甲贝观察｜一文了解CD3靶点及相关药物研发进展

2023-05-27

免疫疗法细胞疗法

阅读指南篇幅较长，可根据兴趣选择阅读1T细胞与CD分子预计阅读时长 1 min2靶点结构预计阅读时长 1 min3信号通路预计阅读时长 1 min+ 8 min4疾病&药物类型预计阅读时长 1 min5研究现状预计阅读时长 1 min6活性检测细胞株预计阅读时长 3 minT细胞与CD分子T淋巴细胞（T lymphocyte) 简称T细胞，起源于骨髓的多能干细胞，在胸腺内胸腺激素的诱导下，分化为成熟的T淋巴细胞，再通过淋巴及血液循环分布到全身免疫器官及组织，发挥免疫杀伤及免疫调控等功能。分化簇（cluster of differentiation, CD）专指白细胞膜上的抗原或抗原识别的抗体，又称为白细胞分化抗原（leukocytedifferentiation antigen，LDA），如CD3、CD20和CD25等。它们多是细胞膜上的穿膜蛋白或糖蛋白（目前“CD”不仅代表白细胞表面抗原，还有红细胞、血小板和髓系细胞表面抗原，以及其他组织细胞表面或细胞内容的抗原）。这些CD分子是T淋巴细胞及其亚群之间相互识别的分子基础，广泛参与免疫细胞的抗原识别、细胞黏附及信号转导，是炎症发生、免疫应答、肿瘤转移等一系列重要生理和病理过程的分子基础。T细胞的活化是启动适应性免疫应答的关键步骤。下面我们将介绍CD3 /T细胞受体（T cell receptor，TCR）的信号转导。靶点结构CD3分子作为重要的白细胞分化抗原表达于所有T淋巴细胞表面，是T淋巴细胞鉴定的重要标记。CD3分子包括εδ、εγ 和ζζ 二聚体。在CD3γ，δ，ε 三条链中含有高度保守的酸性氨基酸残基( CD3γ 为谷氨酸，CD3δε 为天冬氨酸) ，这使三条肽链中的酸性氨基酸残基可以与TCR α 和β 链上的碱性氨基酸残基形成稳定的结构。在CD3胞质段含免疫受体酪氨酸活化基序( immunoreceptor tyrosine-based activation motif， ITAM) ，CD3γ，ε 和δ 链，每个包含一个单一的ITAM，而每个ζ 链含三个不同的ITAM( ζa，ζb 和ζc) ，共计10个ITAM 序列。成熟的TCR是由α 和β 链以共价连接的异源二聚体( TCR αβ) ，TCR的二级结构分别由259(α)个和296(β) 个氨基酸残基组成。TCR的α，β 链包含一个可变结构域(V) 和一个恒定的免疫球蛋白结构域(C) ，其中V主要功能为识别抗原,C的功能是通过一个半胱氨酸与另一个链形成巯基桥。图1.CD3结构示意图信号通路CD3靶点参与的信号通路主要有以下几个：TCR信号通路：CD3靶点与TCR复合物结合后，可以促进TCR复合物的聚集和激活，从而启动TCR信号通路。T 细胞受体 (TCR) 激活可促进许多信号转导级联反应，通过调控细胞因子产物、细胞生存、增殖和分化来最终决定细胞命运；PI3K-Akt信号通路：CD3靶点激活后，可以通过激活PI3K-Akt信号通路，促进T细胞增殖和生存，并调节T细胞的免疫应答； MAPK信号通路：CD3靶点激活后，可以通过激活MAPK信号通路，促进T细胞的增殖、分化和功能调节； NF-κB信号通路：CD3靶点激活后，可以通过激活NF-κB信号通路，促进T细胞的增殖、分化和生存，并调节T细胞的免疫应答；Ca2+信号通路：CD3靶点激活后，可以通过激活Ca2+信号通路，促进T细胞的增殖、分化和功能调节，并调节T细胞的免疫应答；总之，CD3靶点参与的信号通路非常复杂，其作用涉及到T细胞的增殖、分化、生存和免疫应答等多个方面。CD3/TCR信号通路（详解篇）拓展篇图2.CD3 /TCR 复合物信号通路示意图CD3 /TCR 复合物是CD3分子通过盐桥与TCR以非共价键相连而成，参与T淋巴细胞识别、黏附、活化抗原和信号转导。而CD3 /TCR复合物不仅负责抗原识别和信号传递，还利用不同的模块和分子控制抗原在细胞表面的表达。在未成熟的T淋巴细胞，CD3 /TCR识别由主要组织相容性复合体( major histocompatibility complex，MHC) 呈递的内源性抗原肽触发出信号，使未成熟T淋巴细胞在胸腺经历阳性选择和阴性选择，从而成为外周幼稚T淋巴细胞。在成熟T淋巴细胞，外来抗原肽与自身MHC结合后活化CD3 /TCR复合物，后者是抗原特异性T淋巴细胞分化为效应或记忆T淋巴细胞的关键性一步。在这一过程中，CD3ε发挥关键作用，阻断CD3ε 可导致T淋巴细胞停留在双阴性阶段，而阻断CD3δ 和CD3γ 没有造成这样的缺陷，而缺陷的TCR信号同样可导致T淋巴细胞的选择不当和自身反应性T淋巴细胞的产生，或使T细胞无法识别、清除抗原。免疫突触是一种特殊的细胞间连接，CD3+T 细胞和APC之间免疫突触的形成依赖于TCR和整合素的参与,TCR信号在细胞间接触部位的边缘激活Arp2 /3与支链肌动蛋白丝复杂聚合反应，驱动CD3+T细胞在APC表面聚集，触发免疫突触的形成。这涉及表面受体、胞内小泡和APC或靶细胞快速、协调的移向接触点。而TCR与MHC特异性结合是导致免疫突触装配的主要事件。TCR识别并结合由MHC分子呈递的抗原肽，导致CD3的ITAM 保守序列的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶磷酸化。淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶( lymphocyte-specific protein tyrosine kinase，Lck) 和原癌基因酪氨酸蛋白激酶都属于Src 家族激酶，其中Lck 有4个监管结构域: SH4，UD，SH3和SH2。ITAM酪氨酸残基已被发现可以与Lck结构域相互作用，影响Lck的底物选择性。Lck对CD3链具有强选择性，而CD3ε 是最有利的，这是因为CD3ε残基序列和Lck UD 的酸性残基之间丰富的离子相互作用。功能试验表明，通过CD3ε 募集Lck控制TCR磷酸化的启动。在生理pH 值，人CD3ε 和CD3ζ 分别携带+11，+5的电荷，而CD3δ 和CD3γ携带0电荷。静息T 细胞表面的CD3ε 和CD3ζ 可以通过离子相互作用绑定到质膜的酸性磷脂上，这可以使双层膜上的关键酪氨酸发生磷酸化。而这种安全的绑定控制可以被Ca2+和其他因素去除活化的T细胞，使酪氨酸磷酸化时CD3ε 和CD3ζ是可用的。可逆的脂质结合CD3ε 和CD3ζ 使调控ITAM的磷酸化更精确。这种机制是否也适用于CD3δ 和CD3γ 仍不清楚。ITAM 的磷酸化是T细胞活化信号转导过程早期阶段的重要生化反应之一，而有缺陷的TCR信号可导致T细胞的选择不当。骨髓衍生抑制细胞介导CD3 /TCR的抑制作用，这些细胞产生过度的活性氧类和过氧化亚硝酸盐从而改变TCR识别抗原肽的能力，同时肿瘤微环境中炎性因子亦诱导骨髓衍生抑制细胞的聚集，增加其抑制活性，从而促进肿瘤生长。其机制为有效的免疫反应的开发提供了药理学干预的可能性。疾病&药物类型CD3靶点是一种常见的免疫治疗靶点，它能够激活T细胞，诱导它们攻击癌细胞。基于对CD3的认识加深，近年来CD3靶点在以下领域展露出成药的潜力和希望： CAR-T细胞治疗：CAR-T细胞（嵌合抗体受体T细胞）是一种最先进的靶向治疗方法，它可以改造患者的自身T细胞，美国国家过敏和传染病研究所针对免疫缺陷综合征在研的靶向CD3×CD19的一款CAR-T药物目前处于临床2期；单克隆抗体：如Teplizumab（泰普利单抗，Provention Bio），作为CD3抑制剂，是一个可以延缓1型糖尿病前期的药物。该药物也于2022年11月17日获得FDA批准上市，是除了胰岛素外，全球首个用于1型糖尿病的first-in-class生物药.双特异性抗体：双特异性抗体是一种能够同时识别CD3和肿瘤细胞上的抗原的抗体，它可以促进T细胞攻击靶细胞。这种治疗方法还处于研究阶段，但已经显示出很大的潜力；三特异性抗体：近日，Sanofi RD的科学家们设计了一款HER2/CD3×CD28三特异性抗体（通过CD3和CD28双信号通路刺激T细胞的激活和增殖），并调查了这类三抗抵抗乳腺癌的潜力；2021年底，博锐生物的三特异抗体BR110（CMG1A46）的临床试验请求获国家药品监督管理局同意，这是全球首个获批临床的CD3/CD19/CD20三抗产物；2022年6月，惠和生物首个靶向CD19/CD3/CD28的三特异性抗体CC312的IND申请获得FDA默示许可，这是国内首个、全球第三个基于CD28共刺激信号进入临床研发阶段的三特异性抗体。融合蛋白：2022年1月，Immunocore公司的Tebentafusp被FDA批准用于治疗HLA-A*02:01阳性、不可切除或转移性葡萄膜黑色素瘤成年患者。Tebentafusp作为一种双特异性融合蛋白，通过高亲和力 T 细胞受体 (TCR) 结合域和抗 CD3 T 细胞接合域引导 T 细胞杀死表达 gp100 的肿瘤细胞。图3.CD3-BsAbs在肿瘤中的作用机制CD3靶点作为新型的免疫治疗方法，正在不断地发展和完善，它将为患者提供更为有效的肿瘤治疗方案。研究现状目前，海内外布局CD3靶点相关生物药研究管线的公司和机构很多。在国内市场，CD3同样是药物研发的主要靶点，国内有2款CD3相关抗体药已经获批上市，为安进开发的靶点为CD3×CD19的倍利妥（Blinatumomab）CD3×CD19的倍利妥（Blinatumomab）和抗人T细胞CD3鼠单抗 CD3鼠单抗（武汉生物制品研究所）。全球范围内，以CD3为双抗药物研发主要靶点的在研项目总计262项。除此之外，共有124款处于临床阶段，121款处于临床前或申报临床阶段。从靶点组合看，CD3×CD20组合的双抗药物布局最多共26款，其中3款已经获批（Epcoritamab、Glofitamab、Mosunetuzumab），9款已进入临床阶段；CD3×BCMA组合的双抗布局数量排名第二，共21款，其中一款批准上市（Teclistamab），一款上市申请中（Elranatamab），14款已进入临床阶段。靶点组合为VEGF×CD3组合的双抗共计16个项目，8款处于临床阶段，1款处于IND申报阶段。相较于其它类型的双抗产品，CD3双抗研发目前遇到的主要问题有严重的细胞因子风暴(CRS)、招募泛T细胞亚群和实体瘤疗效不明显等，这些问题大大降低了CD3双抗临床试验的成功率，也亟待新技术的解决。活性检测细胞株传统CD3 靶点活性是以体外刺激T细胞的强弱程度来检测抗体体外活性的强弱，该方法重复性差、不够稳定，导致结果准确性差。甲贝医药通过构建报告基因细胞株作为效应细胞，抗体的Fab区结合靶细胞的抗原区，和报告基因细胞株表面的CD3结合，从而激活下游信号通路，诱导报告基因Luciferase 的表达， Luciferase 的信号值高低和抗体活性成正比。图4.CD3活性检测细胞株机制图甲贝医药构建的报告基因法优势如下：方法稳定、变动小；实验窗口大、响应值高；利用转基因构建的效应细胞可稳定传代；该细胞株可以作为所有CD3靶点抗体活性检测的效应细胞；适合放行、长期稳定性检测，方便方法验证；数据展示物料信息细胞：Jurkat-CD3-Luc（甲贝医药,CAT#SBTCL008）药物：Anti-CD3 Ab （甲贝医药）实验培养基：99%RPMI 1640+1%FBS反应底物：ONE-Glo Luciferase Assay System数据流式结果利用流式细胞仪FACS检测Jurkat-CD3-Luc 细胞株表面CD3的表达情况，用Jurkat空细胞做阴性对照对比，结果表明Jurkat-CD3-Luc 细胞株的CD3阳性率高达97%，细胞株表面高表达CD3，结果见图5和表1。图5.Jurkat-CD3-Luc 细胞株表面CD3表达流式结果图表1.Jurkat-CD3-Luc细胞株流式结果数据表专属性考察用Anti-CD3 Ab 抗体和不相关抗体Human IgGs检验Jurkat-CD3-Luc 细胞株的专属性，结果显示Jurkat-CD3-Luc 细胞株对Anti-CD3 Ab 抗体有明显的剂量依赖效应，而无关抗体Human IgGs没有剂量依赖效应。专属性结果如下图6。图6.Jurkat-CD3-Luc 细胞株专属性考察结果（Ab1和Ab2都是CD3抗体）代次稳定性考察验证细胞Jurkat-CD3-Luc的代次稳定性，用P10、P21 和P29 代次的细胞对比做活性实验，结果显示在P29 次内实验方法依然稳定，曲线表现一致，EC50 变化在接受标准范围内，因此此细胞株在P29 次内稳定。代次稳定性考察结果图如下图4。图7.Jurkat-CD3-Luc 细胞株放入代次稳定性考察结果文献引用[图12] 川大生物治疗国重杨金亮课题组[1] 殷和松,孔英君,李世敏等.CD3/TCR的信号转导及CD3+T淋巴细胞在实体肿瘤中的表达[J].医学综述,2018,24(11):2150-2154.[2] Combined Immunoscore of CD103 and CD3 Identifies Long-Term Survivors in High-Grade Serous Ovarian Cancer[J]. Hans-Christian B?smüller;;Philipp Wagner;;Janet Kerstin Peper;;Heiko Schuster;;Deborah Lam Pham;;Karen Greif;;Christine Beschorner;;Hans-Georg Rammensee;;Stefan Stevanovi?;;Falko Fend;;Annette Staebler.International Journal of Gynecological Cancer,2016[3] https://diabetes.ucsf.edu/teplizumab甲贝医药活性检测平台在抗体药物的临床前研发中，一旦确定抗体药物的分子形式并在哺乳动物细胞中表达出抗体蛋白分子后，就需要对抗体的活性进行验证与测定。活性测定是对药物的有效成分和含量以及药物效价的测定，是确保抗体类药物有效性的重要质控指标。现阶段抗体药物的活性分析方法主要是体外(in vitro)检测，主要有基于细胞、转基因细胞以及新技术应用三方面对抗体药物活性测定的方法。报告基因检测系统就是其中一种方式，由于其方法稳定，方便验证，被广泛用于批次放行、稳定性检测。甲贝医药提供多种热门靶点的活性报告基因细胞株，拥有完善的单抗、双抗及多抗的活性细胞株检测体系，如CD3/EGFR、PD-1/CTLA4、PD-L1/CD47、PD-L1/TGFβ和PD-L1/VEGF等双抗分子活性检测，可按照客户需求，提供定制化方案。相关细胞株产品具有构建资料完整、溯源性好、稳定性好和便于方法验证等优势，符合客户GMP检测的需求，非常适合放行/稳定性检测，能够满足客户IND/NDA申请要求。我们的产品具有：试剂采购发票完整，细胞株构建记录完整，溯源性好，可以满足中美双报要求大量数据验证，专属性，重复性、精密度，代次稳定性表现良好产品手册ROA指导客户建立方法根据客户需求建立相应活性用细胞株及方法甲贝医药活性细胞系目录（限时优惠）点击链接靶点专题Insulin|GIP|GLP1|GH|FSH|PD-1/PD-L1|CTLA4|CD32a|CD47|CD16a|VEGF|TRKA【近期活动】甲贝医药（Shell BioTech）是一家线上和线下联动的新型生物药 CDMO技术服务平台，致力于为客户的蛋白抗体类药物提供从“Shell DA™（可开发性评估）到 IND”一站式技术服务，如靶点调研、市场分析、分子设计和筛选、成药性评估、细胞株构建、生产工艺开发、IND 申请和 cGMP 生产等,同时提供美国及欧盟报批所需的全部药学资料，也为核酸类和 XDC 药物提供专业高效的研发服务和技术支持。目前，已经与40多家医药企业合作，加速生物药创新开发。我们将始终坚守让好药、让健康属于每一位患者的使命，坚持客户第一，加速生物药创新，赋能未来！甲贝医药测试事业部（STD）依托甲贝医药一站式CDMO平台丰富的生物药生产和质量分析经验，为抗体、重组蛋白、细胞因子、蛋白偶联物、多肽、mRNA类、小分子核酸类和细胞疗法等新型药物，提供从Discovery到 Manufacturing全流程、个性化的质量解决方案，特色服务有mRNA药物的可开发性评估、分析检测和加帽率检测等。固定电话：021-5470 6068手机：191 2130 9459邮箱：service@shellbiotech.com网址：www.shellbiotech.com地址：中国上海闵行区梅陇镇景联路258号6号楼期待您的来电！

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