD8+ (CD8+) T细胞，观察其对靶细胞的比活性。尤其是CD8+ HLA-B2705限制性突变体特异性T细胞，携带V600E的黑色素瘤细胞被选择性识别和杀灭。巧合的是，类似的结果已在V600E突变和HLA-A02阳性的黑色素瘤患者中得到验证。这些研究表明V600E突变肽能与HLA-B2705和HLA-A2结合，诱导CD8+ CTL反应，为免疫治疗提供了一个有前景的表位。 G12突变是K-ras基因的主要致癌突变，其中G12D和G12V突变在60-70%的胰腺癌、20-30%的结直肠癌和20-30%的非小细胞肺癌(NSCLC)中均有报道。目前，针对突变K-ras的免疫治疗方法已被开发。将含有G12V突变的多肽接种于胰腺癌患者，CD8+特异性T细胞在体内杀伤携带G12V突变的自体肿瘤细胞，并验证HLA-B35限制性多肽VVVGAVGVG为效应T细胞的作用靶点。利用树突状细胞(dc)提呈K-ras突变体G12V多肽，激活突变体特异性T细胞，在体外和小鼠胰腺肿瘤模型中发挥抗胰腺癌的作用。G12D K-ras突变DNA疫苗作为一种新型的免疫治疗药物在小鼠NSCLC肿瘤模型中进行了研究，观察到接种后辅助性T细胞1免疫应答增强，肿瘤浸润的CD8+ T细胞数量增加。巧合的是，通过免疫HLA-A1101转基因小鼠和基因工程人外周血淋巴细胞，获得了HLA-A1101限制性G12D突变表位特异性t细胞受体(TCR)。在小鼠异种移植模型中，转导的TCR-T细胞显著抑制携带G12D突变的HLA-A1101阳性肿瘤生长。 EGFR T790M首次作为获得耐药性突变被研究于EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)治疗，约50% ~ 60%的NSCLC患者在接受EGFR TKIs治疗后出现疾病进展后检测到该突变。最近的研究发现，79.9%的EGFR存在T790M突变TKI治疗前NSCLC患者的发生率为0.009% ~ 26.9%。2015年，奥希替尼(Tagrisso)被FDA批准为第三代药物EGFR TKI，与EGFR的某些突变形式(T790M, L858R, 19外显子)结合缺失)的浓度约为野生型的9倍。然而，在体外实验中，在临床相关浓度的奥希替尼也抑制了HER2, HER3, HER4, ACK1和BLK的活性。可以说，EGFR T790M是近年来抗肿瘤药物研究的热门靶点。研究人员希望找到一种专门针对这种突变的药物，从而特异性地杀死肿瘤细胞，而不是其他组织。通过HLA-A2限制性内切酶验证了2条T790M突变肽为肿瘤特异性表位。此外，HLA-A2+健康供试者的PBMCs经突变肽刺激后可诱导出突变特异性CTI，并选择性地对携带HLA-A2+的T790M的NSCLC细胞产生反应，这表明EGFR T790M突变可能是EGFR- TKI EGFR- TKI耐药患者的潜在免疫治疗靶点。最近，针对P53来源的pMHC的抗体优先表达黑色素瘤抗原(PRAME)、甲胎蛋白(AFP)等肿瘤相关抗原也被一一筛选出来，并用于临床前抗肿瘤研究。这表明肿瘤相关和肿瘤特异性的pMHC越来越受到关注。研究者希望通过这类靶点的发现，拓宽抗肿瘤药物靶点的选择，为发现一类新的抗肿瘤药物和治疗方法奠定坚实的基础。 2.2. 肿瘤特异性突变胞外跨膜蛋白跨膜蛋白的胞外结构域位于细胞表面，可以与抗体或抗体衍生物结合。一旦突变发生在跨膜蛋白的胞外区，可能产生一个新的突变特异性B细胞表位。国际癌症基因组联盟(International Cancer Genome Consortium, ICGC)数据库和癌症体细胞突变目录(Catalogue Of Somatic mutation In Cancer, COSMIC)数据库是两个重要的肿瘤测序数据库，基于ICGC数据库，分析了9155例肿瘤样本，在胞外跨膜蛋白发现了3328个突变，其中17个突变发生频率超过5次，频率超过1%(表1)。表2. 胞外跨膜蛋白17种突变概述 EGFR变异体II(EGFRvIII)突变是由EGFR外显子2-7缺失引起的在恶性胶质瘤和NSCLC中发现。近20年来，EGFRv III作为一种肿瘤特异性的抗原表位的研究在我国呈上升趋势，人们对其进行了大量的研究，尤其在单克隆抗体中。AMG595是一种高度选择性EGFRv III特异性ADC，由Amgen开发，显示出有效的对肿瘤生长抑制的活性。这是第一个靶向肿瘤特异性表位的ADC进入I期临床试验。此外，EGFR S492R突变也是一种潜在的肿瘤特异性ADC靶点，是膜蛋白胞外结构域的一个点突变显著影响西妥昔单抗与EGFR的结合。在西妥昔单抗治疗后的转移性结直肠癌(mCRC)活检组织和mCRC细胞系中检测到这种变异，而所有治疗前的活检组织和细胞均为EGFR和K-ras野生型，并在体外验证了西妥昔单抗耐药。此外，建立了一种基于微滴式数字PCR的方法检测帕尼单抗和西妥昔单抗治疗的mCRC患者血浆中循环游离DNA (cfDNA)中EGFR S492R突变，西妥昔单抗组16%(46/285)的患者检测到S492R突变，帕尼单抗组1%(3/261)的患者检测到S492R突变。此外，EGFR S492R突变也是一种潜在的肿瘤特异性ADC靶点，是膜蛋白胞外结构域的一个点突变显著影响西妥昔单抗与EGFR的结合。这种变异在转移性结直肠癌(mCRC)活检和mCRC细胞中被检测到西妥昔单抗治疗后的细胞系，而所有治疗前的活检和细胞均为野生型体外验证其对西妥昔单抗耐药。此外，建立了一种基于微滴式数字PCR的敏感检测血浆中循环游离DNA (cfDNA) EGFR S492R突变的方法帕尼单抗联合西妥昔单抗治疗的mCRC患者，S492R突变16%(46/285)接受西妥昔单抗治疗的患者和1%(3/261)采用帕尼单抗治疗。以上研究表明，EGFR S492R突变可能是西妥昔单抗治疗后的一种独特的获得性耐药突变，与原发耐药无关，其在西妥昔单抗治疗后的频繁发生使其成为潜在的肿瘤特异性抗原，可用于突变特异性抗体治疗。 3. 结论目前正在进行临床试验的ADC大部分靶点仍然是肿瘤相关抗原，但许多肿瘤特异性抗原已经在进行临床或临床前研究。随着测序技术和检测技术的发展，更多原发性肿瘤特异性抗原和获得性肿瘤特异性抗原将被发现和鉴定。因此，在抗体和ADC靶点的选择上，更倾向于选择肿瘤特异性抗原，以减少靶点选择带来的副作用。关于ADC靶点的选择有非常多的讲究，后续会为大家带来更多分享。参考文献 1.Jun Lai and Shuqing Chen,Relationship Between Target and Specific Action of Antibody-Drug Conjugates. 2.Xiaoxiao Wang,The target atlas for antibody-drug conjugates across solid cancers. 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓