IF=60.6！饶燏团队综述：PROTACs构效关系优化之路

2022-08-26

蛋白降解靶向嵌合体小分子药物免疫疗法抗体

导读近年来，靶向药物在抗癌药物的发展中立下了汗马功劳，在现有的抗癌靶向药物中，许多针对癌症的靶向疗法是抑制驱动肿瘤生长的蛋白质活性的小分子或单克隆抗体，然而，长期使用之后，肿瘤细胞通常会“聪明地”通过靶蛋白的过表达或者突变来获得对这些药物的抗性，从而使其能够摆脱药物的抑制作用。在最新的研究中，研究者将目标瞄准了细胞内的“清洁工”，也就是我们体内的泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System, UPS），并希望通过该系统的参与来应对靶蛋白过表达或者突变带来的药物抗性。图1 PROTACs双功能分子的发展时间轴2022年8月2日，清华大学饶燏教授团队在Chemical Society Reviews期刊上发表了题为“Chemistries of bifunctional PROTAC degraders”的重磅文章。值得注意的是2015年起，饶燏教授课题组开始致力于探究细胞内靶向蛋白质降解技术（PROTACs），以及将PROTAC技术转化为临床相关的抗肿瘤活性分子，取得了一系列重要研究进展。本综述通过分析PROTACs开发的众多代表性示例，强调了这一蓬勃发展领域的重要进展以及传统的经验主义开发PROTACs的局限性。综述作者从药物设计的角度总结和分析了PROTACs结构优化的一般原则和策略，并提出了促进PROTACs发展蓝图。https://pubs-rsc-org.libproxy1.nus.edu.sg/en/content/articlelanding/2022/CS/D2CS00220E01E3连接酶配体的设计与优化1.1 第一代多肽的PROTAC的设计2008 年，Rodriguez课题组使用VHL识别的HIF1α的七个氨基酸序列(ALAPYIP) 代替IkBa磷酸肽，合成了新一代靶向ERa(4)和AR(5)的PROTAC。这些PROTAC可以诱导特异性降解低微摩尔范围内的ERa或AR，无需显微注射。与磷酸肽PROTACs相比，发现能招募VHL E3泛素连接酶与短肽的PROTACs化合物，使该技术的发展取得了突破。然而，由于其肽特性，肽PROTACs的细胞通透性较差，这限制了PROTAC技术用于开发实用疗法。图2 基于多肽的PROTAC的设计与优化1.2小分子PROTACs的设计从2001年到2011年，虽然PROTACs的概念提出了十年，但这项技术发展缓慢。基于小分子的E3泛素连接酶配体的发现导致PROTACs 技术的快速发展。目前，已鉴定出 600 多种人类基因组编码的 E3 泛素连接酶，但缺乏高亲和力和特异性的 E3 泛素蛋白连接酶小分子配体限制了 PROTAC 技术的更广泛应用。迄今为止，几种类型的 E3 配体已用于 PROTAC 的设计和开发。小鼠双微体基因2蛋白 (MDM2)、细胞凋亡蛋白抑制剂 (cIAP)、希佩尔林道蛋白(VHL) 和 CRBN (cereblon) 已成功用于小分子 PROTAC，特别是基于CRBN的 ARV-110 和 ARV-471 已用于临床研究。图3 E3连接酶配体发现时间表红点表示适当的linker连接位点综述作者还根据降解目标对使用的E3连接酶进行了分析。通过分析，作者发现不同蛋白质对E3连接酶的耐受性存在一定差异。有些蛋白质对 E3 连接酶的耐受性更高，因此可以使用多种 E3 连接酶（CRBN、VHL、MDM2、cIAP 等）来设计 PROTAC，例如 BRD4、BTK、HDAC 等。耐受 E3 连接酶，只有特定的 E3 连接酶（CRBN 或 VHL）可用于设计 PROTAC，如 Aurora A、FKBP12 等。造成这些差异的原因主要有以下几点：首先，可能是不同类型的E3连接酶在不同细胞中的表达水平不同，导致降解活性的效率不同。其次，可能是不同的靶蛋白具有一定的E3连接酶选择性，导致E3连接酶诱导的蛋白质泛素化和降解效率不同。最后，可能是基于不同E3连接酶的PROTACs的数量和种类不够，导致基于某一种E3连接酶设计的降解剂不能诱导相关蛋白的降解。基于以上分析结果，我们发现在后续的PROTACs设计中，我们可以总结和借鉴以下经验：首先，最好选择 CRBN 或 VHL 连接酶作为 E3 配体，因为这两种 E3 连接酶的作用域最高。其次，当基于已知 E3 连接酶配体设计的 PROTAC 不能诱导新靶蛋白降解时，可以使用新的 E3 连接酶配体来设计 PROTAC，但这种策略需要大量的实验验证。图4 目前常用的 E3 连接酶类型、它们的比例以及可被基于 VHL 和 CRBN 的 PROTAC 降解的代表性靶标02PROTACs的连接基团设计策略PROTACs的整体降解效率不仅取决于靶蛋白配体的亲和力和E3配体的类型，还取决于通过合适的连接基团连接的POI配体和E3配体的有效组合。大量数据表明，连接基团长度和组成对于三元复合物的形成、降解活性和靶标选择性很重要。包括长度、组成、刚性和附着位点等。但是，连接基团的设计和优化还没有普遍适用的设计策略。通常，使用短且结构简单的烷基链或 PEG链作为起点，通过迭代试错调整连接基团的相关特性。2.1选择合适的E3连接酶配体结合位点Maniaci课题组基于VHL与VH298结合的共晶结构，设计了用于VHL自诱导降解的Homo-PROTACs。可以很容易地观察到VH298有两个溶剂暴露位点，这两个位点上的连接子并不影响VH298与VHL的结合方式。因此，他们合成了三种不同的附着点组合的PROTACs，发现最高效的PROTAC CM11与VH032的左乙酰基对称连接。然而，从其他位置连接的PROTACs，如化合物37和38，显示出无效降解，这突出了适当的附着位点对降解活性的重要性。Crews报告的另一个例子是通过改变连接子长度和连接位点实现p38的异型选择性降解他们开发了基于foretinib和VHL配体的p38a-和p38dselective PROTACs。SJFa在较低的纳米摩尔浓度下能有效降解p38a，但p38b、p38g和p38d的降解活性较差。SJFd有效降解p38d，而p38a、p38b和p38g未降解。图5基于VHL的PROTAC的合理设计2.2 选择合适的靶蛋白配体结合位点PROTACs选择的用于降解不同靶蛋白的小分子配体种类繁多。因此，连接这些小分子配体的连接位点也有多种策略。选择接头进入位点的原则是从配体结合口袋边缘或溶剂区进入接头，而不改变或微弱改变小分子与其受体的结合亲和力。与 POI 结合的众多小分子的晶体结构数据为我们选择合适的接头附着位点提供了理论基础。通常，从配体的活性原子中提取接头，例如羧基、氨基等。图6基于POI配体的PROTACs的合理设计2.3 PROTACs分子自组装目前对于新的 PROTACs 连接基团没有普遍接受的设计规则，可以确保为任何给定的目标蛋白质生成有效的降解剂，并且通常需要一定程度的经验试验和错误。PROTACs 连接基团最常见的基序结构是 PEG 和不同长度的烷基链。由于其高效和快速，点击化学通常用于 PROTACs 分子的合成。因此，三唑结构的接头也是连接 POI 和 E3 连接酶配体的一种选择。药物化学家尝试仅使用刚性接头，包括炔烃和饱和杂环，如哌嗪和哌啶，并在PROTACs的开发中取得了成功。表1已发表PROTACs中常见的连接基团根据 POI 配体和 E3 配体的结构特性，预组装的接头基序可以在任一端通过正交条件或去保护序列有效地官能化。首先，可以将POI配体和接头基序组装，得到带有接头基序的中间体，可以直接进行下一步或带有保护基。然后修饰的中间体与 E3 泛素连接酶配体连接形成PROTAC 分子。反过来，我们也可以将连接体与 E3 配体连接，然后与 POI 配体连接以获得 PROTAC 分子。另一种常见的策略是将 POI 配体和 E3 配体分别连接到一个接头基序上，然后通过简单的化学反应（如酰胺缩合、点击化学等）将这两部分组装起来形成PROTAC分子。图7 PROTAC组装和代表性PROTAC概述03典型PROTAC的设计3.1亚型选择性PROTAC的设计基于选择性抑制剂的亚型选择性PROTAC的设计。图8亚型选择性PROTACs的合理设计基于通用型抑制剂的亚型选择性PROTAC设计。图9亚型选择性PROTACs的合理设计3.2设计降解蛋白质复合物的PROTACs近年来，已经开发了一系列新的EED 靶向和 EZH2 靶向 PROTAC，以消除 PRC2 复合物的功能。2019 年，Bloeche课题组通过将有效的 EED 抑制剂 MAK683 EED 抑制剂 MAK683 与 VHL 配体结合，开发了一种 EED 降解剂 86与 EED 结合并促进与 VHL 形成三元复合物，并诱导EED 快速有效的降解。图10靶向EED的PROTAC分子可降解PRC2蛋白复合物3.3‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍不同抑制剂以降解相同POI的PROTAC2016 年，基于 I 型 BCR-ABL 抑制剂 BCR-ABL 抑制剂（达沙替尼和波舒替尼），Crews 课题组首先尝试开发用于降解 BCR-ABL 的 BCR-ABL PROTAC。为了设计 BCRABL PROTAC，作者将波舒替尼和达沙替尼与VHL 和 CRBN E3 泛素连接酶配体结合。优化的连接基团可以诱导 BCR-ABL 靶标和 VHL E3 连接酶之间的良好相互作用，从而导致 BCR-ABL 的降解。图11代表性 BCR-ABL 抑制剂 BCR-ABL 抑制剂 (A) 和PROTAC (B) 的化学结构3.4设计降解不可成药靶标的PROTACs基于SI-109的结构,王少萌课题组使用来那度胺和泊马度胺作为E3连接酶配体与SI-109连接，得到23种不同的STAT3降解剂，它们除了E3连接酶配体外，在连接基团和靶蛋白配体上也有所不同。连接基团包括不同长度的炔链和烷基链。通过STAT3降解活性测试，发现降解剂SD-36对STAT3的降解活性最好，在MOLM-16细胞和SU-DHL-1细胞中STAT3的降解活性DC50分别为60 nM和28 nM。图12 针对 STAT3 的合理设计和代表性 PROTACs04设计突变蛋白PROTACs4.1降解野生型和突变型蛋白质的PROTAC设计2018 年，饶燏课题组首次开发了一系列新的PROTACs 用于耐依鲁替尼的 BTK 降解。依鲁替尼和泊马度胺连接的降解剂 P13I 表现出最强的降解活性，可以有效降解野生型（DC50 =9.2 nM）和依鲁替尼-Mino 细胞中的抗 C481S BTK (DC50 = 30 nM)。进一步优化 P13I，将 P13I 的 E3 连接酶配体替换为来那度胺，得到新的降解剂 L18I。它不仅可以有效降解野生型 BTK，还可以有效降解多种临床相关的 BTK 突变体（C481S/T/ A/G/W) 在浓度低于 50 nM 的 HeLa 细胞中。降解剂L18I在体外能有效抑制表达C481S-BTK的DLBCL和MCL细胞的增殖，而依鲁替尼对增殖的抑制效果较差。图13 BTK PROTACs的合理设计4.2选择性降解突变蛋白的PROTAC设计2020年，王佳亮研究团队报道了由 E3 连接酶配体沙利度胺和 BRAF 激酶抑制剂vemurafenib BRAF 激酶抑制剂vemurafenib 产生的 BRAF 降解剂。最有效的降解剂选择性诱导 BRAFV600E 的降解，而不是野生型 BRAF，尽管它们对两种蛋白质的亲和力相似。图14 BRAFV600E选择性降解PROTAC的设计05不可逆共价和可逆共价PROTAC的设计5.1不可逆共价PROTACs的设计与POI配体共价结合图15 靶向KRASG12C的不可逆共价PROTAC与 E3 连接酶共价结合图16 不可逆共价 BTK PROTAC5.2可逆共价PROTACs的设计依鲁替尼与 BTK 具有高共价和非共价结合活性。它是非共价类似物，不能形成共价复合物，对 BTK也有很高的亲和力。基于依鲁替尼结构开发的可逆共价抑制剂也实现了良好的结合亲和力。迄今为止，已开发出多种非共价BTK降解剂，证明了PROTAC技术实现BTK高效降解的可行性。基于这些结果，London 课题组报道了非共价的139、基于丙烯酰胺的 140 和基于氰基丙烯酰胺的141 PROTAC，它们都表现出明显的 BTK降解，DC50 小于 10 nM，Dmax 大于 85%。图17 可逆共价PROTAC的设计06双机制降解器的设计一系列针对 RTK 激酶降解的 PROTAC 已被报道以分子胶做为例子。2018 年，Winter 课题组基于混杂激酶抑制剂舒尼替尼合成了一系列基于 CRBN 的 PROTAC。出乎意料的是，这两个系列均未能诱导其共有靶标的降解，而单个分子（如 MI-389）在急性白血病细胞系中显示出明显的抗增殖作用。一些数据表明 MI-389 的细胞毒性取决于 CRBN E3 连接酶复合物，并由靶蛋白降解而不是残余激酶抑制活性触发。图18同时具有PROTAC和分子胶作用机制（GSPT1）化合物的开发优化过程07改善PROTACs药代动力学特性的结构设计与 AR 一样，ER 也与疾病密切相关，尤其是乳腺癌。雌激素调节细胞生长、增殖、发育和分化等多种生理过程。ER是核受体（NR）蛋白超家族的重要成员，是一种配体激活的转录因子，包括α和β亚型。ERα 在正常乳腺上皮中的表达率较低，但在乳腺肿瘤中高表达。ERα基因敲除小鼠实验表明，ERα在乳腺发育中具有促进乳腺肿瘤形成的作用。因此，使用PROTAC开发ERα降解剂的技术已成为治疗乳腺癌的新方法。图19 Erα PROTACs的设计和优化08基于晶体结构和计算化学的PROTACs设计8.1以三元配合物的晶体结构为指导的理性PROTACs设计基于受体-配体晶体结构的药物设计一直是小分子药物发现和优化的重要理论基础。与小分子不同，PROTACs诱导靶蛋白配体和E3连接酶配体之间形成三元复合物，这种三元复合物的相互作用可以通过连接基团来调节。图20基于三元配合物晶体结构的选择性BRD4 PROTACs的合理设计8.2计算化学指导下的理性PROTACs设计虽然PROTACs是研究和医疗的优越生物技术，但PROTACs复杂的机制在开发过程中带来了更多的困难。“POI-PROTAC-E3连接酶”三元复合物模型是PROTACs开发的最重要指导方案之一。三元复合物结构为POI、PROTACs分子和E3连接酶之间提供了促进结构活性的合理作用模式关系分析，大大加快了分子优化过程，清楚地说明了降解选择性的来源。由于复合体庞大、灵活且不稳定，构建三元复合体需要严格的条件，极其耗时和困难。真正的共晶结构远远落后于要求。因此，开发用于三元复数建模的计算方法迫在眉睫。人工智能可以进一步利用现有高质量但分散的实验结果，推动理解蛋白-蛋白相互作用的内在机制，促进PROTAC的发展。图21 基于计算化学的PROTACs的开发过程09条件控制PROTAC的设计尽管已经报道了许多 PROTAC，但这些PROTACs可以快速高效地诱导蛋白质降解，在生物学研究和疾病治疗中都发挥着重要作用，其缺点主要表现在人工可控性差、时空选择性差等，导致无法人工控制释放药物和存在明显的副作用。目前策略主要分为三类。第一类是光控PROTACs，这是目前最成功的方法。第二类是利用叶笼策略来控制和实现蛋白质降解。第三类是在其他条件下人工释放PROTACs，如缺氧激活PROTACs。最近的一篇综述详细介绍了PROTACs的组成和不同的产生策略。图22不同条件控制的PROTAC分子总结和展望自2001年第一个概念验证PROTAC被报道以来，PROTACs技术进入了实际应用阶段。PROTACs分子设计的最大挑战是潜在降解剂候选物的发现过程仍然是经验性的。这个过程在很大程度上依赖于合成和药物化学方面的大量努力，这既费时又昂贵。PROTACs化合物设计的一般流程大致如下，通过筛选确定合适的目标蛋白配体；分析配体与靶蛋白的结合方式；在不影响配体与靶蛋白结合的情况下选择合适的连接基团结合位点；然后与E3连接酶配体结合形成PROTACs化合物。与传统的小分子抑制剂不同，PROTACs的优化很难让人概括系统的构效关系。对于一个新的靶点，通常研究人员只能尝试寻找活性PROTACs化合物，这增加了研究的工作量和难度。开发具有预测功能的新型计算工具将促进PROTAC发展。总之，PROTAC为跨越当前生物研究中药物发现和工具开发的障碍提供了一种新的有前途且强大的方法。另一方面，需要更多的努力来深入了解PROTACs在临床上的疗效和安全性。更多适合开发PROTAC的目标结合剂和E3连接酶仍有待探索。更重要的是，在现有的研究基础上，逐步总结规律，以利于PROTAC分子的分子设计和优化。参考文献：Han XR, Chen L, Wei Y, Yu W, Chen Y, Zhang C, Jiao B, Shi T, Sun L, Zhang C, Xu Y, Lee MR, Luo Y, Plewe MB, Wang J. Discovery of Selective Small Molecule Degraders of BRAF-V600E. J Med Chem. 2020 Apr 23;63(8):4069-4080. doi: 10.1021/acs.jmedchem.9b02083. Epub 2020 Apr 10. PMID: 32223235.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。