Cetuximab

摘要：嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T）治疗在过去数十年间取得了突破性进展，已获批用于治疗多种血液系统恶性肿瘤，且在非肿瘤疾病领域的潜力也逐步显现。然而，当前临床级 CAR-T 细胞的体外制造流程复杂、耗时且成本高昂，限制了其广泛应用。本文将系统梳理 CAR-T 细胞的结构与发展历程，深入分析体外 CAR-T 治疗面临的制造难题与毒性风险，重点阐述体内 CAR-T 细胞生成技术的研究进展，包括病毒载体与纳米载体递送系统的应用，同时探讨 CAR-NK、CAR-M 等其他免疫细胞的体内工程化潜力，最后展望该领域的未来方向，为读者全面呈现 CAR-T 细胞治疗从体外到体内的技术变革。 一、CAR-T 细胞：结构解析与发展历程（一）CAR-T 细胞的核心结构 嵌合抗原受体（CAR）是 CAR-T 细胞发挥作用的关键，其典型结构呈模块化设计，主要包含胞外域（Ectodomain）、跨膜域（Transmembrane Domain, TMD和胞内域（Endodomain）三个核心部分，各部分又由多个功能结构组成（图 1A）。 胞外域：负责以不依赖主要组织相容性复合体（MHC）的方式识别肿瘤细胞表面抗原，是 CAR-T 细胞靶向性的基础。它包含抗原结合域和铰链域（Hinge Domain, HD）： 抗原结合域：目前最常用的是单链可变片段（scFv），但 scFv 存在免疫原性强、易自聚集导致 CAR-T 细胞过早耗竭的问题。作为替代方案，纳米抗体（又称 VHH 域）凭借更小的分子体积，能更轻松地接触到实体肿瘤中 scFv 难以抵达的表位，为实体瘤治疗提供了新可能。 铰链域：又称 “间隔区”，连接抗原结合域与跨膜域，为 CAR 提供稳定性和灵活性。基于免疫球蛋白（Ig）的铰链域需特别注意 ——IgG 分子的 CH2 区域可能与先天免疫细胞表面的 Fcγ 受体结合，引发非特异性免疫反应。不过，通过突变或完全删除 CH2 区域，可减少这类反应，同时提升 CAR-T 细胞的存活时间和抗肿瘤效果。此外，铰链域的长度需根据抗原表位与细胞膜的距离设计：较长的铰链域能增加灵活性，适用于识别膜近端表位或复杂糖基化抗原；较短的铰链域则更适合靶向膜远端表位。 跨膜域：连接胞外域与胞内信号域，虽主要起结构支撑作用，但对 CAR 在 T 细胞表面的表达水平、稳定性及功能影响显著。例如，跨膜域参与抗原结合后的 CAR 二聚化过程，并通过与内源性信号分子相互作用传递激活信号，不同类型的跨膜域可调控 CAR 的功能。 胞内域：位于细胞质内，负责将胞外的抗原识别信号转化为胞内信号，激活 T 细胞并触发免疫反应。它通常包含 T 细胞激活域和一个或多个共刺激域： 激活域：目前所有美国食品药品监督管理局（FDA）获批的 CAR-T 产品均采用 CD3ζ 链作为激活域，其胞质域中的免疫受体酪氨酸激活基序（ITAMs）可招募蛋白激酶 ZAP70，启动信号级联反应。即便 CAR-T 细胞形成的是非经典免疫突触，在识别抗原后仍能激活 ZAP70，确保信号传递的有效性。 共刺激域：共刺激信号对 CAR-T 细胞的活化、增殖、存活至关重要，也是 CAR-T 细胞代际升级的核心标志，不同共刺激域会引导 CAR-T 细胞产生不同的功能特性。（二）CAR-T 细胞的五代发展历程 自 1987 年 Kuwana 等人提出 “T-bodies” 概念，将单克隆抗体片段与 T 细胞受体（TCR）融合，实现 MHC 非依赖的抗原识别以来，CAR 结构不断优化，至今已发展至第五代（图 1B）。 第一代 CAR-T 细胞：仅包含 scFv 抗原结合域和 CD3ζ 链（或 FcγR）激活域。早期研究显示，基于 CD3ζ 链的 CAR-T 细胞因含多个 ITAMs，细胞毒性显著优于 FcγR 基 CAR-T 细胞。但在临床研究中，第一代 CAR-T 细胞存在存活时间短、抗肿瘤效果弱的问题，无法满足长期治疗需求。 第二代 CAR-T 细胞：在第一代基础上加入一个共刺激域，是目前临床应用最广泛的类型。共刺激域主要来自 CD28 受体家族（如 CD28、ICOS）或肿瘤坏死因子受体家族（如 4-1BB、OX40），不同共刺激域赋予 CAR-T 细胞不同特性： 第三代 CAR-T 细胞：整合两个不同共刺激域（如 CD28+4-1BB），旨在结合不同共刺激域的优势，实现 “双重信号激活”。例如，CD28 提供的快速杀伤能力与 4-1BB 带来的长期存活特性结合后，可显著提升 CAR-T 细胞的抗肿瘤效果。在白血病、非霍奇金淋巴瘤（NHL）等疾病的早期临床研究中，第三代 CAR-T 细胞展现出更强的扩增能力和更长的存活时间，但也有研究指出，第二代 CAR-T 细胞可能通过形成超分子信号复合体，激活更强烈的信号，在部分场景下抗肿瘤能力更优。 CD28 共刺激域：与抗原呈递细胞（APCs）表面的 CD80/CD86 结合后，可促进 IL-2 分泌，增强初始 T 细胞的存活、增殖和代谢活性，使 CAR-T 细胞快速发挥抗肿瘤作用，但可能引发过度激活和 T 细胞耗竭，导致长期疗效不佳。 4-1BB 共刺激域：仅在 T 细胞激活后表达，与配体结合后能促进记忆 T 细胞形成，延长 CAR-T 细胞在体内的存活时间，且 tonic 信号（非特异性持续激活信号）较弱，细胞耗竭程度低，但细胞扩增速度和早期杀伤效率不及 CD28 基 CAR-T 细胞。 OX40 与 ICOS 共刺激域：OX40 可增强 T 细胞的持久性，ICOS 则在调控体液免疫、炎症反应及 Th17 细胞发育中发挥作用，且 ICOS 基 CAR-T 细胞的体内存活时间优于 CD28 基 CAR-T 细胞。 第四代 CAR-T 细胞（TRUCKs）：又称 “通用细胞因子杀伤 T 细胞”，在第二代 CAR 结构基础上，加入受核因子活化 T 细胞（NFAT）调控的转基因 cassette，可在识别肿瘤抗原后诱导表达 IL-2、IL-12、IL-15 等细胞因子。这些细胞因子能招募先天免疫细胞（如巨噬细胞、NK 细胞），在肿瘤微环境（TME）中形成协同抗肿瘤效应，同时避免细胞因子对全身的毒副作用。 第五代 CAR-T 细胞（下一代 CAR）：在第二代 CAR 基础上，插入 IL-2 受体 β 链（IL-2Rβ）的截短胞质域（位于 CD28 共刺激域与 CD3ζ 链之间），并引入 STAT-3/5 转录因子结合基序。抗原结合后，CD28、CD3ζ 链与 JAK-STAT 3/5 通路同时激活，可进一步增强 CAR-T 细胞的功能、增殖能力和存活时间。此外，为应对免疫检查点抑制（如 PD-1/PD-L1 通路）导致的 CAR-T 细胞耗竭，研究人员开发了 PD-1/CD28 嵌合开关受体 —— 其胞外域为 PD-1，可结合肿瘤细胞表面的 PD-L1，胞内域为 CD28 的共刺激信号区，能将 PD-1 介导的抑制信号转化为激活信号。在一项 IB 期研究中，靶向 CD19 的 PD-1/CD28 嵌合开关受体 CAR-T 细胞（CD19-PD-1/CD28-CART）展现出持久的临床疗效。 图 1 CAR-T 细胞结构与五代发展示意图A：CAR-T 细胞的核心结构，包含胞外域、跨膜域和胞内域；B：从第一代到第五代 CAR-T 细胞的结构演变，展示各代共刺激域、细胞因子诱导元件等的差异 （三）实体瘤 CAR-T 治疗的特殊优化 尽管 CAR-T 治疗在血液系统肿瘤中成效显著，但目前尚无针对实体瘤的 CAR-T 产品获批，主要瓶颈在于肿瘤微环境（TME）的抑制作用和肿瘤特异性抗原缺乏。为突破这些限制，研究人员从多个方向对 CAR 进行优化： 改善 TME 浸润：实体瘤基质中富含硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）和透明质酸，会阻碍 CAR-T 细胞进入肿瘤内部。通过在 CAR-T 细胞中表达肝素酶（降解 HSPG）或透明质酸酶（降解透明质酸），可破坏基质屏障，提升 CAR-T 细胞的浸润能力；同时，让 CAR-T 细胞表达肿瘤微环境中趋化因子的受体（如 CXCR1、CXCR2、CCR4），可引导 CAR-T 细胞向肿瘤部位迁移。 逆转免疫抑制：通过基因工程让 CAR-T 细胞分泌 IL-12、IL-15、IL-18 等促炎细胞因子，可直接改善肿瘤微环境的免疫抑制状态，增强 CAR-T 细胞的抗肿瘤活性。 解决抗原异质性与逃逸：实体瘤抗原表达具有高度异质性，单一抗原靶向易导致抗原逃逸。双重靶向 CAR-T 策略成为解决方案： 提升治疗安全性：为降低 “脱靶毒性”（On-target/Off-tumor Toxicity），研究人员开发了 “抑制性 CAR（iCAR）”。iCAR 识别正常组织表达而肿瘤组织缺失的抗原，其胞内域含 PD-1 或 CTLA-4 的抑制性信号区。当 CAR-T 细胞接触正常组织时，iCAR 激活抑制信号，阻止 CAR-T 细胞活化，从而保护正常组织。 混合 CAR-T 细胞（Pooled CAR-T）：将靶向不同抗原的 CAR-T 细胞联合输注。例如，在肺癌小鼠模型中，输注靶向 EphA2 和 FAPα 的混合 CAR-T 细胞，抗肿瘤效果显著优于单一 CAR-T 细胞。 双特异性 CAR-T 细胞（biCAR-T）：单个 T 细胞同时表达两种靶向不同抗原的 CAR。在胶质母细胞瘤模型中，同时表达 HER2 和 IL13Rα2 CAR 的 biCAR-T 细胞，抗肿瘤效果优于单一 CAR-T 细胞或混合 CAR-T 细胞。 双价 CAR-T 细胞（Bivalent CAR-T）：一个 CAR 分子包含两个不同的 scFv，可识别两种抗原，分为 “串联型”（两个 scFv 的 VL-VH 直接连接）和 “环型”（两个 scFv 的 VL-VH 通过间隔序列分开）。二、体外 CAR-T 治疗的挑战：制造难题与毒性风险（一）体外制造流程的复杂性与高成本 目前临床获批的 CAR-T 细胞均为自体产品，需从患者体内采集 T 细胞，经体外工程化改造后再回输，整个制造流程耗时 3-4 周，单患者成本通常超过 40 万美元，部分甚至突破 100 万美元，其复杂性主要体现在以下环节（图 2 左半部分）： T 细胞采集与分离：通过白细胞分离术（Leukapheresis）从患者外周血中获取白细胞，再分离纯化 T 细胞； 激活与转导：用抗 CD3/CD28 抗体激活 T 细胞后，通过病毒载体（如慢病毒、逆转录病毒）或非病毒载体（如转座子）将 CAR 基因导入 T 细胞； 体外扩增：在含细胞因子（如 IL-2）的培养基中培养 T 细胞，使其大量增殖，达到临床所需剂量； 质量控制与回输：对扩增后的 CAR-T 细胞进行无菌性、存活率、纯度、效价等指标检测，合格后回输患者。 自体 CAR-T 制造还面临物流与时效性挑战：白细胞分离术需专业设备和团队，采集后的细胞需快速转运至 GMP 级实验室，且 CAR-T 细胞保质期短，需在规定时间内回输，这对物流和生产效率提出极高要求。 为降低成本，异基因 CAR-T 细胞（从健康供体获取 T 细胞进行工程化）成为研究方向。异基因 CAR-T 细胞可批量生产，形成 “现货型”（Off-the-shelf）产品，大幅缩短治疗周期并降低成本。但异基因 CAR-T 细胞存在两大关键问题： 移植物抗宿主病（GvHD）：供体 T 细胞表面的 TCR 可能识别患者正常组织的抗原，引发致命性的 GvHD； 宿主抗移植物反应（HvG）：患者免疫系统可能将异基因 CAR-T 细胞视为 “异物” 并清除，导致 CAR-T 细胞在体内存活时间缩短，治疗失效。（二）CAR-T 治疗相关毒性 尽管 CAR-T 治疗疗效显著，但常伴随严重的系统性毒性，其中细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS） 最为常见且危险。 细胞因子释放综合征（CRS）：CAR-T 细胞识别并激活后，会大量释放 IL-6、IFN-γ 等细胞因子，引发 “细胞因子风暴”，临床表现为发热、低血压、器官衰竭等。CRS 的严重程度与 CAR-T 细胞输注剂量相关，且接受环磷酰胺联合氟达拉滨预处理的患者，CRS 发生率更高。这是因为预处理会清除体内的 “细胞因子 sink 细胞”（如调节性 T 细胞），导致支持 CAR-T 细胞增殖的细胞因子积累，进一步加剧 CAR-T 细胞的过度激活和扩张。 免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）：通常在 CRS 发生后出现，且严重程度与 CRS 相关，临床表现为头痛、意识障碍、癫痫等。其发病机制与全身性炎症反应、内皮细胞活化导致血脑屏障破坏相关。目前尚无获批的 CRS 或 ICANS 预防药物，只能通过对症治疗（如使用 IL-6 受体拮抗剂托珠单抗治疗 CRS）缓解症状，因此优化 CAR 设计、降低毒性成为关键。 图 2 体外与体内 CAR-T 细胞生产流程对比左半部分：体外 CAR-T 生产流程，包含白细胞分离、T 细胞分离激活、转导、扩增、回输等步骤；右半部分：体内 CAR-T 生产流程，通过静脉注射病毒载体或纳米载体，直接在体内完成 T 细胞的转导与 CAR 表达。 三、体内 CAR-T 细胞生成：技术突破与递送平台 为解决体外制造的弊端，体内 CAR-T 细胞生成技术应运而生 —— 通过注射携带 CAR 基因的递送载体，直接在患者体内完成 T 细胞的工程化改造，无需体外操作（图 2 右半部分）。该技术不仅能简化流程、降低成本，还可避免体外扩增导致的 CAR-T 细胞耗竭，同时可能减少毒性反应。目前主要的递送平台分为病毒载体和纳米载体两大类（表 1）。（一）病毒载体递送系统 病毒载体因转导效率高、可实现 CAR 基因稳定表达，是体外 CAR-T 制造的 “金标准”，也被用于体内 CAR-T 生成，主要包括腺相关病毒（AAV）和慢病毒（LV）。 腺相关病毒（AAV）：AAV 具有安全性高、可在分裂与非分裂细胞中实现长期 episomal 表达（不整合到宿主基因组）的优势。Nawaz 等人在研究中，通过注射携带 CAR 基因的 AAV，成功在体内重编程免疫细胞，实现肿瘤消退。但 AAV 也存在局限性：携带基因片段的容量有限，且大规模生产 GMP 级 AAV 成本较高，同时仍有极低概率发生随机整合，存在插入突变风险。 慢病毒（LV）：慢病毒可将 CAR 基因稳定整合到宿主基因组，实现长期表达，且转导效率高、宿主范围广。为提高体内转导的靶向性（避免转导非 T 细胞），研究人员对慢病毒进行改造 —— 在病毒表面融合 T 细胞特异性配体（如抗 CD8 scFv、纳米抗体），实现对循环 T 细胞的精准靶向。例如，Pfeiffer 等人将 CD8-scFv 融合到尼帕病毒假型慢病毒表面，通过腹腔注射到移植人 CD34 + 细胞的 NSG 小鼠体内，成功实现 CD19-CAR-T 细胞的体内生成；Michels 等人开发的 “VivoVec” 慢病毒平台，无需预处理即可实现 CAR-T 细胞在体内的有效扩增和存活，解决了体外 CAR-T 细胞需预处理才能存活的问题。 慢病毒的主要风险在于插入突变——CAR 基因随机整合到宿主基因组可能导致原癌基因激活或抑癌基因失活，引发二次肿瘤；同时，慢病毒可能转导生殖细胞或抑制性免疫细胞（如调节性 T 细胞），导致生殖细胞基因改变或抗肿瘤效果削弱。此外，大规模生产 GMP 级慢病毒流程复杂、成本高昂，也限制了其临床应用。三、体内 CAR-T 细胞生成：技术突破与递送平台（二）纳米载体递送系统 为规避病毒载体的安全性与成本问题，非病毒纳米载体成为体内 CAR-T 递送的重要方向。这类载体具有制备简单、可规模化生产、安全性高的优势，且可通过设计实现 T 细胞靶向递送，主要包括聚合物基纳米载体和脂质基纳米载体（如脂质纳米颗粒 LNPs）。 聚合物基纳米载体：常用材料包括聚乙烯亚胺（PEI）、聚（β- 氨基酯）（PβAE）、聚乙二醇（PEG）等，可通过静电作用与带负电的 CAR 基因（DNA 或 mRNA）结合，形成稳定的纳米复合物。Moffett 等人的研究显示，PβAE 聚合物负载 CAR-mRNA 后，可高效转染原代 T 细胞，且毒性极低；Yu 等人则利用 PEG、PEI 和聚酰胺 - 胺（PAMAM）自组装形成的纳米颗粒（SNPs）包裹 CAR 质粒 DNA（pDNA），在 Jurkat 细胞（一种人 T 细胞白血病细胞系）中的转染效率达到 Lipofectamine 2000（常用转染试剂）的 10 倍，证明了聚合物纳米载体在 T 细胞基因递送中的潜力 。聚合物纳米载体的核心优势在于可通过化学修饰调整性能：例如，PEG 修饰可减少载体被免疫系统清除，延长体内循环时间；表面偶联 T 细胞特异性配体（如抗 CD3 抗体、CD5 靶向肽）可提升对循环 T 细胞的靶向性，降低对肝脏、脾脏等器官的非特异性毒性 。但部分聚合物（如高分子量 PEI）存在一定细胞毒性，且体内转导效率仍需进一步提升，是当前研究需突破的关键。 脂质基纳米载体：主要包括脂质体（Liposomes）和脂质纳米颗粒（LNPs），凭借良好的生物相容性和基因包载能力，成为体内 mRNA 递送的主流平台之一。 脂质体：由磷脂双分子层形成的闭合囊泡，可根据电荷分为阳离子、阴离子和中性脂质体，其中阳离子脂质体因能与带负电的核酸快速结合，被广泛用于 CAR 基因递送。其结构中的磷脂双分子层可模拟细胞膜成分，降低免疫原性，同时通过表面修饰（如靶向配体）实现 T 细胞精准递送。 脂质纳米颗粒（LNPs）：由阳离子可电离脂质、辅助脂质、PEG 化脂质和胆固醇组成，能高效包载 CAR-mRNA 或 pDNA。研究表明，可电离 LNPs 介导的 CAR 表达效率与电穿孔（体外 T 细胞转染常用技术）相当，但 T 细胞存活率显著更高 —— 电穿孔可能导致 T 细胞膜损伤，而 LNPs 通过内吞作用进入细胞，对细胞完整性破坏更小 。 脂质基纳米载体的临床转化潜力已得到验证：Zhou 等人设计的 LNPs 同时包裹 IL-6 shRNA（抑制 IL-6 表达以降低 CRS 风险）和 CD19 靶向 CAR-pDNA，静脉注射到急性淋巴细胞白血病（ALL）异种移植小鼠模型后，体内生成的 CAR-T 细胞展现出与传统体外 CAR-T 细胞相当的抗肿瘤效果；Smith 等人则利用 PβAE 聚合物纳米载体包裹白血病特异性 CAR-pDNA，通过反复静脉注射，在白血病、前列腺癌和乙肝病毒（HBV）诱导的肝癌小鼠模型中，均观察到体内 CAR-T 细胞介导的显著肿瘤消退。不过，脂质基纳米载体仍面临 器官靶向性不足的问题：静脉注射后，大部分 LNPs 易被肝脏中的肝细胞吞噬，导致肝脏毒性风险增加，同时降低 T 细胞转导效率。为解决这一问题，研究人员通过表面修饰实现靶向优化 —— 例如，Rurik 等人将 CD5 抗体偶联到 LNPs 表面，使载体能特异性结合 T 细胞表面的 CD5 分子，显著提升 T 细胞转染效率，同时减少肝脏蓄积。 表 1 体内 CAR-T 细胞生成递送系统对比 （三）体内 CAR-T 技术的关键挑战 尽管体内 CAR-T 细胞生成展现出巨大潜力，但仍存在三大核心挑战，需通过技术优化逐步解决： 精准靶向 T 细胞：当前递送载体难以实现 100% T 细胞靶向，可能转导调节性 T 细胞（Treg）或恶性细胞，影响治疗效果或引发安全风险。例如，若载体转导 Treg 细胞，CAR-Treg 可能抑制效应 T 细胞的抗肿瘤活性；若转导肿瘤细胞，肿瘤细胞表面表达的 CAR 可能 “遮蔽” 靶抗原，导致 CAR-T 细胞无法识别（即 “抗原掩盖”）。在一例儿童 B 细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者中，体外 CAR-T 治疗时因单个白血病细胞被 CAR 基因转导，最终导致治疗耐药。解决方案包括：在载体表面偶联高亲和力 T 细胞特异性配体（如抗 CD3、CD8 scFv）、设计 T 细胞特异性启动子（如 CD4/CD8 启动子，仅在 T 细胞中启动 CAR 基因表达）。 CAR 表达的持久性调控：CAR 表达时间需与治疗需求匹配 —— 血液系统肿瘤可能需要长期 CAR 表达以防止复发，而实体瘤或非肿瘤疾病（如自身免疫病）可能需要短期表达以降低毒性。慢病毒载体因能稳定整合 CAR 基因，单次注射即可实现长期表达，但无法灵活调整；纳米载体（尤其是 mRNA 载体）介导的 CAR 表达为暂时性，需通过多次注射控制表达时长，但多次注射可能增加免疫原性（如载体引发的抗体反应）。未来需开发 “可控表达系统”，例如利用小分子药物调控 CAR 基因的开关，实现 “按需表达”。 毒性控制：体内 CAR-T 细胞虽可避免体外预处理相关毒性（如感染风险），但仍可能因 CAR 设计或过度激活引发 CRS、ICANS 等毒性。例如，含 CD28 共刺激域的 CAR-T 细胞比 4-1BB 基 CAR-T 细胞更易引发早期毒性。当前主流解决方案是在 CAR 中引入 “安全开关”： 自杀基因：如诱导型半胱天冬酶 9（iCas9），当出现严重毒性时，注射小分子药物（如 AP1903）可激活 iCas9，诱导 CAR-T 细胞凋亡； 清除标志物：在 CAR-T 细胞表面表达 CD20 或截短型表皮生长因子受体（tEGFR），毒性发生时注射相应抗体（如利妥昔单抗、西妥昔单抗），通过抗体依赖的细胞毒性（ADCC）或补体依赖的细胞毒性（CDC）清除 CAR-T 细胞； 可逆抑制分子：如酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼（Dasatinib），可抑制 CD3ζ 和 ZAP70 的磷酸化，暂时阻断 CAR 信号，毒性缓解后停药即可恢复 CAR-T 细胞功能，避免不可逆的细胞清除 。四、超越 CAR-T：CAR-NK、CAR-M 细胞的体内工程化潜力 为突破 CAR-T 细胞在实体瘤治疗中的局限（如 TME 浸润差、毒性高），研究人员将目光转向其他免疫细胞，通过 CAR 工程化改造，开发出 CAR-NK（自然杀伤细胞）、CAR-M（巨噬细胞）等新型细胞疗法，且其体内生成技术也成为研究热点。（一）CAR-NK 细胞：低毒、现货型治疗新选择 NK 细胞是先天免疫的核心细胞，无需抗原致敏即可杀伤肿瘤细胞，且具有以下优势，使其成为 CAR 工程化的理想对象： 低毒性：NK 细胞不依赖 TCR 识别抗原，不会引发移植物抗宿主病（GvHD）；同时，NK 细胞在体内存活时间短（通常数周至数月），可减少 CRS、ICANS 等长期毒性； 现货型潜力：异基因 NK 细胞（如脐带血来源）无需基因编辑即可避免 GvHD，可批量生产为 “现货型” 产品，解决自体 CAR-T 的时效性问题； 双重杀伤机制：CAR-NK 细胞可通过 “CAR 依赖途径”（识别肿瘤抗原后释放穿孔素、颗粒酶）和 “CAR 非依赖途径”（如激活受体 NKG2D 识别肿瘤细胞表面应激分子）杀伤肿瘤，降低抗原逃逸风险（图 3A、B）。1. CAR-NK 的结构优化 CAR-NK 的基础结构与 CAR-T 类似，但需加入 NK 细胞特异性信号域以增强功能：例如，在胞内域引入 NKG2D 相关信号分子（如 DAP10、DAP12），可激活 NK 细胞特有的杀伤通路，提升细胞毒性；此外，NK 细胞的体内存活时间短，可通过工程化使其表达 IL-2、IL-15 等细胞因子（如第四代 CAR-NK），延长存活并增强增殖能力。例如，Liu 等人开发的脐带血来源 CAR-NK 细胞，同时表达 CD19-CAR 和 IL-15，在白血病小鼠模型中展现出长期存活和强效抗肿瘤活性。2. CAR-NK 的体内生成进展 目前体内 CAR-NK 生成的研究仍处于早期阶段，仅 Andorko 等人报道了初步成果：他们设计了一种靶向 CD7（NK 细胞表面标志物）的慢病毒载体，包裹抗 CD20 CAR 基因，静脉注射到小鼠体内后，可特异性转导 NK 细胞，生成的 CD20-CAR-NK 细胞能有效清除 CD20 阳性肿瘤细胞。未来需进一步优化载体的 NK 细胞靶向性，同时提升转导效率，以满足临床需求。（二）CAR-M 细胞：实体瘤 TME 的 “破局者” 巨噬细胞具有强大的吞噬能力和 TME 重塑能力，在实体瘤治疗中展现出独特优势： 强效 TME 浸润：巨噬细胞可主动迁移至实体瘤内部，且能耐受 TME 中的免疫抑制因子（如 IL-10、TGF-β），不易发生细胞耗竭 ； TME 重塑功能：CAR-M 细胞可通过吞噬肿瘤细胞、分泌促炎细胞因子（如 TNF-α、IL-1β），将 “免疫抑制型 TME”（以 M2 型巨噬细胞为主）转化为 “免疫激活型 TME”（以 M1 型巨噬细胞为主），同时激活适应性免疫（如 T 细胞）； 双重杀伤途径：与 CAR-NK 类似，CAR-M 细胞可通过 “CAR 依赖途径”（抗原特异性吞噬）和 “CAR 非依赖途径”（如 Fc 受体介导的 ADCC、ROS/iNOS 介导的细胞毒性）杀伤肿瘤（图 3C、D）。1.CAR-M 的临床前证据 Klichinsky 等人开发的 HER2 靶向 CAR-M 细胞，在乳腺癌、卵巢癌小鼠模型中，不仅能直接吞噬 HER2 阳性肿瘤细胞，还能分泌 IL-12 等细胞因子，招募并激活 T 细胞，形成 “CAR-M-T 细胞协同抗肿瘤效应”；此外，CAR-M 细胞的毒性极低，临床前研究中仅观察到轻微发热、体重下降，未出现 CRS 或 ICANS 。2.CAR-M 的体内生成探索 目前 CAR-M 的体内生成研究集中在纳米载体递送：由于巨噬细胞具有较强的吞噬能力，可通过 “被动靶向”（如利用纳米载体的尺寸效应，被巨噬细胞主动吞噬）实现 CAR 基因递送。例如，研究人员利用 PEG 修饰的脂质纳米颗粒包裹 CAR-mRNA，静脉注射后可被脾脏、肿瘤中的巨噬细胞吞噬，实现 CAR-M 细胞的体内生成 。未来需进一步提升载体对肿瘤部位巨噬细胞的靶向性，减少对正常组织（如肝脏、脾脏）巨噬细胞的影响。 图 3 CAR-NK 与 CAR-M 细胞的杀伤机制对比A：CAR-NK 细胞的 CAR 依赖杀伤途径：CAR 识别肿瘤抗原后，释放穿孔素、颗粒酶 B 杀伤肿瘤细胞，同时分泌促炎细胞因子激活 T 细胞；B：CAR-NK 细胞的 CAR 非依赖杀伤途径：通过激活受体（如 NKG2D）、FasL/Fas 通路、CD16 介导的 ADCC 杀伤肿瘤；C：CAR-M 细胞的 CAR 依赖杀伤途径：CAR 识别肿瘤抗原后，通过特异性吞噬清除肿瘤细胞，分泌细胞因子激活 T 细胞；D：CAR-M 细胞的 CAR 非依赖杀伤途径：通过非特异性吞噬、MHC-I 介导的抗原提呈、ROS/iNOS 介导的毒性杀伤肿瘤。（三）CAR-Treg 细胞：自身免疫病治疗的新方向 调节性 T 细胞（Treg）是维持免疫耐受的关键细胞，通过 CAR 工程化改造后（即 CAR-Treg），可特异性抑制针对自身抗原的免疫反应，用于治疗自身免疫病（如类风湿关节炎、1 型糖尿病）。与 CAR-T 细胞不同，CAR-Treg 细胞通过分泌 IL-10、TGF-β 等抑制性细胞因子发挥作用，而非直接杀伤细胞 。 当前 CAR-Treg 细胞的研究以体外制造为主，但面临 “表型不稳定性” 问题 —— 体外扩增过程中，Treg 细胞可能丢失抑制功能，转化为促炎效应 T 细胞，反而加剧炎症。体内 CAR-Treg 生成技术可能解决这一问题：直接在体内对 Treg 细胞进行工程化，避免体外培养的 “人工环境干扰”，维持其抑制表型。例如，Fransson 等人通过体外制造靶向髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）的 CAR-Treg 细胞，成功缓解了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE，多发性硬化症动物模型）的症状 ；若能实现体内生成，将大幅简化治疗流程，提升临床转化潜力。不过，目前体内 CAR-Treg 生成尚未见报道，需突破 Treg 细胞特异性递送、CAR 表达调控等技术瓶颈。五、总结与未来展望（一）技术总结：从体外到体内的核心变革 CAR-T 细胞治疗历经数十年发展，已从早期的体外自体制造，逐步向体内通用型技术演进。体外制造虽在血液系统肿瘤中疗效显著，但受限于高成本、长周期、高毒性三大瓶颈；体内生成技术通过病毒或纳米载体直接在患者体内完成 T 细胞工程化，可同时解决这三大问题 —— 无需体外操作降低成本、单次注射缩短治疗周期、避免体外扩增减少细胞耗竭与毒性。此外，CAR-NK、CAR-M 等新型细胞疗法的兴起，进一步拓展了 CAR 技术的应用边界：CAR-NK 以低毒、现货型优势补充血液系统肿瘤治疗，CAR-M 则凭借 TME 重塑能力突破实体瘤治疗瓶颈，而 CAR-Treg 为自身免疫病提供了精准调控方案 。 从技术成熟度来看，体外 CAR-T 仍是当前临床主流，但体内技术已展现出不可替代的潜力：病毒载体（如慢病毒、AAV）凭借高转导效率成为体内递送的 “基准平台”，纳米载体（如 LNPs、聚合物颗粒）则以安全性和规模化优势成为未来方向。不过，无论是哪种技术路径，精准靶向（避免非靶细胞转导）、可控表达（匹配治疗需求调节 CAR 时长）、毒性控制（降低 CRS/ICANS 风险）仍是需持续突破的核心难题。（二）未来研究方向：从技术优化到临床转化1.载体技术：提升靶向性与安全性 T 细胞特异性递送：当前载体对 T 细胞的靶向效率仍不足 50%，需通过 “双靶向策略” 进一步优化 —— 例如，在慢病毒表面同时融合 CD3 和 CD8 scFv，或在 LNPs 表面偶联 CD5 抗体与 T 细胞特异性肽，实现 “双重识别” 以提升靶向精度；同时，可利用 T 细胞特异性启动子（如 IL-2 启动子），确保 CAR 基因仅在 T 细胞中表达，即使载体转导非靶细胞，也不会产生功能性 CAR 。 非整合型载体开发：为规避慢病毒的插入突变风险，需推动非整合型病毒载体（如无整合慢病毒、高容量腺病毒）和非病毒载体（如 mRNA-LNPs、转座子纳米颗粒）的研发。例如，mRNA-LNPs 介导的 CAR 表达为暂时性，且无基因组整合风险，已在小鼠模型中实现安全的体内 CAR-T 生成，未来需解决 mRNA 易降解、需多次注射的问题。2.CAR 设计：适配体内生成特性 体内生成的 CAR-T 细胞无需体外扩增，需通过 CAR 结构优化增强其体内存活与功能： 代谢适配：体外 CAR-T 细胞依赖有氧糖酵解快速扩增，而体内 T 细胞更依赖脂肪酸代谢维持长期存活，因此可在 CAR 胞内域加入调控代谢的信号分子（如 AMPK 激活域），促进体内 CAR-T 细胞向记忆表型分化 ； TME 抗性：针对实体瘤，可设计 “装甲型 CAR”—— 例如，在 CAR 中加入 PD-L1 抗体片段或 TGF-β 受体阻断域，使体内生成的 CAR-T 细胞能抵抗 TME 的免疫抑制； 多靶点识别：为应对实体瘤抗原异质性，可开发体内双价 CAR 生成技术 —— 例如，利用双启动子载体同时递送两种 scFv，使单个 T 细胞表达能识别 HER2 和 IL13Rα2 的双价 CAR。3.联合治疗：拓展体内 CAR 技术的应用场景 与免疫检查点抑制剂联用：体内生成的 CAR-T 细胞虽可通过 PD-1/CD28 开关受体抵抗 TME 抑制，但联合 PD-1 抗体仍可进一步增强疗效。例如，在黑色素瘤小鼠模型中，体内 CD19-CAR-T 细胞联合 PD-1 抑制剂，可使肿瘤完全消退率从 30% 提升至 60%； 与化疗/放疗联用：低剂量化疗（如环磷酰胺）可清除体内抑制性 Treg 细胞，为体内生成的 CAR-T 细胞提供 “存活空间”。研究显示，在淋巴瘤小鼠模型中，低剂量环磷酰胺预处理可使体内 CAR-T 细胞的扩增效率提升 2 倍 ； 跨疾病应用：除肿瘤外，体内 CAR 技术可拓展至非肿瘤领域。例如，Rurik 等人利用 CD5 靶向 LNPs 递送 FAP-CAR mRNA，在小鼠心脏纤维化模型中，体内生成的 FAP-CAR-T 细胞可特异性清除活化成纤维细胞，恢复心脏功能 ；未来还可探索用于治疗 HIV（靶向 CD4-CAR）、自身免疫病（靶向自身抗原的 CAR-Treg）等。4.临床转化：建立标准化体系 质量控制标准：体内 CAR 载体需建立严格的质量控制指标，包括载体纯度（如病毒载体的复制 competent 病毒检测、纳米载体的粒径均一性）、转导效率（体外 T 细胞转导效率需≥70%）、安全性（如内毒素含量、细胞毒性）； 剂量探索：需通过临床 I 期试验确定载体的安全剂量范围 —— 例如，慢病毒载体的剂量过高可能引发炎症反应，过低则转导效率不足，需在安全性与疗效间找到平衡； 生物标志物监测：开发非侵入性生物标志物（如外周血中 CAR 基因的 ctDNA、细胞因子水平），实时监测体内 CAR-T 细胞的扩增、存活与毒性，为临床剂量调整提供依据。（三）结语 从 1989 年 Gross 等人首次提出 CAR-T 概念，到 2025 年体内 CAR 技术进入临床前验证阶段，CAR 细胞治疗已实现从 “实验室” 到 “临床” 的跨越，但其发展仍处于 “上半场”。体外制造技术的优化（如自动化 GMP 生产）与体内生成技术的突破（如靶向纳米载体）将并行推进，而 CAR-NK、CAR-M 等新型细胞疗法的加入，将构建起 “覆盖血液瘤 - 实体瘤 - 非肿瘤疾病”的 CAR治疗体系。 未来 5-10 年，随着载体靶向性、CAR 设计与联合治疗策略的持续优化，体内 CAR 技术有望实现三大目标：一是将治疗成本降至 10 万美元以下，使更多患者可及；二是实现实体瘤的 CAR 治疗突破，填补当前临床空白；三是拓展至自身免疫病、纤维化等非肿瘤领域，成为 “泛疾病” 的免疫治疗平台。当然，这一过程仍需克服技术、临床与伦理层面的多重挑战，但可以肯定的是，从“体外定制”到“体内生成” 的变革，将重新定义 CAR 细胞治疗的未来。 识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。