Nicotinamide

“ 点击蓝字 关注我们 周璐 复旦大学药学院教授，副院长，教育部青年长江学者（2019），中国药学会药物化学专委会委员。主要针对潜在糖脂代谢药靶开发全新小分子调节剂，用于抗肿瘤及抗炎治疗。作为通信（含共同）作者在国际一流期刊包括 Cell Metab, Nat Struc Mol Biol, PNAS, JACS 发表论文 30 余篇，获授权国内外专利 10项，国际专利 3 项，2 项新药研发项目已完成成果转化，获得中国药学会科学技术二等奖（第一完成人）。 靶向肿瘤代谢酶小分子药物研究进展 PPS  李顺尧，冯磊，张昕晨，黄逸洋，姚雪莹，周璐 * （复旦大学药学院，上海 201203） [ 摘要 ] 肿瘤细胞通过代谢重编程适应快速生长和分裂的需求，表现出与正常细胞不同的代谢特征，包括葡萄糖和氨基酸摄取失调、利用中心碳代谢支持生物合成、对氧化应激保护机制的依赖增加等。这些特征为靶向肿瘤代谢提供了潜在的治疗策略。综述糖、氨基酸、脂质及核酸代谢通路中的关键代谢酶及其靶向药物的研究进展，并展望了未来药物研发的新方向，以期为肿瘤治疗提供参考。 糖、氨基酸、脂质及核酸是细胞的基本组成部分，其正常代谢对细胞生命活动至关重要 [1]。肿瘤细胞快速生长和分裂需要大量的营养物质和能量，通过代谢重编程，肿瘤细胞可以调整相应的转运体和代谢酶 [2-3]，以适应肿瘤微环境，展现出与正常细胞不同的代谢表型和异质性 [4]。 肿瘤代谢的主要特征有以下几条：1）葡萄糖和氨基酸摄取失调 [5]；2）利用中心碳代谢支持生物合成 [6]；3）采用机会性营养获取模式获取能量；4）对电子受体的需求扩大；5）对氧化应激保护机制的依赖增加 [7]；6）对“氮”的需求增加；7）不同肿瘤代谢适应具有异质性 [8]；8）代谢驱动信号通路改变；9）代谢与肿瘤微环境之间存在相互作用；10）融入全身代谢系统。 这些肿瘤代谢特征促进肿瘤的发生发展，保证肿瘤在不同环境下的生长代谢。同时，这些特异性代谢机制为靶向肿瘤代谢进行治疗提供了可能性。本文将简述糖、氨基酸、脂质及核酸的肿瘤代谢通路（见图 1），重点介绍部分代谢酶的临床小分子药物研究进展，并展望靶向肿瘤代谢药物发展的新方向，以期为药物研发提供参考，推动肿瘤治疗的新进展。 1 靶向肿瘤糖代谢 1.1 糖酵解通路及相应临床在研药物 尽管肿瘤代谢研究始于 Warburg 效应，但目前靶向糖酵解的抗肿瘤药物大多处于临床前研究阶段，只有少数药物进入临床试验（见表 1）。 1.1.1 靶向 6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-双磷酸酶 3 临床在研药物 磷酸果糖激酶 1（phospho-fructokinase-1，PFK-1）能够催化 6-磷酸果糖磷酸化生成 1，6-二磷酸果糖（fructose 1，6-bisphosphate，FBP），是糖酵解中 3 个不可逆反应之一，也是限速步骤。6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-双磷酸酶 3（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-biphosphatase 3，PFKFB3）能够催化 6- 磷酸果糖磷酸化生成 2，6-二磷酸果糖（见图 1），变构激活 PFK-1，对糖酵解途径的调控有较大影响。PFKFB3 蛋白在多种癌症中过表达，其高表达和高活性与癌症的侵袭性和不良预后密切相关。研究发现，抑制 PFKFB3 会导致细胞凋亡、细胞周期停滞、自噬、DNA 损伤、巨噬及化疗增敏 [9]，因此开发 PFKFB3 靶向抑制剂是潜在的肿瘤治疗策略。 PFK-158[10] 是目前唯一靶向 PFKFB3 的临床在研药物，对 PFKFB3 有较好抑制作用（IC50 = 137 nmol· L-1），也是首个临床在研的靶向抑制糖酵解药物 [11]，目前处于Ⅱ期临床。PFK-158 对 Th17 细胞和髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）具有免疫调节作用。实验结果表明，PFK-158 能在体内降低晚期癌症患者外周血中的Th17 细胞、γδT17 细胞和 MDSC，增加活化的效应CD4+ 和 CD8+ T 细胞。这意味着 PFK-158 与靶向药物及免疫治疗药物联合用药可能带来额外的临床益处 [12]。目前，PFK-158 的Ⅱ期临床试验仍在进行中，预计于 2025 年完成，主要研究 PFK-158 与奥比努图珠单抗等药物联用对复发或治疗无效的Ⅰ-Ⅲa 级滤泡性淋巴瘤的治疗效果。 1.1.2 靶向丙酮酸激酶 M2 临床在研药物 丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）是另一种关键的糖酵解酶，是糖酵解途径中最后的限速酶，能够不可逆地将磷酸烯醇丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）和腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）催化生成丙酮酸和腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）。PK 在肌肉组织中具有 PKM1 和 PKM2 亚型，二者之间的显著区别在于其催化活性，PKM1 能够自发形成高活性的四聚体，PKM2 则会形成催化效率较低的二聚体 [13]。PKM1 主要存在于终末分化的细胞中，与肿瘤的发生发展关系较小 [13]，PKM2则主要存在于增殖细胞及大部分肿瘤细胞，能被FBP 变构激活（AC50 = 7.0 μmol· L-1）[14]。肿瘤细胞中 PKM2 的低活性，使得糖酵解中的上游中间体累积，进而激活其他生物合成途径，如脂质和核苷酸的合成 [15]，促进肿瘤的发生发展。目前临床上靶向PKM2 的分子包括 2 个激动剂和 1 个已终止的抑制剂（见表 1）。 TP-1454 是首个进入临床研究的 PKM2 小分子激动剂。TP-1454 通过 in-house 的片段筛选并经过改造得到（见图 2）[16]。起初的苗头分子 1 对PKM2 有一定激动活性（AC50 = 36 μmol· L-1）且最大激动效果与 FBP 相当。随后对酰胺氮原子处的化学孔间进行探索合成得到了化合物 2，在此基础上进一步改造发现了活性更优的先导化合物 3，其对PKM2 有更好的激活效果（AC50=0.011 μmol·L-1），且在肺癌细胞 A549 及 H1299 上展现出一定的抑制活性。在进一步改造后，得到了临床候选分子 TP-1454[17-18]。药效学研究显示 [19]，TP-1454 在与程序性死亡受体 1（programmed cell death protein 1，PD-1）和细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4 （cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）抗体联用时能显著增强抗肿瘤效果，并且对小鼠体重无显著影响，证实了该分子的有效性和安全性。目前 TP-1454 处于Ⅰ期临床，用于治疗转移性及晚期实体瘤 [20]，预计于 2025 年 12 月完成Ⅰ期临床研究。 ACT-001 是 PKM2 的选择性激动剂 [21]，能在生理条件下缓慢释放出乌心石内酯（micheliolide，MCL）[22]。ACT-001 及原型药 MCL 对 HL-60/A 细胞均有一定抑制效果 [IC50 分别为（21.5±2）和（6.2±2.2）μmol· L-1]；ACT-001 在急性髓细胞性白血病（acute myelogenous leukemia，AML）NOD/SCID 小鼠模型上展现出较好药效，将模型鼠平均生存时长延长至 63 天（空白对照组为 43 天），并能够显著抑制骨髓中 CD45+ CD33+ 肿瘤细胞（抑制率达 98.4%）；同时，小鼠急毒实验显示 ACT-001 对肝、心及肾脏无明显毒性 [22]。后续研究发现 ACT-001 及 MCL 对胶质瘤等其他恶性肿瘤也有一定抑制效果 [23]。ACT-001 作为天然产物衍生物，具有多个潜在靶点与复杂的抗肿瘤机制。近年来研究发现，PKM2 是 ACT-001 的原型药 MCL 的作用靶点之一。MCL 能够高选择性地对 PKM2 的 424 位半胱氨酸进行共价结合，促进 PKM2 活性四聚体的形成 [21, 24]，对 PKM2 有非常好的激活效果（AC50 = 6 nmol·L-1），同时 MCL 的抗肿瘤活性依赖于 PKM2 的表达 [21]。ACT-001 目前正在美国进行Ⅰ/Ⅱ期临床试验用于多种实体瘤治疗，结果显示其耐受性良好，未发现明显毒性 [25]。 1.2 三羧酸循环通路及相应临床在研药物 肿瘤细胞利用三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TAC）中间体进行生物合成，因此，靶向TAC 中的关键代谢产物是肿瘤治疗的潜在策略。表2 列举了靶向 TAC 代表性临床在研药物。 1.2.1 靶向丙酮酸脱氢酶及丙酮酸脱氢酶激酶临床在研药物 丙酮酸脱氢酶复合体（pyruvate dehydrogenase complex，PDC）通过催化丙酮酸不可逆脱羧为乙酰辅酶 A，是代谢中的关键酶，靶向调控 PDC具 有 重 要 意 义。 丙 酮 酸 脱 氢 酶 激 酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）能够对 PDC 进行磷酸化，降低其活性。肿瘤细胞通过上调 PDK 的表达水平，减少 PDC 活性，从而更倾向于进行糖酵解 [26]。 二氯乙酸盐（sodium dichloroacetate，DCA）是一种通过恢复 PDC 活性发挥抗肿瘤效果的小分子，它通过抑制 PDK 活性，恢复 PDC 的活性改变肿瘤酸性微环境 [27]，并能逆转由于 PDK4 导致的肿瘤耐药问题 [28]。DCA 与多种抗肿瘤药物联用，如紫杉醇、阿霉素及沙利霉素，在体内外实验中显示了一定的效果，并且没有严重血液学、肝、肾或心脏毒性 [28]。在针对局部晚期头颈部鳞状细胞癌的 DCA 联合同步放化疗的Ⅱ期临床试验中，DCA 添加组与安慰剂组相比有着更高的完全反应率（71.4% vs 37.5%，p = 0.036 2），并且在治疗后能够显著降低丙酮酸和乳酸的含量（治疗组与基线组含量之比分别为 0.47 和0.61，p ＜ 0.005）[29]。 CPI-613 是硫辛酸类似物，通过干扰硫辛酸作为氧化还原辅因子的功能抑制 PDC 和 α-酮戊二酸脱氢酶复合体（α-ketoglutarate dehydrogenase complex，α-KGDH）的活性 [27]。CPI-613 对 α-KGDH 的抑制是通过调节 E3 亚基产生的活性氧实现；对 PDC 的抑制则是通过调节 PDK 的活性间接影响 PDC 活性 [30]。目前临床结果显示，CPI-613 与常规化疗药物联用后效果显著优于单用药物 [31]，如 CPI-613 与大剂量阿糖胞苷和米托蒽醌联合应用的疗效显著，老年患者的完全缓解率为 52%，中位生存期为 12.4 个月 [32]，显示出 CPI-613 的成药潜力。在Ⅰb 期临床试验中，未观察到 4 级毒性，经过中位 15.6 个月的随访，客观缓解率为 45%，中位无进展生存期为 10 个月（95%置信区间，7.1~14.9）[33]。 1.2.2 靶向异柠檬酸脱氢酶临床在研药物 异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH） 在TAC 中催化异柠檬酸氧化脱羧形成 α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）和 CO2，并将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+）还原为还原型烟酰胺腺嘌呤 二 核 苷 酸 磷 酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH），其活性与脂质和固醇的生物合成密切相关，也与氧化还原平衡的调节有关。IDH1/2 在多种肿瘤中均有发现相应的突变，突变型异柠檬酸脱氢酶（mutant isocitrate dehydrogenase，mIDH）能够将 α-KG 转化为 D-2-羟基戊二酸（D-2-hydroxyglutarate，D-2HG），并将NADPH 转化为 NADP+，导致基因表达失调、DNA损伤修复障碍和炎症。同时，D-2HG 与 α-KG 结构相似，能竞争性抑制 α-KG 依赖的双加氧酶，导致表观修饰失调，形成过度甲基化的表型 [34]。 目前已有 3 个 IDH 抑 制 剂 上 市， 分 别 是enasidenib，olutasidenib 及 ivosidenib， 这 3 款药物的临床适应证均为急性髓细胞样白血病 [35]。在实体瘤治疗方面，IDH 抑制剂仍有所欠缺，ivosidenib和 enasidenib 在脑中的暴露量较少，难以用于治疗IDH 突变的胶质瘤。Vorasidenib（AG-881）是首款针对 mIDH1/mIDH2 的双重抑制剂，对 IDH1-R132H及 IDH2-R140Q 突变体有着非常好的抑制效果（mIDH1-IC50=6 nmol·L-1，mIDH2-IC50=12 nmol·L-1），且透脑性较好，能够显著降低脑内 D-2HG 的含量。在临床上，接受 vorasidenib 治疗的患者，其肿瘤组织中 mIDH 的代谢产物 D-2HG 浓度平均降低了90% 以上 [36]，并在Ⅲ期临床试验中展现出较好的疗效：与安慰剂组相比，vorasidenib 组 2 级 IDH 突变型胶质瘤患者的中位无进展生存期显著延长（27.7个月 vs 11.1 个月），疾病进展或死亡的风险比为0.39[37]。 1.3 靶向糖代谢在调控肿瘤免疫微环境中的应用前景 葡萄糖对于 T 细胞的增殖及功能十分重要，由于肿瘤细胞对于环境中葡萄糖大量摄取，造成周遭环境极度缺乏营养，因此对肿瘤周围的免疫细胞有较大影响。一方面，肿瘤浸润淋巴细胞为了满足自身营养物质需求，会促进氧化磷酸化过程造成活性氧产生，最终导致肿瘤浸润免疫细胞的失调及耗竭[38]。另一方面，在缺乏葡萄糖环境中，肿瘤相关巨噬细胞更倾向朝促进肿瘤的 M2 样表型转变，并能够促进多种肿瘤细胞的生长 [8]。 此外，由于 Warburg 效应的存在，肿瘤微环境中的乳酸大量蓄积从而使 CD8+ T 细胞、自然杀伤细胞及树突状细胞的活性降低，并使肿瘤相关巨噬细胞极化为耐受性 M2 样表型 [39]。调节性 T 细胞也会通过 MCT1 摄取乳酸并上调 PD-1 表达，从而促进肿瘤免疫逃逸 [40]。其他一系列代谢产物如富马酸、琥珀酸、衣康酸及 D-2HG 等除了本身的代谢功能，也在肿瘤微环境中发挥着重要作用 [41]。 因此对开发靶向代谢酶的小分子调节剂而言，干扰肿瘤微环境，进而消除耗竭免疫细胞，是潜在的治疗策略。尽管目前靶向肿瘤微环境代谢的证据主要来自临床前研究，但这些策略具有较好的临床应用前景，值得进一步探索。 2 靶向肿瘤氨基酸代谢 2.1 靶向谷氨酰胺代谢 谷氨酰胺是癌细胞生长和增殖的第二大营养来源，为生物合成途径提供碳源。大多数癌细胞在代谢重编程后对谷氨酰胺表现出高度依赖性，这也被称为“谷氨酰胺成瘾”[42]。谷氨酰胺代谢通路中涉及的谷氨酰胺转运体、谷氨酰胺酶（glutaminase，GLS）、转氨酶等，对癌细胞生存至关重要 [43]，靶向这些与谷氨酰胺代谢相关的蛋白，在癌症治疗中表现出巨大的潜力，促进了新的抗癌候选药物的开发。 GLS 是多种肿瘤中生长和增殖的关键酶 [44]，能够将谷氨酰胺转化为谷氨酸。表 3 列举了目前正处于临床研究的 GLS 小分子抑制剂。 L-DON 是一类谷氨酸类似物，对 GLS 产生不可逆的抑制 [44-45]。在临床研究中，L-DON 表现出抗霍奇金淋巴瘤和抗胶质母细胞瘤活性 [44]。DRP-104（sirpiglenastat）是 L-DON 的前药，胃肠道不良反应小，在进入肿瘤组织后能够活化释放出原药L-DON[46]，在临床试验中与 PD-L1 抗体药物联合使用，用于晚期实体瘤治疗。 CB-839 是另一个处于临床阶段的 GLS1 小分子抑制剂（GLS1: IC50= 31 nmol·L-1；GLS2: IC50 ＞50 000 nmol·L-1），主要与其他抗癌药物联合使用。目前，该药通常与阿扎胞苷联合治疗骨髓增生异常综合征，与 sapanisertib 联合治疗非小细胞肺癌，与nivolumab 联合治疗黑色素瘤、透明细胞肾细胞癌和非小细胞肺癌，于放疗后与替莫唑胺联合治疗 IDH介导的弥漫性星形细胞瘤。在近期Ⅰb/Ⅱ期临床试验结果中显示 [47]，针对晚期骨髓增生异常综合征患者，CB-839 与阿扎胞苷联用具有良好的耐受性，客观缓解率为 70%，其中 53% 的参与者达到（骨髓）完全缓解，中位总生存期为 11.6 个月。 IPN-60090 是 CB-839 的结构类似物，但化合物IPN-60090具有更优的理化性质和药代动力学特征，在联合哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体 1/2 双重抑制剂用于非小细胞肺癌的治疗中，表现出良好的药效 [48]。 2.2 靶向精氨酸代谢 精氨酸（arginine）直接或间接参与许多生物过程，包括细胞增殖、细胞信号转导、肌肉收缩、免疫、神经传递、血管舒张、生长因子和其他氨基酸的合成 [49]。许多癌细胞对外部精氨酸高度依赖，通过抑制精氨酸代谢酶如精氨酸酶（arginase，ARG）、精氨酸脱羧酶（arginine decarboxylase，ADC）和精氨酸脱亚胺酶（arginine deiminase，ADI），以此靶向外源性精氨酸已成为治疗多种癌症的重要手段 [50-51]。 ARG1 是调节精氨酸代谢的重要靶点之一。CB-1158（见表 4）为口服有效的选择性 ARG1 小分子抑 制 剂（Arg1: IC50 = 86 nmol· L-1；Arg2: IC50 = 296 nmol· L-1），通过阻断精氨酸耗竭来逆转对 T 细胞增殖的抑制，从而杀伤肿瘤细胞 [52]，目前 CB-1158处于Ⅰ/Ⅱ期临床阶段，采用单用或与 PD-1 单抗联合使用的给药方式，用于结直肠癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤的治疗。 2.3 靶向甲硫氨酸代谢 甲硫氨酸（methionine，Met）为含硫必需氨基酸，主要是通过外部获得。它是琥珀酰辅酶 A、同型半胱氨酸、半胱氨酸、肌酸和肉毒素等的前体，参与细胞内 S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-methionine，SAM）、多胺、肌酸和磷脂酰胆碱的生物合成。肿瘤细胞缺乏内源性 Met 生物合成，表现出对外源性Met 的严重依赖性，即霍夫曼效应 [53]。针对肿瘤中Met代谢的药物，如甲硫氨酸腺苷转移酶（methionine adenosyltransferase，MAT）抑制剂，已被证明具有治疗肿瘤的潜力 [54]。 MAT2A 的功能是催化 ATP 和 Met 生 成SAM，而后者是核酸、磷脂、组蛋白、生物胺和蛋白质甲基化的甲基供体。MAT2A 在多种肿瘤中都异常表达；抑制 MAT2A 可抑制癌细胞生长、增殖和迁移，MAT2A 作为癌症治疗靶点也受到广泛关注 [55]。 AG-270 是由 Agios 公司通过高通量筛选及虚拟筛选，并通过基于结构的药物设计开发所得（见表 5）[56]，有较好的体外活性，吸收、分布、代谢和排泄性质以及口服生物利用度。AG-270 于 2023年 4 月完成了Ⅰ期临床试验，研究了 AG-270 单用或与紫杉醇以及吉西他滨联用在甲硫腺苷磷酸化酶（methylthioadenosine phosphorylase，MTAP）基因缺失的晚期实体瘤或淋巴瘤患者中的安全性、药代动力学及临床药效，但该药物目前因安全性及疗效问题已终止临床研究。IDE-397 是 IDEAYA 公司发现的另一款口服有效的 MAT2A 抑制剂，已在美国进入Ⅰ期临床试验，单用或与紫杉烷类抗癌药物（多西他赛、紫杉醇）、戈沙妥珠单抗联用以评估其在转移性癌症患者中的安全性、有效性、药效学和抗肿瘤活性（见表 5）。此外，IDE-397 与蛋白质精氨酸酶甲基转移酶 5 小分子抑制剂 AMG-193 联合疗法也正处于Ⅰ/Ⅱ期临床。 2.4 靶向色氨酸代谢 色氨酸为必需氨基酸，超过 95% 的色氨酸通过色氨酸降解参与犬尿氨酸（kynurenine，Kyn）合成过程。通过这一途径，产生一些与免疫反应和神经传递相关的生物活性代谢物。色氨酸代谢主要发生在肝脏，经犬尿氨酸途径生成各种犬尿氨酸代谢物，其中限速酶为吲哚胺 2，3-双加氧酶 1/2（indoleamine 2，3-dioxygenase 1/2，IDO1/2）和色氨酸 2，3-双加氧酶（tryptophan-2，3-dioxygenase，TDO）。研究表明，大多数人类肿瘤组织中高表达IDO[57]，且 IDO/TDO 活性与癌症免疫逃逸机制以及T 细胞活性的调节密切相关 [58]，靶向 IDO/ TDO 小分子抑制剂的开发成为靶向抗癌药物研发策略之一。表6 列举了目前正处于临床研究的 IDO1 小分子抑制剂。 目前，indoximod，navoximod，epacadostat，linro-dostat 和 PF-0680003 是进入临床阶段的 IDO1 小分子抑制剂（见表 6）。色氨酸类似物 indoximod （NLG-8189）是 NewLink 公司开发的首个临床候选药物，于 2017 年启动与免疫检查点抑制剂联合治疗黑色素瘤的Ⅲ期临床试验。同时，indoximod 的前药形式NLG-802于2017年也进入Ⅰ期临床试验[59-60]。然 而，indoximod（hIDO1: IC50 ＞ 100 mmol· L-1，HeLa IDO1: IC50 ＞ 2.5 mmol· L-1）及其前药并非特异性的 IDO1 抑制剂，其作用机制仍存在争议 [61]。近年来，还有许多不同类型母核结构的 IDO1 小分子抑制剂被陆续报道，也有许多小分子是 IDO1，IDO2 和 TDO 的泛抑制剂，IDO1 小分子抑制剂与组蛋白脱乙酰酶抑制剂、DNA 烷基化试剂、tubulin抑制剂以及 E3 配体偶联形成双功能分子也被开发并得到了广泛应用 [62]。 然而，目前大部分 IDO1 抑制剂的临床研究均已终止，失败的原因主要如下： 1）靶点的局限性。IDO1 抑制剂主要通过抑制IDO1 来阻止肿瘤细胞的免疫逃逸，但肿瘤微环境中涉及的免疫抑制机制非常复杂，单靠抑制 IDO1 不足以产生显著的抗肿瘤效果 [63]。 2）肿瘤微环境的复杂性。肿瘤微环境中存在 多 种 免 疫 抑 制 因 子， 如 TDO，PD-1/PD-L1 和CTLA-4 等，肿瘤细胞能绕过 IDO 途径，从而产生耐药 [63-64]。 3）非依赖 IDO1 的代谢途径。白细胞介素 4 诱导蛋白 1（interleukin 4 induced protein 1，IL4I1）通过独立于 IDO1 的机制继续促进肿瘤免疫逃逸，IL4I1 为分泌型 L-氨基酸氧化酶，主要通过代谢产生犬尿喹啉酸和其他内源性代谢物，激活芳香烃受体，从而在肿瘤微环境中发挥免疫抑制作用，这可能也是 IDO1 抑制剂在某些情况下疗效不佳的原因之一 [65]。 4）IDO 抑制剂本身缺陷。IDO 抑制剂在药代动力学特性上存在不足，如生物利用度低或代谢过快，或者在长期使用中出现不可接受的毒性反应，影响其临床应用 [63]。 2.5 靶向氨基酸代谢在调控肿瘤免疫微环境中的应用前景 氨基酸代谢除了在维持肿瘤生长中发挥重要作用外，在肿瘤免疫微环境的调节中也具有重要意义。首先，肿瘤细胞可通过营养竞争消耗微环境中的氨基酸，从而抑制 T 细胞免疫；其次，氨基酸的有毒代谢物也可抑制 T 细胞功能；再次，氨基酸可以通过调节葡萄糖和脂质代谢来干扰 T 细胞 [66]。 在肿瘤组织中，由于存在高浓度的生长因子，导致细胞内关键信号分子如 c-Myc[67] 和 E2F[68] 被激活，氨基酸转运蛋白表达增加，促进肿瘤细胞对氨基酸的高摄取，导致氨基酸耗竭。而由于肿瘤微环境中的营养限制，免疫细胞、基质细胞和癌细胞必须为生长、增殖等生命活动而竞争营养。免疫细胞往往不适应营养竞争，从而导致免疫能力减弱。 肿瘤细胞对氨基酸的大量消耗伴随着有毒代谢物的产生，这些代谢物中很多都被证明对 T 细胞免疫具有抑制作用。比如色氨酸代谢产生的犬尿氨酸衍生物，一方面可以直接对免疫细胞产生毒性作用，抑制 T 细胞增殖，诱导 T 细胞凋亡，另一方面犬尿氨酸衍生物可引起细胞内氧化还原平衡的改变，并通过产生活性氧类诱导细胞凋亡 [69-70]。 氨基酸代谢对葡萄糖代谢的影响最为显著，氨基酸代谢后可转化为葡萄糖代谢途径中的底物，直接调节葡萄糖代谢；同时还能影响葡萄糖转运体的活性，间接影响葡萄糖代谢。氨基酸（如丙氨酸、色氨酸和丝氨酸）也可以转化为丙酮酸，丙酮酸在一定程度上促进糖酵解并产生乳酸，最终导致 T 细胞整体代谢的改变和功能的抑制 [71]。氨基酸代谢除了影响葡萄糖代谢外，还能调节脂质代谢。谷氨酰胺代谢产生 α-KG，参与脂肪酸的合成，丝氨酸和甘氨酸也是脂质合成的必要前体 [72]，而 T 细胞的快速增殖高度依赖于脂质为其提供细胞膜的成分。 随着氨基酸代谢和肿瘤微环境之间关系被逐步掲示，目前也提出了靶向氨基酸代谢和免疫治疗相结合的疗法，比如靶向氨基酸代谢和嵌合抗原受体T细胞免疫治疗以及与免疫检查点抑制剂联合疗法，在临床前实验以及临床试验中也取得了一些进展，但是整体来说通过靶向氨基酸代谢来开发新药还存在许多挑战。 3 靶向肿瘤脂质代谢 脂质代谢在癌症中被高度重编程，是癌症发生的重要标志之一。在癌症中，脂质代谢的改变通常表现为脂质生成增加、脂质摄取增加、脂滴的储存和动员增强 [73]。这些代谢改变通过提供膜脂成分、供能、调节细胞膜流动性、调控信号转导等多种方式促进肿瘤的增殖、侵袭和转移 [74]。表 7 列举了目前正处于临床研究的脂质代谢通路小分子抑制剂。 3.1 靶向脂肪酸代谢通路 癌细胞相较于普通细胞需要更多脂质以维持其存活和增殖。研究发现激活脂质合成途径是癌细胞增殖的必要条件，其中脂肪酸合成途径是癌细胞获取脂质的主要途径。脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，FAS）是脂肪酸合成途径中的关键酶，以 NADPH 依赖的方式催化棕榈酰辅酶 A 的合成，是脂肪酸合成关键的末端代谢酶。FAS 在肿瘤中表达显著上调，其上调不仅通过提高脂肪酸的合成代谢赋予肿瘤生存优势，还能够通过影响肿瘤微环境和癌症控制网络导致肿瘤的发展及恶性转化 [75]。 TVB-2640（denifanstat，ASC40）是首个经过临床测试的口服选择性强效可逆 FAS 抑制剂药物。该系列化合物通过抑制 FAS 调节脂肪酸合成通路，被用于相关适应证的研究，如丙型肝炎病毒感染、癌症、非酒精性脂肪性肝炎。TVB-2640 在癌症上的首次临床研究报告表明，其具有优异的口服生物利用度和安全性，体内半衰期约为 16 小时，试验中所有剂量水平的人体暴露量均高于小鼠临床前模型中预测的有效剂量 [76]。TVB-2640 在癌症上目前尚未有单药治疗策略的报道，但其与贝伐珠单抗的联合用药策略已进入Ⅲ期临床研究。TVB-2640 与贝伐珠单抗联合治疗复发性胶质母细胞瘤患者的Ⅱ期临床试验取得了积极的结果。临床数据显示，TVB-2640的安全性良好，大多数的不良事件强度为 1 级或 2级；药效方面，TVB-2640 与贝伐珠单抗联用的 6个月无进展生存率为 31.4%，相较贝伐珠单抗组的16% 具有统计学差异，贝伐珠单抗与 TVB-2640 联用的总缓解率为 56%，包括 17% 的完全应答和 39%的部分应答 [77]。此外，Sagimet Biosciences 公司的另一款 FAS 抑制剂 TVB-3567（ASC60）片剂也于2022 年在中国获批临床，用于晚期实体瘤的治疗。 3.2 靶向胆固醇代谢通路 胆固醇代谢是免疫稳态和癌症进展的重要检查点，部分研究已报道了胆固醇在癌症中的积累。胆固醇可以促进细胞的增殖、迁移和侵袭，胆固醇的摄入增加和合成水平上调易于导致肿瘤发生 [78]。癌细胞对胆固醇的需求增加，并且比正常细胞含有更多的脂筏，以满足对促肿瘤细胞信号蛋白的需求 [79]。 在胆固醇代谢通路中与癌症相关研究最多的靶点是 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGCR），是胆固醇合成代谢中的关键限速酶，催化羟甲基戊二酰辅酶 A（hydroxylmethylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA）还原为甲羟戊酸。除胆固醇外，甲羟戊酸下游胆固醇合成中间体也被发现对癌症的进展有关，如异戊二烯焦磷酸酯（isopentenyl pyrophosphate，IPP）、 香 叶 基 香 叶 基 焦 磷 酸 酯（geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）、 法 尼 基 焦 磷 酸（farnesyl pyropho-sphate，FPP）等，其中 GGPP 和 FPP 对各类蛋白的异戊二烯化翻译后修饰具有重要作用。 他汀类药物是 HMGCR 强效竞争性抑制剂，已有众多上市药物用于降低血浆胆固醇水平。近年来，他汀类药物的肿瘤抑制活性愈发受到关注。其抗癌机制多种多样，研究最广泛的是甲羟戊酸途径介导的机制。在该途径中，他汀类药物可通过耗尽GGPP 和 FPP 破坏关键蛋白的异戊二烯化来激活内在的凋亡途径，例如 Ras 和 Rho 的异戊二烯化降低进而延缓了肿瘤的进展 [80]；p53 突变可通过上调甲羟戊酸通路来破坏乳腺腺泡形态，从而发挥致癌作用，他汀类药物则抑制甲羟戊酸通路以发挥抑癌作用 [81]。此外，他汀类药物还被发现可通过调节自噬、诱导铁死亡、诱导焦亡、调节肿瘤微环境等方式抑制肿瘤发展进程 [80]。近年来，许多基于人群的观察性研究报告表明，与未使用他汀类药物的患者相比，癌症患者使用他汀类药物可降低死亡率 [82]。一些介入性临床数据也发现他汀类药物在抗癌治疗效果方面有积极作用，如辛伐他汀可提高局部晚期乳腺癌患者 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）、阿霉素（adriamycin）、环磷酰胺（cyclophosphamide）三药（FAC）联用的疗效，FAC 联合辛伐他汀的总缓解率为 90%，相较 FAC 组具有更好的活性和耐受性趋势 [83]；氟伐他汀对前列腺癌中肿瘤细胞凋亡具有积极作用 [84]；辛伐他汀可提高吉非替尼在吉非替尼耐药非小细胞肺癌患者亚组中的疗效，吉非替尼与辛伐他汀联合用药与吉非替尼单药组相比显示出更高的缓解率（38.5% vs 31.5%）和更长的无进展生存期（3.6 个月 vs 1.7 个月）[85]；他汀类药物与 PD-1抑制剂联合治疗恶性胸膜间皮瘤（malignant pleural mesothelioma，MPM）和晚期非小细胞肺癌（advanced non-small cell lung cancer，aNSCLC），在临床上有着更好的表现，在 2 种癌症中使用他汀类药物均展现出与 PD-1 抑制剂的协同效果，具有更高的缓解率（MPM：22% vs 6%；aNSCLC：40% vs 22%）和更长的无进展生存期（MPM：6.7 个月 vs 2.4 个月；aNSCLC：7.8 个月 vs 3.6 个月）[86]。这些研究展现了他汀类药物在抗癌治疗中的潜力，尤其是与其他抗癌药物联用。 3.3 靶向鞘脂合成通路 鞘脂代谢对癌症的发展也具有重要作用，其中神经酰胺（ceramide，Cer）、二氢神经酰胺、鞘氨醇（sphingosine，Sph）和 1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）可以调节肿瘤细胞死亡、增殖、耐药性以及宿主血管生成、炎症和免疫 [87]。鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SphK）是肿瘤中研究最多的鞘脂代谢靶点，SphK 有 SphK1 和 SphK2 亚型，二者为同工酶，催化 Sph 生成 S1P。SphK 在许多肿瘤细胞中过表达，并且研究证实抑制 SphK 可以杀死肿瘤细胞 [88]。 ABC294640（opaganib）为强效竞争性 SphK抑制剂，目前已进入临床试验阶段。临床前研究发现，ABC294640 在组织培养中可以降低 S1P 水平，抑制多种肿瘤细胞系的增殖、迁移并伴随微丝的消失；ABC294640 在降低 S1P 的同时升高 Cer的水平，抑制信号转导，促进多种癌细胞的自噬和（或）凋亡，并下调多种肿瘤细胞系中 c-Myc 的表达，还能降低前列腺癌细胞系中雄激素受体的表达；ABC294640 还能够抑制二氢神经酰胺去饱和酶1（dihydroceramide desaturase 1，DES1），DES1 的抑制与视网膜母细胞瘤蛋白磷酸化的减少和细胞周期进程的抑制有关，因此 ABC294640 是双功能抗肿瘤药物；ABC294640 与吉西他滨、索拉菲尼等多种药物联用在体外及动物模型中对多种癌症有积极的治疗效果 [88]。在一项针对 22 例晚期实体瘤患者的Ⅰ期临床研究中，ABC294640 表现出良好的耐受性，以 500 mg（bid）剂量给药达到了有效血药浓度，并将 500 mg（bid）的剂量水平确定为Ⅱ期临床推荐剂量；检测给药组患者体内 S1P 水平发现，给药后 12 小时血浆 S1P 达到最低值，250 mg/500 mg/750 mg组均表现出 50% 以上的 S1P 清除率，且血浆 S1P 在24 小时内恢复至基线水平；此外，在实体瘤反应评价标准可评估的患者中，1 例患者为部分缓解，6 例为病情稳定，9 例为最佳缓解 [89]。目前 ABC294640对胆管癌和前列腺癌的Ⅱ期临床试验正在进行中。 3.4 靶向脂质代谢在调控肿瘤免疫微环境中的应用前景 在肿瘤中，脂质代谢的重编程与肿瘤特殊微环境的形成相辅相成。一方面，肿瘤微环境的改变，如缺氧、酸中毒、营养物质改变，驱动了肿瘤细胞的脂质代谢重编程。肿瘤细胞的快速增殖消耗大量氧气，依赖氧气的脂肪酸分解代谢被抑制；在缺氧条件下，缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）-1α 和-1β 被激活，可通过下调肉碱棕榈酰转氨酶-1、上调脂肪酸结合蛋白、上调低密度脂蛋白相关受体-1 的表达等方式抑制脂肪酸氧化并促进脂肪酸的摄取和储存 [90]。肿瘤微环境中乳酸的蓄积通过上调 CD36 和二酰基甘油酰基转移酶促进外源脂质摄取和脂滴的生成 [91]；激活 PI3K/AKT 通路并上调硬脂酰辅酶A去饱和酶-1促进脂肪酸的合成代谢[92]。肿瘤细胞的快速增殖导致肿瘤微环境中营养物质的快速消耗，为增加能量的供应，肿瘤细胞可通过分泌细胞因子诱导周围脂肪细胞释放游离脂肪酸供肿瘤细胞摄取 [93]。另一方面，脂质代谢的重编程也驱动肿瘤微环境转化为适应肿瘤发展的免疫抑制表型。肿瘤中脂质摄取增加会增加调节性 T 细胞、肿瘤相关巨噬细胞和 MDSC 中的脂质代谢水平，促进其免疫抑制功能 [94-96]；CD8+ T 细胞和自然杀伤细胞中CD36 的上调会抑制其抗肿瘤细胞因子释放并降低其对肿瘤细胞的杀伤能力 [97]。 尽管还未有通过调节脂质代谢以调节肿瘤微环境为机制的药物进入临床试验阶段，但众多研究表明该策略具有潜在的应用价值。 4 靶向肿瘤核酸代谢 核酸的合成代谢主要涉及嘌呤和嘧啶的合成，分为从头合成和补救合成途径。非增殖细胞中，从头合成途径活性通常很低或不存在，但在肿瘤细胞中，从头合成途径是必要的，目前大部分药物是针对肿瘤核酸的从头合成途径进行抑制。 一碳代谢作为从头合成中的重要原料提供途径，同样影响核酸代谢。该途径以四氢叶酸（tetrahydrofolic acid，THF）和 SAM 为主，涉及嘌呤与嘧啶合成时碳原子的添加过程。SAM 循环对 DNA 甲基化有重要作用，也是研究致癌原因的重要组成部分 [98]。以下将介绍嘧啶与嘌呤从头合成中关键代谢酶的相关临床在研药物，包括嘧啶合成中的二氢乳清酸脱氢酶（dihydroorotate dehydrogenase，DHODH）和胸苷酸合成酶（thymidylate，TS）、嘌呤合成中的甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶（glycinamide ribonucleotide transformylase，GART） 和 5-氨 基-4-咪唑甲酰胺核糖核苷酸转化酶 /IMP 环 水 解 酶（5-amino-4-imidazolecarboxamide ribonucleotide transformylase/IMP cyclohydrolase，ATIC），以及一碳代谢中的二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）和甲硫氨酸腺苷转移酶 2A（methionine adenosyltransferase 2A，MAT2A）。 4.1 靶向嘧啶从头合成途径 4.1.1 DHODH抑制剂 来氟米特是已上市的DHODH抑制剂，但其抑制活性较差，且具有明显副作用 [99]。RP-7214 为结构尚未披露的新型 DHODH 抑制剂，对 DHODH 有较好抑制效果（IC50=7.76 nmol·L-1），在多种癌细胞系中均表现出不同程度的抗增殖活性，能够抑制 AML 细胞生长（GI50=2~3.2 μmol·L-1），在 1 μmol·L-1 时诱导细胞凋亡，并导致 S 期细胞周期阻滞。此外，RP-7214 还能增强乳腺癌和结肠直肠癌细胞对化疗药物的敏感性 [100]。临床前药效研究显示，RP-7214 在 MV-4-11 小鼠移植瘤模型中作为单一药物或与阿糖胞苷联用均展现出抗肿瘤活性 [101]。RP-7214在针对健康受试者进行的Ⅰ期临床研究中具有良好的吸收和暴露量，且具有良好的安全性 [102]（见表 8）。 4.1.2 TS 抑制剂 TS 抑制剂中的 5-FU 是被广泛应用的抗癌药物（见表 9），它在体内被代谢为活性物 质 5'-氟 脱 氧 尿 苷 一 磷 酸（5'-fluorodeoxyuridine monophosphate，FdUMP）， 通 过 取 代 内 源 性 底物 2'- 脱氧尿苷-5'- 一 磷 酸（2'-deoxyuridine-5'-monophosphate，dUMP）竞争性地抑制 TS。但由于85% 的 5-FU 在肝脏中被二氢嘧啶脱氢酶降解 [103]，且在细胞内转移需要碱基转运体和复杂的酶处理来产生活性物质 [104]，导致克服 5-FU 限制和药理学挑战的药物设计极为重要。在近期研究中发现，NUC-3373 在临床试验中有着良好表现（见表 9）。NUC-3373 是 FdUMP 的前药，采用的是近年来核苷类药物常用的 ProTide 策略，将 FdUMP 中的磷酸基团设计合成相应的磷酰胺结构得到 NUC-3373。在胞内，NUC-3373 能够水解释放出具有活性的FdUMP，从而跳过了胸苷激酶将 5'-氟脱氧尿苷（5'-fluorodeoxyuridine，FUdR）磷酸化的限速步骤，使其能更快在胞内起效，并且能避免胸苷激酶的下调从而克服了 5-FU 原有的耐药问题 [105]。 NUC-3373 对实体肿瘤细胞系（HT-29，HCT-116，MDA-MB-231，SW- 620）、急性髓系白血病细胞（KG1a）均有较好抑制活性。其中 KG1a 对NUC-3373 最为敏感，与 5-FU（LC50=1.4 μmol·L-1）和 FUdR（LC50 =1.18 μmol·L-1）相比，NUC-3373 对KG1a 细胞的抑制活性约有 22 ~ 26 倍的提升（LC50 =0.053 μmol· L-1）[105]。在人结直肠癌小鼠异种移植模型中发现，NUC-3373 比 5-FU 具有更明显的肿瘤抑制作用。在临床研究中也发现，与 5-FU 相比，单药 NUC-3373 在晚期实体瘤患者中显示出良好的安全性和与药代动力学性质 [106]。 4.2 靶向嘌呤从头合成途径 在 嘌 呤 从 头 合 成 过 程 中，有 2 个关键酶—GART 和 ATIC，负责催化甲酰基的转移，为嘌呤提供结构所需的碳源。这 2 个步骤都对 N10-甲酰-四氢叶酸具有依赖性。 目前，针对 GART 与 ATIC 的大部分抑制剂都是模仿叶酸结构设计进而达到抑制效果的经典抗叶酸类药物，如培美曲塞、洛美曲索等。培美曲塞虽然对 GART 和 ATIC 都有抑制活性，但仅在低微摩尔范围内 [107]；而洛美曲索及 AG-2034（见表 10）虽然对 GART 有较好亲和力（Ki = 60 nmol·L-1，Ki =28 nmol· L-1），但遗憾的是这 2 种药物的临床试验均已终止。其中，AG-2034 退出临床试验的原因不仅是其在Ⅰ期临床中并未观察到抗肿瘤疗效，而且存在血小板减少症、中性粒细胞减少症和贫血等不良反应，以及药物代谢蓄积问题 [108]。 经典抗叶酸类药物在使用过程中往往会产生耐药性，产生耐药的主要机制是通过基因突变导致运输和多谷氨酸化机制的损害 [109]。相比之下，非经典的抗叶酸剂通过被动扩散穿透细胞，可克服主动摄取受损引起的抗性。代表性化合物 ATIC 抑制剂LSN-3213128（见表 10）在分子水平对 ATIC 有较好抑制活性（IC50 = 16 nmol · L-1)，对 NCI-H460 细胞的 IC50 达 19 nmol · L-1，且具有适中的药代动力学性质，后续在移植瘤模型中也表现出剂量依赖性的肿瘤生长抑制 [110]。尽管 LSN-3213128 尚未进入临床阶段，但是具有一定成药潜力，值得进一步关注。 4.3 一碳代谢中的抑制剂 在核苷酸代谢中，一碳代谢是重要的生物合成过程。由于增殖指数的增加，癌细胞对该生物过程表现敏感，因此靶向一碳代谢的药物长期以来一直被用作癌症治疗方法 [111]。对于嘧啶，一碳代谢的产物在 TS 催化下与尿嘧啶核苷酸（uridine monophosphate，UMP）反应生成胸苷一磷酸（thymidine monophosphate，TMP），直接影响嘧啶的从头合成过程；在嘌呤的从头合成过程，甲酰化四氢叶酸参与嘌呤的第 4 步与第 10 步甲酰基转移的过程。由于 5，10-亚甲基-四氢叶酸会在胞质内通过亚甲基四氢叶酸还原酶不可逆地还原为 5-甲基四氢叶酸，5-甲基四氢叶酸经 SAM 循环重新转为四氢叶酸，因此叶酸循环与 SAM 循环之间存在着相互联系 [112]（由于 SAM 循环部分已在前述甲硫氨酸代谢部分进行介绍，下面将不再重复阐述）。 DHFR 催化叶酸转化为四氢叶酸，是叶酸循环的起始步骤，也是临床上验证可治疗癌症的一碳代谢靶点。尽管现有许多上市的 DHFR 抑制剂（如甲氨蝶呤、三甲曲沙、雷替曲塞、培美曲塞），但这些药物都有口服利用度差、不良反应多（如黏膜炎、白细胞减少）[112] 等一系列问题。遗憾的是近年来，针对 DHFR 靶点的临床在研药物均以失败告终（见表 11），开发新型安全有效的 DHFR 抑制剂仍具有难度。 5 总结与展望 肿瘤代谢涉及多种营养物质与细胞生长信号通路，各种代谢途径彼此之间相对独立互补又相互关联代偿维持着氧化还原平衡，部分肿瘤的代谢产物又能进一步塑造肿瘤微环境实现免疫逃逸，或能作为信号分子对肿瘤代谢进行调控以增强代谢适应性。肿瘤拥有一个庞大且复杂的“生态体系”，并通过上述多种机制维持着稳态平衡。通过靶向肿瘤代谢破坏其稳态平衡是具有潜力的治疗策略。 目前，靶向肿瘤代谢治疗仍然存在一定瓶颈[8]。从药物开发角度来看，代谢酶小分子抑制剂开发本身便具有挑战性，一方面大部分代谢酶底物均为水溶性小分子，且在体内均以较高浓度存在，给底物竞争性抑制剂开发带来较大难度；另一方面，部分代谢酶在细胞中高度表达 [15]，如 Hela 细胞中，乳酸脱氢酶A（4 μmol·L-1），己糖激酶2（0.27 μmol·L-1）及 GLS1（0.07 μmol·L-1）均有较高表达，小分子难以完全抑制其活性。针对上述问题，寻找相应代谢酶的变构抑制剂则是较好的选择，能够在保证活性的同时提高靶点选择性；针对在胞内高表达的代谢酶，通过蛋白水解靶向嵌合体技术进行代谢酶的降解也是潜在的策略之一，但目前仍需要更多的实验进行验证。 从治疗策略来看，靶向肿瘤代谢也存在一些问题。首先，由于肿瘤的代谢适应性，单独调控代谢通路中的某一靶标，肿瘤仍能通过代谢重编程调整代谢网络，从而引发耐药等问题；且由于各条代谢通路代谢酶及代谢产物之间紧密联系，即使能够对某一代谢产物或酶做到完全抑制，也有可能对其他通路产生影响，产生与预期相反效果。其次，大部分肿瘤的代谢通路对正常细胞来说同样重要，难以做到较好的选择性，此外，部分免疫细胞与肿瘤细胞具有相似的代谢特征，在抑制肿瘤的同时也有可能抑制相应免疫细胞的活性从而使得治疗效果不显著。此外肿瘤代谢的异质性，即不同瘤种具有不同的代谢特征，也会使得单一代谢抑制可能仅对部分瘤种起效。 因此，针对肿瘤代谢治疗，一方面应当采用联合疗法，同时靶向多条代谢通路中的关键步骤，以破坏肿瘤代谢的代偿机制；或作为佐剂影响肿瘤环境增强其他药物的敏感度，这一点目前在靶向肿瘤代谢的临床试验中均有所体现 [8]；也可寻找相应代谢具有协同致死效应目的基因蛋白，以增强治疗效果。同时，针对不同肿瘤代谢特征应采取精准化治疗，例如在与 PD-1 抗体联用治疗时，可根据肿瘤的独特代谢特征选择相应的代谢抑制剂 [8] 改善疗效。另一方面，如果针对肿瘤代谢通路中某一关键酶进行靶向抑制后造成中间体的累积，有可能反而会激活其他旁路代谢；参考 PKM2 及 PDK 抑制剂临床小分子研究所带来的启发，尝试激动剂的开发或激活关键代谢酶，对拥堵的代谢通路进行“疏通”，从而减少代谢关键中间体的累积，减少旁路代谢流从而抑制肿瘤的生长，打破肿瘤原有的稳态环境，也未尝不是潜在的治疗策略。 参考文献: [1] Huynh C, Ryu J, Lee J, et al. 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DRUGAI 今天为大家介绍的是来自澳大利亚悉尼大学、葡萄牙里斯本INESC-ID研究所、英国维康桑格研究所团队的一篇论文。整合不同类型的生物学数据对于全面理解癌症生物学至关重要，但由于数据的异质性、复杂性和稀疏性，这一工作仍然充满挑战。为解决这个问题，作者的研究引入了一个无监督深度学习模型MOSA(Multi-Omic Synthetic Augmentation，多组学合成增强)，该模型专门设计用于整合和增强癌症依赖图谱(Dependency Map，DepMap)。通过利用正交的多组学信息，该模型成功生成了分子和表型谱，使多组学谱的数量增加了32.7%，从而为1523个癌症细胞系生成了完整的DepMap。这些人工合成增强的数据提高了统计检验效能，揭示了与药物耐药性相关的未被深入研究的机制，并完善了癌症细胞系的遗传关联性鉴定和聚类分析。通过应用SHAP进行模型解释，MOSA揭示了对以下两种任务至关重要的多组学特征1）细胞聚类2）与药物及基因依赖性相关的生物标志物鉴定。这种理解对于制定有效策略以优先考虑癌症靶点具有重要意义。 随着对癌细胞系分子和表型特征的深入研究，癌细胞系已成为最受关注的人类细胞模型之一。这些不断增长且丰富的多组学数据持续推动着癌症基因的鉴定和治疗靶点的发现。虽然基因组学一直是寻找癌症预测生物标志物的主要研究方向，但癌症依赖图谱(DepMap)联盟最近开展的功能基因筛选表明，仅有不到20%的RNA干扰癌症依赖性可以通过突变和拷贝数变异来解释。这突出表明了开发整体性机器学习模型的重要性，这类模型需要能够垂直整合正交数据集。在这种情况下，垂直整合不仅涉及基因组学，还包括其他类型的组学数据。 尽管深度学习在多组学整合方面取得了一些成功，但仍面临几个限制，其中最重要的是不同数据类型的高度异质性（例如，离散与连续分布的区别）、内在的技术局限性（例如，缺失值），以及有限的数据可用性（例如，在本研究中，仅有25.8%的癌细胞系具有全部七个组学数据集）。 无监督机器学习在多组学整合方面取得了成功，它能够捕捉不同组学之间共享的数据变化模式。这种方法揭示了与上皮-间质转化(EMT)相关的癌细胞状态，而EMT是药物耐药性和转移过程中的关键过程。基于无监督深度学习的模型可以通过重建缺失测量值和纠正实验误差来生成改进版本的输入数据集，从而增强下游分析。 虽然线性降维模型也是为类似目的而设计的，但深度生成模型在大规模多组学癌细胞模型中的应用仍然滞后。这导致了这些非线性方法在增强数据集和执行统计分析以改善癌症机制、生物标志物和药物靶点特征方面的应用存在空白。 变分自编码器(VAE)等深度学习模型为底层生物学数据提供了更复杂的公式。此外，VAE具有高度灵活的设计，可以稳健地处理数据稀疏性，并且易于扩展以整合不同的数据类型。特别是，基于VAE模型的方法在单细胞多组学整合和增强领域已经取得了显著成功。然而，这些方法通常预设存在特定的数据类型，如来自scRNA-seq和scATAC-seq的计数数据，这限制了它们在更广泛组学领域的应用。 在这项研究中，作者开发了一个多组学合成增强(MOSA) VAE模型，该模型可以整合并合成增强来自DepMap中超过1500个癌细胞系的多组学数据集。 模型部分 图 1 利用DepMap项目，作者整合了七个不同的癌细胞系数据集，包括基因组学、甲基化组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、药物反应和CRISPR-Cas9基因必需性数据（图1a）。这些数据涵盖了1523个癌细胞系，每个细胞系至少有两个可用的数据集。作者设计了针对癌细胞系多组学数据集的MOSA模型，进行了稳健的数据增强，并为生物标志物的发现提供了模型解释（图1b）。 首先，采用后期整合方法，作者为每个数据集训练了单独的编码器，以获得特定于每个组学层的潜在嵌入。这些嵌入随后被连接并进一步简化，形成了联合多组学潜在表示（图1c）。这里的潜在表示是神经网络隐藏层中学习到的抽象特征集（嵌入），它包含了输入数据的主要信息。与多组学线性降维方法MOFA和另一个基于VAE的方法MOVE相比，作者的模型在多组学潜在空间中能够更好地根据组织类型分离细胞系（图1c）。 其次，由于基因组学数据的稀疏性和定性特征，它带来了独特的挑战。为了解决这个问题，作者仅使用癌症驱动事件，并将基因组学分为拷贝数改动和突变两部分。拷贝数事件通过独立的编码器/解码器作为有序数据进行整合（类似于其他组学数据的处理方式），而突变则作为二元条件整合到每个编码器中（图1b）。这样设计的原理是：遗传背景会影响细胞特征和表型，从而调节其他组学层。条件矩阵包含了癌症驱动基因的遗传改变（包括基因融合）、细胞系的组织来源、细胞系生长速率测量值和微卫星不稳定性信息（MSI高），总共237个条件变量。这个条件矩阵进一步与学习到的多组学联合潜在空间连接，作为解码器的输入。因此，遗传背景和细胞信息对于生成潜在表示和重建每个组学数据集都至关重要。 第三，与用于单细胞数据的类似模型相比，DepMap中可用的样本数量有限且组学数据具有异质性，这给训练一个可推广的癌细胞系模型带来了重大挑战。为了降低模型复杂度，MOSA仅将变异性最大的特征作为编码器的输入，而所有特征都由解码器重建用于合成数据生成，这形成了VAE的非对称设计（图1b）。MOSA的这种独特设计使作者能够舍弃低信息量的特征，例如在所有癌细胞系中表达恒定的基因和非必需基因。这种设计将可训练参数减少了39.2%，同时保持了较低的重建误差。 第四，由于多组学数据集的规模差异，可能导致某些数据集在训练过程中占主导地位，从而降低模型的泛化能力和可解释性。作者开发了一个完整组学（视图）丢弃层，该层基于超参数对完整的组学层进行掩蔽。这显著改善了模型的泛化能力，为特定组学的癌细胞系提供了更好的重建结果（图1b）。随后，作者通过计算所有组学输入特征的SHAP值，对多组学模型进行解释，以评估这些特征对潜在空间整合和组学特征重建的重要性。这为探索潜在的非线性癌症基因型-表型关联提供了一个系统性的资源。 多组学合成数据的评估 图 2 使用10折交叉验证策略，MOSA重建的CRISPR-Cas9和药物响应的留出集与原始数据显示出稳健的相关性（特征的平均皮尔逊相关系数分别为0.35和0.65）（图2a）。与类似的系统性监督分析相比，MOSA表现更好。这些监督分析旨在预测每个CRISPR-Cas9基因依赖性，它们分别使用核心组学（如基因组学、转录组学）、仅基因组学或仅功能相关基因进行预测（最佳特征的平均皮尔逊相关系数为0.25）。 MOSA通过利用从原始数据中学习到的多组学潜在空间来重建输入数据矩阵。数据重建生成完整的组学矩阵，从而处理缺失值（部分数据集增强），更重要的是，通过垂直整合重建整个组学数据（完整数据集增强）（本研究中要求每个细胞系至少需要两个组学数据）。 对于部分数据集增强，MOSA可以填补不完整的特征，例如，由于质谱基础蛋白质组学数据常见的技术限制，某些蛋白质的测量数据比较稀疏。对于一个在模型训练期间完全缺失的最新独立药物响应数据集，MOSA准确地进行了重建（IC50值，皮尔逊相关系数r = 0.87，n = 32,659）（图2b），优于MOFA、MOVE和简单平均填充方法（图2c-e）。 MOSA的重建结果与原始数据集之间的显著差异揭示了可能存在的不准确实验测量。例如，对MEK1/2抑制剂曲美替尼的响应与重复测量结果以及同一细胞系中具有相同经典靶点的药物不一致。这些差异还突显出一些药物（如venetoclax）或药物类别（如抗凋亡抑制剂），它们目前缺乏有效的分子生物标志物，这凸显了为其响应开发可靠预测模型的挑战。 此外，蛋白质组学数据存在大量缺失值，主要影响低丰度蛋白质。MOSA使用所有组学的信息填充了原始矩阵约32%的数据，同时保持了与独立蛋白质组学数据集（CCLE）的样本相关性。值得注意的是，MOSA有效重建了SMAD4基因缺失细胞系中的SMAD4蛋白质谱，这类细胞系通常表现为SMAD4基因表达和蛋白质丰度较低。 MOSA增强的蛋白质组学矩阵保持了通过蛋白质配对相关性识别蛋白质相互作用的能力。与存在缺失值的原始矩阵相比，MOSA增强的蛋白质矩阵是完整的，可以直接用于下游分析，如广义线性模型，这改善了蛋白质复合物相互作用的召回率。 MOSA在完整数据集增强方面的效果 图 3 随后，作者评估了完整数据集增强的效果。对于缺乏蛋白质组学测量数据的癌细胞系，MOSA生成的合成蛋白质组学数据与独立的蛋白质组学测量结果显示出相关性，这种相关性与实际拥有蛋白质组学数据的细胞系相当（图3a）。在药物响应方面，107个重叠药物的重建结果与独立数据集（CTD2）的测量结果显示出稳健的相关性（图3b）。 作者通过比较原始数据矩阵和增强数据矩阵来评估下游分析。MOSA将CRISPR-Cas9细胞系筛选数量增加了34.9%，增强后的数据集提高了发现基因关联的统计效力(图3c)。基因必要性特异性(Fisher偏度检验)可用于识别选择性癌症脆弱性，结果显示合成的CRISPR-Cas9筛选细胞系与先前可用的筛选结果之间存在中等程度的正相关(皮尔逊相关系数r = 0.52)(图3d)。然而，由于潜在的非必需基因异常值的存在，这种相关性可能被低估了。MOSA准确重建了基因依赖关系，例如BRAF功能获得性突变癌细胞系中的BRAF依赖性(图3e)，以及携带FLI1-EWSR1融合基因的细胞系中的FLI1依赖性(图3f)。 最后，作者着手评估开发一种能够原生集成两种以上组学数据方法的优势。具体而言，作者关注了转录组学和药物反应数据集，它们分别代表分子和表型数据集。这两类数据集在多组学整合中经常被使用，也是作者基准测试中信息量最丰富的组学类型。在评估的方法列表中，作者考虑了iClusterPlus、JAMIE、scVAEIT和moCluster。MOSA在转录组学和药物反应数据的重建方面表现更好。特别是，向MOSA添加更多组学数据相比现有方法带来了显著改进，支持了使用整体多组学模型的价值。此外，MOSA在组织来源聚类方面持续优于其他方法。仅考虑转录组学和药物反应时，可以获得最佳的组织来源聚类结果，这反映了这些组学数据按组织来源的强结构特征。相比之下，其他组学如蛋白质组学和代谢组学按组织的结构性较弱。因此，包含按组织结构性较弱的组学数据自然会导致较松散的组织聚类。 综上所述，这些多样化的例子展示了MOSA在部分和完整数据集增强方面的能力，这些能力已通过来自不同实验室的各种独立数据集得到验证。大规模多组学数据集的生成既耗时又需要大量资源，因此MOSA成为了一个有价值的工具，可用于药物靶点的计算机模拟测试和优先级排序，为实验验证提供依据。 模型可解释展示了癌症的细胞状态 为了确定最有前景的靶点，模型需要在产生可靠预测之外具有可解释性。因此，作者使用SHAP算法来计算特征重要性，将其定义为每个特征对潜在空间的贡献量(图1b)。当按照相应的组学数据集对特征进行分组时，作者观察到代谢组学、药物反应和拷贝数变异表现出最高的平均特征重要性。关于条件特征，尽管它们的平均特征重要性适中，但某些关键特征，如TP53突变、生长率以及造血和淋巴组织来源，即使与其他组学数据集相比也显示出高度显著性(图4a)。这强调了将条件变量纳入模型的重要性。来自每个组学数据集排名前五的特征也验证了作者的方法能够重现与癌症相关的已知分子过程的能力(图4a)，例如CDKN2A拷贝数变异，以及对SRC家族抑制剂达沙替尼的敏感性。有趣的是，其他排名较高但不太明显的特征揭示了此前较少探索的生物学机制。 一个具体的例子是参与烟酸和烟酰胺代谢的代谢物1-甲基烟酰胺，经计算它是代谢组学中对多组学潜在表征最重要的特征(图4a)。作者观察到1-甲基烟酰胺细胞内含量增加与烟酰胺N-甲基转移酶(NNMT)酶的过表达之间存在强相关性，该酶催化这种代谢物的产生。作者还观察到1-甲基烟酰胺与癌细胞系的EMT状态之间存在关联，这一点通过VIM和CDH111的表达得到证实。这证实了最近一项单细胞研究的发现：携带EGFR激活突变的PC-9非小细胞肺癌细胞系通过EMT标志物的表达和1-甲基烟酰胺的积累，发展出对EGFR抑制剂的耐药性细胞状态。此外，在A549细胞系EMT早期阶段观察到1-甲基烟酰胺显著增加，这种增加与糖酵解代谢物和组蛋白翻译后修饰的变化相关，表明1-甲基烟酰胺与EMT过程中的表观遗传修饰之间存在联系。虽然需要进一步的实验验证，但这可能为识别导致药物耐药性的癌症细胞状态铺平道路。 为了深入研究，作者随后使用SHAP算法专门计算了药物反应重建的特征重要性，从而有助于发现最有前景的生物标志物。如预期的那样，药物反应特征本身平均而言是最重要的特征。值得注意的是，条件特征成为第二重要的组学数据，反映了组织来源、突变和生长率在影响药物反应中的关键作用。 以代谢物1-甲基烟酰胺为中心，已知与EMT相关的药物在1-甲基烟酰胺的特征重要性排名中位列前茅（图4b）。除了Daraprim（Pyrimethamine）这个未被纳入数据集作为抗癌药物的药物外，排名前五的所有药物在近期研究中都被发现与EMT有关。具体来说，UNC0638、Entinostat和BIX02189能够抑制EMT，而甲氨蝶呤则表现出诱导EMT的能力。这一发现表明排名最高的药物Daraprim可能也与EMT密切相关，为癌症治疗中的药物重新定位提供了潜在途径。其他与EMT相关的特征，如GPX1蛋白强度，也在Daraprim的顶级特征中排名靠前，这表明可以利用列表中的其他特征来发现最有前景的药物反应生物标志物（图4c）。 在这些排名靠前药物的其他重要特征中，KRAS和KMT2D被一致识别为具有高度重要性，这两个基因都与EMT有关。最后，作者使用外部代谢组学数据集来验证通过SHAP值与1-甲基烟酰胺相关的药物。虽然在他们的研究中没有直接测量1-甲基烟酰胺的丰度，但作者分析了与烟酸和烟酰胺代谢相关的药物，其中1-甲基烟酰胺是烟酰胺甲基化的直接产物。通过SHAP值识别的几种重要药物，包括Daraprim、UNC0638、Entinostat（MS-275）和PAC-1，也被排名为耐药或敏感药物。 综上所述，作者的发现表明1-甲基烟酰胺和EMT在数百个癌细胞系中存在广泛的关联，并可能在药物耐药性中发挥作用。虽然需要进一步评估来证实这一点，但从更广泛的角度来看，这揭示了使用MOSA作为整体模型的潜力。该模型可以整合癌细胞的分子和表型数据，用于研究癌细胞状态、药物耐药性及其潜在机制。 编译|黄海涛 审稿|王梓旭 参考资料 Cai, Z., Apolinário, S., Baião, A. R., Pacini, C., Sousa, M. D., Vinga, S., ... & Gonçalves, E. (2024). Synthetic augmentation of cancer cell line multi-omic datasets using unsupervised deep learning. Nature Communications, 15(1), 1-12.