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概述:在生物医药蓬勃发展的今天,离不开动物细胞培养基的升级换代,同时大家对培养基成份的了解也进一步加深。今天,在生产一线的小编就细胞培养基,给刚入职的细胞培养人员进行分享和总结,希望对大家的工作有所帮助。
背景
在动物细胞培养基开发和发展的60多年中,有两个里程碑式的事件:
1、1955年和1959年,Harry Eagle博士两次在《科学》杂志上发表细胞培养基配方研究文章,并指出培养基是“一个包含无机盐、氨基酸、糖、维生素及其它必须营养物的等渗透压且具有pH缓冲能力的混合物”,并在后一篇文章中进一步改进配方,并将该配方命名为Minimal Essential Medium,这就是至今仍被广泛使用的MEM培养基。为支持细胞生长,这款培养基含有10%以上的血清。这是动物细胞培养基发展史的第一个里程碑,Eagle的研究也奠定了近代无血清培养基开发的基础。
2、1997年,Gibco推出一款名称为CD CHO的化学成分确定培养基(Chemically Defined Medium,CDM),不含血清,不含水解物,不含蛋白,开创化学成分确定培养基开发的先河。此后,多个重磅炸弹药物如Rituxan、Herceptin、Remicade、Enbrel、Humira和Avastin等获批上市,这些靶向治疗药物的热销带动了化学成分确定培养基的个性化开发。
无血清培养基的组成和作用
1
葡萄糖
动物细胞培养基中添加的糖主要是葡萄糖,添加量通常在5-25mM之间。葡萄糖的主要代谢途径是通过糖酵解代谢成丙酮酸,进而降解成乳酸。这最终会导致乳酸在培养基中积累。代谢流研究分析发现,只有一小部分(约20-30%)的葡萄糖流向其它途径包括三羧酸循环和戊糖磷酸旁路。
除了葡萄糖,研究发现,动物细胞也能利用谷氨酰胺作为主要的能量物质。谷氨酰胺的添加量常常高于其它氨基酸(2-4mM),也是很多细胞系生长需要的物质。在大多数情况下,谷氨酰胺和葡萄糖会分别被快速利用,在耗尽之前,会引起细胞生长抑制。
2
氨基酸
细胞不同,所需的特定营养也不同,同理,它们所需的必需氨基酸(动物体内不能自身合成)也是不同的。一些非必需氨基酸通常也会加入到培养基中,这是因为有些细胞系自身不能产生相应的氨基酸,从而会限制细胞生长。培养基中氨基酸限制会降低细胞生长速率和/或最高细胞密度。其它非必需氨基酸细胞可以产生,但是不足以维持最优生长。一些氨基酸如谷氨酰胺在培养基中不稳定,因此需要单独加入以维持其在一个合适的浓度水平。
支链氨基酸被很多细胞包括MDCK细胞、人成纤维细胞、小鼠骨髓瘤细胞和BHK细胞等消耗得特别快。研究发现,当杂交瘤细胞利用谷氨酰胺利用率很低的时候,支链氨基酸被氧化的更多。同样,谷氨酰胺的消耗降低,丝氨酸的消耗就会升高。
一些细胞系对氨基酸限制比其它细胞要敏感,因此,在大规模培养基中,补料策略非常重要。例如,谷氨酰胺浓度低,BHK细胞就会消耗更多的其它氨基酸,尤其是必需氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸和非必需氨基酸如丝氨酸和谷氨酸盐。
3
盐
为防止渗透压失衡,培养基的盐浓度需与渗透压匹配。培养基细胞生长标准渗透压是300mOsm/kg,这个渗透压适用于绝大多数细胞。值得注意的是,由于盐会改变培养基的渗透压,因此,向培养基中加盐的时候要特别小心。大多数细胞能承受的渗透压范围在270~330mOsm/kg。
经常用的盐有Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO42-、PO43-和HCO3-。它们几乎出现在所有的基础培养基中。
4
微量元素
培养基中添加了血清含有的无机微量元素,如Mn、Cu、Zn、Mo、Va、Se、Fe、Ca、Mg、Si、Ni和不常用的微量元素如Al、Ag、Ba、Br、Cd、Co、Cr、F、Ge、J、Rb和zr。这些微量元素激活酶的活性,也是大多数细胞生长所需的元素。
无血清培养基中经常添加的元素是硒。硒的主要功能是抗氧化和促进细胞生长,硒以硒蛋白家族形式在动物细胞中发挥生理作用,目前已被确认的形式有11种,据研究,这些蛋白均参与抗氧化活动,如谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白酶。
在某些情况下,特定微量元素的加入会降低对某种生长因子的需求。例如,在很多细胞如B淋巴细胞、MDCK和人二倍体成纤维细胞中,亚铁盐能够替代转铁蛋白。
研究发现,钙参与细胞增殖活动,这对于很多过程如信号转导、细胞分裂和细胞黏附等过程很重要。钙调蛋白(一种钙激活蛋白)通过不同的浓度水平调节细胞分裂过程中的很多丝氨酸/苏氨酸激酶活性。钙浓度升高,对很多细胞如角质形成细胞和人二倍体成纤维细胞生长有利。降低培养基中的钙浓度,就会降低细胞间的黏附。在很多生产系统中,细胞结团是一个大问题,这会降低产量和细胞存活率。如降低培养基中的钙浓度,则可以避开这个问题的产生,而且这在很多搅拌培养系统中被证明十分有效。
5
维生素
培养基中的维生素和荷尔蒙浓度相对较低,它们被作为辅助因子利用,不同细胞系对它们的营养需求存在很大不同。因此,这些辅助因子在不同的培养基中变化很大。维生素对细胞的限制表现在细胞生长和存活上,但不影响最高细胞密度。
培养基中的维生素水平随细胞种类的不同而不同。基础培养基配方如为HeLa细胞和小鼠成纤维细胞而设计的BME培养基含有生物素、叶酸、尼可酰胺、泛酸盐、吡哆醛、核黄素和硫胺。无血清培养基配方越复杂,例如F12、DMEM、M199,它含有的维生素种类就越多。每种维生素的含量都是根据具体的细胞系靠经验添加。因此,每种培养基都需要根据不同的情况而设计。
6
缓冲盐
在细胞培养过程中,HCO3-经常和二氧化碳环境(5-10%)配合使用作缓冲系统,这使得培养基的pH普遍维持在6.9-7.4,在培养箱或者摇瓶中,通过控制气体控制CO2,HCO3--CO2缓冲系统的缺点在于,离开CO2的环境,培养基迅速变为碱性。为防止这种情况发生,有机缓冲液Hepes(pH7.0)经常以~25mM的浓度加入培养基,这使得CO2的浓度可以降低至2%。
7
生长因子
为促进细胞生长,经常在一些培养基中添加特定蛋白,在无血清或低血清的培养基中,这些蛋白能够为细胞生长提供基础物质。他们被称为“生长因子”。
这类生长因子包括成纤维细胞生长因子(酸性FGF和碱性FGF)、类胰岛素生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和转化生长因子(TGF:α和β)。这些生长因子在1-10ng/mL的范围内均有活性。
表 常见生长因子及其作用
种类
靶标细胞
作用
作用条件
成纤维细胞生长因子FGF
中胚层细胞、神经外胚层细胞、脂肪细胞和卵巢粒层细胞
多效生长因子,能控制很多类型的细胞进行增殖、迁移和分化
酸性FGF(pI 5.6)常与肝素结合作用;碱性FGF(pI >9.0)需蛋白激酶C激活。
表皮生长因子EGF
初生细胞、间叶细胞、表皮细胞和神经胶质细胞
广泛的促细胞分裂剂
活性与一种介导细胞信号传导的跨膜酪氨酸激酶的激活有关。它通常能够降低基因表达、改变离子流和有丝分裂过程。它与其他肽类生长因子如IGF-1和TGF能起协同增效作用。
神经生长因子
外周神经系统和中枢神经系统的各种细胞
可以引导交感神经元和培养的PC12嗜铬细胞瘤的分化,并改善生存。
通过激活酪氨酸激酶受体TrkA而发挥生理功能。
转化生长因子TGF
单层细胞如上皮细胞、内皮细胞、干细胞和淋巴细胞
调控细胞生长
酸性环境或某种激活剂
胰岛素和类胰岛素
间叶细胞、脂肪细胞
能促进能量和合成代谢,有效的促细胞分裂剂,能够与FGF、EGF和PDGF协同增效。
需要适量的锌离子
血小板衍生生长因子PDGF
成纤维细胞、平滑肌细胞和其他细胞
促细胞分裂剂
特定PDGF受体
白细胞介素-6
PC12细胞、干细胞、杂交瘤细胞、B细胞
调控免疫系统和造血系统
可以与其它生长因子协同增效
8
脂类
在细胞内,脂类有很多作用。它们是细胞膜、外部信号传感器的组件,也是能量代谢之源。血清本身含有脂类,但是基础培养基配方通常不含脂类。某些脂类作为添加剂添加到无血清培养基中,显示有促进细胞增殖的作用。
通常,血清中的脂类有脂肪酸、磷脂、卵磷脂和胆固醇。磷脂不但是细胞膜的主要构成组件,在调节生长的信号传导途径中也起到非常重要的作用。在细胞外,磷脂对很多细胞系的生长起促进作用。在很多贴壁细胞如MDCK、小鼠上皮细胞和其它肾细胞中,磷脂酸和溶血磷脂酸能促进它们生长。在无血清培养基中,其它脂类如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇可以促进人二倍体成纤维细胞的生长。胆固醇对大多数细胞也有促进生长作用,也是某些细胞(如骨髓瘤细胞)生长的必需成分。其它一些特定的脂肪酸,如油酸和亚油酸,在杂交瘤细胞的无血清培养的传代中也能提高生长速度和产量。
无血清培养基中添加剂的选择原则
在开发新的无血清培养基时,想知道哪种添加剂对每个细胞系的重要性是一件非常困难的事情。与其利用传统的开发方法(如Ham和Sato),倒不如以相似细胞系的现有配方作为参考,或至少作为研究起点去开发新的配方。然而,对于给定的细胞系,生长因子的需求也是变化万千的,因此,这个方法不是总是有效的。
可供选择的生长因子有很多,每种生长因子的作用效果取决于细胞系。下面列举一些基于细胞系的简短原则:
A.上皮细胞:常用的生长因子有EGF、皮质甾类和视黄醇。细胞基质蛋白包括纤维粘连蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白也是有益的,能促进细胞粘附。
B.间充质细胞:生长因子包括酸性/碱性FGF(碱性比酸性更有效)、EGF(或TGFα)、IGF/胰岛素(IGF更有效)、PDGF(BB型更有效)和TGFβ(TGFβ在一些情况下起作用,但是对大多数细胞来说是生长抑制因子)。其它的添加剂包括铁转运蛋白、皮质甾类、细胞外基质蛋白如纤维粘连蛋白、微量元素。
C.转化细胞:通常来说,这些细胞对生长因子的要求比较低。常用的添加剂有IGF/胰岛素、转运蛋白、BSA/肽球蛋白、人转铁蛋白和微量元素。
化学成分确定培养基应运而生
为了提高无血清培养基的性能表现,各种血清或血浆的提取物开发出来。这些成分可能会替代促进细胞生长的全血清。尽管无血清培养基含有这些化学成分不确定的成分,但是它却降低了蛋白含量,这样就会减小批间差异。唯一的不足之处是不知道这些物质的确切化学成分。
科恩分部分离法是用乙醇沉淀法逐步从血液中分离出血浆的方法。这个方法经常在从大规模的合并的人血液中分离血友病因子使用。科恩方法的4.1部分,也就是这个过程的副产物,显示出促进细胞生长的潜能,在培养基中可以代替全血清,促进了MDCK细胞的生长。这些物质的替代物可以购买到商业产品,在细胞培养中用来设计成无血清培养基。这些培养基通常通过特定的细胞系来检验,并与血清培养基的促进生长能力进行比较。
随后,另一种替代物也被开发出来了,即蛋白水解物。它们可以从动物组织、牛奶或植物如大豆、小麦或大米中提取,最终的产物是维生素、脂类、矿物质和双/三肽,从而为细胞生长提供了丰富的基础氨基酸来源。
蛋白水解物虽然能完全替代血清,但是它常被用作基础培养基的添加剂,能够培养的经典细胞系有CHO、杂交瘤、BHK、Vero和淋巴细胞等。
利用蛋白水解物替代血清的优势有:
A.排除了蛋白纯化过程中多余蛋白的干扰。
B.由于血清带入的荷尔蒙不再存在。
C.培养基成本大幅度降低。
D.利用植物来源的蛋白水解物可以降低细胞培养过程中由动物来源的蛋白水解物带入的污染的风险。
尽管含有水解物的无血清培养基有很大优势,但是批间差依然存在。而且,在用到细胞培养基的生物工艺中,动物来源的水解物依旧存在带入污染物的风险如病毒或朊病毒。因此,为安全起见,这也限制了其在人用药物的大规模生产的应用,于是,适合大规模生产的化学成分确定培养基应运而生。
相比于前述的无血清培养基,化学成分确定培养基成分完全已知,不含蛋白,不含水解物,经过特殊设计和优化,可支持并最大限度提高悬浮培养物中细胞系的生长和蛋白质表达,提高生产批次间的一致性和稳定性,不含动物来源成分,使引入外援物的可能性降至最低,便于通过法规审查,这为多个重磅炸弹药物的批量生产和上市提供了可靠的保障。这也奠定了未来无血清培养基的发展基础和方向。
展望
过去的半个多世纪,是无血清培养基快速发展、持续更新的世纪,无数科学家、企业家在此深度耕耘,勤勉不辍,通过开发培养基尤其是化学成分确定的培养基,降低了生物制药的成本,减少了工艺过程的外在风险,甚至可以优化生物仿制药的质量,改善抗体的电荷异构体和糖型,从而加速了生物仿制药的开发和上市。
化学成分确定培养基已经是生物制药的必然趋势,无论是产品线日臻成熟的跨国企业如cytiva、赛默飞、Merck等,还是奋起直追的国内后起之秀如天信和生物、迈邦生物、兰州健顺、倍谙基等,无不在无血清培养基方面做了战略规划和技术创新,有的同时进行了产业链的布署和整合。相信在不久的将来,化学成分确定培养基会发展的越来越成熟,更多中国造培养基企业将逐渐建立并完善规范的行业标准,以更好的促进生物制药行业的发展。
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以“共创偶联药物产业未来”为主题,一场主论坛,九场主题论坛,火热报名中!当上CEO,就相当于坐上了C位。企业走高,CEO首先接受鲜花和掌声。企业跌落,CEO就是“首席背锅侠”和“首席道歉官”。在泛商业领域,针对如此功能复杂、责任重大的岗位,一种分权合作模式诞生——联席CEO。联席CEO通常由公司创始人或资深高管共同担任,优势是双方可以默契合作、优势互补,在科技公司内倾向于表现为按照业务线或产品线进行职责分工。一项调查发现,在87家设有联席CEO的上市公司样本中,近60%的公司在实现股东价值方面表现出色,且联席CEO掌权期间年均股东回报为9.5%,明显高于各公司平均6.9%的相关指数。但并非所有人都认同这种领导方式。反对者认为,分享权力和决策职责过于复杂,难以奏效,包括黑莓公司在内的巨大商业失败就是联合CEO领导的灾难。医药领域尤其要求CEO成为“多面手”,在基础的管理、决策、融资能力之上,还要懂制药技术和宏观医药市场,且后两个条件门槛极高,需要长期的学习和经验积累,如果能多人资历互补,确实可能实现更高的效率。那么从现实案例来看,这种模式适合制药行业这方水土吗?或者,在更广泛的高管合作层面,能为我们带来哪些思考和启发?1Amylyx的双CEO模式Amylyx Pharmaceuticals就采取双CEO模式运作至今。2022年,Amylyx在制药业掀起一阵波澜——其肌萎缩侧索硬化症(ALS)药物Relyvrio先是进入在加拿大市场,而后成为首个获得FDA批准的可以减缓该疾病进展的治疗方法。此前,随着“冰桶挑战”的广泛传播,关注渐冻症药物开发的Amylyx在全球范围内的知名度不断上升,该活动为ALS协会募集了1.15亿美元的捐款,为Relyvrio的开发提供了资金支持。Relyvrio多次受到FDA审查、饱受争议时,Amylyx依然维持良好的对外形象。Relyvrio在上市的第一年就给华尔街留下了深刻的印象,并在2023年第二季度获得了9820万澳元的收入,远超预期。最近,Amylyx还收到了八位华尔街分析师给出的“高评级”——七位给予“买入”评级,另外一位分析师给予“增持”评级。分析师称,Amylyx的股票还具有相当大的上涨空间,目前交易价格低于16美元,预计将上升至40美元以上。Amylyx成功幕后,坐着两位CEO:乔什·科恩(Josh Cohen)和贾斯汀·克利(Justin Klee)。科恩和克利在布朗大学上学时相识。接受Pharma Voice的采访时,他们表示,即使Amylyx经历过一些举步维艰的时刻,但一直以来的联席CEO模式是成功的,这种模式“非常适合医药行业”。Amylyx的命运与核心管线Relyvrio的成败起伏息息相关。除了在该药物临床开发过程中遇到的挑战外,欧洲监管机构在去年10月拒绝批准这种药物,因为对药效与安全性提出质疑,并认为无法确立“效益与风险之间的积极平衡”。科恩和克利说,在这些坎坷的道路上,他们能够共同解决问题,并始终关注患者,这使Amylyx得以立足。以下是Pharma Voice对两位CEO的采访:Q:共同推出Amylyx公司是一种怎样的体验? 克利:其他公司创业的故事里,往往会写到创业伊始就有一个宏伟愿景,创始人对一切都看得很清楚,知道他们要去哪里。但在我和科恩的经历中,我们起初根本不知道自己在做什么。这也是一个优势——我们愿意承认我们的迷茫,并积极向别人请教,学习如何将一个概念转化为候选药物,然后围绕它建立一家公司。我们一边摸索一边前进。Q:你们最初就计划采取联席CEO模式吗?还是看到其他公司的这种模式,受到了启发?科恩:我们没有计划如此,但比起一位CEO全权决策的模式来说,综合决策模式比人们以为的更多。CEO可能是一个孤独的岗位,但许多公司的CEO都会选择与CFO、CEO这类高管伙伴坦诚对话并做出决策。当我们与其他Biotech交流时,我们发现这种动态决策方案并不少见。只是在Amylyx,这种情况更加明显。Q:如何让这种模式发挥作用?科恩:一切都归结于沟通。在这一点上,我们几乎总是默契的。如果领导者向公司传达的是两个不同的声音,这个模式可能就不太管用了。克利:从一开始,我们就有了一致的、共同的愿景和价值观,这一点非常重要。在决策方面,我们力求简单,坚持单一因素至上原则——只考虑我们要帮助的ALS患者及其家人,所有决策从不偏离这一点,这是我们始终如一的主线。Q:你们如何分工?科恩:我们并没有严格划分谁做与谁不做的事情。当然,有些事情会有侧重。但大多都是,我们会根据每周或每天要完成的任务进行划分。这更像是一个日复一日、周复一周的决定。克利:科恩和我都认为——我们是一个整体,希望“一加一等于三”。这就是我们处理事情的方式,而不是各自按功能划分领地。Q:当你们意见相左时,要怎么办?克利:99.9%的情况下,科恩和我得出的结论是一样的。极少数情况下,会得出不同的结论,我们会退后一步进行讨论和辩论。这可能意味着这不是一个明确的决定,也许是一个人看到了另一个人所没有看到的东西。最终,充分辩论之后,才会做出更优的决策。科恩:这时,联合CEO模式是最强大的。在数据不明确或观点不一致的时候......正确的做法是去获取更多数据......因为可能是数据并没有显现出清晰的方向。我们从未遇到过陷入僵局的情况。我们有着共同的使命——这也是因为我们的性格。Q:为什么认为联合CEO模式在制药行业特别有效?克利:药物开发真的很艰难,需要很多不同类型的专业知识,而且是一个漫长的过程,你总会面临各种各样的挑战。科恩和我都认为,在成果周期长、运作复杂的行业中团队合作更加重要。在某些行业,你可能能够在12到18个月内就建立起商业模式。但制药业不行,我们花了10年时间才获得第一个药物上市批准,这已经很快了。对我们来说,联席CEO模式和组织模式非常适合我们的行业,正是因为医药行业非常复杂,需要很多方面的专业知识。在做出重要决策时,参与讨论的人越多,公司就越有可能变得更强大。科恩:我也有同感。在制药业,公司最大的竞争优势是团队合作,而不仅仅是优秀的技术。这是关于那些能很好地协同工作、共同进步的人。联席CEO模式意味着高层有团队精神,而这种精神会贯穿公司上下。当制药公司进展不顺利时,往往是因为皇帝没有穿衣服,人们各自为政,不说实话,没能提出问题,当你有一个涉及监管、临床、生产等方面的复杂产品时,很容易出现这种情况,要让团队每个人都坦诚合作是很难的。Q:联合CEO模式在公司遇到危机时表现如何?克利:有一个例子。此前我们曾信誓旦旦地说要带着NDA接受函上市,但咨询委员会质疑我们的治疗是否应该获得批准。我们在IPO时筹集的资金是以商业化为前提的,突然之间这就变得非常不确定了。但我们有一支出色而充满激情的外勤团队和商业运营团队。幸运的是,我们又有了第二位副总经理......最后药物也获得了批准。 在这段不确定时期,组织很容易迷失方向。我们没有达到里程碑。华尔街不悦,股票下跌。不过我们感到非常自豪的是,我们的团队始终专注于使命。我们回到了我们能够控制的事情上——为ALS社区做正确的事情。虽然这对我们来说很困难,但对他们和他们的家人来说要困难1000 倍。回到初心,关注他们的需求,并为后续做好准备。也许这在一定程度上是因为联席CEO模式起了作用。这又回到了团队合作的问题上,希望联席CEO模式能展示出我们是如何从高层开始密切合作的。Q:如果你们都从Amylyx辞职,会建议公司继续采用联席CEO的模式吗?科恩:这很难强求,也很难......为此去寻找合适的高管。它更多地是通过联合创始人自然形成的。我认为这是一个很好的模式,但很难在公司生命周期的后期建立。克利:我和科恩都打算一直在这里,直到我们做到了治愈这些疾病。我们想在几年内做到这一点,但可能需要更多时间。2什么情况下,1+1>2?在恰当的环境下,联席CEO能发挥很多作用。他们能够带来多样的能力、背景和专业视野,可以如同一个人的多个分身,也可以结成左脑和右脑般的完美伙伴关系。同时,双CEO模式还能让领导者保持清醒。曾在私募股权公司华平(Warburg Pincus)担任联席CEO长达17年、现独自担任CEO的奇普·凯(Chip Kaye)说,分享权力能帮助领导者“抑制自负”。事实上,建立像科恩和克利那样默契的伙伴关系并不容易。有调查总结,联席CEO模式成功到达关键要素,包含愿意参与、互补的技能、明确责任和决策权、冲突解决机制、展现团结、完全分担与平衡、董事会支持、共同的价值观,以及提前预想好退场机制等。当然,并非总是需要严格满足这些条件,上文中Amylyx就形成了更适合自己体质的双CEO模式。在中国,例如复星国际、先声药业、华深智药等中大型药企,也由于种种原因采取这种模式。但有业内人士透露,仅靠制度很难实现一加一大于二的效果,“责任板块过于明确时,CEO有时会更在意个人指标,而非集体利益”,“当(CEO间)竞争局面形成,隔阂还会进一步扩大”,“CEO有时也会只把自己当作权利更大的部门主管”。参考文献:1.‘1 plus 1 equals 3’ — the co-CEO model in pharma;PharmaVoice更多优质内容,欢迎关注↓↓↓
或许,在埃尔利希(Ehrlich)提出“魔法子弹”那一刻,他怎么也想不到,这个杀死肿瘤的“特洛伊木马”投入战场需要近一个世纪。顾名思义,抗体偶联药物(ADC)的名字,已经解释了它的三个重要组成部分——抗体、毒素、连接子。很长一段时间内,这些不同支线都在或慢或快地推进,失败、止步不前、一筹莫展是常有之事。不过,科学家习惯失败,更懂如何从失败中修正与重建。ADC的组成部分纵使ADC的“碎片”在时间上相距遥远,待到时机成熟,在制药产业的整合下,它们最终汇聚为一体。无论是首个上市的Mylotarg,还是开启靶向化疗时代的Kadcyla,抑或是实现对Kadcyla全面超越的新标杆Enhertu,在它们身上,都凝结了百年的积累。一定程度上,正是这些以Enhertu为代表的闪亮之星,持续推高业界对ADC的期待。今年以来,涉及ADC的并购、合作比比皆是。最近一次大事件,来自默沙东总计高达220亿美元的加码,从第一三共引进3款在研ADC。根据GlobalData的估算,到2029年,ADC在全球肿瘤治疗中的市场价值预计将超过360亿美元,而第一三共将稳坐第一把交椅——没错,又是这家日本药企。凭借Enhertu,第一三共成功将自己塑造为“ADC开拓者”,吸引默沙东、阿斯利康等跨国巨头青睐。深受专利悬崖困扰的MNC,迫切地挤上快车,开启下一阶段狂飙突进。但想推出下一款“Enhertu”,光是砸钱联姻还远远不够。Enhertu的诞生,称得上是漫长的横跨多个领域的共同努力。在一篇博客中,作者Alex Telford梳理了Enhertu一个世纪以来的创新链发展。谁能料想到,40多年前,日本酸奶饮料公司养乐多的一项发现,会为若干年后Enhertu的诞生做出巨大贡献?这也是当我们讲Enhertu的创新,或者尝试捕捉谁会成为下一个时代的“弄潮儿”时,却又不能只讲ADC的原因所在。促成Enhertu诞生的创新链(相关事件标注说明:圆圈代表学术界。三角形代表政府。正方形代表私营部门;最左侧浅绿色部分,代表与化学有效载荷相关的事件。左起第二位蓝绿色部分,代表与ADC和连接子相关的事件。左起第三位蓝色部分,代表与抗体相关的事件。最右侧紫色部分,代表与靶点相关的事件。)11890-1949:从零开始的抗体 故事的最开始要从抗体讲起。1890年,贝林(Behring)和北里柴三郎,共同发表了一篇关于动物白喉免疫和破伤风免疫的论文。他们发现,消毒过的白喉或破伤风杆菌能使动物产生“抗毒素”,而当这种经免疫的动物血清转移到其他染病动物上时,可以提供被动保护。这就是应用至今的血清疗法的由来,所谓的“抗毒素”即是今天我们熟知的抗体。1900年,被誉为“现代免疫学之父”的埃尔利希提出了“侧链学说”,抗体分子模型首次被提出。贝林和北里柴三郎所发论文1911年,劳斯(Rous)报告了一些奇怪的现象:他将雌鸡的肉瘤标本磨碎过滤,并注射到同一品种母鸡身上,发现后者都产生了肿瘤。随后,劳斯又将肿瘤标本粉碎,向鸡注射无细胞滤液,也观察到肉瘤的产生。劳斯认为,癌症可以通过比细胞还小的单位传播——现在我们知道,他当时发现的是一种逆转录病毒,为纪念此事,将其命名为“劳氏肉瘤病毒”。在劳斯的试验两年后,埃尔利希提出魔法子弹的概念。正如孟德尔的豌豆故事一般,埃尔利希向肿瘤发动特洛伊战争的想法落地,也跨越了近90年。很长一段时间内,这都是作为支线剧情推进。1929年,海德堡(Heidelberger)在一项定量试验中发现,抗原能被抗体沉淀,他判断抗体是一种蛋白质。接下来,马拉克(Marrack)对这一发现做了更详尽的研究,并提出抗原-抗体结合学说,从理论上解释了血清反应现象。到1935年,菲利普(Phillips)等人从淋巴结中分离出抗体,这时,抗体的来源和作用机制已经搞明白很多了。抗体的重大突破密集发生于20世纪40年代。彼时,正值第二次世界大战,无数士兵在战场上因失血过多而死。科恩(Cohn)临危受命,推动开发一种血液分离工艺,分离而出的血清白蛋白挽救无数生命。科恩科恩的哈佛大学合作者奥克利(Oakley)受到启发,在科恩的研究基础上,奥克利改进了提取和提纯抗体的工艺。也在那时,学术界首次报道了免疫组化(IHC),即利用抗体特异性结合,使特定的结构或蛋白质可视化,以帮助诊断。这项论文发表于1941年。在4年后,从30年代开始的对抗体“原产地”的争议也终有了确定的结论。通过分离血浆,哈里斯(Harris)发现抗体浓度在淋巴细胞中最高,他认为,抗体是由淋巴细胞产生的。1946年,贝林与北里柴三郎的血清疗法也迎来新实践。斯威特(Sweet)、豪厄尔(Howell)等人在一项临床试验中,为早产儿注射人源免疫血清球蛋白,以观察抗体的输注能否保护婴儿免受感染和死亡。但他们并未发现免疫血清球蛋白对总死亡率有影响。21950-1980:深入理解癌症20世纪50年代,化学突飞猛进,首次实现细胞毒性剂与抗体的连接。1985年,科学家将甲氨嘌呤与抗白血病抗体结合后,在地鼠白血病模型中测试其疗效。同年,喜树的树皮和茎提取物被发现有抗肿瘤活性。从这里,我们似乎能看到Enhertu的故事,初显苗头。此间,生物化学迅猛发展,到了60年代,已经发展成熟到有化学健合、偶联等多种方法联系生物分子。这些方法,最终串起了包含不同DAR值和不同payload的ADC设计。在1966年,高斯(Ghose)等人将放射性同位素与抗肿瘤抗体相连,并在小鼠模型中进行测试。这是首个关于放射性免疫偶联药物的报告,为早期开发ADC提供了原理证明。另一方,沃尔(Wall)在加入非营利组织后,重新审视喜树碱,并成功将其分离而出。前人经验证实,喜树碱提取物具有抗癌效果,沃尔随后合成喜树碱的钠盐,以提高溶解度,使其顺利进入临床试验。上世纪60年代末,埃德尔曼(Edelman)开发了一种蛋白质测序的方法,并借此成功测定出首个lgG抗体的全序列。而70年代,注定也是值得载入史册。仅在1970年一年,就能看到可观数量的科学新发现:在这一年,喜树碱钠完成了在黑色素瘤和胃肠道癌症中的检测试验,但由于疗效一般且严重副作用,它的开发陷入停滞;另外,科学家们成功分离了单克隆抗体,还发现了癌基因的存在。劳斯与“病鸡”的故事还没完。马丁(Martin)观察到劳氏肉瘤病毒在鸡内可以正常复制,不会导致癌症。在试验中,他成功将非转化株与转化株分离,此举证明了病毒中的致癌因子是遗传性的,也就是所谓的“致癌基因”。1970年,特明(Temin)与其合作者发现逆转录酶,确认了遗传信息能从RNA回到DNA。站在巨人的肩膀上,毕晓普(Bishop)和瓦尔姆斯(Varmus)在1976年将这件“鸡、肿瘤、病毒”的故事推上高潮——他们发现,劳氏肉瘤病毒癌基因广泛存在于鸡之外多种生物的染色体上,表明“致癌基因”并不是纯粹的病毒现象,“原癌基因”的失调有可能导致癌症,而无论病毒是否参与。毕晓普和瓦尔姆斯因为相关发现获得诺贝尔奖在此后几年间,科学家又相继在大肠杆菌、哺乳动物中发现了DNA拓扑异构酶。这是一种解缠机器,释放DNA因为盘绕过度导致的张力,便于复制。1972年,在一篇名为《抗体作为苯丁酸氮芥载体》的论文中,首次报道了化学连接的ADC。此后,到1975年,杂交瘤技术发展起来,使得生产单克隆抗体的生产具有更高的同质性和靶向准确性,并且可以大规模生产,堪称是该领域的重大飞跃。进入70年代的末期,科学家发现了表皮生长因子受体(EGFR),也收集到癌症中组织蛋白酶过度表达的证据。31980-1990:探索化疗药物20世纪80年代,是一段特殊的时期。当列侬在1980年的冬天身中4枪死去,嬉皮士迎来了衰败的终局;然而喇叭裤、爆炸头,这些迪斯科的风潮带的烂漫气息,还在继续向世界传播——自由、开放、野蛮生长,这是独属80年的性格印象。制药业也是如此。很多人都知道“养乐多”乳酸菌,却不知道这家公司也从事制药——喜树碱衍生物伊立替康,就是由养乐多科学家首次在日本发现并合成。在70年代发现DNA拓扑异构酶后,科学家们开展了广泛的研究,但因为临床应用中体现出的毒性和低稳定性,研究举步维艰。直到1985年,科学家确定喜树碱是通过抑制DNA拓扑异构酶I的机理来抗癌,喜树碱才重新挥别先前的阴影,再度唤起人们兴趣。彼时,研究人员相信,喜树碱衍生物,将会成为化疗药物的重要补充。作为首个拓扑异构酶I抑制剂,伊立替康于1994年顺利在日获批宫颈癌、肺癌和卵巢癌等适应症,而后又陆续在欧美获批上市。二十多年以来,伊立替康为全球实体瘤治疗做出巨大贡献。开普拓(盐酸伊立替康注射液)开发与商业化伊立替康的过程,都是由养乐多和第一制药合作而成。而后者,正是第一三共的前身之一:2005年,日本三共制药与第一制药合并,当下叫做第一三共的药企由此登上历史舞台。1987年,第一制药在一份研究报告中指出,伊立替康是一系列喜树碱衍生物中毒性最小、最有效的衍生物。而在8年后,第一制药合成的依喜替康,取代了伊立替康最佳喜树碱衍生物的称呼——与伊立替康不同,依喜替康不需要代谢活化。不过,依喜替康的欢喜只是暂时。2003年,在一个联合依喜替康与吉西他滨,对比吉西他滨单药治疗未经治疗的晚期胰腺癌的III期研究中,联用组合并没有表现出更优的OS数据。此后,第一制药停止继续开发依喜替康。让我们再折回到80年代,ADC主线也有了一些进展。1983年,ADC开展了首个人体临床试验。研究人员在8位晚期转移癌患者中,研究了长春地辛-抗CEA偶联药物的安全性及放射性标记后的定位能力。其中,有5例患者能检测到偶联物的定位,且未引起明显毒性/过敏反应。不过,研究人员也倒没发现有明确的疗效。另一方面,HER2靶点同样被深度挖掘。当1970年癌基因被发现后,研究人员启动筛选程序,一直在寻找其他致癌基因。随后,HER2基因被发现与大鼠肿瘤有关,并确定为是潜在的癌基因。1984年,科学家成功分离了大鼠HER2基因。此后一年,业界又确定HER2基因与EGFR同源。而在1986年,HER2基因的致癌性也终于被书面确定,抗HER2的单抗可以阻断这一转变过程。1987年,科学家又发现HER2与不良乳腺癌有关,由此该靶点的适应症得以确认。特别的是,现在用于基础研究和临床诊断的免疫组织化学IHC,第一次检测应用就是为了HER2阳性乳腺癌。1987年初始应用时仅用于告知预后,后来IHC被用于确定曲妥珠单抗和其他抗HER2药物治疗是否合适。41990-至今:ADC破晓之后说到单抗,1986年首款治疗性单抗muromab-CD3获批,用于治疗预防移植排斥,但推广速度很慢。1989年,基因泰克的科学家分离出一种名为“4D5”的抗体,它对HER2蛋白具有高特异性,且在体外能抗肿瘤细胞增殖。1990年代,才是抗体厚积薄发的主场。基于上述的“4D5”抗体,基因泰克的科学家利用CDR嫁接技术,构建出大名鼎鼎的曲妥珠单抗。经过一系列临床试验,1998年,曲妥珠单抗以商品名赫赛汀出现在医院药室里,用于与紫杉醇联合治疗HER2阳性乳腺癌。而对于ADC,它也将要迎来命运的转折点,上市。90年代初,惠氏与Celltech展开合作,成果之一就是发现了吉妥珠单抗奥唑米星,依靠可切割连接子,将抗CD33的单抗和卡奇毒素连接起来。很快,吉妥珠单抗奥唑米星拥有一个更为响当当的名字——Mylotarg。Mylotarg是史上第一款获批的ADC药物,于2000年在美国获批用于治疗CD33阳性的急性髓系白血病。可惜,它虽开辟了先锋,却也倒在了技术不成熟上。由于连接子不稳定,导致卡奇霉素被过早释放,引起严重毒副作用,最终该药于2010年悻悻退市。在埃尔利希灵光一闪的一个世纪后,2011年,CD30靶向的ADC维布妥昔单抗,被批准用于治疗复发难治经典霍奇金淋巴瘤和系统性间变性大细胞淋巴瘤;随后2013年,FDA又批准了HER2靶向的ADC Kadcyla,用于治疗曲妥珠单抗耐药的转移性乳腺癌,正式开启靶向化疗时代。ADC两个里程碑药物Enhertu的出现,革新了Kadcyla,将ADC带入一个新的的时代。第一制药虽停止了依喜替康的开发,但这份遗留的经验却保留在了第一三共身上,后者由此开发出依喜替康衍生物,作为Enhertu的毒素。除了突破ADC传统使用毒素,Enhertu还拥有高于平均的DAR值。在临床疗效方面,依靠旁观者效应,Enhertu攻克了低表达乳腺癌适应症。ADC获批的步伐不断加快,2019年获批了2款,2020年又有另外3款ADC上市。与此同时,药企间关于ADC的交易也水涨船高。今年上半年,辉瑞以430亿美元收购ADC明星公司Seagen,足以见这一赛道的火热。巨头的抢滩竞赛中,谁才能推出下一款革命性的“Enhertu”?而ADC的成功,又会成为什么新药的“垫脚石”?在螺旋上升的发展历程中,未来充满无限期待。参考文献:An Enhertu innovation map,及其文中所引链接;近期直播推荐识别微信二维码,添加生物制品圈小编,符合条件者即可加入生物制品微信群!请注明:姓名+研究方向!版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的,且明确注明来源和作者,不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com),我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点,不代表本站立场。
100 项与 Yangzhou Koen Biological Technology Co., Ltd. 相关的药物交易
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