细胞培养工匠 | 浅谈无血清培养基的组成及作用

2024-06-10

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概述：在生物医药蓬勃发展的今天，离不开动物细胞培养基的升级换代，同时大家对培养基成份的了解也进一步加深。今天，在生产一线的小编就细胞培养基，给刚入职的细胞培养人员进行分享和总结，希望对大家的工作有所帮助。背景在动物细胞培养基开发和发展的60多年中，有两个里程碑式的事件： 1、1955年和1959年，Harry Eagle博士两次在《科学》杂志上发表细胞培养基配方研究文章，并指出培养基是“一个包含无机盐、氨基酸、糖、维生素及其它必须营养物的等渗透压且具有pH缓冲能力的混合物”，并在后一篇文章中进一步改进配方，并将该配方命名为Minimal Essential Medium，这就是至今仍被广泛使用的MEM培养基。为支持细胞生长，这款培养基含有10%以上的血清。这是动物细胞培养基发展史的第一个里程碑，Eagle的研究也奠定了近代无血清培养基开发的基础。 2、1997年，Gibco推出一款名称为CD CHO的化学成分确定培养基（Chemically Defined Medium，CDM），不含血清，不含水解物，不含蛋白，开创化学成分确定培养基开发的先河。此后，多个重磅炸弹药物如Rituxan、Herceptin、Remicade、Enbrel、Humira和Avastin等获批上市，这些靶向治疗药物的热销带动了化学成分确定培养基的个性化开发。无血清培养基的组成和作用 1 葡萄糖动物细胞培养基中添加的糖主要是葡萄糖，添加量通常在5-25mM之间。葡萄糖的主要代谢途径是通过糖酵解代谢成丙酮酸，进而降解成乳酸。这最终会导致乳酸在培养基中积累。代谢流研究分析发现，只有一小部分（约20-30%）的葡萄糖流向其它途径包括三羧酸循环和戊糖磷酸旁路。除了葡萄糖，研究发现，动物细胞也能利用谷氨酰胺作为主要的能量物质。谷氨酰胺的添加量常常高于其它氨基酸（2-4mM），也是很多细胞系生长需要的物质。在大多数情况下，谷氨酰胺和葡萄糖会分别被快速利用，在耗尽之前，会引起细胞生长抑制。 2 氨基酸细胞不同，所需的特定营养也不同，同理，它们所需的必需氨基酸（动物体内不能自身合成）也是不同的。一些非必需氨基酸通常也会加入到培养基中，这是因为有些细胞系自身不能产生相应的氨基酸，从而会限制细胞生长。培养基中氨基酸限制会降低细胞生长速率和/或最高细胞密度。其它非必需氨基酸细胞可以产生，但是不足以维持最优生长。一些氨基酸如谷氨酰胺在培养基中不稳定，因此需要单独加入以维持其在一个合适的浓度水平。支链氨基酸被很多细胞包括MDCK细胞、人成纤维细胞、小鼠骨髓瘤细胞和BHK细胞等消耗得特别快。研究发现，当杂交瘤细胞利用谷氨酰胺利用率很低的时候，支链氨基酸被氧化的更多。同样，谷氨酰胺的消耗降低，丝氨酸的消耗就会升高。一些细胞系对氨基酸限制比其它细胞要敏感，因此，在大规模培养基中，补料策略非常重要。例如，谷氨酰胺浓度低，BHK细胞就会消耗更多的其它氨基酸，尤其是必需氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸和非必需氨基酸如丝氨酸和谷氨酸盐。 3 盐为防止渗透压失衡，培养基的盐浓度需与渗透压匹配。培养基细胞生长标准渗透压是300mOsm/kg，这个渗透压适用于绝大多数细胞。值得注意的是，由于盐会改变培养基的渗透压，因此，向培养基中加盐的时候要特别小心。大多数细胞能承受的渗透压范围在270~330mOsm/kg。经常用的盐有Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO42-、PO43-和HCO3-。它们几乎出现在所有的基础培养基中。 4 微量元素培养基中添加了血清含有的无机微量元素，如Mn、Cu、Zn、Mo、Va、Se、Fe、Ca、Mg、Si、Ni和不常用的微量元素如Al、Ag、Ba、Br、Cd、Co、Cr、F、Ge、J、Rb和zr。这些微量元素激活酶的活性，也是大多数细胞生长所需的元素。无血清培养基中经常添加的元素是硒。硒的主要功能是抗氧化和促进细胞生长，硒以硒蛋白家族形式在动物细胞中发挥生理作用，目前已被确认的形式有11种，据研究，这些蛋白均参与抗氧化活动，如谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白酶。在某些情况下，特定微量元素的加入会降低对某种生长因子的需求。例如，在很多细胞如B淋巴细胞、MDCK和人二倍体成纤维细胞中，亚铁盐能够替代转铁蛋白。研究发现，钙参与细胞增殖活动，这对于很多过程如信号转导、细胞分裂和细胞黏附等过程很重要。钙调蛋白（一种钙激活蛋白）通过不同的浓度水平调节细胞分裂过程中的很多丝氨酸/苏氨酸激酶活性。钙浓度升高，对很多细胞如角质形成细胞和人二倍体成纤维细胞生长有利。降低培养基中的钙浓度，就会降低细胞间的黏附。在很多生产系统中，细胞结团是一个大问题，这会降低产量和细胞存活率。如降低培养基中的钙浓度，则可以避开这个问题的产生，而且这在很多搅拌培养系统中被证明十分有效。 5 维生素培养基中的维生素和荷尔蒙浓度相对较低，它们被作为辅助因子利用，不同细胞系对它们的营养需求存在很大不同。因此，这些辅助因子在不同的培养基中变化很大。维生素对细胞的限制表现在细胞生长和存活上，但不影响最高细胞密度。培养基中的维生素水平随细胞种类的不同而不同。基础培养基配方如为HeLa细胞和小鼠成纤维细胞而设计的BME培养基含有生物素、叶酸、尼可酰胺、泛酸盐、吡哆醛、核黄素和硫胺。无血清培养基配方越复杂，例如F12、DMEM、M199，它含有的维生素种类就越多。每种维生素的含量都是根据具体的细胞系靠经验添加。因此，每种培养基都需要根据不同的情况而设计。 6 缓冲盐在细胞培养过程中，HCO3-经常和二氧化碳环境（5-10%）配合使用作缓冲系统，这使得培养基的pH普遍维持在6.9-7.4，在培养箱或者摇瓶中，通过控制气体控制CO2，HCO3--CO2缓冲系统的缺点在于，离开CO2的环境，培养基迅速变为碱性。为防止这种情况发生，有机缓冲液Hepes（pH7.0）经常以~25mM的浓度加入培养基，这使得CO2的浓度可以降低至2%。 7 生长因子为促进细胞生长，经常在一些培养基中添加特定蛋白，在无血清或低血清的培养基中，这些蛋白能够为细胞生长提供基础物质。他们被称为“生长因子”。这类生长因子包括成纤维细胞生长因子（酸性FGF和碱性FGF）、类胰岛素生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）、神经生长因子（NGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）和转化生长因子（TGF：α和β）。这些生长因子在1-10ng/mL的范围内均有活性。表常见生长因子及其作用种类靶标细胞作用作用条件成纤维细胞生长因子FGF 中胚层细胞、神经外胚层细胞、脂肪细胞和卵巢粒层细胞多效生长因子，能控制很多类型的细胞进行增殖、迁移和分化酸性FGF（pI 5.6）常与肝素结合作用；碱性FGF（pI >9.0）需蛋白激酶C激活。表皮生长因子EGF 初生细胞、间叶细胞、表皮细胞和神经胶质细胞广泛的促细胞分裂剂活性与一种介导细胞信号传导的跨膜酪氨酸激酶的激活有关。它通常能够降低基因表达、改变离子流和有丝分裂过程。它与其他肽类生长因子如IGF-1和TGF能起协同增效作用。神经生长因子外周神经系统和中枢神经系统的各种细胞可以引导交感神经元和培养的PC12嗜铬细胞瘤的分化，并改善生存。通过激活酪氨酸激酶受体TrkA而发挥生理功能。转化生长因子TGF 单层细胞如上皮细胞、内皮细胞、干细胞和淋巴细胞调控细胞生长酸性环境或某种激活剂胰岛素和类胰岛素间叶细胞、脂肪细胞能促进能量和合成代谢，有效的促细胞分裂剂，能够与FGF、EGF和PDGF协同增效。需要适量的锌离子血小板衍生生长因子PDGF 成纤维细胞、平滑肌细胞和其他细胞促细胞分裂剂特定PDGF受体白细胞介素-6 PC12细胞、干细胞、杂交瘤细胞、B细胞调控免疫系统和造血系统可以与其它生长因子协同增效 8 脂类在细胞内，脂类有很多作用。它们是细胞膜、外部信号传感器的组件，也是能量代谢之源。血清本身含有脂类，但是基础培养基配方通常不含脂类。某些脂类作为添加剂添加到无血清培养基中，显示有促进细胞增殖的作用。通常，血清中的脂类有脂肪酸、磷脂、卵磷脂和胆固醇。磷脂不但是细胞膜的主要构成组件，在调节生长的信号传导途径中也起到非常重要的作用。在细胞外，磷脂对很多细胞系的生长起促进作用。在很多贴壁细胞如MDCK、小鼠上皮细胞和其它肾细胞中，磷脂酸和溶血磷脂酸能促进它们生长。在无血清培养基中，其它脂类如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇可以促进人二倍体成纤维细胞的生长。胆固醇对大多数细胞也有促进生长作用，也是某些细胞（如骨髓瘤细胞）生长的必需成分。其它一些特定的脂肪酸，如油酸和亚油酸，在杂交瘤细胞的无血清培养的传代中也能提高生长速度和产量。无血清培养基中添加剂的选择原则在开发新的无血清培养基时，想知道哪种添加剂对每个细胞系的重要性是一件非常困难的事情。与其利用传统的开发方法（如Ham和Sato），倒不如以相似细胞系的现有配方作为参考，或至少作为研究起点去开发新的配方。然而，对于给定的细胞系，生长因子的需求也是变化万千的，因此，这个方法不是总是有效的。可供选择的生长因子有很多，每种生长因子的作用效果取决于细胞系。下面列举一些基于细胞系的简短原则： A．上皮细胞：常用的生长因子有EGF、皮质甾类和视黄醇。细胞基质蛋白包括纤维粘连蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白也是有益的，能促进细胞粘附。 B．间充质细胞：生长因子包括酸性/碱性FGF（碱性比酸性更有效）、EGF（或TGFα）、IGF/胰岛素（IGF更有效）、PDGF（BB型更有效）和TGFβ（TGFβ在一些情况下起作用，但是对大多数细胞来说是生长抑制因子）。其它的添加剂包括铁转运蛋白、皮质甾类、细胞外基质蛋白如纤维粘连蛋白、微量元素。 C．转化细胞：通常来说，这些细胞对生长因子的要求比较低。常用的添加剂有IGF/胰岛素、转运蛋白、BSA/肽球蛋白、人转铁蛋白和微量元素。化学成分确定培养基应运而生为了提高无血清培养基的性能表现，各种血清或血浆的提取物开发出来。这些成分可能会替代促进细胞生长的全血清。尽管无血清培养基含有这些化学成分不确定的成分，但是它却降低了蛋白含量，这样就会减小批间差异。唯一的不足之处是不知道这些物质的确切化学成分。科恩分部分离法是用乙醇沉淀法逐步从血液中分离出血浆的方法。这个方法经常在从大规模的合并的人血液中分离血友病因子使用。科恩方法的4.1部分，也就是这个过程的副产物，显示出促进细胞生长的潜能，在培养基中可以代替全血清，促进了MDCK细胞的生长。这些物质的替代物可以购买到商业产品，在细胞培养中用来设计成无血清培养基。这些培养基通常通过特定的细胞系来检验，并与血清培养基的促进生长能力进行比较。随后，另一种替代物也被开发出来了，即蛋白水解物。它们可以从动物组织、牛奶或植物如大豆、小麦或大米中提取，最终的产物是维生素、脂类、矿物质和双/三肽，从而为细胞生长提供了丰富的基础氨基酸来源。蛋白水解物虽然能完全替代血清，但是它常被用作基础培养基的添加剂，能够培养的经典细胞系有CHO、杂交瘤、BHK、Vero和淋巴细胞等。利用蛋白水解物替代血清的优势有： A．排除了蛋白纯化过程中多余蛋白的干扰。 B．由于血清带入的荷尔蒙不再存在。 C．培养基成本大幅度降低。 D．利用植物来源的蛋白水解物可以降低细胞培养过程中由动物来源的蛋白水解物带入的污染的风险。尽管含有水解物的无血清培养基有很大优势，但是批间差依然存在。而且，在用到细胞培养基的生物工艺中，动物来源的水解物依旧存在带入污染物的风险如病毒或朊病毒。因此，为安全起见，这也限制了其在人用药物的大规模生产的应用，于是，适合大规模生产的化学成分确定培养基应运而生。相比于前述的无血清培养基，化学成分确定培养基成分完全已知，不含蛋白，不含水解物，经过特殊设计和优化，可支持并最大限度提高悬浮培养物中细胞系的生长和蛋白质表达，提高生产批次间的一致性和稳定性，不含动物来源成分，使引入外援物的可能性降至最低，便于通过法规审查，这为多个重磅炸弹药物的批量生产和上市提供了可靠的保障。这也奠定了未来无血清培养基的发展基础和方向。展望过去的半个多世纪，是无血清培养基快速发展、持续更新的世纪，无数科学家、企业家在此深度耕耘，勤勉不辍，通过开发培养基尤其是化学成分确定的培养基，降低了生物制药的成本，减少了工艺过程的外在风险，甚至可以优化生物仿制药的质量，改善抗体的电荷异构体和糖型，从而加速了生物仿制药的开发和上市。化学成分确定培养基已经是生物制药的必然趋势，无论是产品线日臻成熟的跨国企业如cytiva、赛默飞、Merck等，还是奋起直追的国内后起之秀如天信和生物、迈邦生物、兰州健顺、倍谙基等，无不在无血清培养基方面做了战略规划和技术创新，有的同时进行了产业链的布署和整合。相信在不久的将来，化学成分确定培养基会发展的越来越成熟，更多中国造培养基企业将逐渐建立并完善规范的行业标准，以更好的促进生物制药行业的发展。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。