Piperazine

▎药明康德内容团队编辑 根据中国国家药监局（NMPA）官网批件信息，在刚刚过去的2024年11月，有十多款新药*在中国迎来首次获批上市，覆盖癌症、罕见病、眼科疾病等领域。其中有7款新药获批治疗癌症，包括为卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等患者带来了新的治疗选择。本文将根据公开资料介绍这些刚刚获批的癌症新药的基本信息。（*此处的新药定义为：NMPA受理号类型为X的药物） 图片来源：123RF 辉瑞：甲苯磺酸他拉唑帕利胶囊 作用机制：PARP抑制剂 适应症：去势抵抗性前列腺癌 11月5日，NMPA官网公示显示，辉瑞（Pfizer）的甲苯磺酸他拉唑帕利胶囊已在中国获批上市，联合恩扎卢胺用于HRR（同源重组修复）基因突变的转移性去势抵抗性前列腺癌 (mCRPC) 成人患者。 根据辉瑞新闻稿介绍，甲苯磺酸他拉唑帕利胶囊是一种聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP，包括PARP1和PARP2）抑制剂，具有抑制PARP酶及PARP捕获双重作用机制。该药与雄激素受体抑制剂恩扎卢胺联用，可诱导携带HRR基因突变导致的肿瘤细胞死亡。其关键3期研究TALAPRO-2中HRR突变队列研究结果显示，甲苯磺酸他拉唑帕利联合恩扎卢胺显著降低55%的疾病进展或死亡风险，完全缓解率（CR）高达38.4%（对照组为18.5%），客观缓解率（ORR）达67.1%（对照组为40%）。 亚虹医药：灌注用盐酸氨酮戊酸己酯 作用机制：荧光显影剂类药物 适应症：辅助膀胱癌诊断和管理 11月5日，NMPA官网公示，亚虹医药联合申报的灌注用盐酸氨酮戊酸己酯新药上市申请已获得批准。这是一款辅助膀胱癌诊断和管理的新一代显影剂类药物（研发代号APL-1706），活性成分为5-氨基酮戊酸己酯（HAL）。由于其可以被肿瘤组织高度选择性吸收，通过与蓝光膀胱镜的联合使用可以提高非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）的检出率，使切除手术更完全，以降低肿瘤复发率。2021年1月，亚虹医药从Photocure公司引进了APL-1706在中国大陆及台湾地区的独家注册及商业化权利。 正大天晴/益方生物：格索雷塞片 作用机制：KRAS G12C抑制剂 适应症：KRAS G12C突变非小细胞肺癌 11月8日，NMPA宣布通过优先审评审批程序附条件批准格索雷塞片上市，该药适用于治疗至少接受过一种系统性治疗的KRAS G12C突变型的晚期非小细胞肺癌（NSCLC）成人患者。根据正大天晴新闻稿介绍，格索雷塞采用一种创新的分子结构设计——采用双甲基取代哌嗪，能量更低且构象更稳定。其和血浆蛋白结合率低，提高血浆和脑组织中游离药物浓度和总暴露量，在多种KRAS G12C突变的体外及动物模型中展现出抗肿瘤活性。2023年8月，正大天晴与益方生物签订许可与合作协议，获格索雷塞在中国大陆地区开发、注册、生产和商业化的独家许可权。 格索雷塞治疗KRAS G12C突变的非小细胞肺癌2期临床研究数据显示，客观缓解率（ORR）为52%，疾病控制率（DCR）为88.6%，中位缓解持续时间（DOR）为12.5个月，中位无进展生存期（PFS）为9.1个月，中位总生存期（OS）为14.1个月。研究人员认为，该研究数据显示格索雷塞在携带KRAS G12C突变的NSCLC患者中持续表现出较高的肿瘤缓解率和较长的缓解持续时间。 晨泰医药：盐酸佐利替尼片 作用机制：EGFR-TKI 适应症：非小细胞肺癌 11月20日，NMPA宣布批准晨泰医药1类创新药盐酸佐利替尼片上市，该药适用于具有表皮生长因子受体（EGFR）19号外显子缺失或外显子21（L858R）置换突变，并伴中枢神经系统（CNS）转移的局部晚期或转移性非小细胞肺癌（NSCLC）成人患者的一线治疗。 根据晨泰医药新闻稿介绍，佐利替尼是一款面向伴CNS转移的晚期非小细胞肺癌开展注册临床试验并取得显著成果的药物，也是一款采用非血脑屏障外排蛋白底物设计的EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI），可100%透过血脑屏障。国际多中心随机对照3期临床研究EVEREST证实，在大多数患者是L858R置换突变或颅内病灶数>3个的情况下，佐利替尼的整体PFS获得了显著获益，颅内iPFS达到了17.9个月，显著降低了颅内进展/死亡风险37%。 默沙东：贝组替凡片 作用机制：HIF-2α抑制剂 适应症：VHL病相关癌症 11月21日，NMPA官网公示，默沙东（MSD）的贝组替凡片（belzutifan）上市申请已获得批准，适用于治疗不需要立即手术治疗的von Hippel-Lindau（VHL）病相关肾细胞癌（RCC）、中枢神经系统（CNS）血管母细胞瘤或胰腺神经内分泌肿瘤（pNET）成人患者。贝组替凡是一款选择性新型口服缺氧诱导因子（HIF-2α）抑制剂。HIF-2α通路相关研究曾在2019年荣获诺贝尔生理学或医学奖。研究发现，在缺乏VHL的肾癌细胞中，抑制HIF蛋白（一种能够激活动物细胞中多个对缺氧环境产生反应的基因的蛋白）的功能可以成功阻止肿瘤的生长。 值得一提的是，belzutifan也是获美国FDA加速批准的首个HIF-2α抑制剂。该药在VHL相关RCC患者中报告的ORR为49%。在其它VHL相关非RCC肿瘤患者中，24例可评估的CNS血管母细胞瘤患者的ORR为63%，12例可评估的pNET患者的ORR为83%。 科伦博泰：芦康沙妥珠单抗 作用机制：靶向TROP2的ADC 适应症：三阴性乳腺癌 11月27日，科伦博泰宣布1类新药芦康沙妥珠单抗在中国获批上市。这是一款靶向TROP2的抗体偶联药物（ADC），本次获批的用于既往至少接受过2种系统治疗（其中至少1种治疗针对晚期或转移性阶段）的不可切除的局部晚期或转移性三阴性乳腺癌成人患者。根据2024年5月在美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上公布的3期OptiTROP-Breast01研究数据，与化疗相比，芦康沙妥珠单抗在无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）方面均显示出具有显著统计学意义和临床意义的改善。 值得一提的是，科伦博泰此前已有偿独家许可默沙东（MSD）在大中华区（包括中国大陆、香港、澳门和台湾地区）以外开发、使用、制造及商业化芦康沙妥珠单抗。 华东医药：索米妥昔单抗注射液 作用机制：靶向FRα的ADC 适应症：FRα阳性上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌 11月27日，NMPA官网公示，华东医药全资子公司中美华东联合申报的索米妥昔单抗注射液上市申请已获得批准，用于既往接受过1-3线系统性治疗的FRα阳性、铂类耐药的上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌成年患者。这是一款“first-in-class”针对叶酸受体α（FRα）靶点的抗体偶联药物（ADC），由FRα结合抗体、可裂解的连接子和美登木素生物碱DM4组成。2020年10月，中美华东与ImmunoGen公司达成合作，获得了索米妥昔单抗在大中华地区（包括中国大陆、香港、澳门和台湾地区）的独家临床开发和商业化权益。 值得一提的是，2023年12月，艾伯维（AbbVie）以总额达约101亿美元收购ImmunoGen，将索米妥昔单抗（商品名：Elahere）纳入研发管线。2024年3月，艾伯维宣布基于验证性3期临床试验MIRASOL的结果，Elahere获得FDA完全批准。 除了上述癌症新药，11月还有其他多款新药首次在中国获批上市，包括： 安进（Amgen）口服选择性补体C5a受体(C5aR) 小分子抑制剂阿伐可泮胶囊，获批用于成人严重、活动性抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关性血管炎（肉芽肿性多血管炎[GPA]或显微镜下多血管炎[MPA]）在含糖皮质激素的标准治疗下的辅助治疗。 科笛集团引进的外用4%米诺环素泡沫剂盐酸米诺环素泡沫剂，获批用于9岁及以上儿童和成人患者的非结节性中度至重度寻常痤疮炎症性病变的局部治疗。 箕星药业引进的眼科产品酒石酸伐尼克兰鼻喷雾剂，这是一种经鼻给药促进天然泪液分泌的创新方式，获批用于增加干眼患者的泪液分泌。 中美华东与Kiniksa Pharmaceuticals全资子公司合作开发的一款IL-1抑制剂注射用利纳西普，获批用于治疗成人和12岁及以上青少年冷吡啉相关周期性综合征（CAPS），包括家族性寒冷型自身炎症综合征（FCAS）、Muckle-Wells综合征（MWS）。 期待这些新药早日来到患者身边，为他们带来新的治疗选择。 参考资料： [1]中国国家药监局官网.Retrieved Nov 30，2024, From https://www.nmpa.gov.cn/zwfw/zwfwpjfbzs/index.html [2]各公司官网及公开资料 本文来自药明康德内容团队，欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权及其他合作需求，请联系wuxi_media@wuxiapptec.com。 免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。

研究背景 RNA 的转录后（表转录组）修饰在基因表达和细胞稳态调节中起着关键作用。N6-腺苷甲基化 (m6A) 是 150 多种已报道的RNA修饰中最丰富的。它已被发现于 mRNA、tRNA、rRNA 和几种非编码 RNA。m6A 是一种动态且可逆的修饰，由定义为“写入器”的蛋白质沉积并被“擦除器”蛋白质去除。第三个表观转录组蛋白家族（“阅读器”）可识别甲基化 RNA，从而导致转录本的剪接、核输出、翻译、稳定性改变和降解。通过这种方式因此，m6A 修饰可以介导 特定基因RNA 的表达或沉默特定基因。 这种表观转录组机制能够实现干细胞分化、细胞对应激的反应以及生理条件下昼夜节律周期的调节等过程。它的失调与越来越多的病理状况有关。特别是，异常的 m6A 水平与多种癌症有关，包括白血病、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌等。 图1.与 METTL3 相关的各种疾病 甲基转移酶样 3 (METTL3) 和 METTL14 形成异二聚体蛋白复合物，催化 m6A 修饰的沉积（写入器）。METTL3 是催化亚基，与结合共底物 S-腺苷-L-甲硫氨酸 (SAM) 结合的催化亚基，而 METTL14 促进 RNA 结合和复合物的稳定。许多研究表明，增加 m6A 水平可以增强细胞增殖和抗凋亡作用。此外，据报道，METTL3 可以促进其他致癌过程，与其催化活性无关。小鼠基因敲除研究表明，m6A 修饰的缺失会导致早期胚胎死亡。小鼠胚胎干细胞 (mESC) 可以在 METTL3 基因敲除后存活并继续增殖，但失去分化能力。在人类造血干/祖细胞 (HSPC) 中，m6A 修饰控制骨髓分化。HSPC 中的RNA (shRNA) 介导的 METTL3 沉默可促进细胞分化并减少细胞增殖。    迄今为止，仅报道了两个系列的 SAM 竞争性、强效和选择性 METTL3 抑制剂，其中一个源自苏黎世大学 (UZH) 小组开展的药物化学活动研究。低纳摩尔抑制剂 UZH2 和 Storm Therapeutics 发表的化合物 (STM2457) 在急性髓系白血病 (AML) 细胞系中显示出抗增殖作用，增强了靶向 METTL3−14 复合物的治疗潜力。 图2.UZH2结构 图3.STM2457结构    METTL3 的小分子抑制剂 STC-15（SAM 竞争性，由 Storm Therapeutics 开发）目前正处于 1 期临床试验 (https://clinicaltrials.gov/study/NCT05584111)。自2022年11月15日起，共有66名患者入组并接受给药，以评估STC-15在晚期恶性肿瘤受试者中的安全性、药代动力学、药效学和临床活性。由于临床试验已持续近 14 个月，服用 STC-15 后似乎并未出现严重副作用。 图4.STC-15结构  最近一项使用 METTL3 抑制剂 STM2457（临床试验中的化合物 STC-15 的前身）的体内研究报告称，与 METTL3 敲除研究中观察到的效果相比，用药物抑制 METTL3 对正常造血的影响更温和、更细微且易于控制。在最早的造血祖细胞中观察到的谱系偏差包括中性粒细胞的增加和红细胞的减少，表明贫血是催化性的 METTL3 抑制的潜在副作用。现有数据表明，通过敲除或抑制 METTL3 会影响正常细胞，但效果取决于细胞和系统环境。然而，SAM 的高细胞浓度（在大鼠肝脏中测量为 60 至 160 μM）可能会限制 SAM 竞争性抑制剂的范围。 蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 是小分子抑制剂的有效替代品。PROTAC 是由靶蛋白 (POI) 配体与 E3 连接酶配体共价连接的异双功能分子。与两个靶标结合后，PROTAC 促进 POI 泛素化，随后被 26S 蛋白酶体降解。这是一种很有前景的方法，已应用于多种目标，特别是在表观遗传学领域。它们类似催化的作用机制导致蛋白质降解后， PROTAC 分子的循环/再利用。此外，由于整个蛋白质的降解，PROTAC 消除了其酶促和支架功能，起到了蛋白质的化学敲除作用。   在这里，该团队报告了一项药物化学研究，旨在开发针对 METTL3−14的 PROTAC 分子。 研究内容 PROTAC的总体结构和优化策略  该研究建立在该团队之前开发 METTL3−14. 小分子抑制剂期间获得的结果基础上。在这里，作者从两种有效且选择性的 METTL3−14 抑制剂 UZH2（IC50= 5 nM）及其去氟衍生物 AD22（IC50 = 89 nM）开始着手（图5）。 图5.POI配体结构 作为 E3 泛素连接酶，作者选择了 Cereblon (CRBN)，其最常见的配体是 4-氨基沙利度胺（泊马度胺）和来那度胺。通过晶体学分析，确定了与连接子形成共价键的 UZH2/AD22 原子。METTL3−14 复合物中 UZH2 (PDB 7O2F) 和 AD22 (PDB 7O0P) 在METTL3−14 复合物中的结合位置（图 6）提供了一个从嘧啶环到溶剂暴露区域的出口导向。   图6.METTL3 与 AD22（青色碳原子）和 UZH2（橙色碳原子）结合的晶体结构的重叠  用丙基二氨基基序（手柄）替换甲氨基部分后，可以通过连接子方便地连接到 CRBN 配体。直接连接到嘧啶环的氨基旨在与 METTL3 中的 Asp377 侧链保持有利的氢键相互作用（图 7）。 图7. Asp377 侧链与 AD22 和 UZH2 甲胺之间的氢键 末端氨基官能团允许最终形成酰胺键，从而通过连接子将 POI 配体与泊马度胺连接（图8）。丙基二氨基部分被正式认为是连接体的一部分。然而，它会影响 PROTAC 对 METTL3−14 的亲和力，正如研究团队在时间分辨 FRET 测定（以下称为二元测定）中测量的那样。因此，这部分被称为手柄，以清楚地将其与连接子的其余部分区分开来 。    图8.合成PROTAC的结构 第一组 PROTAC 分子（化合物 1−4）由 AD22 作为 POI 配体、丙二胺为手柄、聚乙二醇 (PEG) 为连接体和泊马度胺作为 E3 连接酶配体（图9）。它们的合成是通过最终酰胺键的形成来实现的，如合成部分的方案 4 中进一步详细描述的。 图9.第一组PROTAC分子结构以及活性数据 第一组使用 PEG 连接体的理由是具有不同数量 PEG 亚基的 PEG 链的可商业化购买。这使研究团队能够覆盖 POI 和 CRBN 的 PROTAC 部分之间的不同距离。这对于研究三元复合物 CRBN/PROTAC/ METTL3−14 形成的最佳范围非常有用。此外，由于其良好的理化性质，PEG链被广泛用于生物共轭和生物标记的交联。在 AML 细胞系 MOLM-13 中，16 小时时间点通过蛋白质印迹法分别测定不同浓度（10、5、1、0.1、0.01 μM）的PROTAC降解 METTL3 和 METTL14 的情况。然而，四种第一代 PROTAC（化合物 1−4）均未表现出降解活性（图9）。还在生化三元复合物形成试验 (TCFA) 中测试了化合物 1、2、3 和 4。Hook曲线峰值处相对较高的有效浓度（ECmax：6.8、2.8、1.9 和 2.0 μM）反映了对 CRBN 和 METTL3−14 的低亲和力。此外，与本文其他化合物相比，Hook曲线的振幅较低。这可能表明弱协同性和不太稳定的三元复合物形成，而这是成功降解活性所必需的。   由于PROTAC的高分子量和/或高亲水性可能会导致细胞渗透性较低，研究团队决定使用细胞热转移试验（CETSA）评估细胞的渗透性和靶标参与度。第一组 PROTAC（化合物 1−4）仅在 100 μM 的极高浓度下表现出较低的蛋白质稳定性。考虑到 CETSA（图 10）和 TCFA 结果，缺乏降解可能是由于细胞渗透性低和/或无法形成稳定的三元复合物所致。 图10.MOLM-13 (AML) 细胞系中基于 AD22 的 PROTACS 1-9 的评估 细胞通透性和 POI 配体亲和力的优化 为了解决低渗透性的问题，研究团队合成了第二组基于 AD22 的 PROTAC（化合物 5−9），旨在增加分子的亲脂性。PEG 连接体被烷基链取代（图11）。CETSA 实验（图10）证实了亲脂性增加对细胞膜渗透的积极影响，更明显的稳定效应表明了这一点。    图11.第二组PROTAC结构优化 为了提高三元复合物的稳定性，研究团队决定通过用效力强 20 倍的抑制剂 UZH2 替换 AD22 来改变 POI 配体（图12）。 图12.第三组PROTAC结构优化 正如预期的那样，与AD22 类似物相比，所得PROTAC（化合物10−13）对 METTL3−14 表现出更高的亲和力（图13）。此外，TCFA 中测得的 ECmax 也得到了显著改善。化合物 10、11 和 12 的 ECmax 低于 1 μM，与非氟化类似物相比提高了 3 至 6 倍（图13）。尽管细胞渗透性和对靶蛋白的结合亲和力增加，但通过在多个时间点（6、16、36小时）在0.2、2和20μM PROTAC浓度下的WesternBlot测定，没有一个测试化合物显示METTL3−14的降解。    图13.第三组PROTAC分子结构以及活性数据 由于迄今为止合成的 PROTAC 具有相同的手柄基序（丙二胺），作者质疑其对三元复合物形成和蛋白质降解的影响。从之前的研究中，作者知道用芳基或脂肪环取代 UZH2 中的甲基氨基，可以与 METTL3− 14 结合位点边缘提供有利的亲脂相互作用。此外，手柄或连接子中的刚性和大体积特征可能导致 PROTAC 构象更容易发生细胞渗透和/或三元复合物形成。考虑到这一点，研究团队继续合成带有更刚性手柄/连接子的 PROTAC（图14）。 图14.第四组PROTAC分子结构以及活性数据 连接子长度和刚性的优化 第四组七个 PROTAC 分子包含苄二胺手柄而不是丙二胺。此外，研究团队改变了连接子线性部分的长度，保留了之前优化步骤中的烷基（化合物 14-17）和烷基三唑（化合物 18-20）基序。芳环的存在显著提高了 METTL3−14 的亲和力（通过基于 FRET 的二元测定法测量）以及 ECmax 值（图15）。    图15.PROTAC分子14-17的结构以及活性数据 在 MOLM-13 细胞中观察到，在2 μM PROTAC 中孵育 24 小时后， METTL3 和 METTL14 蛋白的实质性降解。需要注意的是，对于 SAM 竞争性 PROTAC，低微摩尔浓度下的细胞活性与之前在细胞试验中测量的 UZH2 的低微摩尔活性一致，这是由于上述 SAM 浓度较高的缘故。化合物 14 、 19 和 20 降低了 METTL3 （分别为 52% 、33% 和 42%） 和 METTL14 水平 （分别为 52% 、40%和 51%）（图16）。最有前途的衍生物 PROTAC 14 与该组的其他 PROTAC 相比，包含更短的连接子。 图16.PROTAC分子18-20的结构以及活性数据 此外，研究团队还合成了另一组 11 个 PROTACs，其中包含亲脂性和刚性手柄，如哌啶（化合物 21-25）、哌嗪（化合物 29-32）和三唑（化合物 26-27）与不同长度的烷基连接子组合。在细胞中进行一轮蛋白质降解筛选并通过 Western blot 分析（2 μM，24 小时 MOLM-13）定量后，具有哌啶或哌嗪手柄的化合物 22、23、24、29、30 和 31 显示 METTL3 和/或 METTL14 降解 50% 或更高（图17）。异源二聚体复合物 METTL3-14 两种蛋白质的相关降解提供了证据，证明 PROTAC 结合在 METTL3 的 SAM 口袋可以降解这两种蛋白质。PROTAC 30 显示出最显著的降解活性，METTL3 和 METTL14 均减少了约 60%。相比之下，以三唑环为手柄的 PROTACs（化合物 26 和 27）表现较差，降解效率分别为 13% 和 12%。    图17.PROTAC分子21-35的结构以及活性数据 具有 3 到 5 个亚甲基长度的连接子（即 PROTAC 14、22、23 和 30）实现了最高的降解 （50-60%）。当减少连接子长度时，TCFA 显示 ECmax逐渐改善，正如在哌啶手柄系列 PROTACs 25、24、23、22 和 21 中看到的那样。其中，最短的PROTAC化合物21具有最好的ECmax (0.06 μM)，但在降解方面，它比稍长的类似物22和24差，分别降低了21.6%、46%和36%的METTL3。生化TCFA和细胞降解试验之间差异的可能解释是TCFA采用截断的蛋白质结构。PROTAC 21可能太短而无法与全长蛋白形成稳定的三元复合物，并且一些空间冲突可能导致三元复合物的非最佳构象。即使在更短的连接体长度下，也没有观察到这种ECmax改善趋势，正如PROTAC 32(无连接子)所示，它在TCFA和细胞降解试验中都是无活性的。因此，似乎有一个最佳范围的连接长度(三至五个亚甲基)。 图18 显示了 MOLM-13 中蛋白质降解百分比的分布，作为 TCFA 中测定的 ECmax 的函数。尽管相关性并不强（相关系数 r = 0.44），但只有 PROTAC 28 显示出高于 20% 的降解且 ECmax > 1 μM。生化 TCFA 可以被认为是一种有用的筛选技术，可以优先考虑 PROTAC 的生物学特性。    图18.MOLM-13 中蛋白质降解百分比的分布 为了进一步增加手柄/连接子部分的刚性，研究团队合成了三种连接子刚性性增强的 PROTAC（化合物 33−35）。其中，PROTAC 33 表现最好，显示出 44% METTL3 减少，而化合物 34 显示出不显著的蛋白质减少，35 仅显示 21% METTL3 减少。考虑到化合物 34 和 35 含有比 PROTAC 33 短得多的接头连接子，这些结果进一步突出了连接子接头长度的重要性。 一旦确定了最有希望的手柄和实现蛋白质降解的理想长度，作者就尝试修饰与 CRBN 配体的连接。PROTAC 23 在位置 5 处与沙利度胺连接。这种修饰具有良好的耐受性，并且该化合物会导致 50% METTL3 的降解。尽管如此，与其 4 取代类似物 (PROTAC 22) 相比，降解（50% 与 46%）和 ECmax （0.16 μM 与 0.19 μM）的差异可以忽略不计（图19）。 图19.METTL3降解(MOLM-13)与连接子长度的关系 至此，作者决定选择PROTACs的一个子集在多个AML细胞系中进一步验证。作者首先关注了8个PROTACs，它们在MOLM-13中表现出亚微摩尔ECmax 和至少50%的METTL3和/或METTL14降解(14,20,22,23,24,29,30,31，图20中突出显示)。当作者决定关注PROTAC的一个小子集时，PROTAC 33还没有准备好。 图20.PROTAC浓度为2μM时METTL3和METTL14在MOLM-13中降解的相关性  作者进一步限制为只有5个PROTACs，因为PROTAC 23是22的间取代物，而PROTACs 29 - 31只是亚甲基的数量不同。因此，作者在不同的AML细胞系(THP-1、NOMO-1和KASUMI-1)中研究了化合物14、20、22、24和30的降解活性(图21)。． 虽然在THP-1和NOMO-1细胞系中观察到的降解水平与MOLM-13相当，但在KASUMI-1细胞系中检测到的METTL3和METTL14的降解水平更高。2 μM PROTAC 30作用于KASUMI-1细胞24 h, POI降解率达70%。 为了进一步验证PROTACs的降解能力，研究团队对其中一些针对实体肿瘤细胞系进行了测试。并将重点放在两种前列腺癌细胞系(DU145和PC3)上，因为最近有证据表明METTL3在前列腺癌中的重要性。所选择的PROTACs 14、20、22、24和30在DU145细胞系中仅显示出轻微的影响(图21)。相比之下，24小时后PC-3中的METTL3水平大幅降低，PROTACs 20和22的降解值最高，分别降低了48%和64%(图21)。这一结果表明，研究团队的PROTAC分子的降解活性不仅限于白血病细胞系，而且对前列腺癌也有很好的潜力。此外，不仅在MOLM-13中观察到METTL3和METTL14的相关降解，而且在所有其他测试细胞系中也观察到METTL3和METTL14的相关降解。    图21.选取的PROTAC（浓度为 2 μMin）对AML细胞系和前列腺癌细胞系的细胞降解测定 PROTACs细胞活性的验证 在这个阶段，研究团队评估了PROTAC联合高浓度小分子抑制剂来那度胺或UZH2治疗后METTL3−14蛋白水平(图22)。这些控制包括分别饱和CRBN或METTL3 - 14的结合袋，从而防止三元配合物的形成。在2 μM PROTAC、2 μM PROTAC + 10 μM来那度胺和2 μM PROTAC + 10 μM UZH2 3种不同条件下，用PROTACs 20和24处理细胞。． 正如预期的那样，当使用高浓度来那度胺时，作者没有观察到任何降解。有趣的是，高UZH2浓度的存在导致METTL3 - 14水平升高，无论是在对照组还是与PROTAC联合使用。这一观察结果表明了一种可能的细胞补偿机制，其目的是在抑制剂存在的情况下保持蛋白质的催化活性， 这也为METTL3 - 14难以达到50%以上的降解水平提供了一个潜在的解释。 图22.PROTAC联合高浓度小分子抑制剂来那度胺或UZH2治疗后METTL3−14蛋白水平 作者为了确认化合物是通过泛素-蛋白酶体系统 (UPS) 导致蛋白质降解，合成了基于单一甲基化的阴性对照，这导致了无活性的来那度胺/泊马度胺衍生物。因此，研究团队制备了甲基化版本的 PROTAC 14 和 24（me-14 和 me-24）（图23）。这些甲基化化合物在标准测试条件（2 μM，24 小时）下没有表现出任何 METTL3−14 降解（图23）。 图23.PROTAC 阴性对照 me-14 和 me-24 的化学结构。 两种对照 PROTAC 在生化三元复合物形成测定中均未发出信号（图 24）。甲基化衍生物不活跃，表明它们无法形成三元复合物，并进一步证实了研究团队的 PROTAC 的特异性。化合物 me-14 还在 METTL3 和 CRBN 上的 CETSA 中进行了测试，以提供其具有细胞渗透性并且与 POI 而非 CRBN 结合的证据（即，阴性对照的验证）。正如预期的那样，该化合物表现出 METTL3 的稳定性，但 CRBN 的稳定性不高。 图24.与 MOLM-13 中的阴性对照 me-14 和 me-24 相比，PROTAC 14 和 24 的降解能力 此外，研究团队建立了体外泛素化测定，以量化不同浓度 PROTAC 存在下 METTL3 和 METTL14 的泛素化。化合物 14 和 me-14 在 2、8 和 32 μM 下进行测试（图 25）。 图25.化合物 14 及其阴性对照 me-14 的体外泛素化测定结果  与没有化合物的对照组相比，me-14 不会增加 METTL3 的泛素化，但 PROTAC 14 在 2 μM 时将 METTL3 的泛素化水平提高至约 40%。化合物14浓度较高时，泛素化的降低与Hook效应一致。METTL14 的泛素化并不那么明显（图 26）。这可能表明泛素化位点主要在 METTL3 上。有趣的是，Zeng 等人表明，METTL14 可以在 METTL3− 14 界面中被 STUB1 泛素化，因此 METTL3 似乎可以防止METTL14泛素化。由 PROTAC 引起的 METTL3 和 METTL14 同时降解可能是由于两种蛋白质都作为复合物受到蛋白酶体的影响，或者是由于没有 METTL3 的 METTL14 稳定性降低。 图26 最后，作者分析了 MOLM-13 细胞系中 METTL3 和 METTL14 降解的浓度依赖性。作者选择了 PROTACs 14 和 30，它们在 MOLM-13 中具有最高的 METTL3 降解 （分别为 52% 和 57%）。还将 PROTAC 14 的活性与其阴性对照 me-14 的活性进行了比较。研究团队用五种不同浓度的 PROTACs 14 、 30 和 me-14 处理 MOLM-13 细胞 （图 27）。正如预期的那样，浓度依赖性显示了所谓的 Hook 效应，是由于 CRBN 和 METTL3-14 在高 PROTAC 浓度下饱和而产生的，其中 PROTAC/CRBN 和 PROTAC/METTL3-14 二元复合物阻止了三元复合物的形成，从而阻止了降解。这一结果证实了合成的化合物根据 PROTAC 作用机制的原理发挥作用。对于 PROTAC 30，在 0.1 μM 浓度下观察到最高降解，最高可达 60%，对于 PROTAC 14，在 1 μM 时观察到最高降解，METTL3 降低约 50%。化合物 me-14 在 10 μM 时没有降解，甚至增加了 METTL3 水平，与单独的 UZH2 抑制剂相似。    图27.PROTACs 14 、 30 和 me-14 的细胞表征 为了评估合成的化合物诱导的降解是否会转化为增强的细胞死亡，研究团队使用所有基于 UZH2 的 PROTAC 对 MOLM-13 进行了细胞活力测定。化合物 20、22、24 和 30 也在其他 AML 细胞系 THP-1 和 Kasumi-1 以及前列腺癌细胞系 PC3 和 DU145 中进行了测试（图 28）。仅在测试的最高浓度 （10 μM） 下观察到，某些 PROTAC 对细胞活力的显著影响。该浓度高于生化测定中测得的 ECmax 值，因为如前所述，PROTAC（和 UZH2）与细胞测定中 SAM 的微摩尔浓度竞争。有趣的是，在 PC3 细胞系上，只有 PROTAC （化合物 22、24 和 30） 而不是 UZH2 显示出抗增殖作用。 图28 PROTAC在 AML 细胞系（上）和前列腺癌细胞系（下）中的细胞活力测定 为了更好地了解 MOLM-13 细胞系中的细胞活力结果，研究团队测试了 PROTAC 处理后细胞 m6A/A 水平的变化（通过 LC-MS 定量）（图 29）。在 2 μM（用于降解筛选的浓度）时，没有观察到对 m6A/A 水平的显著影响（除了化合物 22 略有降低）。在 10 μM 浓度下观察到 m6A/A 的明显降低。考虑到 PROTAC 分子的浓度依赖性活性（Hook 效应），观察到的 m6A 修饰减少很可能是由于基于 UZH2 的弹头抑制了 METTL3 的催化活性，而不是蛋白质降解。催化活性的部分抑制也可能解释在最高测试浓度的 PROTAC 下观察到的细胞毒作用。总之，m6A/A 的适度细胞毒性和降低表明，需要高于 50-70% 的降解水平才能观察到 PROTAC 诱导的 METTL3-14 降解的特异性表型效应。     图29.MOLM-13 中多腺苷酸化 RNA 中 m6A/A 水平的 LC-MS 定量。 结果讨论 研究团队使用 METTL3−14 与强效 (IC50  = 5 nM) 和选择性抑制剂 UZH2 复合物的晶体结构作为起始信息。首先使用 UZH2 的脱氟衍生物作为 METTL3−14 的一个部分，有效地优化了 PROTAC 连接体。虽然最初考虑的是基于 PEG 和基于烷基的连接体，但只有具有基于烷基的连接体的 PROTAC 表现出细胞渗透性。随后，合成了26个基于UZH2的具有不同长度烷基连接体的PROTAC。通过基于 FRET 的测定和体外泛素化测定证实了 METTL3 三元复合物的形成和泛素化。 PROTAC 的细胞表征仍然非常必要，但生化 TCFA 已成为有效筛选 PROTAC 进行进一步验证的有价值的工具。值得注意的是，具有 UZH2 独特刚性延伸的五种 PROTAC（14、20、22、24 和 30）在多种 AML 细胞系和前列腺癌细胞系 PC3 中实现了实质性 METTL3−14 降解（50% 或更高），展示了它们作为靶向蛋白质降解研究的宝贵工具的潜力。   与催化抑制剂 UZH2 相比，PROTAC 22、24 和 30 对前列腺癌 PC3 显示出更高的抗增殖活性，但对 AML 细胞系则没有。在 UZH2 存在的情况下，METTL3−14 的水平升高，并且聚腺苷酸化 RNA 的 m6A/A 水平没有降低（通过 LC/MS 测量），表明 METTL3−14 的降解程度要高得多（可能高于 90%）。有很强的抗增殖作用。同样，在未来的体内研究中，需要具有更高活性的化合物来表征 METTL3 PROTAC 的潜在副作用。 在研究 PROTAC 成功降解蛋白质的特征时，这项研究为理解连接子的关键作用做出了宝贵的贡献。生化和细胞特征提供的证据表明，需要最小的连接子长度来实现 PROTAC、E3 连接酶 CRBN 和 POI(s) METTL3−14 之间三联复合物的形成。在这方面，PROTAC 32 和 34 的连接体太短，无法形成允许 METTL3−14 降解的三元复合物。更显著促进降解的 PROTAC（14、20、22、23、24、29、30、31 和 33）的特点是刚性“手柄”（苄基、哌啶和哌嗪）和较长的连接体。与本研究中合成的其他分子（18、19、21 和 25）相比，这些 PROTAC 的结构仅存在很小的差异，这表明连接子的几何形状、长度和/或刚性的微小差异可以对三元复合物的形成和稳定以及最终的蛋白质降解产生重大影响。    药物筛选中心（暨南大学）对外提供新药筛选服务 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓