Foretinib

导读近年来，靶向药物在抗癌药物的发展中立下了汗马功劳，在现有的抗癌靶向药物中，许多针对癌症的靶向疗法是抑制驱动肿瘤生长的蛋白质活性的小分子或单克隆抗体，然而，长期使用之后，肿瘤细胞通常会“聪明地”通过靶蛋白的过表达或者突变来获得对这些药物的抗性，从而使其能够摆脱药物的抑制作用。在最新的研究中，研究者将目标瞄准了细胞内的“清洁工”，也就是我们体内的泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System, UPS），并希望通过该系统的参与来应对靶蛋白过表达或者突变带来的药物抗性。图1 PROTACs双功能分子的发展时间轴2022年8月2日，清华大学饶燏教授团队在Chemical Society Reviews期刊上发表了题为“Chemistries of bifunctional PROTAC degraders”的重磅文章。值得注意的是2015年起，饶燏教授课题组开始致力于探究细胞内靶向蛋白质降解技术（PROTACs），以及将PROTAC技术转化为临床相关的抗肿瘤活性分子，取得了一系列重要研究进展。本综述通过分析PROTACs开发的众多代表性示例，强调了这一蓬勃发展领域的重要进展以及传统的经验主义开发PROTACs的局限性。综述作者从药物设计的角度总结和分析了PROTACs结构优化的一般原则和策略，并提出了促进PROTACs发展蓝图。https://pubs-rsc-org.libproxy1.nus.edu.sg/en/content/articlelanding/2022/CS/D2CS00220E01E3连接酶配体的设计与优化1.1 第一代多肽的PROTAC的设计2008 年，Rodriguez课题组使用VHL识别的HIF1α的七个氨基酸序列(ALAPYIP) 代替IkBa磷酸肽，合成了新一代靶向ERa(4)和AR(5)的PROTAC。这些PROTAC可以诱导特异性降解低微摩尔范围内的ERa或AR，无需显微注射。与磷酸肽PROTACs相比，发现能招募VHL E3泛素连接酶与短肽的PROTACs化合物，使该技术的发展取得了突破。然而，由于其肽特性，肽PROTACs的细胞通透性较差，这限制了PROTAC技术用于开发实用疗法。图2 基于多肽的PROTAC的设计与优化1.2小分子PROTACs的设计从2001年到2011年，虽然PROTACs的概念提出了十年，但这项技术发展缓慢。基于小分子的E3泛素连接酶配体的发现导致PROTACs 技术的快速发展。目前，已鉴定出 600 多种人类基因组编码的 E3 泛素连接酶，但缺乏高亲和力和特异性的 E3 泛素蛋白连接酶小分子配体限制了 PROTAC 技术的更广泛应用。迄今为止，几种类型的 E3 配体已用于 PROTAC 的设计和开发。小鼠双微体基因2蛋白 (MDM2)、细胞凋亡蛋白抑制剂 (cIAP)、希佩尔林道蛋白(VHL) 和 CRBN (cereblon) 已成功用于小分子 PROTAC，特别是基于CRBN的 ARV-110 和 ARV-471 已用于临床研究。图3 E3连接酶配体发现时间表 红点表示适当的linker连接位点综述作者还根据降解目标对使用的E3连接酶进行了分析。通过分析，作者发现不同蛋白质对E3连接酶的耐受性存在一定差异。有些蛋白质对 E3 连接酶的耐受性更高，因此可以使用多种 E3 连接酶（CRBN、VHL、MDM2、cIAP 等）来设计 PROTAC，例如 BRD4、BTK、HDAC 等。耐受 E3 连接酶，只有特定的 E3 连接酶（CRBN 或 VHL）可用于设计 PROTAC，如 Aurora A、FKBP12 等。造成这些差异的原因主要有以下几点：首先，可能是不同类型的E3连接酶在不同细胞中的表达水平不同，导致降解活性的效率不同。其次，可能是不同的靶蛋白具有一定的E3连接酶选择性，导致E3连接酶诱导的蛋白质泛素化和降解效率不同。最后，可能是基于不同E3连接酶的PROTACs的数量和种类不够，导致基于某一种E3连接酶设计的降解剂不能诱导相关蛋白的降解。基于以上分析结果，我们发现在后续的PROTACs设计中，我们可以总结和借鉴以下经验：首先，最好选择 CRBN 或 VHL 连接酶作为 E3 配体，因为这两种 E3 连接酶的作用域最高。其次，当基于已知 E3 连接酶配体设计的 PROTAC 不能诱导新靶蛋白降解时，可以使用新的 E3 连接酶配体来设计 PROTAC，但这种策略需要大量的实验验证。图4 目前常用的 E3 连接酶类型、它们的比例以及可被基于 VHL 和 CRBN 的 PROTAC 降解的代表性靶标02PROTACs的连接基团设计策略PROTACs的整体降解效率不仅取决于靶蛋白配体的亲和力和E3配体的类型，还取决于通过合适的连接基团连接的POI配体和E3配体的有效组合。大量数据表明，连接基团长度和组成对于三元复合物的形成、降解活性和靶标选择性很重要。包括长度、组成、刚性和附着位点等。但是，连接基团的设计和优化还没有普遍适用的设计策略。通常，使用短且结构简单的烷基链或 PEG链作为起点，通过迭代试错调整连接基团的相关特性。2.1选择合适的E3连接酶配体结合位点Maniaci课题组基于VHL与VH298结合的共晶结构，设计了用于VHL自诱导降解的Homo-PROTACs。可以很容易地观察到VH298有两个溶剂暴露位点，这两个位点上的连接子并不影响VH298与VHL的结合方式。因此，他们合成了三种不同的附着点组合的PROTACs，发现最高效的PROTAC CM11与VH032的左乙酰基对称连接。然而，从其他位置连接的PROTACs，如化合物37和38，显示出无效降解，这突出了适当的附着位点对降解活性的重要性。Crews报告的另一个例子是通过改变连接子长度和连接位点实现p38的异型选择性降解他们开发了基于foretinib和VHL配体的p38a-和p38dselective PROTACs。SJFa在较低的纳米摩尔浓度下能有效降解p38a，但p38b、p38g和p38d的降解活性较差。SJFd有效降解p38d，而p38a、p38b和p38g未降解。图5基于VHL的PROTAC的合理设计2.2 选择合适的靶蛋白配体结合位点PROTACs选择的用于降解不同靶蛋白的小分子配体种类繁多。因此，连接这些小分子配体的连接位点也有多种策略。选择接头进入位点的原则是从配体结合口袋边缘或溶剂区进入接头，而不改变或微弱改变小分子与其受体的结合亲和力。与 POI 结合的众多小分子的晶体结构数据为我们选择合适的接头附着位点提供了理论基础。通常，从配体的活性原子中提取接头，例如羧基、氨基等。 图6基于POI配体的PROTACs的合理设计2.3 PROTACs分子自组装目前对于新的 PROTACs 连接基团没有普遍接受的设计规则，可以确保为任何给定的目标蛋白质生成有效的降解剂，并且通常需要一定程度的经验试验和错误。PROTACs 连接基团最常见的基序结构是 PEG 和不同长度的烷基链。由于其高效和快速，点击化学通常用于 PROTACs 分子的合成。因此，三唑结构的接头也是连接 POI 和 E3 连接酶配体的一种选择。药物化学家尝试仅使用刚性接头，包括炔烃和饱和杂环，如哌嗪和哌啶，并在PROTACs的开发中取得了成功。表1已发表PROTACs中常见的连接基团根据 POI 配体和 E3 配体的结构特性，预组装的接头基序可以在任一端通过正交条件或去保护序列有效地官能化。首先，可以将POI配体和接头基序组装，得到带有接头基序的中间体，可以直接进行下一步或带有保护基。然后修饰的中间体与 E3 泛素连接酶配体连接形成PROTAC 分子。反过来，我们也可以将连接体与 E3 配体连接，然后与 POI 配体连接以获得 PROTAC 分子。另一种常见的策略是将 POI 配体和 E3 配体分别连接到一个接头基序上，然后通过简单的化学反应（如酰胺缩合、点击化学等）将这两部分组装起来形成PROTAC分子。图7 PROTAC组装和代表性PROTAC概述03典型PROTAC的设计3.1亚型选择性PROTAC的设计基于选择性抑制剂的亚型选择性PROTAC的设计。图8亚型选择性PROTACs的合理设计基于通用型抑制剂的亚型选择性PROTAC设计。图9亚型选择性PROTACs的合理设计3.2设计降解蛋白质复合物的PROTACs近年来，已经开发了一系列新的EED 靶向和 EZH2 靶向 PROTAC，以消除 PRC2 复合物的功能。2019 年，Bloeche课题组通过将有效的 EED 抑制剂 MAK683 与 VHL 配体结合，开发了一种 EED 降解剂 86与 EED 结合并促进与 VHL 形成三元复合物，并诱导EED 快速有效的降解。图10靶向EED的PROTAC分子可降解PRC2蛋白复合物3.3‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍不同抑制剂以降解相同POI的PROTAC2016 年，基于 I 型 BCR-ABL 抑制剂（达沙替尼和波舒替尼），Crews 课题组首先尝试开发用于降解 BCR-ABL 的 BCR-ABL PROTAC。为了设计 BCRABL PROTAC，作者将波舒替尼和达沙替尼与VHL 和 CRBN E3 泛素连接酶配体结合。优化的连接基团可以诱导 BCR-ABL 靶标和 VHL E3 连接酶之间的良好相互作用，从而导致 BCR-ABL 的降解。图11代表性 BCR-ABL 抑制剂 (A) 和PROTAC (B) 的化学结构3.4设计降解不可成药靶标的PROTACs基于SI-109的结构,王少萌课题组使用来那度胺和泊马度胺作为E3连接酶配体与SI-109连接，得到23种不同的STAT3降解剂，它们除了E3连接酶配体外，在连接基团和靶蛋白配体上也有所不同。连接基团包括不同长度的炔链和烷基链。通过STAT3降解活性测试，发现降解剂SD-36对STAT3的降解活性最好，在MOLM-16细胞和SU-DHL-1细胞中STAT3的降解活性DC50分别为60 nM和28 nM。图12 针对 STAT3 的合理设计和代表性 PROTACs04设计突变蛋白PROTACs4.1降解野生型和突变型蛋白质的PROTAC设计2018 年，饶燏课题组首次开发了一系列新的PROTACs 用于耐依鲁替尼的 BTK 降解。依鲁替尼和泊马度胺连接的降解剂 P13I 表现出最强的降解活性，可以有效降解野生型（DC50 =9.2 nM）和依鲁替尼-Mino 细胞中的抗 C481S BTK (DC50 = 30 nM)。进一步优化 P13I，将 P13I 的 E3 连接酶配体替换为来那度胺，得到新的降解剂 L18I。它不仅可以有效降解野生型 BTK，还可以有效降解多种临床相关的 BTK 突变体（C481S/T/ A/G/W) 在浓度低于 50 nM 的 HeLa 细胞中。降解剂L18I在体外能有效抑制表达C481S-BTK的DLBCL和MCL细胞的增殖，而依鲁替尼对增殖的抑制效果较差。图13 BTK PROTACs的合理设计4.2选择性降解突变蛋白的PROTAC设计2020年，王佳亮研究团队报道了由 E3 连接酶配体沙利度胺和 BRAF 激酶抑制剂vemurafenib 产生的 BRAF 降解剂。最有效的降解剂选择性诱导 BRAFV600E 的降解，而不是野生型 BRAF，尽管它们对两种蛋白质的亲和力相似。图14 BRAFV600E选择性降解PROTAC的设计05不可逆共价和可逆共价PROTAC的设计5.1不可逆共价PROTACs的设计与POI配体共价结合图15 靶向KRASG12C的不可逆共价PROTAC与 E3 连接酶共价结合图16 不可逆共价 BTK PROTAC5.2可逆共价PROTACs的设计依鲁替尼与 BTK 具有高共价和非共价结合活性。它是非共价类似物，不能形成共价复合物，对 BTK也有很高的亲和力。基于依鲁替尼结构开发的可逆共价抑制剂也实现了良好的结合亲和力。迄今为止，已开发出多种非共价BTK降解剂，证明了PROTAC技术实现BTK高效降解的可行性。基于这些结果，London 课题组报道了非共价的139、基于丙烯酰胺的 140 和基于氰基丙烯酰胺的141 PROTAC，它们都表现出明显的 BTK降解，DC50 小于 10 nM，Dmax 大于 85%。图17 可逆共价PROTAC的设计06双机制降解器的设计一系列针对 RTK 激酶降解的 PROTAC 已被报道以分子胶做为例子。2018 年，Winter 课题组基于混杂激酶抑制剂舒尼替尼合成了一系列基于 CRBN 的 PROTAC。出乎意料的是，这两个系列均未能诱导其共有靶标的降解，而单个分子（如 MI-389）在急性白血病细胞系中显示出明显的抗增殖作用。一些数据表明 MI-389 的细胞毒性取决于 CRBN E3 连接酶复合物，并由靶蛋白降解而不是残余激酶抑制活性触发。图18同时具有PROTAC和分子胶作用机制（GSPT1）化合物的开发优化过程07改善PROTACs药代动力学特性的结构设计与 AR 一样，ER 也与疾病密切相关，尤其是乳腺癌。雌激素调节细胞生长、增殖、发育和分化等多种生理过程。ER是核受体（NR）蛋白超家族的重要成员，是一种配体激活的转录因子，包括α和β亚型。ERα 在正常乳腺上皮中的表达率较低，但在乳腺肿瘤中高表达。ERα基因敲除小鼠实验表明，ERα在乳腺发育中具有促进乳腺肿瘤形成的作用。因此，使用PROTAC开发ERα降解剂的技术已成为治疗乳腺癌的新方法。图19 Erα PROTACs的设计和优化08基于晶体结构和计算化学的PROTACs设计8.1以三元配合物的晶体结构为指导的理性PROTACs设计基于受体-配体晶体结构的药物设计一直是小分子药物发现和优化的重要理论基础。与小分子不同，PROTACs诱导靶蛋白配体和E3连接酶配体之间形成三元复合物，这种三元复合物的相互作用可以通过连接基团来调节。图20基于三元配合物晶体结构的选择性BRD4 PROTACs的合理设计8.2计算化学指导下的理性PROTACs设计虽然PROTACs是研究和医疗的优越生物技术，但PROTACs复杂的机制在开发过程中带来了更多的困难。“POI-PROTAC-E3连接酶”三元复合物模型是PROTACs开发的最重要指导方案之一。三元复合物结构为POI、PROTACs分子和E3连接酶之间提供了促进结构活性的合理作用模式关系分析，大大加快了分子优化过程，清楚地说明了降解选择性的来源。由于复合体庞大、灵活且不稳定，构建三元复合体需要严格的条件，极其耗时和困难。真正的共晶结构远远落后于要求。因此，开发用于三元复数建模的计算方法迫在眉睫。人工智能可以进一步利用现有高质量但分散的实验结果，推动理解蛋白-蛋白相互作用的内在机制，促进PROTAC的发展。图21 基于计算化学的PROTACs的开发过程09条件控制PROTAC的设计尽管已经报道了许多 PROTAC，但这些PROTACs可以快速高效地诱导蛋白质降解，在生物学研究和疾病治疗中都发挥着重要作用，其缺点主要表现在人工可控性差、时空选择性差等，导致无法人工控制释放药物和存在明显的副作用。目前策略主要分为三类。第一类是光控PROTACs，这是目前最成功的方法。第二类是利用叶笼策略来控制和实现蛋白质降解。第三类是在其他条件下人工释放PROTACs，如缺氧激活PROTACs。最近的一篇综述详细介绍了PROTACs的组成和不同的产生策略。图22不同条件控制的PROTAC分子总结和展望自2001年第一个概念验证PROTAC被报道以来，PROTACs技术进入了实际应用阶段。PROTACs分子设计的最大挑战是潜在降解剂候选物的发现过程仍然是经验性的。这个过程在很大程度上依赖于合成和药物化学方面的大量努力，这既费时又昂贵。PROTACs化合物设计的一般流程大致如下，通过筛选确定合适的目标蛋白配体；分析配体与靶蛋白的结合方式；在不影响配体与靶蛋白结合的情况下选择合适的连接基团结合位点；然后与E3连接酶配体结合形成PROTACs化合物。与传统的小分子抑制剂不同，PROTACs的优化很难让人概括系统的构效关系。对于一个新的靶点，通常研究人员只能尝试寻找活性PROTACs化合物，这增加了研究的工作量和难度。开发具有预测功能的新型计算工具将促进PROTAC发展。总之，PROTAC为跨越当前生物研究中药物发现和工具开发的障碍提供了一种新的有前途且强大的方法。另一方面，需要更多的努力来深入了解PROTACs在临床上的疗效和安全性。更多适合开发PROTAC的目标结合剂和E3连接酶仍有待探索。更重要的是，在现有的研究基础上，逐步总结规律，以利于PROTAC分子的分子设计和优化。参考文献：Han XR, Chen L, Wei Y, Yu W, Chen Y, Zhang C, Jiao B, Shi T, Sun L, Zhang C, Xu Y, Lee MR, Luo Y, Plewe MB, Wang J. Discovery of Selective Small Molecule Degraders of BRAF-V600E. J Med Chem. 2020 Apr 23;63(8):4069-4080. doi: 10.1021/acs.jmedchem.9b02083. Epub 2020 Apr 10. PMID: 32223235.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

扫描文末二维码，申请药渡数据3天免费试用来源：药渡撰文：军师祭酒    编辑：丸子当前，靶向蛋白质降解 (TPD) 策略已彻底改变了传统的对于某些靶标不可成药的观点。由于抑制选择性和化合物对特定组织及细胞类型的靶向等因素，许多被寄予希望的小分子抑制剂在对蛋白质功能的干预和抑制方面都显得一筹莫展。PROTAC（蛋白水解靶向嵌合体）和分子胶技术的优势在于可实现对靶点抑制的高度选择性。多项研究表明，PROTACs 可以通过优化连接链的类型和长度来形成稳定的三元复合物。由于 PROTAC 的双功能特性，可以利用 E3 连接酶的组织选择性来揭示新的靶向机制。本文对选择性的 PROTAC和新型PROTAC 技术的最新进展进行了总结与分析，并展望了基于选择性PROTAC的未来发展趋势。1简介靶向蛋白质降解 (TPD) 是一种利用细胞内的泛素-蛋白酶体系统以定向方式降解特定靶蛋白的技术。TPD 主要包括蛋白降解靶向嵌合体 (PROTAC)和分子胶两种类型。本文中我们将主要关注 PROTAC，但许多相同的原理同样适用于分子胶。PROTAC 是由两个小分子配体组成的异双功能分子，一端与靶蛋白结合，另一端与 E3 连接酶结合，通过连接链连接而成。PROTACs 可以诱导目标蛋白 (POI) 和 E3 连接酶相互接近，进而促进蛋白酶体对目标蛋白的泛素化和随后的降解（图 1A）。完成底物泛素化后，PROTAC 分子可被回收用于进一步的泛素化迭代循环和残留靶蛋白的降解。与传统的小分子抑制剂的策略相比，PROTAC 具有显著的优势，例如可以靶向不可成药的蛋白、与靶标的结合不需要很高的结合能力、对靶标更好的选择性等。与需要高全身暴露以维持药理作用的传统小分子抑制剂相比，PROTAC 的催化性质可能会在低全身暴露的情况下赋予靶蛋白抑制活性，从而具有较低的毒性。 图一 代表性 PROTAC 策略和已报道的 PROTAC 数据分析根据PROTAC 的在线数据库(PROTAC-DB)显示，目前已经开发了2258 个 PROTAC，以针对 124 个不同的 POI。这些分子由 275 个 POI 结合配体与 68 个 E3 连接酶配体连接而成（图 1B）。在 124 个 POI 中，研究最多的靶标是：雌激素受体 (ER)、雄激素受体 (AR)、BTK、ALK、BCR-ABL 和 BRD4，基于这一系列靶标开发的 PROTAC占总数的近 30%（图 1B ）。其中有两个靶标（ER 和 AR）的PROTAC已经进入了2 期临床试验，分别是ARV-110 和ARV-471 。从 E3 连接酶的角度来看，在 600 多种可能用于 TPD 的 E3 连接酶中（图 1C）。目前绝大多数 PROTAC 仅使用两种E3连接酶：CRBN（1363 个 PROTAC）和 VHL（733 个 PROTAC）。此外，已经开发了基于连接酶 IAP 和 MDM2 的E3连接酶配体的 PROTAC，但是这些数量并不多（124 个基于 IAP 和 20 个基于 MDM2 的 PROTAC，如图1C所示）。目前科学家们也在致力于发现新的E3连接酶。在过去的二十年里，研究人员一直在致力于开发不同种类 POI 的 PROTAC分子。然而，对于如何通过合理的 PROTAC 设计实现目标和组织选择性的降解仍然是重大挑战。这一挑战的解决对于充分发挥 PROTAC 和 TPD 作为治疗方式的潜力至关重要。2靶标选择性小分子抑制剂的靶向性是候选药物的关键特性。具有选择性的小分子抑制剂可减少脱靶效应，从而避免临床试验中潜在的不良副作用。同样，选择性对于 PROTAC 的发现也起着重要作用。但与传统的小分子相比，其存在新的挑战和机遇。PROTACs 不仅仅是一个单一的结合事件，它通常会在 E3连接酶和目标 POI 之间诱导新的蛋白-蛋白相互作用，这种相互作用可能会因为E3连接酶配体的不同和连接链长度不同而有很大差异。虽然这些分子特征可能会影响 PROTAC 结合效果，但对于靶蛋白的多聚泛素化也起着重要作用。与其母体化合物相比，PROTAC 的选择性变化是一种普遍存在的现象（表一）。 表一  选择性PROTAC列表1从多靶点抑制剂中获得的降解选择性Crews 实验室进行了一系列的开创性工作，探讨了配体结合选择性与降解选择性的相关问题。研究发现，目标 POI 的选择性降解不一定与目标配体结合选择性或亲和力相关。例如，多靶点的激酶抑制剂 foretinib，该抑制剂在 10 μM 时可结合超过 130 种激酶。可一旦转化为双功能分子，这些基于foretinib的 PROTAC 便仅显示与 54 种靶激酶结合。靶头抑制剂和招募的 E3 连接酶之间的最佳配对对目标POI 降解至关重要。他们将三种 BCR-ABL 酪氨酸激酶抑制剂（伊马替尼、波舒替尼和达沙替尼）与已知的 VHL 和 CRBN 结合配体结合，设计并合成了几种 BCR-ABL PROTAC，通过配对不同的靶头和 E3 连接酶来比较靶降解曲线。结果表明，招募达沙替尼 CRBN 的 PROTAC (DAS-6-2-2-6-CRBN) 可以降解 cABL 和 BCR-ABL，而任何 VHL-ABL 均未见 BCR-ABL 降解。然而，当用配体 bosutinib 取代达沙替尼时，招募 VHL 的 PROTAC 不能降解任何蛋白质靶标。因此，通常需要评估多个目标 POI 配体、E3 连接酶配体和接头，以实现靶蛋白的降解选择性。2E3连接酶和靶蛋白配体系统配对的选择性如上所述，只有少数E3连接酶可被用于PROTAC开发。研究表明，E3 连接酶与靶蛋白的配对是产生有效和选择性PROTAC的最关键因素之一。降解的成功与否取决于不同的E3连接酶与目标蛋白形成三元复合物能力的强弱（图2A）。 图 2 在 PROTAC 设计中评估多种 E3 连接酶的重要性研究表明，使用的特定 E3 连接酶如何对 PROTAC 活性和选择性具有重大影响。首先，一些激酶，例如 MAP3K11 和 SRC，显示出相似的连接酶偏好。CRBN 和 VHL配体与三种不同的激酶靶向支架配对的比较表明：VHL 配体可以靶向 CRBN 的 PROTAC 未靶向的另外16 种激酶，这表明增加E3连接酶配体的多样性可以增加靶标的数量。其次，使用 CDK4/6 抑制剂 palbociclib 对四种不同 E3 连接酶的系统探索表明，降解的选择性主要是通过基于 VHL 而不是 CRBN、MDM2 、IAP 的 PROTAC实现的（图 2B）。此外，研究人员探索了PROTAC 对 HDAC 家族蛋白的降解选择性。作者设计合成了基于泛 HDAC 抑制剂（dacinostat）合成了与三种不同 E3 连接酶配体（CRBN、VHL 和 IAP）配对的降解剂，并评估了几种 HDAC 蛋白家族成员的降解。他们发现降解选择性通常与使用的特定 E3 连接酶有关。例如，基于 CRBN 的 dacinostat PROTAC 优先降解 HDAC6 和 HDAC8，而 IAP 招募化合物显示出对 HDAC6 的选择性降解。因此，PROTAC 设计中使用不同的E3 连接酶配体可以促进降解选择性，特别是在没有选择性结合配体的大型蛋白质家族的情况下。3PROTAC诱导的三元配合物的协同作用泛素化的重要因素是诱导三元复合物的形成，而实现有效和选择性降解的关键环节是形成稳定的、协同的靶蛋白-PROTAC-E3 连接酶三元复合物（图3A）。 图 3 通过形成稳定且高度协同的三元配合物选择性PROTAC诱导的靶标降解的示意图从三元复合物（BRD4-MZ1-VHL，PDB 5T35 ） 的晶体结构发现PROTAC 诱导的靶蛋白和 E3 连接酶之间的静电表面相互作用对稳定三元复合物具有重要作用。协同性 ( α ) 已定义为 PROTAC 结合的二元和三元复合物解离常数之比 ( α = K d (二元)/ K d (三元))。它可以是正数 ( α > 1)，负数 ( α< 1) 或中性 ( α = 1)，具体取决于目标 POI 和 E3 连接酶之间相互作用的有利程度。一般来说，目标 POI 和 E3 连接酶之间有利的蛋白质-蛋白质相互作用导致正协同性 ( α > 1)，而负协同性 ( α< 1) 则不利于三元复合物的形成。值得注意的是，协同性对“钩子效应”有显着影响，高浓度的PROTAC与有效的三元配合物竞争，从而以浓度依赖性方式降低降解效力（图 3B）。虽然越来越多的研究表明协同性是驱动选择性靶标降解的关键因素，但也有一些例外的情况显示实现有效的蛋白质降解并不需要从根本上的正向协同性。例如，几个基于 CRBN 的 BTK PROTAC 具有相对较长的连接链，即使具有中性协同性 ( α = ∼1) ，也显示出有效的 BTK 降解活性 (DC 50 = 1–40 nM )。此外，基于 CRBN 的 BRD4 PROTAC (dBET23) 具有负协同性 ( α = 0.4)，却表现出 BRD4 的有效降解活性 (DC 50 = ∼50 nM)。因此，尽管积极的协同性通常与目标降解相关，这并不是绝对必要的。此外，重要的是要注意协同性和三元复合物的形成也可能受到细胞中靶标、E3 连接酶和 PROTAC 的绝对浓度的影响。另一个考虑因素是高度稳定的三元复合物可能产生一定的副作用，因为它可能会阻止有效的催化循环。因此，简单地基于协同性优化 PROTAC 可能并不总是理想的。4蛋白质周转和合成的注意事项蛋白质降解是细胞途径的核心调控过程。根据编码序列的特定特性，蛋白质半衰期的可能从几分钟到几天不等。这些差异是由于泛素-蛋白酶体系统成员和自噬的特定相互作用而产生的，而自噬是蛋白质消除的主要途径。确定目标 POI 对 TPD 是否适用的最关键因素是了解其在相关细胞类型和疾病状态的内在降解和合成。如前文所述，蛋白质周转率 (PTR) 是预测有效 PROTAC的给药方案的参数。在 PROTAC 降解目标 POI 并从动物体内清除后如果目标 POI 的合成速度很快，功能可能会很快恢复。理论上由PROTAC 降解的蛋白质的合成率可能与基础稳态条件下的蛋白合成率不匹配，因为细胞内存在代偿机制。值得注意的是，如果降解的蛋白质在合成速率上有差异，人们可以利用这些合成差异来设计PROTAC 分子。并且蛋白质半衰期并不总是与特定目标 POI 的可降解性相关。因此，长时间暴露的 PROTAC 的选择性可能低于暴露时间短的 PROTAC。此外， PK-PD建模降解和细胞反应可能在实现必要的功效和保持足够的靶标选择性以避免毒性方面发挥关键作用。5可逆和不可逆共价PROTAC另一种实现目标选择性的方法是利用共价 PROTAC（图 4）。这在目标 POI 找不到高亲和力小分子抑制剂的情况下特别适用。例如对于许多传统上不可成药的蛋白质，如转录因子和 GTP 酶。使用不可逆地与目标 POI 结合的共价 PROTAC 已显示出较好的潜力。该方法显着缺点是不可逆的共价结合意味着 PROTAC 不能像非共价 PROTAC 那样有效地回收，从而降低效力。然而，共价 E3 连接酶配体没有类似的问题，并且这种含有共价 E3 连接酶配体的催化性质是由 E3 连接酶的蛋白质半衰期驱动的。最近，包括半胱氨酸反应基团在内的多种共价配体筛选策略已经确定了有效的和具有选择性的降解分子。值得注意的是，可逆共价 PROTAC 得益于选择性共价键，同时在目标 POI 降解后仍然能够解离。 图 4 以可逆和不可逆共价方式接合目标 POI 或 E3 连接酶的 PROTAC 的优缺点6旁观者效应PROTAC 目标选择性的另一个考虑因素是 PROTAC 有可能促进与目标 POI 相关的临近蛋白质的泛素化。对于多组分蛋白质复合物中存在的目标 POI 尤其如此。据报道，靶向 EED 的 PROTACs 是表观遗传调控多梳抑制复合物 2 (PRC2) 的核心亚基，不仅会降解 EED，还会降解 PRC2 复合物的 EZH2 和 SUZ12 成分。因此，需要考虑旁观者降解是否是 PROTAC 参与一个复杂蛋白的直接结果，从而导致泛素分子转移到目标 POI 和其他相关蛋白。这可能特别具有挑战性，因为通常一个复杂蛋白的降解会导致化学计量失衡，使得复合物中的其他蛋白质被细胞的蛋白质质量控制机制降解。在任何情况下，当 PROTAC 目标 POI 是多亚基复合物的一个组成部分时，应考虑旁观者泛素化，并且根据上下游信号通路的变化判断该降解是积极还是消极的结果。3细胞和组织选择性PROTAC 富有吸引力的另一特点是能够利用E3 连接酶的组织特异性来驱动特定细胞类型、组织类型和疾病状态的目标蛋白选择性降解。这种方法有可能提高PROTAC的治疗指数。1鉴定组织和细胞类型特异性E3连接酶据报道，大约 12 种 E3 连接酶（ CRBN、VHL、IAP、MDM2、AhR、DCAF15、DCAF16、DCAF11、RNF114、KEAP1、FEM1B 和 RNF4）可促进 PROTAC 对目标 POI 的降解。优先开发仅限于某些组织的连接酶的配体可能会为治疗疾病提供重要机会。一种用途可能是降解 BRD4 的溴结构域 PROTAC，由于BRD4 的消耗具有肠道毒性，因此，将 PROTAC 活性限制在癌症或免疫细胞上可能会提高治疗窗口。组织或细胞类型的特异性也开启了针对广泛表达的目标蛋白开发 PROTAC 的可能性。此前的报道表明，E3连接酶在蛋白质水平和转录水平上表现出组织和癌细胞的特异性表达，但是没有一种被用于靶向蛋白质降解。当前 GTEx 蛋白质组学数据的分析（图 5）揭示了几种在各种组织中选择性表达的连接酶，其中最引人注目的数据来自大脑和肌肉/心脏组织。FBXO41、FBXL16、RNF167、TRIM9、TRAF3 和 TRIM2 都仅限于特定的脑组织，使其成为治疗神经系统疾病的目标。文献数据表明，这些连接酶的许多肌肉特异性靶标及其对细胞稳态的重要性。利用这些连接酶的 PROTAC 可能为治疗肌肉萎缩或心脏损伤提供了一条更具治疗前景的途径。 图 5 E3 连接酶的蛋白表达谱癌细胞中过度表达的连接酶不是专注于组织或细胞类型，而是为选择性降解提供了另一种途径。TCGA 和 DEPMAP 数据可以结合起来，深入了解哪些连接酶在某些环境中过度表达，以及哪些连接酶对癌细胞增殖至关重要。组织选择性 PROTAC 开发最成功的例子之一是 BCL-xL PROTAC。BCL-xL 是一种经过充分验证的癌症靶点，但传统的 BCL-xL 抑制剂（如 ABT263）显示出靶向性、剂量限制性血小板毒性。为了减少这种情况的发生，人们开发了一种 BCL-xL PROTAC (DT2216)，它通过招募 VHL E3 连接酶来靶向 BCL-xL 进行降解。研究发现 DT2216 对各种 BCL-xL 依赖性白血病细胞系更有效。最重要的是，它对血小板的毒性比 ABT263 低得多，因为 VHL 在血小板中的表达最低。这些发现证明了使用 PROTAC 有降低靶向药物毒性的潜力。2MAGE家族组织和疾病特异性E3连接酶黑色素瘤抗原 (MAGE) 家族是肝细胞癌三大相关抗原之一，在所有真核生物中进化相对保守。首次发现的人类肿瘤抗原 MAGE-1 被鉴定为患者细胞毒性 T 细胞 (CTL) 识别的抗原，随后的研究表明它属于更大的 MAGE 基因家族。人类的 MAGE 家族由大约 40 个基因组成，根据它们的染色体基因位置、序列同源性和组织特异性表达模式分为两大类。I 型 MAGE，也称为睾丸癌抗原 (CTAs)，由位于 X 染色体上的 MAGE-A、-B 和 -C 亚家族组成，其在多种肿瘤中过表达，主要分布在睾丸癌中（图 5 和 6A）。相反，II 型 MAGE，包括 MAGE-D、-E、-F、-G、-H、-L 和 NECDIN 基因，在许多组织中广泛表达，其中一些在特定脑区富集。在过去的几十年中，MAGE CTA 在预后不良的侵袭性肿瘤中的频繁表达以及它们促进癌症进展和转移的能力已得到很好的证明。我们现在知道 MAGE 蛋白充当特定 E3 泛素连接酶的底物受体，以在癌症中异常表达时改变细胞蛋白质组（图 6B）。最广为人知的 MAGE 底物受体关系之一是通过 MAGE-A11 的保守 MAGE 同源结构域 (MHD) 的底物结合裂隙 (SBC) 识别 PCF11。研究人员通过高通量筛选确定了 MAGE-A11 的小分子抑制剂，可阻止其与 PCF11 结合并以 MAGE-A11 依赖性方式导致细胞毒性。类似的分子可能有助于开发靶向 MAGE 的配体，用于 PROTAC 策略，以实现目标 POI 的癌症特异性降解。 图 6 MAGEs在肿瘤中的表达和功能3光诱导和光控靶蛋白降解为了提高PROTACs的治疗指数，研究人员开发了时空可控的PROTACs。通过将光不稳定基团 4,5-二甲氧基-2-硝基苄基 (DMNB) 1嵌入到 dBET1 或 MZ1 降解剂中，并在 365 nm 的紫外线照射下被有效裂解（图 7A）。DMNB-caged dBET1，称为 photocaged-PROTAC1 (pc-PROTAC1)，显示 BRD4 在活细胞中的强光依赖性降解并在斑马鱼模型也表现出较好的降解活性。另一个光不稳定的笼子组，二乙氨基香豆素 (DEACM)，被安装在基于 VHL 的 ERR α PROTACs 中，在紫外线照射下，DEACM 笼子的 PROTACs 对ERR α的降解可与传统 PROTAC 相媲美。在类似的策略中，已经报道了基于 CRBN 的光可控 PROTAC，其中硝基戊酰氧羰基 (NVOC) 基团已与 pomalidomide（称为 opto-pomalidomide）缀合，并开发成光诱导型 opto-dBET1，降解 BRD3 和 BRD4 . 图 7 用于时空蛋白质降解的光控 PROTAC4抗体-PROTAC偶联物和基于抗体的PROTACPROTAC 递送的新兴策略和抗体-药物偶联物 (ADC) 类似，抗体-PROTAC 偶联物 (APC) 有可能将多种 PROTAC 选择性靶向特定细胞类型，从而增加组织特异性靶标降解的特异性（图 8A）。 图 8 选择性 TPD 的新兴策略除此之外，还可以使用靶向膜蛋白的双特异性 IgG 诱导降解，从而实现多样化靶向蛋白降解。最近报道了基于抗体的 PROTAC（AbTAC，图 8B），通过诱导膜结合的 E3 连接酶与感兴趣的蛋白质接近可导致细胞表面靶标的泛素化和降解。RNF43 是一种广泛表达的单程膜结合 E3 连接酶，由结构化的胞外域和细胞内 RING 域组成。在先前的研究中，RNF43 被证明通过 Wnt 辅助受体 Frizzled 的泛素化负调节 Wnt 信号通路，导致其内吞作用和降解。在第一份 AbTAC 报告中，作者通过募集 RNF43 来靶向降解程序性死亡配体 1 (PD-L1)。这种方法为使用 AbTAC 方法靶向其他跨膜蛋白的降解开辟了新途径。4未来研究方向一个领域的发展得益于新技术，这些新技术大大改善了PROTAC的选择性与降解活性。然而，这些技术也同样面临许多问题：不同细胞类型中的活性 E3 连接酶是什么？如何利用它们选择性降解新的底物？如何扩展 PROTAC 化合价以实现更高的特异性？如何在不进行大量化学合成活动的情况下用计算机模拟实现选择性？1量化各种组织和细胞类型中的E3连接酶活性组织、细胞和疾病特异性连接酶的评估很大程度上依赖于基因组学和蛋白质组学的方法。尽管这些方法具有巨大的价值，但它们并不能揭示整个过程，因为连接酶转录物或蛋白质的丰度并不总是与活性相关。提高我们对 E3 连接酶活性的了解将是实现细胞和组织特异性连接酶的关键一步。用于测量 E3 连接酶活性的探针 (ABP)，可以量化内源靶标E3 连接酶的活性。2018 年，有研究描述了一种评估 HECT 型 E3 连接酶活性的技术，方法是设计一种 E2泛素缀合物，该缀合物在异肽键内包含一个半胱氨酸反应弹头，弹头将与 HECT 连接酶的活性位点残基反应并可以通过亲和力下拉连接酶（图9A）。将这种方法应用于多种组织和细胞类型可能会揭示这些环境中最活跃的连接酶，并指导我们理解如何设计选择性的 PROTAC。 图 9 分析 E3 连接酶活性另一种测量 E3 连接酶活性的方法是使用光激活 ABP，用于具有不同 E3 激活机制的 RING E3 连接酶。工程化的 E2∼Ub 缀合物被设计成具有非不稳定的赖氨酸异肽键，取代了硫酯泛素键，并在泛素本身上引入了光交联基团（图 9B）。这使作者能够捕获 RING 连接酶的活性复合物，如 RNF4，并且他们推测将这些技术与质谱法相结合可以用来分析某些细胞类型中治疗性连接酶。由于连接酶具有多亚基复杂结构，因此评估 cullin-RING 连接酶的活性也带来了挑战。了解哪些 cullin 连接酶具有活性的一种方法是研究组装到这些复合物中的接头的化学计量。Deshaies 实验室在两项具有里程碑意义的研究中率先采用该技术来了解 CRL1 和 CRL4 复合物的活性。为了测量不同 CRL 复合物的丰度，他们开发了一种称为蛋白质相互作用动力学和化学计量估计 (PIKES) 分析的定量蛋白质组学技术（图 9C ））。这种方法需要在“分子海绵”存在的情况下对 cullins 进行内源性标记和免疫沉淀，以防止在此过程中发生适配器交换。他们发现 CRL4 连接酶复合物的底物受体占有率变化高达 200 倍。重要的是，同源 PROTAC 底物受体的更高组装可以显着提高降解效力。将此应用于其他 cullins 和细胞类型可能会揭示复杂组装中的重要差异，这些差异不能仅由 mRNA 或蛋白质水平决定。该方法极大帮助我们对组织和细胞特异性连接酶的理解，并推动连接酶在 PROTAC 开发中的设计。2从蛋白水解产物中获得选择性选择性不仅可以从靶标和连接酶本身表现出来，还可以通过靶蛋白降解后发生的下游事件表现出来。T 细胞双特异性抗体 (TCB) 是一种利用与 T 细胞结合剂融合的 TCR 模拟抗体来诱导 T 细胞介导的杀伤肿瘤细胞的方式，其细胞表面具有特定的肽抗原。已证明源自靶向 WT1 的 PROTAC 的 MHC-1 肽可增强抗体驱动的 T 细胞活化和效应器功能的活性。因此，PROTAC 与双特异性抗体的结合特定抗原仅在癌细胞中表达，因而使得 PROTAC 的降解具有细胞靶向性。图 10 由 PROTAC 介导的蛋白水解产生的新型 TCR 抗原介导的 T 细胞选择性杀伤肿瘤细胞3三价PROTAC最近的一项研究探索并开发了具有两种 BET 溴结构域抑制剂和一种 E3 连接酶配体的三价 PROTAC 的效力、动力学和特异性。报道的三价 PROTAC (SIM1) 在分子内与 BRD4 的 BD1 和 BD2 溴结构域结合，并与 VHL 形成 1:1:1 三元复合物，增加靶标结合的亲和力并增强与靶标的相互作用（图 11）。与亲本二价 PROTAC 相比，三价PROTAC对目标具有更有效且快速的降解。从机制上讲，SIM1 通过诱导 BD1 和 BD2 的构象变化来结合 BRD4，并形成结构、热力学和动力学有利的三元复合物，从而降低“Hook”效应。尽管三价 PROTACs 具有明显的降解效果，但仍面临挑战。其理化性质可能不利于细胞渗透性和生物利用度。此外，三价是否可以应用于蛋白的降解仍有待验证。  图 11 与三价 PROTAC 形成三价三元复合物的代表性模型4分子建模以缩小对选择性理解的差距分子建模将降低选择性测定的障碍，并成为化学和 E3 连接酶生物学之间的重要桥梁。三元结构建模的最新进展推进了计算机 PROTAC 设计的快速发展。传统的 PROTAC 建模方法最初集中在将 PROTAC 对接到一种蛋白质的口袋中，选择特定的构象或对接姿势，然后将另一种蛋白质叠加到复合物上。后来基于 Rosetta 的建模已应用于 PROTAC 设计，并且诸如 PROsettaC 之类的工具已经可用。所有这些方法都使用已知的晶体结构和对接配体，通常侧重于接头优化以实现最低能量构象。这些模型可用于研究 PROTAC 对密切相关蛋白质的选择性并解释活性的差异。许多组织选择性连接酶的结构是未知的，这妨碍了我们对其生物学的理解以及在 TPD 方法中的应用。Alphafold技术可以在没有结构信息的情况下研究具有连接酶和靶蛋白的三元复合物。在使用 PROTAC 和连接酶/靶蛋白对三元复合物建模后，Alphafold 预测可以深入了解表面暴露的赖氨酸的保守性以及密切相关的连接酶或靶标之间的蛋白-蛋白相互作用。Alphafold有助于进行广泛的筛选以寻找新化学实体，并提供有关目标和连接酶的易处理性和配体性的信息。5结论可成药的靶标相当有限，因为大约 85% 的蛋白质没有适合小分子结合的功能性结合位点。目前为止，药物发现还严重依赖于传统的小分子抑制，因此大多数蛋白质都是难以成药的。TPD可以通过降解致病靶蛋白而发挥治疗作用，它的出现彻底改变了药物开发的格局。PROTAC 介导的降解已扩展到多种靶蛋白，目前的研究方向是如何产生特异性小分子以实现靶点和组织选择性。在特定的组织和细胞类型中靶向 POI 降解可以提高治疗系数。TPD 未来的另一个重要挑战是使用的 E3 连接酶的范围。人体中可能有超过 600 种 E3 连接酶，但目前只有非常有限的 E3 连接酶可用于PROTAC设计。因此，扩展 E3 连接酶以进行合理的 PROTAC 设计将很重要，这不仅可以增加可靶向蛋白的数量，还可以提高靶向的选择性。通过利用组织选择性连接酶和其他靶向方法，包括光诱导的时空可控 PROTACs 和组织可递送抗体介导的 PROTACs，PROTACs 的治疗指数将继续提高。然而，挑战与机遇并存。开发识别目标 POI 和 E3 连接酶的非功能性配体是未来研究趋势。靶蛋白配体是 PROTAC 开发的重要组成部分。E3 连接酶本身是难以获得结合剂的蛋白，许多与疾病相关的 POI 可能无法与之连接。因此，随着对PROTAC的理解不断深入，挑战可能会转向识别非功能性配体。未来研究方向主要聚焦于靶蛋白配体的发现，高通量筛选、DNA 编码文库筛选和全面的化学蛋白质组学等技术将进一步推动PROTAC领域不断前进。参考文献Doi：org/10.1039/D2CS00200K扫描二维码，申请药渡数据免费试用  点击"阅读原文",随时掌握行业动态