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侃言 所谓“无氮不成药”，虽然不是那么绝对，但含氮杂环或基团在药物成分中出现的频率一向居高。 本周五，美国亚利桑那大学（就是那个经常统计每年最畅销药物的团队）统计了自2013至2023年间FDA批准的231款独特的小分子化合物，对它们的结构和性质进行分析，以及重要杂原子如硫、氟、和关键小氮取代基（CN、NO2）的频率信息，刊载在J Med Chem上。 https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1021/acs.jmedchem.4c01122 相比于上一次1938-2012年的统计（下图一），本次统计（下图二）发生了很大的重新洗牌！接下来一起看看详细内容。 图一：1938-2012年FDA批准药物高频含氮骨架 图二：2013-2023年FDA批准药物高频含氮骨架 01   分析总览   本次分析了2013年1月至2023年12月共11年间批准的药物，其中包含321种独特的小分子药物，包括36种（约11%）是联合用药的新型结构。 与2014年的统计分析相比，含氮杂环的药物产生了惊人的增长，先前的研究显示59%的药物含有至少一个氮杂环，而本次统计分析显示82%的新批准的小分子药物含有氮杂环。 此外，每个药物的氮杂环数量也显著增加，33%的药物含有2个氮杂环，23%的药物含有3个氮杂环，8%的药物含有4个氮杂环；而还有2款批准药物结构中还有6个氮杂环！ 不同类型的氮杂环出来频率表出显著的增长，其中大多数在早期的研究中（2014年）并不存在。六元非芳香族氮杂环最为常见，其次是融合型和六元芳香性氮杂环，如下图。 毫不奇怪，这些氮杂环中的大多数是由六元或五元芳香族环或非芳香族环组成的，在此之外，含氮大环则是最大的一类。 而且，经典的天然产物衍生的氮杂环化合物，如阿西芬、戊南、吗啡、萜类生物碱和麦角碱，在这个数据集中几乎没有出现。 除了碳、氢、氧、氮以外的元素，还分析了更多的元素出现频率，如上图，其中氟、硫、氯是这些原子取代中最重要的代表。统计中显示，34%的药物中至少含有一个氟取代基，23%药物中含有硫取代基，17%的药物中含有至少一个氯取代原子。 在这些批准药物中，最大的一组被批准用于癌症治疗，包含89种（28%），其中55种是激酶抑制剂。 抗感染药物是第二常见的疾病类别，有56种（17%）新药，其中10种被批准用于丙型肝炎。这些新的丙型肝炎药物因其复杂性、立体化学丰富性、对称性的使用、取代基的多样性以及不常见的喹诺啉氮杂环和阿吡咯烷以及在许多情况下含氮大环的使用而更加引人注目。 这些药物中还包括5种偏头痛、6种新型糖尿病小分子药物，以及帕金森病、多发性硬化症、阿尔兹海默病等的新型药物。而针对眼部、皮肤、肠道相关疾病的多种新型小分子治疗方式也在过去的十年间出现。 如上图，按照在FDA批准药物小分子中出现的频率，排名前35的氮杂环。 每个方框中以彩色标记氮杂环，#号为其出现频率排名，灰色条形图按比例绘制，代表该氮杂环骨架出现在多少药物分子中。 此次35种氮杂环排名与先前2014年统计的25种氮杂环排名，出现了许多新型的结构，Top排名也发生了大洗牌！ 在前5最常见的氮杂环中，吡啶取代了哌啶，跃居首位，哌啶退居第2，吡咯烷由第5升至第3，哌嗪从第3降至第4，嘧啶从原先的第10上升至第5。 02   含氮优势骨架   # 1  吡啶 吡啶是最常见的氮杂环，取代了之前分析中排名第一的哌啶。共54种含吡啶的药物，如下图。 #2  哌啶 在过去的11年里，总共有40种含哌啶的药物被批准。 哌啶类药物包括一种内酰胺(ubrogeogen)和两种戊二胺(gepirone和泊马度胺)。大多数哌啶类药物在1-(81%)或4位(72%)或两者都含有取代基(40%)。一半的哌啶是双取代的，其次是三取代(23%)和单取代(14%)。 这些哌啶类药物中有13种(33%)是非手性的，并且总共有16种(40%)哌啶类核心含有至少一个手性碳原子。大多数哌啶类药物被批准用于治疗癌症。 # 3   吡咯烷 在这个数据集中总共出现了40种含吡咯烷的药物。 # 4   哌嗪 哌嗪类药物是该数据集中第四个最常见的氮杂环，以36种独特的新小分子药物为代表。 # 5  嘧啶 嘧啶类药物排名第五，共有25个新小分子药物成员。 # 6  吡唑 吡唑类是氮杂环化合物中排名爬升最高的！ 在最初的美国FDA药物分析中没有出现在前25名中，而在过去的11年里，共有20种独特的小分子药物出现！ # 7  吲哚 共有21种小分子吲哚药物和诊断方法获得批准。 # 8  咪唑 共有18种咪唑药物。 # 9  吗啉   共有13种吗啉药物。 # 10  苯并咪唑   共有10种苯并咪唑药物。 # 11  1,2,3/4-三氮唑   共有9种1,2,3/4-三氮唑药物。 # 12  噻唑  共有8种噻唑药物。 # 13  尿嘧啶   共有7种尿嘧啶药物。 # 14  吡啶酮   共有6种吡啶酮药物。 # 15  四氢异喹啉  共有6种四氢异喹啉药物。 # 16   喹啉     共有6种喹啉药物。 # 17   喹唑啉   共有5种喹唑啉药物。 # 18 吡咯并嘧啶，#19 吡唑并嘧啶， #20吡咯并嘧啶  # 21 嘌呤， # 22  吲唑， # 23 吡咯酮  # 24 1,3-噁嗪烷， #25  苯并吡嗪， # 26 氮杂环丁烷   # 27 喹啉酮，#28 异喹啉酮，  # 29 四氮唑， #30 异恶唑  # 31 氮杂双环酮，#32 吡唑并吡啶 # 33 氮杂环庚烷，#34 吡咯并三唑 # 35 噻二唑   大环多胺 03   频繁出现的官能团和原子   重要的小氮取代基：腈和硝基 在过去的11年里，有22种新的含腈药物被批准，其中一半被批准用于治疗癌症，5种被批准用于治疗病毒和真菌感染。 结构上最有趣和最活跃或最不稳定的腈基团可能是那些在共轭腈和核苷腈中发现的。 该数据集中出现了8种新的含硝基药物，其中一半是咪唑环的取代基和硝基咪唑抗生素的成员。其中两种硝基药物(苯并硝唑和硝呋替莫)已被批准用于治疗Chagas病。 含氟药物小分子 氟在新批准的杂原子取代小分子药物中占主导地位，有107个（34%）。 其中，最频繁的是单氟取代芳基/杂芳基取代基，其次是三氟甲基取代芳基/杂芳基、三氟甲基非芳香族取代、二氟甲基等。 其它卤素：Cl、Br、I 含硫小分子药物   含磷、氘代、硅、硼药物   04   理化性质分析   如上图，对比两个时期FDA批准药物，可以看出在理化性质上有一个清晰的趋势，更多超越经验规则的药物批准上市。 以Ro5规则为标准，2013年以前有10%的药物不符合Ro5经验规则；而这个比例在最近的11年间上升到了29%！ 以AbbVie的Tier规则利用计算机对理化性质进行更细致的分析，其中Tier 1是最有利的，Tier 7是最不利的，中间分7个层级。 可以从上图底部的对比中看出，2013年以前的药物具有更有利的特征分布，其中超过50%的药物处于前三个层级；而2013年后的11年间，前三个层级仅超过25%，将近有一半的药物处于最不利的第7层级。 这些变化，表明近些年药物开发组合的重大转变！ 在20世纪90年代以前，以神经递质胺类相关的GPCR靶点药物开发为主导；而当前以激酶抑制剂等靶点的药物开发占主导。 在过去的20多年间，共有80多种激酶药物获批，其中58种是过去10年间获批的。 而激酶类药物通常处于Ro5理化性质空间的尖端，66%的药物至少有一个违背Ro5，21%的药物有一个以上违背Ro5。 相比之下，以神经递质胺类物质相关的GPCR药物通常满足Ro5，甚至在很多情况下通过Ro4、Ro3。 如下是对平均分子量、平均AlogP对比的近些年的分析可视化散点图分布。 很明显，与前几十年相比，过去十年中药物的分子量发生了重大变化；然而，药物的亲脂性几乎没有显著的变化。如下图，从两组药物性质的分布可以看出这一点，在分子量中差异有统计学意义(α值=0.05)，而在Alogp中差异无统计学意义。 药物转向更具挑战性、不易分解的化学物质的另一个迹象是整体化合物质量的下降。化合物质量可通过QED、PFI、AB-MPS等药物相似性指标进行量化。在所有情况下，这些的平均值都朝着表明质量较差的方向移动,如下图和表。 这一趋势在APT分布中也很明显，2013年之前的药物具有更有利的物理化学层的化合物。从下图平均QED与平均AB-MPS的对比图更进一步说明药物质量的变化。 随着时间的推移，药物性质的另一个显著变化是总体拓扑极性表面积(TPSA)的显著上升，这表明药物随着尺寸的增加而变得更加极性。 这种TPSA的增加并不完全是分子量增加的结果，因为与2013年之前相比，过去十年中每重原子的TPSA也有显著差异，如下图。 这一增长很可能是由于药物中氮和氧原子百分比的上升，与前几十年相比，过去十年中氮和氧原子的比例明显增加了约17%。 如下图的饼图，是最近11年药物Ro5比例分布的逐年变化趋势。 从其它分析化合物的参数对比来看，逐年变化如下图。   总结     这项分析对过去11年FDA批准小分子药物进行了具体的刨析和总结，一方面对含氮杂环和基团进行了分类、统计、和分析，另一方面，也对氮以外的氟、硫、氯、溴、碘、磷、氘、硼、硅等元素进行了总结。如上图。 关于氮杂环的代表性，变化最为显著，新批准的含氮杂环的药物从早期数据集的59%增加到82%，并且主要转向含多个氮杂环的药物。 许多排名靠前的氮杂环是相同的，但随着许多新成员的加入，排名也发生了变化。该数据集中药物结构的多样性，它们的复杂性，以及新原子和官能团的包含确实令人印象深刻和鼓舞人心。 与之前的几十年相比，化学复杂性的增加导致了过去11年中药物的分子量大小的增加，以及批准的超过Ro5的药物数量的增加。显然，为了患者的利益而追求高价值的药物靶点人类动用了一切可以动用的手段，并打破常规，尝试一切可能！ 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

侃言 PROTACs通过降解靶蛋白的策略治疗疾病，对于缺乏有效活性口袋的靶标相关疾病的治疗开拓了新的治疗思路。PROTAC降解靶蛋白不仅受POI配体、E3配体的影响，同时还受合适的连接子的影响。 近期EJMC上一篇综述汇总了含氮杂环连接子在PROTACs分子中的合理性设计和应用，分以下几点展开： 1、引入含氮杂环考虑的主要因素 2、不同类型的含氮杂环：     三氮唑     单个饱和氮杂环     多个饱和氮杂环     氮杂螺环 3、氮杂环连接子设计&优化中的挑战 4、谈谈一些感想和新的设计、发现策略 01 引入含氮杂环的主要考虑因素 在PROTACs早期设计中，主要集中于柔性链作为连接子，如：烷基链、聚乙二醇链（PEG）、和类聚乙二醇链等。 虽然以烷基柔性链为连接体的PROTAC在体外生物活性评价中表现良好，但亲脂性烷基柔性链的引入降低了这些药物分子的亲水性，导致其在体内生物实验中的药代动力学特性和药理活性普遍较差。 同时，也有报道表明，在PROTACs分子中引入烷基柔性链，具有引起体内溶血的风险！这进一步限制了烷基链在临床PROTACs分子中的应用。 PEG链、和类PEG链在PROTACs中的应用可以弥补某些种类烷基链的不足，但使用过长的PEG链会引起大量氧原子的积累，从而增加PROTACs的极性表面积，降低细胞的通透性。这不利于PROTACs分子被细胞吸收，进而降解靶标蛋白。 此外，药物代谢研究表明，含有PEG链和类PEG链的PROTACs分子在生物体内容易发生氧脱烷基反应，导致药物代谢稳定性下降。 链长&柔韧性：另一个值得一提的问题是，无论使用烷基链、PEG链还是类PEG链，当长度过长时，由于其柔韧性的增加，整体分子构象会逐渐变得更加复杂。在微观水平上，它表明柔性链很容易与蛋白质缠绕在一起，这不利于三元复合物的稳定性。因此，柔性链仅适用于PROTAC探索的早期阶段，后续开发仍需对连接子进行持续优化。 刚性结构：近些年，利用刚性结构，包括氮杂环、炔、和芳香环，在PROTAC连接子的设计和化学合成中得到了广泛的报道。 多项报道证明，这些刚性结构的引入，有利于提高PROTACs分子的药物活性、和代谢稳定性，并显著推进PROTACs分子的开发。 在这些刚性结构中，氮杂环更受研究结构和制药公司的青睐，包括三氮唑、吡啶环、哌嗪环等。 氮杂环的优势： （1）用柔性链相比，氮杂环作为连接子，保留了一定的柔韧性、和刚性。这不仅减少了PROTACs在三元复合物形成过程中，连接子黏附在蛋白质表面的可能性，使三元复合物更加稳定；而且使PROTACs能够以合适的构象与靶蛋白和E3连接酶链接，进一步增强PROTACs降解活性。 （2）氮杂环中的氮原子在整个PROTACs分子的极性表面积和亲脂性之间提供了一个精细的平衡。这种微妙的平衡使得PROTACs分子更容易被细胞吸收。 （3）环形结构可以延缓药物在体内的代谢，从而延长药效时间。 （4）在连接子中引入氮杂环，可以提高PROTACs分子的选择性！ 02 不同类型的含氮杂环 鉴于含氮杂环在PROTACs分子的连接子中的优势，文中汇总了近些年的应用实例，主要阐述了三氮唑、单个饱和氮杂环、多个饱和氮杂环、氮杂螺环等的主要应用。 2.1、三氮唑 三氮唑是一种以其稳健性、和多功能性而闻名，在PROTAC生成中作为连接子的一部分发挥了至关重要的作用。 一方面，三氮唑通过限制连接子的柔韧性，稳定PROTAC与POI和E3连接酶形成的三元复合物，从而显著增强降解POI的活性。 一方面，三氮唑类化合物能与POI相互作用，增强PROTAC分子与POI的结合力。 另一方面，可以通过高效、温和的化学反应，构建三氮唑，如“Click”环化，使三氮唑易于融入PROTAC连接子中。 这些都是三氮唑在PROTACs连接子中应用的优势，使其成为连接子设计中的热门选择。 如下图，是近些年报道的三氮唑在PROTAC连接子中的应用的一些实例。 化合物1中三氮唑，增强了POI与SIRT2蛋白之间的亲和力； 化合物2中的三氮唑，增强了烷基链连接子生成的PROTAC分子降解CDK9的活性，这可能源自于三氮唑基团增强了POI配体与POI之间的结合力； 化合物3中引入三氮唑，显著增强了其对CDK6的降解活性，并没有影响其选择性。引入三氮唑前，以长链聚乙二醇为连接子，链长更长，具有选择性降解，但降解活性不理想。 化合物4中引入三氮唑（注，文中三氮唑结构错误，应为1,2,3-三氮唑），在保持原连接子长度最小变化的情况下，有效解决了原化合物缺乏降解活性的问题。改造前，研究人员发现烷基链、或聚乙二醇链作为连接子生成的PROTAC，对GSK-3β靶蛋白具有很强的亲和力，但没有降解活性！ 化合物5采用三氮唑作为连接子，在1μM时几乎完全降解BRD4。在优化过程中，研究人员也是发现，三氮唑的引入显著提高了降解剂的降解活性。 化合物6是在化合物5的基础上保留了原有的三氮唑连接子，选用亲和力更强的配体，对POI配体和E3配体进一步的优化，获得了降解活性更强的PROTAC分子。 化合物7能够同时降解p38α、p38β。在设计的过程中，烷基链和PEG链作为连接子，化合物的降解活性都不是很好，只有20个原子的长柔性链具有良好的p38α降解活性，且E3配体通过酰胺键连接连接子时，降解活性进一步下降。通过三氮唑固定连接子的构象，降解活性显著提高！ 化合物8是在化合物7的基础上，用VHL配体代替了CRBN配体，并对连接子做了细微的调整。化合物8的水溶性显著增加，同时比化合物7降解p38α的活性增强，且具有选择性。 化合物9在PEG链连接子连接POI配体端引入三氮唑，在100 nM时，SHP2几乎被完全降解，显著抑制HeLa细胞的增殖。 化合物10引入三氮唑，显著提高了对AR靶标的亲和力，在30 μM时，几乎完全降解AR，还有进一步优化的潜力。 化合物11在连接子的中间引入三氮唑，并对两端的烷基链长度进行了优化，具有良好的FLT3的降解活性、和选择性。 化合物12中引入三氮唑，同时对烷基链、PEG链等柔性链进行长度的优化，以及E3配体的选择性优化，获得的具有EGFR特异性降解活性的PROTAC分子，最大降解效率91%。 化合物13在连接子中引入三氮唑的同时，在两端分别优化烷基链、PEG链的长度，大大提高了对EZH2的亲和力、以及降解活性。 化合物14在柔性链中引入三氮唑，大大提高了对ERα的降解活性。 这些PROTACs分子针对的POI、细胞系以及降解活性如下表所示。 以上实例揭示了三氮唑在改变连接子性质方面的关键作用，其能够显著地降低连接子的灵活性，从而使连接子稳定在最佳构象中。在连接子的两端引入三氮唑，不仅可以增加其刚性，还加强了配体与靶标之间的相互作用，从而提高化合物的降解效率。 目前的研究，三氮唑在连接子中的应用主要还是涉及其与柔性链的结合，而其与其它刚性结构协同提高连接子的性能方面的研究较少。 2.2、单个饱和氮杂环 哌啶、哌嗪等半刚性饱和氮杂环在PROTACs连接子的应用中日益广泛。 一方面，哌啶、哌嗪等氮杂环在一定程度上提高连接子的刚性，使连接子趋于有利于参与三元复合物形成的构象，因此，增强PROTACs降解POI的活性； 另一方面，哌啶、哌嗪的氮原子为整个PROTACs分子提供了碱性中心，有可能提高PROTACs分子的口服利用度，增强其在生物体系中的代谢。 以下是近些年，一些PROTACs实例中，单个饱和氮杂环的应用。 化合物15的改造过程可以看出，使用单个氮杂环（如哌啶环），同时将链长保持在6-7个原子长度，即使采用弱亲和的E3配体产生的PROTACs，也具有更好的AR降解活性。这表明，在连接子中使用氮杂环可能会增强弱亲和力E3连接酶配体在PROTAC中的适用性。 化合物16是SHP2的有效PROTAC降解剂。然而，在后续的优化中，研究人员发现，利用烷基链等长的PEG链迭代，或者用哌嗪氮杂环迭代酰胺键等措施，降解活性明显降低，或未达到增强的目的。 而利用哌嗪氮杂环迭代原有的酰胺键氨基，得到化合物17，获得了对SHP2较高的降解活性！这表明，酰胺键产生的空间排列时必要的。而保持酰胺键位置不变的情况下，哌嗪环逐渐向VHL配体靠近，活性逐渐减弱。这表明氮杂环引入的位置需要仔细地探究，它可能影响三元复合物内结合地角度。 化合物18中引入哌嗪环，显著增强了其降解H-PGDS地活性；在研发过程中发现，利用PEG链作为连接子，随着链长地缩短降解活性增加，刚性地哌嗪环时降解活性达到峰值！而换用乙二胺，降解活性降低。 化合物19在连接子中引入哌嗪环，增强了化合物地活性，其对SARS-CoV-2、HCoV-OC43、HCoV-229E等多种冠状病毒具有良好的药物活性。 化合物20在化合物19地基础上进一步缩短了连接子，获得了更优地抗病毒活性。然而，两个化合物的溶解度都处于中等，哌嗪环的引入使整个PROTAC分子具有了一个碱性位点，然而由于邻位的羰基具有吸电子的效应，使得这个碱性位点并没有显著提高化合物的pKa值。 化合物21是研究人员通过在连接子POI配体端引入哌嗪环，获得的PROTAC分子，显著增强了其降解AR的活性。然而，哌嗪环的引入并没有如预期的那样增强分子的质子化过程，进而增强溶解性。可能的原因是哌嗪与POI配体的吡啶环邻近，降低了哌嗪环的电子云密度，因而没有增强化合物结合质子的能力。 化合物22中引入了刚性的哌啶环，改变了原有POI配体仅针对BRAF V600E的特异性，使其对其它突变体也具有降解活性。 化合物23在连接子中引入哌嗪环，对HER2具有良好的降解活性，且对POI具有高选择性。哌嗪环上的两个氮原子都被烷基链的给电子作用增强，从而提高了它们接受质子的能力，这使得其亲脂性和亲水性之间的平衡更加理想。 化合物26是通过对PEG链连接子的不断优化，引入哌嗪刚性环，并获得最合适的连接长度而产生的PROTAC分子，可以解决c-MET耐药问题。然而，哌嗪环上两个氮原子都受到羰基和苯基环吸电子作用，导致氮原子的碱性降低，这使得化合物26很难通过哌嗪环的引入质子化来提高其水溶性，以及获得理想的口服PK特性。 化合物27是通过烷基链连接VHL配体和KRASG12C配体获得的有效降解剂。研究发现，在烷基链中引入哌啶、哌嗪、三氮唑等刚性结构，以稳定构象，能够显著提高对POI的降解活性。其中，引入哌啶环获得的化合物28，其降解活性是化合物27的2.5倍！ 化合物29具有较高的CKD9降解活性，但水溶性较低。研究人员希望通过引入哌啶环，增加连接子的刚性，并增加整体分子的碱性中心，以提高水溶性。 初步利用哌啶环直接迭代原有的短柔性链，获得化合物30，降解活性显著提高，但水溶性没有明显改善。推测是羰基的吸电子效应，降低了整体PROTAC分子的质子化效应。 去除羰基，获得化合物31，降解活性略有下降，但水溶性大大提高！这种现象可能是由于去除了羰基，导致连接子中整体吸电子作用减弱，从而提高了哌啶环内氮原子的碱度。这使得氮原子更容易与质子结合，从而提高了化合物的水溶性。 化合物32是通过对烷基链的不断优化，并引入刚性氮杂环，最终获得的降解活性显著提高的PROTAC分子。研究发现，当氮杂环和羰基中间引入亚甲基时，降解活性略有下降，直接去除羰基，则降解活性消失。同时还发现，在10μM时，具有强烈的钩效应。 化合物33是引入哌啶环获得的对CBP较强降解活性的PROTAC分子。有趣的是，通过将化合物33的4-氨基哌啶环的取向反转到连接子结合位点，得到的化合物34，显示出对CBP的选择性降解。随后，在化合物33的E3配体优化过程中，开发出了CBP/p300强降解化合物35 ，其对CBP和p300的最大降解率达到99%，DC50值分别低至0.05 nM和0.2 nM。 化合物36是在连接子中引入哌啶环获得的针对AR有效降解的PROTAC分子；进一步对POI配体进行优化，获得化合物37，具有良好的口服生物利用度（F=99%)。 化合物38是通过在连接子中引入哌嗪取代柔性烷基碳链获得的对GPX4降解活性显著提高的PROTAC分子（从10%提高到33%）。化合物39也是同样的策略，提高了分子的靶向性和生物活性。用VHL配体替换CRBN配体，获得化合物40，降解活性进一步提高，且具有更高的耐药性和选择性。 化合物41引入哌嗪作为连接子，具有良好的BRD9降解活性，且增强了其选择性，对同源的BRD4/7均无降解活性。此外，整体的碱性中心，增加了分子的碱性，进而增加了其水溶性。同时还是其获得了较强的药代动力学特性。 化合物42在烷基链中引入氮杂环替代，有效地规避了其低选择性、副作用，提高了口服生物利用度，具有良好的EML4-ALK降解活性。 下表中是各PROTACs分子对应的POI、细胞系、以及降解活性。 单饱和氮杂环在PROTAc连接子的设计中经常单独使用，这对PROTAC的降解活性、药代动力学数据等有显著影响。与四元、五元饱和杂环相比，六元饱和氮杂环限制了连接子的灵活性，提供了合适的构象，在设计应用中具有一定优势。 哌嗪、哌啶等六元氮杂环构象相似，但是，哌嗪中额外的氮原子会影响连接子的极性表面积；哌啶的引入还要考虑方向性的问题；还要考虑杂环在连接子中的位置，以及是否受邻近基团电子效应的影响等。 2.3、多个饱和氮杂环 在连接子中引入单个饱和氮杂环显著影响PROTAC的活性和体内药代动力学特性，这说明氮杂环可以促进PROTAC分子的临床药物性能的开发，因此，也有众多的研究将多个饱和氮杂环引入到连接子的设计之中。 化合物43在连接子中同时引入了哌啶、哌嗪环，获得了最优的IRAK3降解活性。然而，化合物44（DC50=52nM)仅比化合物43（DC50=2nM)在两个氮杂环中多了一个亚甲基，其降解活性明显降低。这表明，虽然氮杂环引入带来了刚性环境，但过于刚性的连接子可能会影响PROTAC与POI、E3连接酶形成三元复合物的角度。因此，适当的引入柔性链可以调节键合角度，是三元复合物稳定形成。 化合物45、46都是在AR降解剂中引入哌啶、吡咯氮杂环、以及羰基连接两个氮杂环，但吡咯环连接POI配体的手性不同。结果是，具有R型手性构型的化合物45具有最高的AR降解活性，而对应的化合物46降解AR活性较弱。这说明连接子的构象对于三元复合物的形象至关重要。 化合物47是通过一系列的结构优化、引入哌啶、哌嗪，获得的高效降解BCR-ABL的PROTAC分子。研究人员首先通过POI配体Asciminib与POI的共晶结构研究，发现用哌嗪替代配体中暴漏出来的吡咯烷-3-醇基团对POI保持了较强的亲和力，并显著提高了水溶性。 随后，研究人员通过酰胺键将柔性链连接的CRBN配体连接在哌嗪N上，然而，获得的PROTAC分子降解活性不高；去除羰基，降解活性显著提高！而用相当长度的柔性链取代哌嗪环，降解效果几乎消除。在哌嗪和吡啶之间引入一个哌啶环，优化得到最终的化合物47，又进一步提高了降解活性。 化合物48是在连接子中同时引入两个哌啶环、和一个炔烃，开发出来的口服BTK降解剂。两个哌啶的碱性中心有助于提高化合物的水溶性，使其在亲脂和亲水之间达到微妙的平衡，具有特殊的口服利用度。 化合物49使用1-(哌啶-4-基)哌嗪作为连接子，对MDM2蛋白的降解活性最好。 化合物50使用两个连续的乙基哌啶作为连接子，对PARP1的降解活性最好。 化合物51在两个哌啶氮杂环中间加入一定长度的烷基柔性链，对BTK降解活性最强。 化合物52在氮杂环-氮杂环体系中间加入亚甲基以改变连接子构象，对AR-FL、AR-V7具有有效的降解活性。 化合物53也是研究人员在探索连接子的过程中发现，在半刚性的氮杂环中间引入亚甲基柔性链获得的BTK降解活性显著提高的降解剂。然而，其口服利用度较差，可能是由于氮杂环中碱性过高，导致水溶性过高，亲脂性不足。 化合物54是通过4元杂环的刚性环代替柔性环优化而得的高选择性、高BRD4降解活性的降解剂。然而，其水溶性较差。通过引入一条4-甲基哌嗪-1-乙基侧链，通过这条侧链增强了碱性中心，从而提高了整个PROTAC分子结合质子的能力，从而提高了其水溶性，获得化合物55，不仅具有较高的水溶性，而且保持了其选择性、和降解活性。 化合物56-59等AR降解剂的研发、优化过程堪称经典。最初先以烷基链作为连接子确定了降解AR最佳的碳链长度，精确的11-12个原子范围；随后，引入不同氮杂环（吡啶、哌啶、哌嗪）到连接子中，保持总长度，观察到了降解活性的显著提高、和溶解性的改善；通过比较，最终确定1,4’-双哌啶作为连接子；最后对剩余的柔性链进行固定构象优化，获得化合物56（DC50=0.86nM)，具有较好的AR降解活性。使用CRBN配体替代VHL配体，获得化合物57（DC50=0.28nM)，降解活性略有提高，同时还改善了口服生物利用度(F=67%）。进一步对POI配体和连接子杂环进行优化，获得化合物58（DC50=0.04nM)，降解活性极高，同时保持了口服生物利用度（F=51%)。化合物59相比于化合物58，用螺环代替了POI配体中的六元环，降解活性降低，但也相对较高（DC50=0.6nM)，但是大鼠的口服生物利用度提高到了82%。 化合物60、61在连接子中引入两个哌啶环、一个哌嗪环，并保持原有柔性链的长度，降解活性得到显著提高。两个化合物的降解活性在伯仲之间。 化合物62通过在PEG链中引入哌嗪、吡嗪等刚性杂环的引入，改善了其水溶性和代谢稳定性，同时可有效降解RIPK2。 化合物63通过哌嗪环、哌啶环作为连接子，连接3CLpro配体和CRBN配体，能够有效降解POI。 下表中是各PROTACs分子针对不同靶标、不同细胞系的降解活性汇总。 与单个饱和氮杂环相比，多个饱和氮杂环可能不会显著提高PROTACs分子的降解活性，但可以显著改善其体内药代动力学特性，进一步提高其临床应用价值。 但是，多个饱和氮杂环的引入，也可能大大增加整个连接子的刚性，可能导致连接子失去最佳构象，影响三元复合物的稳定性；或者大大增加整个PROTACs分子的碱性，进而失去了亲脂性、亲水性的平衡，导致口服生物利用度降低；因此，需要综合评估引入氮杂环的种类、数量、附着位置，而且要深入调查氮杂环之间的连接模式是否影响形成稳定构象等，必要的时候需要引入适当的柔性链。 2.4、氮杂螺环 氮杂螺环相比于饱和含氮杂环，在三维空间构象上具有独特性，赋予PROTAC连接子立体化学构象。 一方面，而这种空间构象的修饰可能潜在地增强三元复合物的稳定性，从而增强PROTAC分子的降解活性。 一方面，这种氮杂螺环多由脂肪环烃、和氮杂环烃组成。其中的氮原子提供了碱性中心，有利于提高化合物的水溶性。 另一方面，螺环中的环状脂肪烃有助于维持化合物的亲脂性。 因此，氮杂螺环在PROTACs连接子中的应用，可以有效地平衡整体分子的水溶性和脂溶性，进而促进其更有效地进入细胞、以及发挥治疗作用。 以下是一些报道的氮杂螺环在连接子应用中的实例。 化合物64在连接子中引入了氮杂螺环和羰基哌啶，与单独引入氮杂环相比，可有效增强化合物对AR靶标的降解活性以及高生物利用度。需要注意的是，连接子中羰基的存在，降低了螺环中氮原子结合质子的能力，导致整个PROTACs分子水溶性降低、亲脂性增加。因此，化合物64在口服生物利用度上表现中等。同时，化合物64具有良好的体内药代动力学。 化合物65通过羰基连接两个哌啶杂环作为连接子，对ERα具有较强的降解活性。然而，其大鼠口服生物利用度仅有10%。可能是羰基的存在导致的！降低了哌啶环的电子云密度。 化合物66是在化合物65的基础上对两个哌啶环和羰基的位置进行了重新排列，从而引入了螺环结构。改造后，化合物的降解活性并没有降低（有一定提高），反而大大改善了其口服生物利用度。 化合物67以烷基-氮杂螺环为连接子对MLKL的最大降解率超过90%。 化合物68以烷基柔性链为连接子，确定了最优链长，能够有效降解SMARCA2；引入哌啶杂环，保持链长，显著提高了降解活性；通过氮杂螺环替代哌啶环，同时引入环己烷将柔性链固定在E3配体附近，这些优化，最终获得了选择性的降解剂化合物70。 各PROTACs分子对应POI及细胞系的降解活性如下表。 相对于饱和氮杂环，氮杂螺环环化合物作为连接体在平衡PROTAC分子的水溶性和亲脂性方面具有更大的优势，从而更好地促进PROTAC分子进入细胞发挥其治疗作用。此外，氮杂螺环化合物还可以通过维持水溶性和亲脂性之间的平衡来促进口服活性PROTAC的发展。 然而，氮杂螺环化合物的种类远远超过饱和氮杂环，这给氮杂螺环化合物的选择、优化带来了巨大的挑战。 03 含氮杂环连接子设计&优化中的挑战 含氮杂环在PROTACs连接子的应用中具有改善降解活性和药代动力学特性的优势，但在设计和应用中仍存在着诸多挑战。 挑战一：含氮杂环类型的选择。在四元到六元氮杂环之间选择、从饱和到不饱和、含氮原子数（如哌嗪环还是哌啶环）、单个杂环还是多个杂环、含氮杂环的选择等，仍然是一个巨大的挑战。 挑战二：优化位点的选择。氮杂环引入的位点仍是个棘手的问题。 挑战三：引入氮杂环需要加入的化学键的选择。在PROTACs连接子的设计中，单个原子都有可能显著影响POI降解的活性，不同的连接基团，降解活性差异很大。如前文中提到的羰基对邻近基团电子云的影响、亚甲基对连接子柔韧性/刚性的影响等。这些都需要大量的实验工作来验证合适的连接组合。 挑战四：氮杂环的引入，可能引起的手性选择的问题，对PROTAC活性影响也比较显著，如前文提到的化合物45、46。这无疑给优化的工作带来了更复杂繁琐的挑战。 挑战五：连接子支链的选择。目前与PROTAC连接子设计相关的文献很少涉及引入支链，但也有少数研究报道，引入支链可以显著改善PROTAC在体内的药代动力学特性，如前文提到的化合物54、55。如果考虑支链的影响，这无疑更加加大了连接子优化的工作量。 然而，最大的挑战是对于PROTACs连接子中含氮杂环的合理设计仍然缺乏有效的理论指导。研究人员只能靠分子对接和大量实验的经验总结，经过长期探索，获得经验性积累。 总结与展望： PROTACs无疑给疑难疾病治疗，特别是不具有传统意义上的“可药物化”靶标的疾病治疗带来了革新的治疗手段。 PROTACs连接子需要具备一定的刚性、柔性、亲脂性、亲水性，刚柔并济，亲脂亲水平衡，才能在稳定三元复合物构象、增强细胞渗透性和口服生物利用度上获得改善。因此含氮杂环，如三氮唑、哌嗪、哌啶、以及单个、多个或者含氮螺环等在改善连接子的构象和水溶性上将发挥巨大的作用。 但是含氮刚性杂环不易过多，“过刚易折”不利于三元复合物适合键合度的形成，过碱也不利于生物口服利用度，需要把握好刚与柔、亲脂性与亲水性的平衡。 出来数量和种类，同时还需要注意杂环的方向性、邻近化学键基团电子诱导效应、连接杂环的手性、侧链等等因素的影响。 这还仅仅是连接子的“选择困难症”，如果再加上POI配体、E3连接酶配体的选择等，这将更是一个庞大的工程！ 虽然，现在已经有了行之有效的方案，如，先确定高亲和力的POI配体、E3配体；通过烷基柔性链或PEG柔性链的筛查，确定合适的连接子长度；再通过引入合适的含氮杂环改善化合物的降解活性、水溶性、药代动力学特性；而后亦可再优化POI配体或E3连接酶配体。这已经是一个非常逻辑严密的策略了，但是中间的每一步的实施都需要大量的实验工作，以及长期的经验积累。 或许DNA编码化合物库（DEL）筛选技术，可以给以上繁琐的工作量带来解放！ 前面我曾分享过DEL技术在PROTACs分子、分子胶等靶向降解剂发现的应用，详见👉🔗。DEL技术基于亲和力筛选，可以高通量地构建包含POI配体、E3配体、连接子的多样性文库，同时筛查连接子的选择、POI配体的选择、E3配体的选择，甚至包括筛查连接化学键的选择。以上提到的挑战，都可以在DEL文库的构建中“一视同仁”！目前已经在一些靶标如BRD4、BRD9等得到了POC验证，未来，这或许是一个解放工作量的选择！ 参考文献 Application and challenges of nitrogen heterocycles in PROTAC linker. Eur. J Med. Chem., 2024, 273, 116520 DOI: 10.1016/j.ejmech.2024.116520 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓