VHL

侃言 蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）是一种异双功能分子，通过诱导泛素-蛋白酶体系统(UPS)对靶标蛋白质进行泛素化和降解。这是一种事件驱动的作用机制，相比于小分子抑制剂有诸多优势，比如：催化性质的低浓度低剂量需求、减少给药量和给药频率、减少毒副作用、更加长效持久、有效降低药物耐药、靶点适用自由度高等，具有非常高价值的治疗应用前景。 然而，由于可利用的E3配体的开发和应用有限，高频过度的使用仅有的如VHL(60.1%)、CRBN(30.1%)配体（数据来自iScience)，导致PROTACs耐药性问题成为困扰当前PROTACs治疗的一大难题。因此，开发肿瘤组织特异性E3配体就变得非常重要，依靠肿瘤自身癌蛋白(oncoprotein)，将极大地降低突变耐药的机率。 近日，PROTACs奠基人、Arvians创始人、耶鲁大学著名科学家Craig Crews教授在JACS上刊载了其团队最新研究成果，突出强调基于肿瘤组织，特异性E3连接酶底物衔接蛋白配体的开发，在解决PROTACs耐药性突变问题上的重要性。 文章的第一作者李科博士为我多年好友。许多关键性问题，也和李博士进行了探讨。 文章于2024年8月27日在线，地址如下： https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1021/jacs.4c05393 1 PROTACs耐药性 与     肿瘤特异性E3复合体蛋白   PROTACs作为一种异双功能分子，有效地诱导靶蛋白和E3连接酶邻近，形成三元复合物，使靶蛋白泛素化，进而被蛋白酶体识别后降解。然而，由于过度依赖和高频使用VHL、CRBN等E3连接酶配体，也出现了PROTACs耐药性问题。 依赖肿瘤自身癌蛋白，开发肿瘤组织特异性E3连接酶配体，是解决当前PROTACs耐药性问题的关键。 E3连接酶底物衔接蛋白：MAGE-A3 黑色素瘤抗原A3型蛋白(MAGE-A3)，是一种组织特异性表达的蛋白，也是一种E3连接酶的底物衔接蛋白，与E3连接酶结合，通过改变亚细胞位置或靶向泛素化的独特底物，来调节E3连接酶的活性。 MAGE蛋白家族包括I型(AMGE-A/B/C)和II型(AMGE-D/E/F/G/H/L/Necdin)两种抗原类型、以及众多亚族。其中，I型为MAGE睾丸癌抗原，主要在生殖组织中表达，若启动子去甲基化异常表达则易导致癌症；而II型MAGE蛋白可在多种组织中表达。 MAGE同源结构域(MHD)在I/II型蛋白中都是高度保守的。然而，尽管结构相似，MHD底物结合间隙中的独特残基，被赋予了与不同蛋白伴侣特异性结合的能力。 MAGE-A3就是这种具有与E3连接酶结合能力的组织特异性衔接蛋白，因此，极具潜力作为开发肿瘤特异性PROTACs的靶点： 能够作为E3连接酶底物招募模块 在体细胞组织中极少表达 能够在多种肿瘤类型中发现 最近的研究发现，MAGE-A3与三重基序蛋白28(TRIM28)相互作用，并调节TRIM28。而TRIM28的表达无处不在，具有多种功能，包括E3连接酶激活。 因此，由MAGE-A3配体组成的PROTACs，可以在表达MAGE-A3的肿瘤组织中，特异性地招募由TRIM28介导的靶蛋白泛素化。 MAGE-A3在免疫治疗中的应用 此外，诱导MAGE-A3降解，可能对癌细胞具有抗增殖作用。而MAGE蛋白家族本身就是癌症免疫治疗的热门靶点，已有多项临床试验针对MAGE-A3抗原。 PROTACs介导的MAGE-A3降解有可能增加抗原在同源MHC复合物上的呈递，进而改善免疫治疗的结果。 2 DNA编码化合物库技术（DEL) 助力     E3连接酶衔接蛋白MAGE-A3配体发现    研究人员利用DEL技术，针对MAGE-A3的MHD进行亲和力筛选，如上图A，包含约109个DEL化合物。 DEL具有广泛的靶点适用性，也非常适合缺乏酶功能的靶标、以及非活性位点抑制剂类配体的发现。并以发现的苗头化合物为起点，指导靶标特异性异双功能小分子的设计。 DEL苗头化合物发现和类药性优化 从这个包含约十亿多种化合物的超级化合物库中，对MAGE-A3同源结构域进行筛选后数据分析，最终发现了两个来自不同文库的相似的“化学型”家族：苯甲醛支架、氨基嘧啶支架，如上图B。 在这两个相似的“化学型”富集中，通过对全长分子的富集度、物化特性、组成合成砌块、以及起始原料的综合考虑分析对比，最终选择了一些列分子进行off-DNA合成、验证。化合物KL346就是其中用于后续验证的代表，如下图。 通过对KL346和MAGE-A3 MHD进行ITC生物物理表征，发现了低微摩尔结合亲和力，如上图B，KD=8.1±2.3 μM。同时也发现了KL346:MAGE-A3复合体构成的化学计量比例为1：2（N~0.5)。 配体“成药性”也是PROTACs成功的关键，出于此考虑，研究人员根据采用常见的策略来截断DEL苗头化合物，获得化合物MJBIA9836(如上图A)：去除组成苗头化合物中靠近寡核苷酸标签的合成砌块，一般认为其多作为间隔而不是药效团，对配体亲和结合力贡献较小。 如上图B，结果也证实，截取后的分子保留了相当的结合亲和力，但其类药性特性却获得了极大的改善。 如上图C，通过细胞热移试验(CETSA)，MJBIA9836相比于DMSO对照组，稳定了两个MAGE-A3阳性细胞系内源性MAGE-A3或增加了蛋白水平。这表明，改善后的化合物具有细胞渗透性。 靶标:配体相互作用的结构表征 如上图，研究人员利用分子对接技术，通过MAGE-A3晶体结构，评估了MJBIA9836的潜在结合位点，并对观察到的1:2结合化学计量进行了合理化。 单体与二聚体模型对接结果揭示了一个相似的结合位点。在没有变构的情况下，二聚体模型中的结合界面是位于预测的显示1：2结合化学计量的结合位点。因此，研究人员进行了进一步的结构表征以验证配体结合位点和辅助基于结构的配体优化。 然而，MJBIA9836的溶解度有限，研究人员获得了其吗啉类似物KL861，其结合亲和力与MJBIA9836相当，但溶解度提高，并用于单晶结构分析，如下图。 单晶衍射与分子对接结果一致，疏水作用是配体结合的驱动力。同时，也再次印证了单个配体分子与MAGE-A3二聚体结合。 为了确定MAGE-A3与配体的生物活性位点，研究人员利用靶标突变体进行进一步的研究。观察到R211A侧链靠近二聚体界面，并且位于配体羰基的氢键距离内，研究人员获得了R211A突变的MAGE-3A MHD，如上图B。 3    MAGE-A3配体驱动的PROTACs    在获得了MJBIA9836在体外、结构、以及细胞内均能够结合MAGE-A3的证实后，研究人员以此进行PROTACs设计，并验证MAGE-A3配体在靶向降解剂中的实用性。 PROTACs设计及验证 如上图，研究人员首先基于VHL和CRBN设计PROTACs，进行概念性验证（POC）。然而，仅基于VHL招募的PROTACs以剂量依赖性的方式降低MAGE-A3的水平，并观察到VHL蛋白水平升高，如下图B。 最有效的PROTAC为KL465，如上图A，装配有（rh)-VHL。有效降低HeLa细胞MAGE-A3水平，Dmax~60%，DC50~2μM。 VHL的重要性 为了进一步验证VHL在靶标降解中的重要性，研究人员设计了KL465的无活性版本——KL633，如下图B。在KL633组成中，对于VHL结合至关重要的羟基脯氨酸部分，其立体化学倒置，因此在保持了相当的物化特性的同时，不具有VHL招募活性。 在上图A中可以看出，两种浓度下，KL465能够诱导靶标有效降解；但KL633、MJBIA9836并不能显著降低MAGE-A3的蛋白水平。这表明，KL465降解靶标是VHL依赖性的。 如图C，KL465在MAGE-A3阳性细胞中，其对细胞增殖的抑制作用更大。这表明，与单独结合配体相比，MAGE-A3的降解显著降低了细胞活力。 总之，这些数据表明，使用KL465降解MAGE-A3可以降低癌细胞活力，并且这种观察到的效果不是由于脱靶毒性导致。 KL465不影响MAGE-A3:TRIM28相互作用 利用MAGE-A3配体作为肿瘤特异性TPD的E3招募元件，还需要小分子配体不破坏MAGE-A3:TRIM28的相互作用，验证如下图。 利用TR-FRET试验，最终表明，基于MAGE-A3的配体或基于配体设计的PROTAC都不能与TRIM28竞争性结合MAGE-A3，不影响其相互作用。 4       总结与展望     当前的PROTACs设计和应用，依然依赖于VHL和CRBN，两者都是Cullin-E3复合物的E3连接酶衔接蛋白。然而，它们的广泛表达限制了其组织和疾病特异性降解。而且，高频过度的使用，也出现了耐药性问题。这主要归因于E3连接酶机制的突变，而不是靶蛋白，因此，发现更多E3连接酶配体将势在必行。 而compartment-特异性降解在这个形势下将具有远大的前景。PROTACs开发的下一步逻辑必将是在特定组织或疾病状态中，利用E连接酶靶向降解。 然而，针对E3连接酶底物结合位点可能需要占据较浅的口袋或内源性蛋白质底物的竞争，这两种情况都为E3连接酶结合带来挑战。幸运的是DEL技术为此提供了一种快速高效的组合方法。DEL技术已经成功发现多种E3连接酶伙伴配体，如DCAF1、GID4、MAGE-A3等，助力PROTACs开发。 整合DEL筛选数据、与机器学习（ML）强大能力，可以增强可扩展性、结构多样性、总体命中率、效力和类药性。 本文中KL465对靶标适度降解，可能有以下几个因素： 在组织培养中观察到的MAGE-A3半衰期短，重合成速度快，这限制了观察到的最大降解； 开发PROTACs使用的配体仅表现出中等结合亲和力，减少了低效三元复合物的形成； PROTACs的连接子还没有进一步探索优化。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

侃言 靶向蛋白降解（TPD），最为人所熟知的是基于泛素-蛋白酶体系统的技术，如靶向嵌合体的蛋白水解(PROTACs)、和分子胶降解剂；此外，最近也出现了一种基于溶酶体系统的技术，如通过去唾液酸糖蛋白受体的细胞外蛋白分子降解(MoDE-As)、和通过靶向嵌合体的巨噬降解(MADTACs)。 这些技术为长期抑制病理相关的蛋白提供了一种革新的靶向降解策略。近日，北京师范大学化学学院郑积敏教授团队在iScience上发表重要综述，着重强调了分子胶在临床应用中的潜力，并对分子胶介导的TPD技术的发展提出指导意见。 1 分子胶：小分子药物新机会 当代药物两大主体：小分子药物、大分子生物制剂。小分子药物一般分子量较小，具有一些固有的优势： 潜在的口服生物利用度； 跨越生物屏障的能力； 易通过化学合成获得，并进行结构修饰 因此，小分子主导了现代药物市场，占全球销售额的90%之多。小分子药物可以通过占据靶标的活性结合位点而起到酶抑制剂和受体拮抗剂的作用。 小分子药物瓶颈、及新机会 然而，在人类基因组编码的药理学可利用度药物靶标中，仅有15%的靶标可被小分子药物靶向。其余的蛋白质靶标通常有浅而宽的活性位点，对小分子来说难以处理；或者，表面光滑，几乎没有可结合的位点；因此，它们常被认为是“不可成药”的蛋白质。这极大地限制了小分子药物的应用和开发。 峰回路转，分子胶的出现为小分子药物靶向不可药物蛋白质提供了新的治疗策略！ 分子胶是一种通过增强两种蛋白质之间的亲和力来发挥作用的小分子，从而诱导蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）；这一点区别于传统小分子药物仅靶向单一蛋白质。 这一概念并非凭空而来，分子胶的作用机制在自然界随处可见：蛋白质的翻译后修饰，包括甲基化、乙酰化、泛素化等也是通过蛋白质募集影响生物过程的分子胶。 分子胶相比于传统药物小分子，其可以靶向对小分子没有高亲和力活性结合位点的蛋白质，从而克服了传统小分子药物在靶标选择上的局限性，是许多“不可成药”蛋白质可以作为药物靶标。 分子胶分类 分子胶包括两大类：PPI稳定剂、邻近化学诱导剂（CIPs）。 PPI稳定剂是PPI调节器的一个子集，通过增强原生PPI的热力学稳定性来调节PPI网络，如下图a。 CIPs诱导非原生的PPI，利用生物系统中的邻近原理，如上图d。邻近诱导分子，如支架蛋白和共价修饰，非共价或部分共价参与分子识别，提高生物过程的特异性和速率。 因此，CIPs诱导的PPIs可能是无活性的，阻断了参与者的选择性内源性蛋白抑制活性。 分子胶独特的作用机制，在生物研究和药物开发中有着广阔的应用前景，促使各种分子胶介导的技术迅速发展，其中分子胶介导的靶向降解技术最为突出：通过分子胶，利用内源性蛋白质降解系统，即泛素-蛋白酶体系统（UPS)、和溶酶体系统（LYS)来消除与人类病理相关的蛋白质。 在真核细胞中，蛋白质通过蛋白酶体、或溶酶体途径消除。 蛋白酶体主要降解细胞内蛋白质，包括受损的、错误折叠的、和无功能的蛋白质；而溶酶体负责去除细胞外的、长寿的、膜上的蛋白质，以及不溶性蛋白质聚集体。 此外，溶酶体途径管理其它生物大分子和受损细胞器对的处置；蛋白酶体途径占哺乳动物细胞蛋白质降解的80-90%，在细胞功能调节和蛋白质稳定中起关键作用。 2 基于泛素-蛋白酶体系统 泛素-蛋白酶体系统（UPS)协调蛋白质清除，包括泛素、泛素活化酶（E1s）、泛素结合酶（E2s）、泛素连接酶（E3s)、和蛋白酶体。 泛素是一种含有76个氨基酸的蛋白质，其中有7个氨基酸残基为赖氨酸。在细胞蛋白降解系统中，参与泛素连接的赖氨酸残基K11、K48、K63可以作为降解标记。其中蛋白酶体统计的降解标记为K11和K48；溶酶体途径的降解标记为K63。如下图a。 如上图b，泛素化过程是一个三步酶级联过程，包括泛素激活、泛素结合、和泛素连接，涉及三种泛素酶。 而泛素转移的过程中，因E3的不同而有差别。E3连接酶可细分为4种类型：即HECT型、RING型、U-box型、和RBR型，其中以RING型E3连接酶为主。 如上图c，对于RING型和U-box型E3连接酶，泛素直接从E2转移到底物蛋白上；而对于HECT型、和RBR型E3连接酶，泛素首先分别转移到E3连接酶和RING2结构域上，催化半胱氨酸，然后转移到底物蛋白上。 PROTACs和分子胶的设计理念就是基于以上的一个基础。对于分子胶，通过其修饰E3连接酶的结合偏好，可以诱导E3连接酶和新底物之间的非原生PPI，从而可能对E3连接酶进行再协调，是病理相关蛋白泛素化。 靶向嵌合体蛋白水解（PROTACs） PROTACs是一种异双功能分子，如下图a，由一个E3招募配体、一个兴趣靶标（POI)的靶向弹头、以及一个连接子连接配体和弹头组成。 下图中b-d即为一个典型的PROTACs分子，及其招募E3并靶向BRD4靶标形成三元复合体的示意图。 鉴于PROTACs独特的作用机制，其相对于传统小分子药物有几大优势： PROTACs的催化特性使其在低浓度下就能发挥有效作用，避免了传统小分子药物因高化学计量而可能导致的副作用； PROTACs通过降解POI而实现抑制，需要新的蛋白质合成来恢复，比传统小分子药物具有更长期的有效性，而传统小分子药物的效果随着血浆浓度的降低而减弱； 如同分子胶，PROTACs在靶标选择上比传统小分子药物具有更大的自由度。在这一点上，PROTACs仅需要适当的表面暴露赖氨酸残基进行泛素化以及一个弹头结合口袋；而传统小分子药物依赖于高亲和力的活性结合位点。 基于以上优势，PROTACs可以靶向通常不可药物的蛋白质，如支架蛋白、转录因子等，只需要确定它们的配体。同时，对于传统小分子可药物化的靶标，也适用于使用小分子药物作为靶标靶向弹头组成PROTACs。 以下是PROTACs发展的三个阶段： 第一代：2001年2008年。 bio-PROTACs时代，没有已知的E3结合小分子，多肽作为E3配体。然而，以多肽作为E3配体，具有潜在的免疫原性、细胞渗透性差等是临床应用潜力比较有限。 第二代：2008年-至今。 小分子PROTACs时代，随着E3小分子配体的发现而出现，克服了bio-PROTACs的局限性。小分子PROTACs主要是利用4种已知的RING型E3连接酶配体进行POI泛素化，即MDM2、VHL、CRBN、VHL。其中，以VHL、CRBN使用频率最高（分别为60.1%、30.1%），cIAP频率约5.5%。 第三代：2019年-至今，如第二代并行。 第三代PROTACs主要是解决第二代PROTAC面临的脱组织效应，这也是现代基于抑制疗法持续存在的问题。为了实现更高的可控制性和组织选择性，避免脱组织效应，因此新一代PROTACs引入了光笼组、光切换连接子、以及酶反应笼组等控制组，以精准控制PROTACs的靶向降解活性。 此外，体外研究发现，在高PROTAC浓度下，E3-PROTACs-POI三元复合体可能出现“钩效应”，这涉及到由于同时形成E3-PROTAC和PROTAC-POI二元复合体而阻碍了E3-PROTAC-POI三元复合体的形成。 这种体外的现象导致PROTACs效率降低，然而，体内研究尚未发现“钩效应”。因此，在临床应用中，“钩效应”是否对PROTACs应用有不良的影响还待进一步的研究。 分子胶降解 在靶向降解剂领域里，分子胶降解剂是指一类表现出类似PROTACs的蛋白酶体降解活性的分子胶。如下图a所示，如同PROTACs，分子胶降解剂通过诱导E3连接酶与兴趣靶标（POI)之间的相互作用而发挥效力。 分子胶也是诱导PPI邻近，随后形成三元复合物，进而降解靶蛋白。 然而，与PROTACs相比，分子胶降解剂诱导PPI的方式不同，一个独立的分子胶降解剂可能只对E3连接酶或POI有亲和力。 也就是说，分子胶降解剂首先与它有亲和力的相应蛋白质结合，形成二元复合体；随后，二元复合体暴露在结合口袋外的部分与周围残基形成新的相互作用表面，并招募PPI的另一个蛋白质伙伴，再形成三元复合体。如上图的b-d。 如PROTACs不同，蛋白质表面性质在分子胶降解剂诱导的三元复合体形成的过程中起到重要作用。 分子胶降解剂与PROTACs催化作用机制相似，也能在低浓度下发挥作用，并实现对POI的长时间控制。然而，相比于PROTACs，分子胶具有更明显优势，由于分子量更小，因此在两个方面获得了更优的改善： 口服生物利用度改善 药代动力学特性改善 此外，分子胶还可以靶向对于传统小分子药物和PROTACs都具有挑战性的蛋白质：例如，PROTACs需要POI上有一个可配体结合的口袋，而分子胶可以适应在POI或E3连接酶表面的浅的疏水凹槽中，利用周围的氨基酸残基创建蛋白质招募表面。 分子胶仅需要POI或E3连接酶表面具有适当的赖氨酸残基，使得其潜在的可靶向药物靶标谱明显更加广泛。 然而，新的分子胶的降解剂的发现往往来自偶然或合理性的发现（如下图a)，合理性的设计非常具有挑战性，这是因为，分子胶的独特的作用机制、对PPI界面的了解有限、以及必要可配位点的缺乏等。 分子胶降解剂的偶然发现，通常是源于对已知的药物的研究，如免疫调节药物（上图b)。上图c中，芳基磺胺类分子胶的偶然发现，是基于对其抗肿瘤活性背后机制的探索发现。 鉴于分子胶的优势，各种合理性发现手段被拓展应用了起来，如高通量筛选、化学基于型筛选，如上图d-f。 虽然分子胶降解剂的合理性设计具有挑战性，但基于其MoA、SAR、以及蛋白质-分子胶降解剂相互作用的研究取得了重大进展，使其能够基于结构进行合理性优化，如上图g-h。 当前分子胶的临床应用主要集中在癌症的治疗上，非癌蛋白降解分子胶降解剂的开发还有待进一步的探索完成。 3 基于溶酶体系统 溶酶体是一种膜封闭的细胞器，含有60多种酸水解酶，包括脂肪酶、蛋白酶、和糖苷酶。 在真核细胞中，溶酶体主要用于降解生物大分子，如蛋白质、脂质、核酸、细胞外颗粒、和功能失调的细胞器。如下图，降解物质通过内吞作用、吞噬作用、和自噬作用被运送到溶酶体。 去唾液酸糖蛋白受体的 细胞外蛋白分子降解(MoDE-As) 针对细胞外的蛋白和膜蛋白，近些年来发展了两种基于生物制剂的技术：基于抗体的PROTACs（即AbTACs）、和溶酶体靶向嵌合体（即LYTACs）。为专门针对细胞外蛋白和膜蛋白设计的新策略。 AbTACs利用双特异性抗体模拟PROTACs的作用机制；LYTACs通过将细胞表面溶酶体靶向受体（LTRs）配体偶联到POI抗体上，劫持LTRs，进而诱导POI内化、溶酶体降解。 而在LYTACs的研究基础上，开发了基于去唾液酸糖蛋白受体的细胞外蛋白分子降解技术（MoDE-As），是一种分子胶的细胞外蛋白质降解技术。如下图。 靶向嵌合体的巨噬降解(MADTACs) 一类新的靶向溶酶体的分子胶，被称为靶向巨噬降解嵌合体（MADTACs），其利用巨噬降解细胞酶蛋白质的溶酶体。MADTACs包括两个亚型，靶向自噬嵌合体（AUTACs、和AUTOTACs）以及自噬体系化合物（ATTECs）。 AUTAC:如下图 AUTOTACs如下图： ATTECs如下图： 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1 (RIPK1，Receptor - interacting serine/ threonine- protein kinase 1) 作为协调细胞存活、炎症和免疫原性细胞死亡 (ICD，immunogenic cell death) 的关键应激哨兵发挥作用。尽管 RIPK1 的催化功能是触发细胞死亡所必需的，但其非催化支架功能可介导强的促生存信号传导。因此，癌细胞可以劫持 RIPK1 以阻止坏死性凋亡并逃避免疫检测。这里，开发了一种小分子蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC)，它可以选择性降解 RIPK1。PROTAC 介导的 RIPK1 耗竭会解除 TNFR1 和 TLR3/4 信号中枢的调节，从而增强 NF-κB、 MAPK和 IFN 信号传导。此外，RIPK1 降解同时促进 RIPK3 激活和坏死性凋亡诱导。RIPK1 降解通过使癌细胞对治疗诱导的 TNF 和干扰素敏感，增强了放射治疗和免疫治疗的免疫刺激作用。文章近期发表在《Immunity》杂志。 1. 背景介绍 细胞死亡和炎症是对抗感染和驱动抗肿瘤反应的先天免疫反应密切相关的部分。虽然感知危险的能力对于任何生物体维持组织功能都是不可或缺的，但不受控制或过度的炎症反应会损害组织并导致慢性炎症性疾病的发病，包括牛皮癣、神经退行性疾病、炎症性肠病和哮喘。 此外，肿瘤细胞经常通过抑制先天免疫反应来逃避免疫检测和消除。 细胞死亡不仅仅是一个终点；它促进垂死细胞与周围组织微环境之间的信息交换。重要的是，它会向受干扰的部位发出警报并招募免疫细胞。RIPK1是一种关键的应激哨兵，可以正向和负向调节细胞死亡、先天免疫和炎症。 RIPK1 位于许多细胞因子受体和模式识别受体 (PRR) 的下游，在确定促生存NF-κB 信号传导与细胞死亡之间的结果方面发挥着至关重要的作用。尽管 RIPK1 的催化功能是触发细胞死亡所必需的，但其非催化支架功能对于调节促炎症和促生存信号转导至关重要。因此，RIPK1 的受控激活有助于组织修复和免疫监视。然而，RIPK1 的过度激活可能导致许多自身免疫性疾病和炎症性疾病。因此，RIPK1 失调和随后的异常细胞死亡是慢性炎症性疾病的常见特征。因此，RIPK1 已成为一个有前途的治疗靶点。 尽管慢性RIPK1激活与炎症性疾病相关，数据表明癌细胞经常劫持 RIPK1，促进细胞存活、对肿瘤坏死因子(TNF) 不敏感以及对免疫治疗产生抵抗。这是因为 RIPK1 的支架功能驱动 NF-κB 信号传导和 NF-κB 依赖性促生存基因诱导。此外，慢性 RIPK1 介导的 NF-κB 信号传导可以促进免疫抑制趋化因子程序，导致浸润性自然杀伤 (NK) 和CD8 + T 细胞减少，减少局部 TNF 超家族配体和深度免疫检查点阻断 (ICB) 抵抗。此外，RIPK1 的支架功能可以亚致死性激活 caspase-8，进而水解并灭活RIPK3 、去泛素酶(CYLD) 和 RIPK1 本身，从而有效阻止坏死性凋亡。 因为 RIPK1 抑制 Toll 样受体 3/4 (TLR 3/4) 和ZBP1下游的坏死性凋亡信号传导,靶向 RIPK1 有潜力克服出现细胞凋亡抵抗，并引发更多免疫原性形式的细胞死亡。目前，大多数抗癌药物通过细胞凋亡杀死癌细胞，而细胞凋亡通常是免疫沉默的。坏死性凋亡是一种不依赖半胱天冬酶的细胞死亡裂解形式，可引发强烈的免疫反应。据认为，这种免疫原性源自死亡受体或 PRR 在细胞因坏死性凋亡而死亡时激活 NF-κB 和/或干扰素(IFN) 信号传导的能力。IFN 信号传导和 NF-κB 激活均驱动诱导性损伤相关分子模式 (iDAMP) 的产生，与组成型 DAMP 一起有效地向免疫系统发出危险警报，确保抗原呈递树突状细胞同时吸收死细胞来采样癌症表位并被激活以促进 CD8 + T 细胞交叉启动。因此，开发驱动坏死性凋亡的疗法可能受益于直接杀死肿瘤细胞和（重新）激活患者针对癌症的免疫系统。 尽管 RIPK1 已成为治疗靶点，但其与疾病相关的活性不能轻易地仅通过激酶抑制剂来实现。 因此，替代策略，例如使用可特异性靶向 RIPK1 支架功能的蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 降解剂，可能会更有效地治疗 RIPK1 驱动的疾病。为了改善 RIPK1 靶向性，本文研发生成了一系列双功能 PROTAC 分子。 2. RIPK1 PROTAC 实现 RIPK1 的选择性和有效降解 虽然RIPK1激酶抑制剂对小鼠非常有效，选择性 RIPK1 激酶抑制剂 PK68 和 GSK'963 仅部分抑制 RIPK1 诱导的人类细胞死亡，如它们不能有效地阻止 RIPK1 诱导的细胞凋亡，但可以有效地阻止坏死性凋亡（图 S1 A-C）。  为了改善 RIPK1 靶向，这里合成了一系列异双功能PROTAC分子 ，由 RIPK1 结合弹头、接头和 von Hippel-Lindau (VHL) E3连接酶配体组成（图 1A ）。 使用 PK68 作为 RIPK1 结合配体 ，它通过不同长度的接头与 VHL 配体融合。RIPK1-PROTAC 治疗显示，一组人类和小鼠细胞系以及原代细胞中 RIPK1 水平呈剂量依赖性下降（图 1 B-1E）。  R1-ICR-5 是最有效的 RIPK1 降解剂，在人和小鼠细胞中以纳摩尔浓度消耗 RIPK1。R1-ICR-5 引起的 RIPK1 降解是 VHL 介导的，即 R1-ICR-5S，它在脯氨酸4 位上具有反向立体化学，阻止了 VHL 结合，未能以类似的方式耗尽 RIPK1（图 1 F）。此外，PK68处理并不影响RIPK1蛋白水平。总之，这些数据表明 R1-ICR-5 触发 VHL 介导的 RIPK1 降解。 图1. 选择性 RIPK1-PROTAC 降解剂的开发 在有效的 RIPK1-PROTAC 浓度下，相关激酶的蛋白质水平没有明显变化，例如 RIPK2、 RIPK3 、BRAF 和TrkA， PK68 的潜在“脱靶”结合物（图 1G）。与 PK68 共同处理有效地竞争了 RIPK1 PROTAC，防止了 RIPK1 降解。R1-ICR-5 最早在处理后 2 小时就降解了 RIPK1，并在 6 小时时几乎完全降解（图 1G）。全蛋白质组分析表明，在骨髓源性巨噬细胞 (BMDM) 和 U937 中，只有 RIPK1 被 RIPK1-PROTAC 显著降解（图 1H ）。用 VHL 或蛋白酶体抑制剂处理证实了降解需要 VHL 结合和蛋白酶体蛋白水解（图 1G）。洗脱实验表明，RIPK1 的蛋白再合成率较低，需要 72 小时以上才能达到预处理水平（图 1I）。 尽管R1-ICR-5的亲脂性目前不利于动物的全身治疗，但局部施用R1-ICR-5即可有效耗尽体内的RIPK1。 3. RIPK1 降解剂解除先天免疫信号传导 接下来，评估了急剧消耗 RIPK1 是否会损害TNF或TLR3信号传导。出乎意料的是，R1-ICR-5 处理解除了 TNF 处理的原代 BMDM 和三阴性乳腺癌 EO771 细胞的转录反应，增强了 TNF 诱导的细胞因子表达（图 2A-C）。TNF 刺激基因中最值得注意的是Tnf 、 Il-6和A20。尽管 RIPK1 的急性缺失加剧了 TNF 诱导的 NF-κB 信号传导，但在静息 BMDM 中耗尽 RIPK1 会诱导Tnf 、 A20和Sod2的转录（图 2C）。R1-ICR-5 介导的TNF产生依赖于丝裂原激活蛋白激酶激活蛋白激酶2 (MK2) 介导的 TNF生物合成以及随后的自分泌 TNF 介导的信号传导（图 2D ）。 与 TNF 信号传导的失调相一致，我们注意到当 RIPK1 耗尽时，通过死亡结构域 (TRADD) 相关的TNF 受体1 向TNF 受体 1 (TNFR1) 的募集增强（图 2D），这可能是由于 TNF 受体 1 的竞争动态TRADD 和 RIPK1 之间的TNFR1结合。TRADD 募集增强伴随着TRADD、TNFR 相关因子 2 (TRAF2)、细胞凋亡蛋白抑制剂 1 (cIAP1) 和 HOIL-1 相互作用蛋白 1 （HOIP，即RNF31）的增强泛素化（图2E）。由于 TNFR1 信号复合物 I (complex-I) 成分的泛素化介导 NF-κB 激活，因此复合物 I 泛素化增强可能会导致 BMDM、L929、EO771 以及人 LIM1215 和 HT29 细胞中 TNF 信号传导失调（图 2F）。 图2. RIPK1 的快速降解会解除 TNFR1 和 TLR3 信号传导的调节。 RIPK1-PROTAC 治疗还解除了 TLR3 信号传导的调节，增强了 BMDM 和 EO771 中Il-6 、 Tnf 、 Ccl2 、 Cxcl9 、 Cxcl10和Ifnβ的诱导（图 2G）。此外，R1-ICR-5 处理并没有增强EO771 Ripk1- KO细胞中的先天免疫信号传导。这些数据表明，且 RIPK1 是微调 TNFR1 和 TLR3 信号传导激活所必需的，从而防止这些途径的过度激活。 4. RIPK1 PROTAC 促进 TNFR1 和 TLR3/4 介导的 RIPK3 激活 急剧降解 RIPK1 也会使细胞对细胞死亡敏感，同时增强 RIPK3 和MLKL(mixed lineage kinase domain-like pseudokinase) 的磷酸化和激活（图 3 A-C）。同样，急剧降解 RIPK1 也会增强 TLR3 和 TLR4 诱导的坏死性凋亡，这是由含有 TIR 结构域的接头蛋白诱导干扰素-β（TRIF，或 Ticam1）介导的，不依赖于 TNFR1 和ZBP1 （图 3 D-E）。TLR3/4 介导的坏死性凋亡部分需要干扰素 α 和β 受体1 (IFNAR1)，因为Ifnar1 -KO 抑制了这种死亡。因此，急剧降解 RIPK1 不仅会导致先天免疫信号通路（例如 TNFR1 和 TLR3）过度激活，还会引发不受阻碍的细胞死亡激活。 图3. RIPK1 降解剂驱动 TNFR1 驱动的坏死性凋亡，独立于 TRIF 和 ZBP1。 RIPK1 降解后 TNF 诱导的细胞死亡需要 TNFR1，而不是 TNFR2（图 3F）。TNF/R1-ICR-5 诱导的细胞死亡完全不依赖于 RIPK1，因为与多种 RIPK1 激酶抑制剂共同处理并不能阻止这种死亡（图 3G）。然而，当 RIPK1 存在时，这些 RIPK1 激酶抑制剂可有效阻断 TNF 诱导的细胞死亡，表明 RIPK1 的支架功能阻断 TNFR1 触发细胞死亡的能力。 降解 RIPK1 也会使细胞对自分泌产生的 TNF 敏感。因此，BMDM 对单独 RIPK1-PROTAC 处理敏感，并且通过Tnfr1基因删除或与 TNF 中和生物制剂Enbrel共同处理可防止这种效应（图 3H）。抑制 MK2 介导的 TNF 生物合成也抑制了 BMDM 中的 R1-ICR-5 杀伤作用。无活性对照化合物 R1-ICR-5S 或使用 RIPK2 靶向 PROTAC 接合 VHL 对细胞活力没有影响（图 3B 、3I 和 3J），表明 R1-ICR-5 的细胞毒性作用是特定于 RIPK1 耗竭并依赖于 TNFR1 通路的参与。 PROTAC 的细胞毒性与其降解 RIPK1 的能力相关，其中 R1-ICR-5 是最有效的。R1-ICR-5不仅杀死原代BMDM，还杀死小鼠真皮成纤维细胞和腹膜巨噬细胞，将这一观察扩展到其他细胞类型。单独的 PROTAC 治疗主要引起敏感细胞的坏死性凋亡（图 3 J-K），表明当 RIPK1 急剧降解时，TNFR1 信号传导可以通过未知机制触发 RIPK3 激活，这一观察结果已被注意到之前。 虽然 RIPK1-PROTAC 诱导的 RIPK3 激活发生在一系列细胞类型中，但对 RIPK1 急性降解的反应是细胞和组织类型依赖性的，因为有些细胞无法驱动 TNF 介导的自分泌RIPK1缺失时 RIPK3 激活。 5. TNF/RIPK1-PROTAC 诱导的 RIPK3 激活独立于 TRIF 和 ZBP1 TNF/RIPK1-PROTAC 诱导的 RIPK3 激活独立于 TRIF 和 ZBP1 接下来，评估了 TNF 如何驱动 RIPK3 激活。将 RIPK3 募集至 RIPK1、 TRIF或 ZBP1（Z-DNA 结合蛋白 1，又称为DAI 或 DLM-1）的 RIP 同型相互作用基序 (RHIM) 可以启动 RIPK3 激活和坏死性凋亡。为了评估 RIPK3 的 RHIM 的重要性，我们用野生型 (WT) RIPK3 或 RIPK3 的 RHIM 突变形式重建了 RIPK3 缺陷细胞。尽管 RIPK3WT在 RIPK1 缺失的情况下很容易重建 TNF 诱导的坏死性凋亡，但 RIPK3RHIMm却不能（图 3L），这表明 RIPK3 的 RHIM 在其激活过程中发挥着不可或缺的作用。 由于 TRIF 和ZBP1是唯一的其他含有 RHIM 的蛋白质，因此，研究了 TRIF 和/或ZBP1是否在 RIPK1 耗尽时介导 TNFR1 诱导的 RIPK3 激活。原代肺成纤维细胞 (LF) 中Trif和Zbp1的双重缺乏并不影响 R1-ICR-5 处理后 TNF 诱导的细胞死亡（图 3M-N），排除了这些含有 RHIM 的蛋白质的参与。 6. RIPK1 与 DD 结构域作用限制 TRADD 的纤维化 接下来，测试了复合物 I 成分在 RIPK3 激活中的参与情况。TRADD 的敲减完全保护细胞免受 PROTAC 或 RIPK1 基因耗尽时 TNF 诱导的坏死性凋亡（图 4A）。尽管在这些条件下，Spata2 和Cyld的敲减部分保护了细胞，但 TNFR1 下游没有其他信号成分的敲减或药物抑制抑制了 TNFR1 介导的 RIPK3 激活（图 4 B-C）。这表明 TRADD 在驱动 R1-ICR-5 介导的 RIPK3 激活中发挥关键作用。 图4. RIPK1 降解促进 TRADD 纤维化形成和 TRADD-RIPK3 相互作用 RIPK1 不仅抑制 TRADD 向 TNFR1 复合物-I 的募集，而且还阻止其与死亡诱导复合物-II 中的 RIPK3 结合（图 4D ）。RIPK3 向 TRADD 的募集增强与 RIPK3、MLKL 激活增强和细胞死亡相关（图 4 D-F）。 RIPK1 响应 TNF 抑制 TRADD 聚集和纤维化形成（图 4G），因为当 RIPK1 降解时，TNF 处理会导致 TRADD 聚集体出现时间依赖性积累。RNAi 消耗 RIPK1 同样会引起 TNF 介导的 TRADD 纤维化形成。 7. PROTAC 介导的 RIPK1 降解实现抗肿瘤活性 协调暴露于 iDAMP 和死细胞可以激活免疫细胞，驱动抗肿瘤免疫。由于 RIPK1 的消耗同时增强 NF-κB/IFN 信号传导和对坏死性凋亡的反应，作者探索了利用 PROTAC 介导的 RIPK1 降解来触发ICD和增强抗癌治疗的潜力。 R1-ICR-5 处理后，几种不同的癌细胞系能够驱动 TNFR1、TLR3 和 IFNR 介导的坏死性凋亡（图 5 A-C）。R1-ICR-5 处理还使癌细胞对 IFN 诱导的坏死性凋亡敏感（图5 C-D）。R1-ICR-5 处理后 TRADD 与 RIPK3 有效结合，导致 RIPK3 激活增加和坏死性凋亡（图5 E-G）。 图5 . RIPK1 保护癌细胞免受 TNF 和 IFN 诱导的细胞死亡 由于 PROTAC 介导的 RIPK1 降解使癌细胞对 TNF 和IFN敏感（图 5 A-5D），因此假设 R1-ICR-5 可能与产生富含 TNF 和 IFN 的肿瘤微环境的疗法（例如 RT 和 IFN）具有协同作用。 这里专注于 TNBC，其中 放疗 和 免疫阻断肿瘤 是标准护理治疗。放疗不仅刺激NF-κB和IFN驱动的信号传导反应，而且引起EO771和MC38细胞的坏死性凋亡，这种坏死性凋亡被Mlkl缺陷阻断，并被RIPK1-PROTAC处理增强（图5 I-J）。 总之，这表明 RIPK1 作为生存因子，抑制 放疗 介导的细胞死亡。放疗 诱导的坏死性凋亡部分由 TNF 介导，因为Enbrel或Tnfr1缺陷治疗抑制了治疗反应（图 5K-L）。总之，这些观察结果表明癌细胞可以劫持 RIPK1 来抑制细胞对 放疗 的反应。 接下来，测试了靶向 RIPK1 是否可以增强 放疗在体内“加热”肿瘤的能力。肿瘤形成后，进行三次瘤内注射 R1-ICR-5（图 6A ）。尽管放疗 和 R1-ICR-5 作为单一疗法的效果可以忽略不计，但放疗/R1-ICR-5 在 50% 的小鼠中实现了治疗反应。尽管 70 天后，十分之三的小鼠没有肿瘤，但一只小鼠在第 76 天时复发（图 6B -D）。结果表明，R1-ICR-5 可以通过增强活化的 TNF + IFNy +淋巴细胞向肿瘤微环境的募集来延长 放疗 治疗小鼠的存活时间，同时使 EO771 癌细胞容易受到 TNF/IFNy 诱导的细胞死亡的影响。 图6 . RIPK1 作为癌细胞对抗 RT 影响的保护因子 接下来，测试了 R1-ICR-5 是否增强 RT/ICB 组合，使用较低剂量的放疗 (4 Gy)，然后使用 CTLA-4单抗± R1-ICR-5 治疗（图 6J -N）。放疗/ CTLA-4单抗 与 R1-ICR-5 组合可强烈抑制肿瘤生长（图 6K-L），十分之九的荷瘤小鼠对治疗有反应，其中八只完全治愈（图 6M-N）。 图6 . RIPK1 作为癌细胞对抗 RT 影响的保护因子 此外，还确定了 R1-ICR-5 是否可以增强PD1单抗独治疗的抗肿瘤功效。尽管 R1-ICR-5 和PD-1单抗 ICB 作为单一药物都没有被证明有效，但该组合显著减缓了治疗肿瘤的生长动力学（图 7A -D）。联合治疗的小鼠受益于改善的反应率（60%反应）和总体存活率，且三分之一的治疗小鼠完全治愈（图7E ）。 图 7. RIPK1 PROTAC 增强对免疫检查点阻断的反应。 8. RIPK1 急性降解可抑制 RIPK1 驱动的皮肤炎症 先前的研究表明，异常的 RIPK1 介导的角质形成细胞死亡可导致皮肤病变。由于角质形成细胞对 RIPK3 的独立于 RIPK1 的激活有一定的抵抗力，因此，评估了 PROTAC 介导的体内RIPK1 降解是否可以抑制 RIPK1 诱导的皮肤炎症。单独皮下注射R1-ICR-3 或 R1-ICR-5 不会引起皮肤毒性，表明 RIPK1 的急性消耗具有良好的耐受性，并且不会引起皮肤中 RIPK3 的激活。 为了测试 RIPK1-PROTAC 的治疗效果，使用了两种皮肤炎症模型。结果表明 RIPK1-PROTAC 可以抑制 RIPK1 介导的炎症性皮肤病。与只能有效阻止人类细胞坏死性凋亡的 RIPK1 激酶抑制剂不同，RIPK1-PROTAC 可以有效抑制人类细胞系中 RIPK1 诱导的caspase激活和凋亡。而RIPK1 激酶抑制剂 PK68 和 GSK'963 在人类细胞中对此无效。因此，RIPK1-PROTACs 可能有效治疗由 RIPK1 诱导的细胞凋亡和/或坏死性凋亡驱动的人类病理，特别是在 RIPK1降解时固有地缺乏 RIPK3 激活的组织中。 参考：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.immuni.2024.04.025IF：25.5 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓