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深度聚焦类器官应用与3D细胞培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769，点击↑图片查看议程，扫码领取免费入场券： 本文提炼、整理自温州医科大学、中南大学湘雅医院、中南大学临床药理研究所的Mei J, Liu X, Tian HX, et al., 近期发表于《Clinical and Translational Medicine》的综述文章：Tumour organoids and assembloids: Patient-derived cancer avatars for immunotherapy. 摘要： 类器官技术是一个新兴且发展迅速的领域，在研究器官发育和筛选临床治疗方案方面前景广阔。患者来源的肿瘤类器官（Patient-derived Tumour Organoid, PDTO）概念被提出后，可用于个性化药物筛选和新药研发。PDTO和原发性肿瘤之间的相似性越大，该模型的影响力就越大。最近，受细胞共培养技术启发的“肿瘤组装体（Tumour Assembloid）”引起了人们的关注，以作为对现有PDTO技术的补充。高质量的PDTO必须重组装关键组分，包括多种细胞类型、肿瘤基质、旁分泌因子、血管和微生物等。PDTO作为癌症患者的”替身“，目前正在进行大量基础研究和临床试验，最终目标是替代动物模型，以及在临床中真正使肿瘤患者获益。 关键点： 当前的PDTO模型尚未完全构建关键的细胞和非细胞组分。   PDTO应具有可扩展性和可编辑性。 在能够构建成熟的PDTO模型后，PDTO可以成为很有前景的免疫疗法临床前模型。 迫切需要在一致且共识的标准下构建PDTO生物样本库。 图1. PDTO是用于精准医疗和新药发现的强大体外模型（Mei J, Liu X, Tian HX, et al. Clin Transl Med. 2024）。 1   类器官和组装体技术 近十年来，类器官（Organoid）已成为研究器官发育和预测临床治疗方案的新兴模型。鉴于二维（2D）培养的细胞与体内微环境之间的差异，三维（3D）培养的类器官在组织发育、疾病建模、靶点发现、药物筛选和个性化精准医疗等方面的潜在用途引起了极大关注，并吸引了多学科的不同专家踏足该领域。类器官技术弥补了2D细胞系和动物模型的不足之处，可在微米至毫米的范围内捕捉人体器官/组织的表型、结构和功能的关键特征。 尽管PDTO技术发展迅速，但依然存在一些技术问题，尤其是尚未能够完全概括复杂的人类组织微环境，例如大多数研究中的类器官缺乏免疫细胞和血管化。因此，近年出现了一个名为 "组装体（Assembloid）"的新术语，定义为由不同类器官或细胞类型组合而成的自组织细胞系统（Pașca SP, et al. Nature. 2022）；这反映了它们在概念上与类器官的接近性，并暗示它们能够弥补当前PDTO的局限性。组装体代表了一种3D细胞共培养系统，在其中多种细胞类型同时或依次混合，以构建异质性的组织微环境。 由于其结构组织性更强，组装体技术迅速融入了组织重塑、组织空间基因组学和药物递送评价体系等领域。与类器官类似，组装体技术在正常组织以及肿瘤组织中都已得到应用。组装体研究的快速发展一定程度上解决了现有的PDTO模型的局限性，并为该领域提供了另一种选择。 2   类器官和组装体的培养与应用 自2011年以来，作为肿瘤患者”替身“的PDTO在临床治疗前研究癌症发生发展和筛选抗癌药物方面显示出了巨大的潜力。本节将讨论目前PDTO或肿瘤组装体的培养方法及其在临床药物筛选中的应用。 （1） 当前PDTO和肿瘤组装体的培养方法 越来越多的研究人员致力于培养出更贴近体内组织微环境的类器官： 虽然很多PDTO培养物主要使用Matrigel作为支架，但生物材料科学家已经利用各种水凝胶作为肿瘤基质，制备出多种肿瘤类器官。例如，有研究使用海藻酸盐-明胶水凝胶构建了肝脏PDTO，包裹了患者来源的肝肿瘤多细胞簇，并用于临床前个性化药物筛选（Dong H, et al. Bioact Mater. 2022）。 PDTO还被整合到微流体设备（即类器官芯片）中，以具备一个循环和流动系统，从而模拟正常组织与肿瘤细胞的相互作用。例如，有研究设计了一个微流控平台来复制肿瘤微环境（TME）中毛细管动脉端附近的生物物质传递；原发性乳腺肿瘤类器官可在该装置内存活20天，并诱导出强有力的血管新生（Shirure VS, et al. Lab Chip. 2018）。另一项研究侧重于肾脏类器官，通过"毫流控芯片（Millifluidic Chip）"上的流动生成血管网络，解决了早期诱导性多能干细胞分化过程中血管不成熟的问题（Homan KA, et al. Nat Methods. 2019）。此外，类器官芯片平台可根据尺寸大小进行预选，从而减少PDTO群体之间的差异性。研究人员开发了一种自动化、高通量微流控3D类器官培养和分析系统，可对多个培养物进行组合和动态的药物处理，并可对PDTO实时分析，这对于临床前研究有较大价值（Schuster B, et al. Nat Commun. 2020）。 气-液界面（Air-liquid Interface, ALI）模型是一种独特的设计，可为体外培养提供缺氧条件和粘液样环境。ALI模型在多孔膜上培养单层细胞或组织切片，培养基在膜下，细胞与空气接触；因此，ALI模型是模拟呼吸系统的理想模型。Kuo的技术团队就使用ALI方法构建了100多个PDTO，以研究它们对原始TME的保留程度，发现接种成功率为73%，并且PDTO内含有多种免疫组分（Neal JT, et al. Cell. 2018）。但是ALI方法仍有一定的局限性，如技术障碍、培养成功率和基于扩散的药物试验所造成的药物损耗。 由于目前的PDTO模型在重现肿瘤微结构及其相关微环境方面存在不足；因此，肿瘤组装体技术近年来被提出，作为类器官技术的补充。肿瘤组装体的概念强调了各种细胞之间的相互作用，尤其是肿瘤细胞和其它相关细胞之间在3D空间中的相互作用，代表了该领域的一个关键进展。 肿瘤类器官模型与肿瘤组装体模型的主要区别在于细胞培养的方式。类器官技术是一种以干细胞为基础的技术，干细胞在自组装的3D细胞球内分化成不同类型的细胞，这就需要对培养基和培养方案进行独特的设计。另一方面，组装体技术是一种基于组织工程的技术，预先制备不同类型的细胞，然后在3D空间内依次或同时进行细胞共培养。组装体技术提供了一种更直接的方式来组装异质性的和成熟的细胞类型，更重要的是，该技术允许对细胞类型之间的比例进行空间上的控制。 （2） 用于药物筛选的PDTO和肿瘤组装体 PDTO可以再现疾病的特异性特征，如免疫微环境，并保留了更多个性化信息，包括基因组、转录组、表观基因组和蛋白质组信息等，因此PDTO可以作为高通量药物筛选的理想体外模型。由于其多样性和可编辑性，PDTO能够冷冻保存以形成生物样本库，并可进行定制和扩展。例如，一项里程碑式研究表明，从转移性胃肠道肿瘤患者样本中构建的PDTO生物样本库可以总结出对瑞戈非尼、帕博西尼、紫杉类药物、西妥昔单抗和TAS-102的临床响应，并将其应用于个性化精准医疗计划中，与临床真实用药结果具有高度一致性：灵敏度100%、特异度93%、阳性预测值88%、阴性预测值100%（Vlachogiannis G, et al. Science. 2018）。 与PDX模型不同，PDTO模型具有更强的可编辑性和可扩展性，能够根据种族、性别、年龄、疾病或其它因素进行个性化设计，以应对复杂的临床挑战。随着PDTO相关技术的进步、包含各种癌症类型的大规模PDTO生物样本库的建立，以及高内涵成像与宽场活细胞成像等尖端分析技术的应用，PDTO现在已成为高通量临床前药物筛选的精确模型，在某种程度上推动了临床试验前药物测试方法的变革。 图2. PDTO及其生物样本库（Mei J, Liu X, Tian HX, et al. Clin Transl Med. 2024）。 PDTO技术还可以与其它技术相结合，如液体活检和循环肿瘤细胞（Circulating Tumour Cell, CTC）的采集。有关CTC类器官的详细内容，请见万象类器官往期推文：循环肿瘤细胞（CTC）能否培养为类器官？ 生物材料学和肿瘤学的专家们合作探索了用于捕获和培养CTC类器官的结构化基质以及随后的药物筛选方法。例如，一种名为”二元胶体晶体（BCC）“的结构化图案系列具有独特的吸引和控制肿瘤细胞粘附的性质；研究人员将最佳的BCC与设计的CTC培养基相结合，证明了可在1个月内扩增数百个CTC类器官。与组装体技术类似，CTC和癌症相关细胞在BCC上“自组装”成球状体（Spheroid），这项技术已应用于胰腺导管腺癌（Wu YH, et al. Eur J Cancer. 2022）、头颈癌（Lin KC, et al. Cancers. 2021）、小细胞肺癌（Lee HL, et al. Cancers. 2020）、软组织肉瘤（Liu YW, et al. J Clin Oncol. 2023）、儿童胶质瘤（Liu YL, et al. Cancer Res. 2023）和胸腺恶性肿瘤（Wu YH, et al. Thorac Cancer. 2023）中。 研究人员通过在肿瘤球状体内添加内皮化的微血管，构建了血管化的肿瘤组装体；这个复杂的模型模拟了在肿瘤结节中观察到的腹腔热灌注化疗药物渗透模式，同时保持了与其亲本异种移植瘤相似的基因表达模式（Lv Q, et al. Acta Biomater. 2023）。尽管如此，由于肿瘤组装体模型的复杂性，在其广泛应用于个体化药物检测和筛选之前，还有相当长的路要走。 3   免疫疗法中的PDTO 人类免疫系统采用体液免疫和特异性免疫等多种机制来消灭肿瘤细胞。TME中肿瘤细胞和非肿瘤性宿主成分之间的动态相互作用可以影响癌变、肿瘤转移、癌症进展和耐药性等。免疫疗法在增强免疫系统识别肿瘤细胞的能力、激活针对癌症的免疫反应方面具有巨大潜力。因此，各种免疫疗法，包括溶瘤病毒、免疫检查点抑制剂（ICIs）、细胞免疫疗法（如嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法、T细胞受体工程化T细胞（TCR-T）疗法、肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）疗法，以及靶向模式识别受体的疗法等），已被用于当前的临床实践中。ICIs可阻断免疫细胞与肿瘤细胞的相互作用，唤醒自体免疫系统；而细胞疗法则可补充生物工程免疫细胞，强化癌症患者薄弱的免疫系统。 随着免疫系统在癌症免疫疗法中的作用得到广泛认可，应用于免疫疗法研究的细胞培养和动物模型的不足也日益明显。因此，当务之急是开发包含免疫细胞和其它关键TME组分的高效研究模型，以评估免疫疗法干预措施的疗效。 图3. PDTO应用于免疫疗法开发（Mei J, Liu X, Tian HX, et al. Clin Transl Med. 2024）。 （1） 免疫检查点抑制剂 包括程序性死亡受体1（PD-1）与程序性死亡受体-配体1（PD-L1）抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）抑制剂和T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域3（TIM-3）抑制剂在内的ICIs已逐渐成为多种肿瘤类型的标准治疗方法。虽然这些ICIs治疗已经在相当大的程度上被证明疗效，但其有效性在很大程度上仍然取决于临床实践中的个体患者特征。目前仍缺乏有效的免疫疗法预测指标和合适的ICI疗效预测模型。因此，开发适当的体外模型（如PDTO模型），对了解疾病病理机制和预测免疫类药物疗效至关重要。PDTO保留了关键的TME成分，包括免疫细胞和肿瘤基质细胞等；相比传统细胞培养模型，PDTO对ICIs表现出卓越的药物预测准确性，为研究ICIs的疗效提供了一个宝贵的平台。 随着大规模的PDTO应用到药物筛选中，研究人员有更多的机会识别影响免疫治疗药物疗效的新基因标志物，并探索可能的细胞免疫机制。这些努力也从基础研究的角度推动了PDTO在免疫疗法临床前试验中的应用。并且，这种以结果为导向的方法可以克服免疫疗法中的个体差异，对指导临床应用具有重要价值。 （2） 过继性细胞疗法 过继性细胞疗法（Adoptive Cell Therapy, ACT）是一种非常个性化的癌症免疫疗法，通过将淋巴细胞回输到体内来协调抗肿瘤、抗病毒或抗炎反应。ACT可以使用具有天然抗肿瘤反应性的宿主细胞，如TILs；或表达抗肿瘤T细胞受体（TCR）或嵌合抗原受体（CAR）的基因工程宿主细胞。 ①  TILs 疗法 TILs是从肿瘤组织中分离出的浸润性淋巴细胞。其中有些淋巴细胞是能检测到肿瘤特异性突变抗原的T细胞，标志着它们是能浸润肿瘤的强大免疫细胞；代表了身体对肿瘤细胞的特异性免疫反应，具有显著的杀伤力。TILs疗法的有效细胞是经过自然选择和富集的群体，具有高比例和丰富多样性的肿瘤特异性T细胞，具有多靶向（Multi-targeting）、高肿瘤向性（High Tumour Tropism）、浸润能力（Infiltration Capacity）和低副作用（Low Side Effects）的优点。 当前，广泛采用的方法是从患者的肿瘤组织中分离出TILs，然后选择性地鉴定出具有特异性肿瘤识别能力的T淋巴细胞，在体外进行扩增或修饰等操作，再回输到患者体内。然而，仅使用患者组织样本进行同源TILs筛选仍面临挑战：获取新鲜肿瘤样本存在困难，细胞扩增过程中的相关成本和时间限制进一步加剧了挑战；此外，体内滞留时间的不可预测性、TME对再输入T细胞的抑制等因素也限制了它们的临床应用。因此，研究人员开始探索TILs治疗中异源肿瘤细胞筛选的可行性，一个全面的PDTO生物样本库在解决TILs治疗局限性方面具有重大潜力。 具体来说，有研究人员提出了一种策略，将外周血淋巴细胞和肿瘤类器官共同培养，以获得对肿瘤有反应的T细胞（Dijkstra KK, et al. Cell. 2018）。同时，“超级T细胞”的概念也在研究之中，这种细胞具有超强的特异性识别能力和对肿瘤类器官的细胞毒性。但是这些方面都还需要更深入的研究。需要强调的是，对于TILs的特异性肿瘤杀伤筛选，特别是异源筛选，PDTO生物样本库是一个理想的平台，有助于确定最有前途的体内免疫疗法候选者。TME模拟技术的改进和PDTO的多样性增加了不同个体治疗的安全性，也为探索治疗机制提供了更好的研究环境。 ②  TCR-T 疗法 TCR-T疗法的基础是其识别位于细胞膜表面或源自细胞内的肿瘤特异性抗原的能力，更有可能突破实体瘤的强大防御。该疗法的显著优势是：TCR-T细胞在人体内自然表达，并完全人源化，从而降低了免疫排斥的风险；此外，TCR-T细胞具有免疫记忆，可以在体内长期存活，增强了其治疗效果。 然而，TCR工程化改造也面临着特殊的挑战，限制了其临床效率，其在个性化治疗中的临床疗效仍然有限。利用PDTO的优势和不断进步的培养技术，PDTO生物样本库可成为TCR-T疗法的重要资源。具体而言，面对TCR-T疗法的临床挑战，PDTO的可编辑性意味着可以构建不同类型和不同肿瘤抗原谱的肿瘤类器官。与此同时，对TCR-T抗原识别特征的研究本身就比较有限，而以PDTO为基础的大型生物样本库为尚未充分开发的TCR-T疗法提供了无与伦比的临床前测试平台，这无疑为医生和患者的临床实践增添了更多信心。例如，研究人员已经成功地将PDTO与天然嵌入的免疫细胞（即T、B、NK和巨噬细胞）一起培育，从而有效地重建了TME，并且PDTO衍生的TILs准确保留了原始TCR谱（Neal JT, et al. Cell. 2018）。 总而言之，通过利用PDTO模型，可以获得更多关键数据，以确保在进入正式临床试验之前获得有效性和安全性数据。基于PDTO的临床前药物筛选模型，包括基于PDTO的动物异种移植模型，有望为TCR-T疗法的临床前评价提供全面的见解。 ③  CAR-T 疗法 CAR-T疗法的基础是对嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）进行基因修饰，使其能够识别肿瘤细胞抗原并杀伤肿瘤细胞。CAR是CAR-T细胞的组成部分，是赋予T细胞特异性识别肿瘤细胞表面特定蛋白质（抗原）能力的蛋白质受体。表达CAR的T细胞识别并结合这些肿瘤抗原，对肿瘤细胞发起攻击。这些细胞经过提取和基因工程改造，再经过大量体外扩增，最终产生数十亿个T细胞；这种直接作用绕过了抗原呈递，使得CAR-T疗法更适用于表面抗原暴露突出的血液肿瘤。 CAR-T疗法的主要问题是其严重的副作用和脱靶效应，将其回输体内有可能会导致严重的免疫风暴，造成不可预测的治疗结果。考虑到这些问题，研究人员提出了对于PDTO模型的需求。例如，有研究利用手术切除的患者肿瘤组织培养出了胶质母细胞类器官（GBO），并概述了通过与CAR-T细胞共培养GBO来研究患者对免疫疗法特异性反应的方案（Jacob F, et al. Nat Protoc. 2020）。但仍然存在的问题是，自体治疗涉及对从患者身上提取的T细胞进行体外修饰和扩增，然而由于患者的淋巴细胞本身可能处于受损状态，造成了高质量T细胞数量不足、时间和经济成本增加。而将同种异体的CAR-T细胞治疗与PDTO生物样本库相结合，有可能在体外筛选健康和高质量的T细胞。PDTO生物样本库不仅能够在一定程度上还原各种病理条件下的TME，还可以修饰多种肿瘤特异性抗原，以验证CAR-T疗法的靶向性和安全性。PDTO生物样本库为通用CAR-T细胞疗法的体外筛选提供了必要的资源和价值，能够增强其肿瘤特异性靶向能力，同时降低免疫排斥风险。 ④  其它基于免疫细胞的疗法 其它的基于免疫细胞的疗法也因各自独特的优势而被探索，包括NK细胞、γδT细胞、CD3激活的杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）、树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞（DC-CIK）和淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）等。这些细胞疗法在疗效、特异性和减少副作用方面不断地取得进展。然而，考虑到与主流的T细胞疗法相比进行临床试验所面临的挑战，以及个体差异和各种免疫细胞在免疫系统中的不同作用，其它的免疫细胞疗法通常需要更多时间和广泛的临床前试验模型来评价其适用性。这可能寄希望于PDTO对于TME模拟程度的技术突破与进展。 图4. 免疫疗法中的PDTO（Mei J, Liu X, Tian HX, et al. Clin Transl Med. 2024）。 感谢您的阅读，对于本篇综述的其它精彩内容与解读，我们下期推文见！ 参考文献： Mei J, Liu X, Tian HX, et al. Tumour organoids and assembloids: Patient-derived cancer avatars for immunotherapy. Clin Transl Med. 2024; 14(4): e1656. END 免责声明：本文信息来源于网络，本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 深度聚焦类器官应用与3D细胞培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769，上下滑动查看详细议程： 戳“阅读原文”立即领取限量免费参会名额！