Blinatumomab

摘要：双特异性抗体（bsAbs）作为下一代治疗性抗体，凭借其 “同时靶向两个抗原” 的独特能力，在癌症免疫治疗、自身免疫疾病、罕见病等领域展现出不可替代的优势。截至 2024 年，全球已有超过 20 种 bsAbs 获批上市，另有数百种处于临床研发阶段。然而，bsAbs 的复杂分子结构（如多条肽链组装需求）使其生产面临三大核心挑战：链错配导致的杂质生成、易聚集的稳定性问题、大规模生产的工艺适配性。本文从工程表达平台、纯化工艺、生物分析方法、可开发性评估四个维度，系统解析 bsAbs 生产的关键技术进展 —— 包括单载体/四载体系统解决链错配、CHO 细胞与无细胞系统的表达选择、混合模式层析（MMC）突破纯化瓶颈、可开发性指数实现早期风险筛选等；同时展望未来技术方向，为 bsAbs 从实验室成果转化为临床药物提供全面参考。 1.引言：双特异性抗体 —— 开启靶向治疗的 “双引擎” 时代 传统单克隆抗体（mAbs）仅能结合一个抗原，在复杂疾病（如肿瘤、自身免疫病）的治疗中常受限于 “单一靶点无法覆盖多通路” 的瓶颈。而双特异性抗体（bispecific antibodies, bsAbs） 通过设计可同时结合两个不同抗原或表位，实现了 “1+1>2” 的治疗效果：例如，靶向 CD3（T 细胞表面分子）和 CD20（B 细胞肿瘤抗原）的 bsAbs，可精准 “牵引” T 细胞攻击肿瘤细胞；治疗 A 型血友病的 Emicizumab，则通过同时结合凝血因子 IXa 和 X，替代缺失的凝血因子 VIII 功能。 截至目前，科研人员已开发出超过 50 种重组 bsAbs 格式，主要分为两大类： IgG 样 bsAbs：保留 Fc 段，具有较长的体内半衰期和抗体依赖的细胞毒性（ADCC），如 Symmetric 型（如 Emicizumab）、Asymmetric 型（如 Glofitamab）； 非 IgG 样 bsAbs：无 Fc 段，分子量小、组织穿透性强，但半衰期短，如片段化的 Blinatumomab（BiTE 格式）、Tebentafusp（双亲和重定向格式）。 尽管 bsAbs 的治疗潜力巨大，其生产过程却远比 mAbs 复杂。核心难点在于： 正确组装难题：多条不同肽链（如两条重链、两条轻链）易发生 “链错配”，生成同源二聚体、半抗体等无活性杂质，部分 Asymmetric bsAbs 的错配杂质占比甚至高达 90%； 稳定性挑战：额外的结构域（如 scFv）或突变（如为促进异二聚化的 KIH 突变）会增加分子柔性，导致聚集风险上升—— 例如某 IgG-scFv 型 bsAbs 在 5mg/mL 浓度下，聚集率可升至 50%； 下游纯化复杂：bsAbs 与杂质（如宿主细胞蛋白 HCPs、病毒、错配片段）的理化性质差异小，传统 mAbs 的纯化工艺无法直接套用。 解决这些挑战，需要从 “上游工程表达” 到 “下游纯化分析” 的全流程技术创新 —— 这正是本文接下来要重点解析的内容。2. 上游工程与表达平台：为 bsAbs “搭好骨架” bsAbs 的正确表达是生产的第一步，核心在于通过载体设计和表达系统优化，实现 “高产量、低错配、高活性” 的目标。近年来，载体系统的进化和表达平台的多样化，为这一目标提供了关键解决方案。2.1 载体系统：从 “多质粒混乱” 到 “单载体精准” 早期 bsAbs 表达依赖 “多质粒系统”—— 即每条肽链（重链 1、重链 2、轻链 1、轻链 2）分别由不同质粒编码，通过共转染进入宿主细胞。但这种方式存在两大问题：一是质粒转染效率差异导致链表达不平衡，加剧错配；二是操作复杂，批次重复性差。 为解决这些问题，载体系统经历了三次关键进化：（1）单载体系统：一条质粒编码所有链 单载体系统将 bsAbs 的所有链（如两条重链、两条轻链）整合到一个质粒中，通过内部核糖体进入位点（IRES） 或2A 肽实现多链协同表达。例如，利用 2A 肽的 “自剪切” 特性，可使不同链从同一转录本中高效释放，确保表达比例平衡 。这种系统大幅降低了转染 variability，使正确组装率提升 30% 以上。（2）双载体 / 四载体系统：应对复杂格式 对于结构更复杂的 Asymmetric bsAbs（如需要 4 条不同链的分子），单载体系统的插入片段过长，易导致质粒不稳定。此时，四载体系统（每条链单独一个质粒）结合转座子技术（如 Sleeping Beauty、Leap-In Transposase®）成为优选：转座子可将外源基因高效、稳定地整合到宿主基因组中，不仅提升表达产量（CHO 细胞中滴定度可达 5-10g/L），还能通过调控各质粒比例，减少错配。 例如，某团队利用 Sleeping Beauty 转座子系统，将 Asymmetric bsAbs 的 4 条链分别导入 CHO 细胞，通过优化质粒比例（重链 1: 重链 2: 轻链 1: 轻链 2=1:1:2:2），使正确异二聚体比例从 35% 提升至 82%。（3）附加体载体：无需整合，灵活表达 附加体载体（如基于 EB 病毒 EBNA1 蛋白的载体）无需整合到宿主基因组，即可在分裂细胞中稳定留存，尤其适合需要精准翻译后修饰（如特定糖基化）的 bsAbs。例如，利用附加体载体表达的抗 HER2 bsAbs，其糖基化均一性比整合型载体高 20%，且无基因组插入导致的随机突变风险。 图 1 展示了 bsAbs 从格式设计到载体选择的全流程方向，清晰呈现了不同格式与载体系统的适配关系。 [图 1 双特异性抗体（bsAbs）发现与生产的主要方向](此处为图表位置，原文图 1 内容：A. bsAbs 格式分类（对称型、不对称型、片段型）；B. 载体系统进化（多质粒→单载体→四载体 + 转座子）；C. 可开发性评估关键参数；D. 上下游工艺优化方向)2.2 表达系统：从原核到无细胞，各有优劣 选择合适的表达系统，是决定 bsAbs 活性、产量和成本的关键。目前主流系统分为四类：原核系统（大肠杆菌）、哺乳动物细胞（CHO、HEK293）、无细胞系统，各有适用场景。（1）大肠杆菌：早期研发的 “快速选择” 大肠杆菌（E. coli）是最早用于 bsAbs 表达的系统，优势在于生长快、成本低、操作简单—— 从接种到收获仅需 24-48 小时，适合早期候选分子的快速筛选。例如，已获批的 Tebentafusp（治疗转移性葡萄膜黑色素瘤）即通过 E.coli 表达 。 但大肠杆菌的局限性也很明显： 无法进行糖基化修饰：而糖基化对 IgG 样 bsAbs 的半衰期、ADCC 活性至关重要； 易形成包涵体：复杂 bsAbs（如多结构域分子）在 E. coli 中易折叠错误，形成不溶性包涵体，需后续复性，过程繁琐且回收率低（通常 <30%）。 因此，大肠杆菌目前主要用于非 IgG 样 bsAbs（如 scFv、BiTE）的表达，或早期研发阶段的快速验证。（2）CHO 细胞：工业生产的 “黄金标准” 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是目前 bsAbs 工业生产的首选系统，全球已获批的 bsAbs 中，80% 以上由 CHO 细胞生产（表 1）。其核心优势在于： 人源化翻译后修饰：能实现与人类抗体一致的糖基化（如唾液酸化、岩藻糖基化），避免免疫原性； 高产量与 scalability：通过培养基优化（如化学限定培养基）和培养工艺（如灌注培养），CHO 细胞的 bsAbs 滴定度可达到 10-15g/L，且能轻松放大至 2000L 生物反应器； 遗传稳定性强：经过数十年改造，CHO 细胞（如 CHO-K1、CHO-DG44）具有良好的遗传稳定性，批次间差异小。 例如，治疗多发性骨髓瘤的 Elranatamab、治疗滤泡性淋巴瘤的 Mosunetuzumab，均通过 CHO 细胞实现大规模生产，且产品纯度可达 99% 以上。（3）HEK293 细胞：瞬转表达的 “灵活补充” 人胚胎肾（HEK293）细胞的优势在于瞬转效率高—— 通过钙 phosphate 或脂质体转染，2-3 周即可获得 bsAbs 表达，适合早期候选分子的快速评估。此外，HEK293 细胞的糖基化更接近人类天然抗体，对于部分对糖基化敏感的 bsAbs（如靶向中枢神经系统的分子），其活性比 CHO 细胞表达的更高。 但 HEK293 细胞的缺点是长期培养稳定性差，且滴定度低于 CHO 细胞（通常 3-5g/L），因此主要用于临床前研究或小批量生产，难以满足商业化大规模需求。（4）无细胞系统：新型快速生产平台 无细胞表达系统（如 ALiCE®、XpressCF+™）是近年来的新兴技术，其原理是利用细胞提取物（如烟草 BY-2 细胞、E. coli 裂解液），在体外实现 bsAbs 的转录和翻译，无需活细胞培养。 这类系统的核心优势是快速、灵活： 速度快：从基因到功能 bsAbs 仅需 24-48 小时，比 CHO 细胞快 10 倍以上； 无细胞毒性限制：可表达对活细胞有毒性的 bsAbs（如某些细胞毒性融合蛋白）； 易修饰：可直接加入非天然氨基酸，实现 bsAbs 的定点标记（如荧光标记、PEG 修饰）。 例如，LenioBio 公司的 ALiCE® 系统（基于烟草 BY-2 细胞提取物），可在 48 小时内生产出活性良好的 IgG 样 bsAbs，且聚集率 <5%；Sutro Biopharma 的 XpressCF+™系统（E. coli 提取物），已用于多个 ADC 类 bsAbs 的早期研发。 表 1 汇总了截至 2024 年 11 月全球已获批的 bsAbs 及其表达系统，清晰展现了不同表达系统的临床应用情况。 表 1 截至 2024 年 11 月已批准的双特异性抗体（bsAbs） 2.3 哺乳动物细胞平台的优化：解决 “链错配” 与 “产量低” 尽管 CHO/HEK293 细胞是主流，但 bsAbs 的多链组装问题仍需针对性优化。近年来，三大技术策略成为解决核心难题的关键：（1）链配对工程：让肽链 “正确牵手” Knob-into-Hole（KIH）技术：在两条重链的 CH3 结构域分别引入 “旋钮”（如 T366W 突变）和 “孔洞”（如 Y407A 突变），通过空间互补促进异二聚化，使正确组装率提升至 90% 以上。例如，CrossMab 技术（KIH 结合轻链交换）可同时解决重链和轻链的错配问题，某抗 HER2/CD3 bsAbs 采用该技术后，错配杂质从 45% 降至 5% 以下； 可控 Fab 臂交换（cFAE）：将两个亲本 mAbs 的 CH3 结构域引入特定突变（如 S354C、T366W），在体外通过还原 - 氧化反应实现 Fab 臂交换，生成 bsAbs。该技术是 DuoBody 平台的核心，已用于 Glofitamab 等多个获批 bsAbs 的生产 。（2）细胞培养优化：提升产量与质量 培养基与培养工艺：采用化学限定培养基（无血清、无动物源成分），并通过 “流加培养”（定期补加葡萄糖、氨基酸）或 “灌注培养”（持续更换培养基）维持细胞高活性 —— 例如，某 CHO 细胞流加培养工艺通过优化谷氨酰胺和半胱氨酸浓度，使 bsAbs 滴定度从 6g/L 提升至 12g/L； 培养条件调控：降低培养温度（如从 37℃降至 30-33℃）可减少细胞凋亡和蛋白降解，某研究显示，温度降低后 bsAbs 的聚集率从 15% 降至 3%；添加 sodium butyrate（丁酸钠）可促进抗体分泌，产量提升 20-30%。（3）细胞系开发平台：高效筛选高产克隆 工业界已开发出多个专用细胞系开发平台，加速 bsAbs 高产克隆的筛选： AbZelectPRO™（Abzena）：结合 CHO-K1 细胞和 2G UNic® 载体技术，10 周内可完成从候选序列到研究细胞库（RCB）的构建，且细胞滴定度可达 8-10g/L； Apollo™X（FUJIFILM）：采用单轮克隆筛选策略，确保 monoclonality（单克隆性）>99%，适合 bsAbs 和 Fc 融合蛋白的大规模生产，某案例中其筛选的 CHO 克隆产量达 15g/L； Beacon®（Brukker）：利用光电子定位技术，将单个细胞置于纳升级 NanoPen® chambers 中，实时监测抗体分泌，可在 1 周内筛选出高产克隆，比传统方法快 5 倍。3. 下游纯化策略：为 bsAbs “去芜存菁” bsAbs 的下游纯化是生产的 “瓶颈环节”—— 由于其杂质（同源二聚体、半抗体、HCPs、病毒等）与目标分子的理化性质（如分子量、电荷、疏水性）高度相似，传统 mAbs 的 “捕获 - 中间纯化 - 精制” 三步法需大幅优化。本节将解析 bsAbs 纯化的核心挑战与解决方案。3.1 bsAbs 纯化的核心挑战 与 mAbs 相比，bsAbbs 的纯化面临三大独特挑战： 杂质多样性：除了 HCPs、DNA、病毒等常规杂质，还存在大量产品相关杂质，如同源二聚体（重链错配）、半抗体（仅一条重链 + 一条轻链）、轻链片段、聚集物等，部分杂质的分子量与目标 bsAbs 差异仅 5-10%； 易聚集特性：bsAbs 的额外结构域（如 scFv）或突变导致分子柔性增加，在纯化过程中（如低 pH 洗脱、高浓度）易发生聚集，影响产品活性和安全性； pH 敏感性：部分 bsAbs 在传统蛋白 A 层析的低 pH 洗脱条件（3.0-3.5）下易降解，需开发温和的洗脱策略。3.2 纯化全流程：从捕获到精制的技术创新 bsAbs 的纯化流程通常包括 “捕获→低pH病毒灭活→中间纯化→精制→病毒过滤→超滤/渗滤” 六个步骤（图 2），每个步骤均有针对性技术突破。（1）捕获阶段：高效富集目标分子 蛋白 A 亲和层析是 IgG 样 bsAbs 捕获的首选技术，其原理是蛋白 A 与抗体 Fc 段的特异性结合，可从细胞培养上清中快速富集目标分子，一步纯化后纯度可达 80-90%。但针对 bsAbs 的特点，需进行以下优化： 工程化蛋白 A 配体：传统蛋白 A 易与 bsAbs 的 VH3 结构域结合，导致错配杂质无法分离。新型配体如 PrismA（Cytiva）通过改造蛋白 A 的 B 结构域，增强对目标 bsAbs 的特异性，某案例中其可将同源二聚体杂质从 20% 降至 5% 以下；MabSelect SuRe LX（Cytiva）的动态结合容量（DBC）比传统蛋白 A 高 30%，适合高滴定度料液的处理； 温和洗脱条件：Purolite Jetted A50 HipH 树脂可在 pH 4.0-5.0 下洗脱 bsAbs，避免低 pH 导致的聚集 —— 某 pH 敏感型 bsAbs 采用该树脂后，回收率从 65% 提升至 90%； 缓冲液优化：添加 CaCl₂（氯化钙）或 L-Arg-HCl（L - 精氨酸盐酸盐）可增强杂质与蛋白 A 的分离，某研究显示，CaCl₂添加后半抗体杂质从 12% 降至 2%；添加 sodium caprylate（辛酸钠）可去除 HCPs，某案例中 HCP 残留从 500ng/mL 降至 50ng/mL。 对于非 IgG 样 bsAbs（无 Fc 段），需采用其他捕获技术： 蛋白 L 层析：蛋白 L 与抗体轻链的 κ 链结合，适合 Fab、scFv 等片段的捕获，如 Capto L（Cytiva）可用于 Blinatumomab 的捕获，纯度可达 85%； IMAC（固定化金属亲和层析）：通过在 bsAbs 上融合 His 标签，与镍 / 钴离子结合实现捕获，某 BiTE 分子经 IMAC 捕获后纯度达 90%，后续结合 SEC（体积排阻层析）可进一步提升至 99%。（2）中间纯化与精制：去除残留杂质 捕获后的 bsAbs 仍含有少量杂质（如 HCPs、聚集物、同源二聚体），需通过中间纯化和精制进一步去除。核心技术包括离子交换层析（IEX）、疏水作用层析（HIC）、混合模式层析（MMC），其中 MMC 是 bsAbs 纯化的 “利器”。（1）离子交换层析（IEX）：基于电荷差异分离 阳离子交换层析（CEX）：适合去除聚集物和半抗体，常用树脂如 Capto SP ImpRes（Cytiva）、ProPac WCX-10（Thermo）。某案例中，CEX 通过线性 pH 梯度（pH 5.0-7.0）洗脱，将 bsAbs 的聚集率从 8% 降至 1%； 阴离子交换层析（AEX）：主要去除 HCPs 和 DNA，常用树脂如 POROS HQ（Thermo）、MonoQ（Cytiva）。在 “流穿模式”（flow-through mode）下，带负电的 HCPs 和 DNA 结合到树脂上，目标 bsAbs 流穿，某案例中 HCP 残留从 100ng/mL 降至 10ng/mL。（2）疏水作用层析（HIC）：基于疏水性差异分离 HIC 通过高盐浓度下蛋白疏水区与树脂的相互作用实现分离，适合去除同源二聚体和聚集物。常用树脂如 Capto Phenyl ImpRes（Cytiva）、TOYOPEARL Butyl 600M（Tosoh）。某研究显示，采用 Capto Phenyl ImpRes 树脂，通过优化硫酸铵浓度，可将同源二聚体杂质从 15% 降至 2%。（3）混合模式层析（MMC）：多作用协同分离 MMC 结合了静电作用、疏水作用、氢键等多种相互作用，分离能力远超单一模式层析，是 bsAbs 精制的 “核心技术”。目前应用最广泛的 MMC 树脂包括： Capto Adhere ImpRes（Cytiva）：配体为 N - 苄基 - N - 甲基乙醇胺，可同时去除 HCPs 和聚集物。某 KIH 型 bsAbs 经该树脂流穿纯化后，HCP 残留降低 35 倍，聚集率从 10% 降至 4%； Capto MMC ImpRes（Cytiva）：配体为 N - 苯甲酰高半胱氨酸，适合去除半抗体和轻链片段。某 WuXiBody 型 bsAbs 经该树脂精制后，半抗体杂质从 8% 降至 1%； 陶瓷羟基磷灰石（CHT，Bio-Rad）：具有钙结合位点（C-sites）和磷酸结合位点（P-sites），可通过调节磷酸盐浓度实现多杂质同时去除。某案例中，CHT 层析一步即可去除聚集物（从 12% 降至 0.5%）、HCPs（从 50ng/mL 降至 5ng/mL）和病毒（log reduction value, LRV>4），纯度达 99%。（3）病毒清除与超滤/渗滤 病毒清除：采用 “低 pH 灭活 + 纳米过滤” 两步法 —— 低 pH（如 pH 3.0-3.5，维持 30-60 分钟）可灭活包膜病毒（如 VSV），纳米过滤（如 0.02μm 滤膜）可去除非包膜病毒（如 parvovirus），某工艺的病毒总 LRV>6，满足 regulatory requirements； 超滤/渗滤（UF/DF）：通过 30kDa 分子量截留膜，实现 bsAbs 的浓缩（如从 1g/L 浓缩至 50-100g/L）和缓冲液交换（如交换至组氨酸 - 盐酸缓冲液），为后续制剂做准备。某案例中，采用切向流过滤技术，bsAbs 的回收率达 95% 以上。 图 2 展示了 bsAbs 的下游纯化全流程，对比了传统工艺与新型 MMC 优化工艺的差异。 [图 2 双特异性抗体（bsAbs）的下游纯化流程](此处为图表位置，原文图 2 内容：A. 传统流程（捕获：蛋白 A 层析→中间纯化：AEX→精制：CEX→病毒过滤→UF/DF）；B. MMC 优化流程（捕获：蛋白 A→中间纯化：MMC→精制：CEX→病毒过滤→UF/DF）；C. 高效 MMC 流程（捕获 + 中间纯化：MMC→精制：CEX→病毒过滤→UF/DF）)3.3 典型杂质的针对性去除方法 bsAbs 的杂质类型多样，需根据杂质特性选择合适的纯化技术。表 2 汇总了主要杂质的去除方法、所用树脂及作用机制。 表 2 双特异性抗体（bsAbs）主要杂质的层析去除方法 4. 生物分析与可开发性评估：为 bsAbs “保驾护航” bsAbs 的质量控制和可开发性评估是确保其临床安全有效的关键 —— 需通过一系列分析技术验证分子的完整性、活性、稳定性，并在早期筛选阶段识别高风险候选分子，避免后期开发失败。4.1 bsAbs 的质量分析技术 bsAbs 的质量分析需覆盖 “结构完整性”“结合活性”“稳定性”“体内特性” 四大维度，核心技术如下：（1）结构完整性分析 变性毛细管电泳（CE-SDS）：通过 SDS 变性处理，分离 bsAbs 的重链、轻链及片段，评估链完整性。例如，某 Asymmetric bsAbs 经 CE-SDS 分析，发现其重链错配率 <5%； 体积排阻色谱（SEC）：检测 bsAbs 的聚集物和片段，常用 SEC-MALS（多角度光散射）联用技术，可同时测定分子量和聚集率。某研究显示，SEC-MALS 可检出 0.1% 的低分子量（LMW）片段； 反相高效液相色谱（RP-HPLC）：基于疏水性差异分离同源二聚体和目标 bsAbs，某案例中 RP-HPLC 的分辨率达 0.8，可有效区分 pI 差异仅 0.1 的两种同源二聚体； 质谱（MS）：解析 bsAbs 的分子量、翻译后修饰（PTMs）和序列完整性。通过 deglycosylation（去糖基化，如 PNGase F 酶解）可减少糖基异质性，某 MS 分析显示，去糖基化后 bsAbs 的分子量测定误差 <0.1%；此外，MS 可检测氧化（如甲硫氨酸氧化）、脱酰胺（如天冬酰胺脱酰胺）等 PTMs，某研究发现，某 bsAbs 的 Asn31 脱酰胺率 > 10% 时，结合活性下降 50%。（2）结合活性分析 桥联 ELISA：通过包被两个不同抗原，检测 bsAbs 同时结合两个抗原的能力，是筛选 bsAbs 的核心方法。某桥联 ELISA 可检出 0.1ng/mL 的活性 bsAbs，比传统单抗原 ELISA 灵敏 10 倍； 表面等离子体共振（SPR）：测定 bsAbs 与两个抗原的结合动力学（ka、kd、KD），评估结合亲和力。例如，SPR 分析显示，某抗 PD-1/CTLA-4 bsAbs 与 PD-1 的 KD 为 1nM，与 CTLA-4 的 KD 为 2nM，表明其双靶点结合能力均衡； 细胞水平活性分析：评估 bsAbs 的生物学功能，如 T 细胞激活实验（检测 IL-2 分泌）、肿瘤细胞杀伤实验（检测 LDH 释放）。某 T 细胞结合 bsAbs 的细胞杀伤实验显示，其 EC50（半数有效浓度）为 0.1nM，比亲本 mAbs 低 10 倍。（3）稳定性分析 差示扫描量热法（DSC）：测定 bsAbs 的 melting temperature（Tm），评估热稳定性。IgG 样 bsAbs 的 Fc 段 Tm 通常为 75-80℃，若 Tm<70℃则需优化 ； 差示扫描荧光法（DSF）：通过荧光染料结合变性蛋白的疏水区域，快速筛选热稳定性，适合高通量分析。某研究用 DSF 筛选 100 个 bsAbs 候选分子，1 周内识别出 20 个 Tm>75℃的高稳定性分子； 加速稳定性实验：在高温（如 40℃）、强光（如 4500lux）、反复冻融（-80℃至室温）条件下，监测 bsAbs 的聚集率和活性变化。某 bsAbs 在 40℃放置 1 个月后，聚集率 <5%，活性保留> 90%，符合临床要求。（4）体内特性分析 血清稳定性：在 37℃下孵育人血清，评估 bsAbs 的降解情况。某研究显示，某非 IgG 样 bsAbs 的血清半衰期 <2 小时，需通过 PEG 修饰延长至 24 小时； 药代动力学（PK）：在小鼠、食蟹猴等动物模型中测定 bsAbs 的血药浓度 - 时间曲线，评估半衰期（t1/2）和清除率（CL）。IgG 样 bsAbs 的 t1/2 通常为 2-3 周，非 IgG 样 bsAbs 需通过白蛋白融合、PEGylation 等技术延长半衰期； 药代动力学 - 药效动力学（PK-PD）模型：预测 bsAbs 的体内疗效，某 PK-PD 模型显示，某抗 CD3/CD20 bsAbs 的血药浓度 > 1μg/mL 时，肿瘤抑制率 > 80%。4.2 bsAbs 的可开发性评估 可开发性评估的核心是 “早期筛选、降低风险”—— 需在候选分子阶段（如临床前）评估其 “可制造性”“稳定性”“安全性”，关键参数和方法如下：（1）关键可开发性参数 聚集性：通过 SEC 和 DSF 评估，聚集率 > 5% 或 Tm<70℃的分子需优化； 疏水性：通过 HIC 或 RP-HPLC 测定保留时间（RT），RT 过长（疏水性过高）易导致非特异性结合和聚集； 电荷异质性：通过等电聚焦（cIEF）或离子交换色谱（IEX）评估，pI 不在 7-9 范围内的分子易吸附到层析树脂，导致纯化损失； 浓度耐受性：通过超滤浓缩至 50-100mg/mL，评估粘度和聚集率，粘度 > 20cP（厘泊）的分子不适合皮下注射。（2）可开发性评估工具 可开发性指数：通过计算分子的疏水相互作用、静电相互作用得分，预测聚集风险。某可开发性指数≥0.8 的 bsAbs，后期开发成功率比 <0.5 的分子高 3 倍； DOTAD 数据库：整合了 1000 + 治疗性抗体的序列、可开发性数据（如 Tm、聚集率、pI），为计算工具提供训练数据，帮助研究者快速评估候选分子的可开发性； in silico 预测工具：通过机器学习预测 bsAbs 的热稳定性、聚集性。某工具基于 1000 个抗体的序列和 Tm 数据，预测准确率达 85%。（3）可开发性评估案例 T 细胞结合 bsAbs：这类分子常含 scFv 结构域，易聚集。某研究发现，scFv 的 VH-VL 界面引入二硫键后，聚集率从 20% 降至 3%，可开发性显著提升； 非 IgG 样 bsAbs：半衰期短是主要问题。某 BiTE 分子通过融合白蛋白结合结构域，半衰期从 2 小时延长至 36 小时，且无免疫原性； 高疏水性 bsAbs：某抗 EGFR/HER2 bsAbs 因疏水性过高，纯化回收率 <50%，通过突变 CDR 区的疏水残基（如 Phe→Ser），疏水性降低 30%，回收率提升至 85%。5. 结论与未来展望 双特异性抗体（bsAbs）作为下一代治疗性抗体，已在癌症、罕见病等领域展现出巨大临床价值，但仍面临 “生产工艺复杂”“下游纯化瓶颈”“可开发性评估不足” 三大挑战。近年来，通过载体系统进化（如四载体 + 转座子）、表达平台优化（如 CHO 细胞流加培养）、纯化技术创新（如 MMC、CHT）、分析方法升级（如 SEC-MALS、SPR），bsAbs 的生产效率和质量已大幅提升 —— 例如，某 Asymmetric bsAbs 的正确组装率从 35% 提升至 90%，纯化回收率从 60% 提升至 90%，为其临床转化奠定了基础。 未来，bsAbs 生产技术将向三大方向发展： 下游工艺创新：目前上游表达工艺（如 CHO 细胞滴定度）已达 15g/L，而下游纯化的收率仍 < 80%，需开发新型层析树脂（如靶向杂质的亲和树脂）和连续纯化技术（如多柱逆流溶剂梯度纯化），进一步提升效率； AI 辅助设计：利用 AI 预测 bsAbs 的链配对效率、聚集风险、纯化工艺参数，例如，某 AI 模型可基于序列预测 bsAbs 的 Tm 和聚集率，筛选效率比传统方法快 10 倍； 临床应用扩展：除了癌症和自身免疫病，bsAbs 在神经退行性疾病（如阿尔茨海默病，通过血脑屏障转运）、 感染性疾病（如 HIV，同时靶向病毒和免疫细胞）的应用将成为研究热点，需开发相应的生产工艺（如低免疫原性修饰）。 随着技术的持续突破，bsAbs 将从 “小众疗法” 走向 “主流疗法”，为更多未满足医疗需求的患者提供精准、高效的治疗选择。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。