Epcoritamab

摘要：最近双特异性抗体（bsAb）平台和产品投资激增的一个主要驱动力是，与两种单克隆抗体的组合相比，bsAb提供了多种不同的作用机制。2023年，四款bsAb产品在美国或欧盟获得了首批监管批准，生物制药行业管线中充满了bsAb候选药物，涉及广泛的治疗应用。在先前报道的bsAb发现活动中，在基于假设选择两种特异性靶蛋白之后，选择和筛选活动通常以单一特异性形式进行。向双特异性模式的转换通常位于发现过程的最后阶段，并且涉及少量先导分子，这主要是由于表达、纯化和分析大量bsAb方面的挑战。这篇综述讨论了促进扩展bsAb组合生产的新兴策略，特别关注生成bsAb矩阵的组合方法。这些技术将使筛查成为可能。双特异性形式，不仅拓宽了可及的蛋白质空间以最大限度地提高成功的机会，而且还推进了实证双靶点验证活动，以评估初始靶标选择假设。【NO.1】介绍图1.示意图概述了bsAb发现过程，并重点介绍了HTP bsAb生产和筛选的适用阶段。主要的双特异性抗体发现过程阶段定义为：1.“靶标ID”，确定假设和/或证明的靶标配对，以实现所需的作用模式；2.“先导化合物发现”，筛选并选择针对这两个靶标的i.mAb以及ii.筛选并选择显示所需作用模式的初始Hit bsAb；3.“先导化合物优化”，旨在改善功能和生物物理特性的初始Hit bsAb的工程和更深入的筛选；4.“早期CMC包括用于大规模bsAb生产的细胞系开发、最终bsAb药物的配方优化以及bsAb产品质量的更详细评估。【NO.2】实现双特异性抗体组合生产的解决方案在评估bsAb检测组合生产方法的适用性时，一系列考虑因素至关重要，包括蛋白质产量、样品纯度、速度、耗材成本、与自动化流程的兼容性以及与预期下游筛选分析的一致性。此外，这些因素的相对重要性将根据使用该方法的发现过程阶段而有所不同（图1）。例如，用于识别非常大的检测组合中的靶标结合反应的早期生物物理筛选分析需要相对较少的样品量，而中等水平的杂质可能是可以容忍的（图1，靶标识别和先导化合物发现）。在此阶段，多孔板中的瞬时表达与单个蛋白质捕获/纯化步骤相结合可能满足样品要求，并且这一过程通过自动化可扩展至非常大的检测组合（100-1000个分子）。相比之下，后期可显影性评估通常需要高度浓缩和纯净的样品，但筛网尺寸可能会小得多（图1，引导图）。此时，可能需要将低通量表达和纯化方法整合到工艺中。给定生产方法使用的bsAb格式也是一个关键考虑因素（图2），特别是对于固有性bsAb，其中预期的作用方式可能会施加几何要求。例如，旨在在单个抗原分子上结合两个表位的双旁原抗体，相对于无法跨抗原分子桥接和单价结合的mAb，这可以增加结合亲和力，这可能有利于特定的分子结构，如发现靶向HIV和SARS-CoV-2刺突蛋白的bsAb所证明的那样。同时，对于T细胞结合bsAbs，已经证明肿瘤相关抗原（TAA）靶标结合的化合价、TAA和CD3结合域的相对位置以及bsAb结合臂的结构是探索实现有效靶细胞杀伤的重要设计因素，同时最大限度地减少非特异性T细胞活化。在这种情况下，最初筛选不同的形式以实现所需的作用模式可能被证明是必不可少的，有利于包含形式多样性的bsAb组合生产方法（图1，选项1.2）。但是，如果在开始bsAb发现活动之前已经确定了所需的“最终格式”，则最好以这种形式进行所有bsAb筛选过程，以便早期数据更能预测分子的可开发性、可制造性和体内活性。如果这种“最终形式”的HTP生产方法不可用，一种折衷的方法是以“中间形式”生产bsAb，更能用于早期筛选活动的HTP生产（图1，靶标识别和先导化合物发现），然后在只需要更小的检测组合时重新格式化为“最终形式”（图1，铅检测组合）。IgG样双特异性抗体是最常用的“最终形式”，目前有11种此类bsAb已在美国或欧洲获得批准（截至2024年1月）。与天然IgG抗体的整体结构和结构域组成（图2a，类似IgG）类似，bsAb保留了关键的生物学特性和功能。首先，Fc结构域赋予较长的血清半衰期，从而减少了许多治疗应用所需的给药量和频率。其次，与天然分子的高同源性使bsAb的潜在免疫原性最小化，因为引入新T细胞表位的可能性降低。第三，虽然免疫细胞重定向bsAb通常包含经过工程改造的Fc结构域，旨在消融细胞毒性Fc介导的效应器功能（例如ADCC），但功能性Fc也可能是预期bsAb作用模式的组成部分，并且可以使用最初为单特异性mAb开发的工程解决方案。IgG样bsAb的可显影性特征通常也更像标准单克隆抗体，而不是由较小抗体片段组成的bsAb，无论是在物理稳定性（聚集水平和片段化倾向）还是与成熟的mAb纯化工艺的紧密兼容性方面。完全端到端的自动化HTP bsAb生产工作流程（通量为>1000bsAb）需要与自动化流程兼容的表达载体生成、蛋白表达、蛋白纯化和生物物理验证的工艺步骤。例如，需要缓冲液梯度或基于体积大小的分离的基于柱的纯化步骤在这种通量下难以实现自动化。同时，据报道，使用市售的Phynexus Phytip®柱或磁性纯化树脂试剂以及Hamilton Microlab ®STAR或Tecan Freedom Evo®液体处理器可实现基于HTP亲和的bsAb纯化过程的自动化。将各个工艺步骤集成到功能增强的系统中，例如样品浓缩测量和均一化，还需要微孔板处理机器人和软件来链接和控制系统内的所有硬件组件。Furtmann等人描述了在其端到端bsAb生产工作流程中开发专用的大肠杆菌、DNA处理和蛋白质科学工作站，每个工作站都使用Plate Butler ®Precise Flex机械臂进行板处理，由Plate Butler®软件指导。此外，使用基于Python®的自定义脚本将控制每个机器人站的软件连接到中央数据库GDB®的集成数据流是其整个过程的关键组成部分，以确保在整个过程中对样品的可靠跟踪以及强大的数据采集和存储。本综述将重点介绍可能阻碍集成到完全端到端HTP bsAb工作流程中的具体工艺挑战。下面讨论了在发现过程的不同阶段实现HTP bsAb生产的五种不同的解决方案。2.1 包含HC-HC和HC-LC配对技术的双特异性形式这里考虑的实现HTP IgG样bsAb生产的第一个解决方案是引入技术，以便在标准重组真核表达系统中生成样品时驱动正确的链配对（有关半抗体氧化还原重组的替代解决方案，请参见下文）。IgG样bsAb由两条重链（HC）和两条轻链（LC）组成，组装成正确的分子取决于结构域间相互作用的特异性（图2b（i））。如果没有通过分子工程来驱动正确的链配对，四条IgG链的共表达将导致物种的异质混合物，从中提取所需的bsAb（假设链表达水平相等，平均只有12.5%的样本）是具有挑战性的。最早的工程解决方案侧重于CH3-CH3'界面的修饰，以促进异二聚体与同源二聚体HC-HC相互作用，例如旋钮孔（KiH）突变集，它引入了新的空间交互作用，并且仍然普遍用于几个已建立的bsAb平台。随后开发了替代解决方案，旨在通过引入静电电荷对促进β链交换或通过计算和结构指导设计优化多个键合参数来进一步改善bsAb纯度曲线和生物物理特性。含有共同LC（cLC）的IgG样双特异性抗体可以使用这些HC-HC配对技术进行组装，并且具有相对简单的纯度特征。已经开发了一系列纯化策略，以去除初始蛋白A亲和捕获后残留的同型二聚体和/或半抗体杂质。例如，通过引入突变以将蛋白A结合到一个HC中，含有不含或两个HC蛋白A结合位点的同型二聚体物种可以通过跨pH梯度的额外蛋白A亲和层析步骤从包含一个位点的正确bsAb中分离出来。或者，通过设计两个HC以确保同型二聚体和半抗体物种相对于正确的bsAb之间的等电点（pI）差异，这些杂质可以在初始蛋白A亲和捕获后通过额外的离子交换色谱（IEX）步骤去除。然而，这些额外的纯化步骤通常涉及使用色谱列，并且比基于板或磁珠的亲和基质更适合HTP生产，据报道，包含制备规模色谱的自动化解决方案通常能够处理少于24个样品每批。因此，多步纯化方法仅适用于样品数量较小（<100）且需要更高纯度（>90%）样品时，例如在引导图阶段，当标准执行更完整的结合、功能和生物物理表征工作包时（图1，引导图）。生产大型cLC bsAb检测组合用于早期筛选已有先例，此时不需要高样品纯度和相关的多步纯化需求。通过瞬时HEK细胞转染和一步蛋白A纯化产生545个HER2-HER3 bsAb（来源于22个抗HER2和32个抗HER3亲本单克隆抗体），能够进行表型筛选以识别阻断HER2/HER3异二聚体配体驱动信号的分子。在MCF-7细胞增殖试验中，只有5种单抗显示出相对于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗（基准抗her2单抗）联合的效力增加，证明了使用大型初始测试面板来增加分子多样性和使用无偏筛选方法以最大限度地提高成功识别功能命中的机会的价值。然而，使用cLC bsAb规格的主要限制在于，通常至少需要通过体外展示技术或LC多样性有限的转基因动物获得亲本抗体。虽然已经建立了一系列平台来加速cLC mAb的发现，但将HC-LC配对技术引入IgG样bsAb可能允许使用任何两种亲本抗体，例如现有治疗药物或源自人类疫苗接种者的mAb。目前已开发出多种HC-LC配对技术，包括Roche的Cross Mab规格，其中CH1和CL结构域分别在一个bsAb臂上切换到LC和HC上；药明康德的WuxiBody格式，其中CH1-CL结构域在一只手臂上被来自T细胞受体的Cα-Cβ恒定结构域完全取代；以及阿斯利康的Duetmab形式，它在一个bsAb臂上移动HC-LC歧键位置。70其他HC-LC配对技术依赖于CH1-CL界面的修饰，将独特的、相反极性的突变集引入每个bsAb臂的CH1-CL结构域。尽管在可能的母体mAb方面提供了最大的灵活性，但同时包含HC-HC和HC-LC配对技术的bsAb的纯度特征比cLC bsAb更复杂，并且正确HC-LC配对的效率对于最大限度地减少含有错误配对的LC的杂质至关重要，通过标准化平台方法从正确的bsAb中去除这些杂质尤其具有挑战性（参见下面的“实现大型双特异性抗体组合的生物物理验证的解决方案”部分）。因此，当整个检测组合需要高纯度（>90%）水平时，通过四链共表达生产非cLC IgG样bsAb通常通常仅限于少量分子（<100），以允许定制纯化步骤（图1，引导图）。开发对特定bsAb产品杂质具有更高耐受性的筛选测定方法并包括额外的对照，可以促进对大型、部分纯化的IgG样bsAb组合进行早期筛选，以实现初始苗头化合物鉴定目的（图1–靶标识别和先导化合物发现）。当可测量活性需要两个靶标结合时，这更简单，在这种情况下，任何样品杂质都不太可能产生假阳性结果，但会降低样品中有效的正确bsAb浓度。emicizumab的第一个发现阶段采用了这种方法，这是一种通过交联因子IX和因子X模拟因子VIII的bsAb，于2017年被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗血友病A患者。将大约200×200个抗IX因子和抗X因子mAb亲本抗体组合在一起，使用仅包含HC-HC链配对技术的IgG样形式（口服纯度约为20%正确的bsAb）生成约40000个bsAb。在HTP酶测定中筛选这个非常大但纯度相对粗糙的面板，成功鉴定了94个bsAb阳性命中，并进一步进行工程设计。如果需要额外的样品纯化，那么生产如此大的bsAb数量在资源和时间成本方面都是不可行的。生产不对称的扩展IgG格式还需要驱动正确链配对的技术（图2a，不对称扩展IgG样）。虽然偏离标准IgG结构存在表达水平降低、分子稳定性降低和体内半衰期缩短的潜在风险（在下面的“只有1-2个不同链的双特异性形式”部分中讨论），但包含额外的抗原结合结构域可以实现更广泛的bsAb作用模式。例如，Columvi®于2023年6月获得FDA批准用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤，是一种Fab-IgG CD20-CD3 bsAb，附加了一个额外的N末端Fab结构域，以允许与TAA CD20进行亲和的二价结合。总之，虽然链配对技术能够生产“最终用于垫子”IgG样和扩展IgG样bsAb检测组合，但样品通量受到检测组合中不同纯度水平的限制，通常需要多个纯化步骤。因此，在重组真核表达系统中，包含配对技术的3-4条链的共表达是生物制药发现工作流程的晚期先导化合物优化阶段更常用于生成bsAb的过程，此时需要较低的“最终格式”分子数（<100），纯度较高（图1）。2.2 只有1-2个不同链的双特异性形式减少生产bsAb所需的不同链的数量是第二种可能的解决方案，并且是减少表达后蛋白质样品潜在异质性的最简单方法，从而简化了所需的下游纯化过程。一系列单息肉肽双特异性形式已非常成熟，包括串联结构域抗体、串联单链可变碎片和单链双抗体（图2a，连接的Ab片段）。此外，将这些简单的单元连接到抗体CH2-CH3结构域有助于通过Fc结构域形成同源二聚化，产生化合价更高的格式，同时仍然只需要单个DNA构建体。相对简单的形式（例如串联结构域抗体模具）也提供了在大肠杆菌表达系统中通常可以产生可溶性的优势，从而大大提高了蛋白质表达的速度并降低了成本。然而，尽管细菌表达提供了便利，但随着格式复杂性的增加和包含翻译后修饰（PTM）的结构域的引入，哺乳动物表达系统通常成为蛋白质生产的最可行的途径。图2.适合其HTP生产的主要bsAb类型和示例方法概述由单个HC和单个LCDNA构建体编码的BsAb形式提供了与标准IgG抗体更密切相关的分子结构，并在Fab或Fc区域附加了额外的抗原结合模块（图2a，对称扩展IgG样）。示例包括四价IgG-（scFv）或IgG-（dAb）形式。2F-star Therapeutics开发的mAb规格提供了一种替代解决方案，其中FcCH3结构域的Fab远端环被工程化以提供第二抗原的结合位点。最近报道的2×VH格式也保持了扩展的IgG样格式，将每个轻链上的可变结构域替换为具有第二结合特异性的可变重结构域。这些形式都避免了链配对不正确的问题，并且与现有的、成熟的IgG单克隆抗体表达和纯化平台非常兼容。此外，与每种靶抗原的二价（或多价）相互作用可能有利于特定的作用机制，例如细胞表面受体或可溶性蛋白的聚集。例如，靶向HER2受体的双旁位抗体，其形式能够与每个表位恶魔分层结合，相对于两种亲本mAb的组合，增强了受体聚集、内化和溶酶体降解。然而，偏离标准IgG形式可能会带来更大的免疫原性风险和额外的分子开发可行性挑战，因此在发现和开发过程的后期需要额外的工作包。例如，灵活的结构域间肽接头可能容易受到切割，添加额外的结构域可能为蛋白质聚集提供替代途径。已经缓解了这些困难，带有附加结构域的双特异性抗体已进入临床研究。如果打算使用包含附加结构域的最终形式，则在发现过程的早期进行形式筛选不仅有利于标记可开发性挑战，而且有利于选择与“最终形式”最兼容的抗体结构域或片段（图1，先导化合物发现和先导化合物优化）。例如，与单个dAb相比，一系列抗NGF结构域抗体（dAbs）在mAb-dAb形式的NGF抑制作用高~1000倍，如果dAb初始选择输出未以形式筛选，则可能被过早地排除在发现过程之外。对于本节中描述的双特异性形式，通常在蛋白质表达后直接获得相对简单的样品混合物，从而能够简化下游纯化步骤，与过程自动化更加兼容。因此，采用这些形式来促进中等大小的面板（100个分子）的材料生成，是一个有吸引力的选择，特别是如果所选格式与预期的双特异性抗体“最终格式”具有相似的结构（图1，选项1.1、1.2和2.2）。然而，为了生成非常大的双特异性抗体组合（1000个至10000个分子），例如从两个从头mAb选择活动中询问组合所需的抗体，需要为筛选中的每个分子生成1-2个独特的表达载体，然后进行蛋白质表达和纯化。最近，报道了一种基于对称交叉双可变域Ig（CODV-Ig）格式的自动化端到端平台bsAb生产工艺，该工艺恰好提供了这种扩展功能。该平台用于生成一组超过25000个bsAb和mAb对照品，以成功鉴定可变结构域、可变结构域位置和结构域间接头长度，从而提高效价和生产滴度。但是，使用下面回顾的组合方法，可以简化生产如此大型面板所需的资源。2.3 重组DNA设计，可实现抗体片段的连接与单独表达每个bsAb相比，生产包含键单元或手柄的抗体片段并随后组装成bsAb分子是更节省资源的HTP bsAb生产途径。通过这种组合方法，可以从相对较少的起始蛋白模块中生成非常大的bsAb组合，从而大大减少所需的DNA质粒数量、蛋白表达和蛋白纯化。理想情况下，键合反应将非常有效，既可以减少所需的起始蛋白模块数量，又无需额外的纯化步骤即可从最终的bsAb中去除未反应的模块。此外，形成的键优选为永久共价键或非常高的亲和力相互作用（结合亲和力亚皮莫拉），以最大限度地提高bsAb在一系列筛选测定条件下的稳定性。在这里，将考虑使用通过重组DNA设计与蛋白质模块融合的键（第三种可能的溶液）开发的方法，而使用化学偶联的方法（第四种溶液）和使用天然抗体特征的方法（第五种溶液）将在以下两节中讨论。由于组合或“即插即用”bsAb生产方法的主要目的通常是为早期筛选生成非常大的检测组合（图1，靶标识别和先导化合物发现），因此可以容忍非天然键基或接头的存在以及抗体片段的使用，因为分子将在后期筛选阶段转化为具有更好可开发性的最终bsAb形式。较小的抗原结合抗体片段（如Fabs、scFv或dAb）可以在标准表达系统中可靠地生产，并通过单步纯化工艺分离，因此是方便的起始模块。早期的“Dock and Lock”bsAb生产策略依赖于共价二硫键的形成来锁定源自cAMP依赖性蛋白激酶和A激酶锚蛋白的两种融合肽之间的结合。Bhatta等人开发的Fab-KD-Fab筛选格式包含来自酵母转录因子GCN4的肽和抗GCN4 scFv之间的简单得多的联系，并且已被证明非常适合HTPbsAb的产生（图2b（ii））。使用十氢组氨酸标签重组工程改造的36个Fab部分，GCN4肽或抗GCN4scFv可在哺乳动物细胞中瞬时表达，并通过镍亲和捕获进行纯化。然后以1：1的比例混合纯化的Fab对，一步生成大的bsAb基质，无需额外纯化。在原代人类细胞表型测定中筛选了3个包含>1000个分子的Fab-KD-Fab格式检测组合，以成功鉴定新的专性双特异性靶标配对，这些配对：（1）抑制B细胞受体激活，（2）抑制细胞外基质积累，以及（3）调节T细胞亚群功能。这种双特异性靶标配对发现的经验方法，加上HTP的发展，疾病相关表型筛选分析，为发现新的bsAb治疗机会提供了更大的机会（图1，靶标鉴定）。几种在标签和/或蛋白质片段之间利用共价肽或异肽键的蛋白质生物偶联技术已应用于双特异性蛋白质生产，包括SpyTag/SpyCatcher相关系统、分裂内含肽或SortaseA介导的偶联（更详细地综述）。例如，带有六组氨酸标记的分裂内含肽（C端部分）的单个Fab-Fc抗体片段的偶联代替第二个Fab臂，Fab片段与六组氨酸标记的分裂内含肽（N端部分）融合，是使用翻译后反式剪接开发的过程的基础（图2b（iii））。Fab-Fc和Fab片段在温和的还原条件下混合后，两个分裂的内含肽部分重新组合并释放出bsAb产物。重组的内含肽分子副产物与未反应的Fab-Fc或Fab片段可以被镍亲和试剂捕获，剩余的bsAb产物被氧化以重新形成链间二硫键。这种bsAb生成工艺已成功在96孔板和384孔板形式中实现小型化，并建立了自动化工艺线，证明了这种方法生产用于早期筛选的非常大（>1000bsAb）面板的可行性。本研究的作者强调，通过改变输入亲本抗体片段或使用正交作用内含肽变体组装三个片段，可以通过这种方法产生不同的bsAb形式。多格式筛选组合的生产为bsAb发现提供了附加值，其中bsAb架构可能需要优化（图1–靶标识别和先导化合物发现）。【NO.2】实现双特异性抗体组合生产的解决方案2.4 抗体片段的化学偶联第一个报道的bsAb是通过化学方法生产的，涉及在样品混合和再氧化之前还原两个单独的（Fab'）样品以破坏链间二硫键。虽然成功获得了双特异性产物，但样品纯度受到低效（Fab'）解离成单个链以及链混合和再氧化后不受控制的链缔合的限制。过去十年对抗体-药物偶联物（ADC）领域的投资加速了化学偶联策略的发展，包括专门针对单亲核侧链残基的策略。这些进步激发了重新审视使用化学偶联产生bsAb的研究。通过化学偶联连接抗体片段为HTP bsAb生产提供了第四种可能的解决方案，本节考虑了使用当前偶联化学试剂的可行性。为了提供一条有效的HTP双特异性抗体生产途径，化学偶联策略应满足以下五个要求：（1）高最终bsAb产量；（2）高最终bsAb纯度；（3）稳定的最终bsAb产品；（4）无需有毒试剂；（5）权宜综合。在开创性的Nisonoff和River报告中获得的异质新产物混合物随后通过在初始Fab还原后，在与第二个Fab混合之前用替代共价键封盖游离硫醇进行了改进。然而，这种方法需要使用有毒的亚砷酸盐试剂，在将bsAb用于下游应用（如细胞检测）之前，很难完全去除这种试剂。最近，半胱氨酸反应联剂已广泛用于偶联抗体片段，包括MDX-H210，这是一种在临床研究中评估的抗HER2×CD64bsAb。通过在T细胞细胞毒性测定中将一组马来酰亚胺交联Fab双特异性抗体与匹配的全长IgG样bsAb进行比较，验证了这种双特异性形式作为T细胞接合器（TCE）bsAb早期筛选的“中间”形式。然而，当输入抗体片段中存在多个半胱氨酸时，通过二硫键加扰或多个半胱氨酸残基的偶联，半胱氨酸交联偶联反应会引起样品异质性。这些并发症可以通过将单个不成对的半胱氨酸残基改造到输入抗体片段中或使用“再桥接”马来酰亚胺来限制，从而在还原的二硫键之间形成新的共价连接（图2b（iv））。新一代再桥接马来酰亚胺偶联物还具有更高的稳定性，可防止通过retro-Michael反应进行降解。然而，通过半胱氨酸交联生产大型bsAb检测组合的主要障碍仍然是需要低通量纯化步骤，例如尺寸排阻色谱（SEC）以去除杂质，包括未反应的抗体片段和聚集体。生物正交点击化学可能满足上述开发高效HTP bsAb生产方法的所有化学偶联要求。使用修饰的下一代再桥接马来酰亚胺试剂，或在输入抗体片段的确定位点掺入非天然氨基酸，可以将预功能化的点击手柄引入抗体片段中。这有助于通过“点击”反应快速、特异性地实现两个抗体片段的生物正交偶联，从而以高产率产生稳定的共价连接和均一的bsAb（图2b（v））。使用应变的点击手柄可实现无铜的点击反应，此外无需有毒金属催化剂，并且只产生氮气（如果有）副产品。种位点特异性偶联和点击策略已成功结合，提供了生成双特异性抗体的模块化两步法。使用下一代马来酰亚胺偶联试剂对输入抗体片段进行功能化，并使用具有快速反应动力学的无铜点击反应，可以实现向“点击”bsAb的良好转化。例如，使用顺序偶联点击法生成的Fab-Fab bsAb获得了高达85%的产量，然后进行单个蛋白A或SEC纯化步骤。如果基于亲和力的纯化步骤足够，则这些步骤可以很容易地小型化，因此该工作流程可能与自动化兼容，以实现HTP bsAb生产。化学偶联bsAb的连接元件提供了将额外的可变性或功能引入bsAb面板的机会。而重组工程的铰链序列可以为双异位bsab引入额外的灵活性，使其能够结合两个抗原表位，这种灵活性可能由表位、不同长度和刚性的化学连接体提供。化学接头也可以用额外的小分子进一步修饰，例如用于产生双特异性ADC的药物化合物、用于成像应用的bsAb的荧光荧光标签，或用于辅助bsAb生产的纯化标签。尽管化学偶联生产方法可能为bsAb检测组合提供更通用的应用，但在用于更复杂的细胞检测或体内研究之前，需要仔细考虑与预期“最终形式”的偏差。因此，通过化学偶联p2生产大型bsAb组合在bsAb发现活动的靶标识别或先导化合物发现阶段具有最明显的应用，以实现“中间”探索性形式的筛选活动（图1，选项1.2）。图1.示意图概述了bsAb发现过程，并重点介绍了HTP bsAb生产和筛选的适用阶段2.5 两种单克隆抗体或其衍生物的氧化还原重组如上所述，当每个抗原靶标的单价结合足以实现所需的作用模式时，使用IgG样bsAb“最终形式”具有多种优势。虽然通过链配对技术实现的生产方法可以生成多达100个左右分子的Ig样bsAb检测组合，但超过此数量的扩展受到实现一致样品纯度通常需要的低通量纯化步骤的限制。上面讨论的组合方法对于HTP bsAb的生产来说资源效率要高得多，但通常仅限于非IgG样bsAb形式（翻译后反剪接除外）氧化还原重组方法允许取得平衡，提供组合方法赋予的优势，同时保持Ig样bsAb形式。IgG4免疫球蛋白亚类的双特异性抗体可在人血清中天然发现。这些来自称为Fab臂交换（FAE）的动态过程，其中构成IgG4分子的两个半抗体，其完整的分子间铰链二硫键比IgG1少，能够与来自不同抗原选择的IgG4分子衍生的半抗体交换配对。这些bsAb通常不会同时遇到靶抗原并在体内发挥bsAb的功能，但它们的单价抗原结合提供了一种在慢性抗原暴露后失谐免疫炎症的机制。动态FAE通过向两种IgG4抗体的混合物中加入温和的还原剂，在体外模拟FAE，得到含有bsAb的混合物。任何该反应的潜在应用，以开发一种常规和可靠地从两个公认的bsAb生成的过程。亲本抗体迅速恢复为IgG1铰链序列，通过受控FAE（cFAE）过程产生的双特异性抗体在去除还原剂后保持稳定，而互补CH3突变集的引入两个亲本抗体有利于异二聚体而不是同源二聚体的形成（图2b（vi））。在cFAE期间未观察到LC交换，使用细胞培养氨基酸（SILAC）质谱（MS）的稳定同位素标记进行验证。进一步的工作表明，通过cFAE产生的抗CD20同源二聚体含有用于驱动异源二聚化的CH3突变集，保留了与抗CD20 mAb相当的IgG1 Fc效应子功能，而cFAE衍生的bsAb表现出与IgG1 mAb相似的药代动力学特性。迄今为止，已经使用Genmab的Duobody®平台开发了四种FDA批准的双特异性抗体产品，即amivantamab、teclistamab、talquetamab和epcoritamab，该平台从发现阶段到临床生产都使用基于cFAE的bsAb生产工艺。此过程涉及四个主要步骤：（1）在哺乳动物表达系统中表达两个亲本抗体组合（每个组合包含两个完整的CH3突变组之一，以驱动正确的HC-HC配对），（2）通过蛋白A捕获纯化亲本抗体组合，（3）以1：1的比例组合亲本抗体并添加温和的还原剂以启动cFAE反应，（4）去除ReDUCing试剂以终止cFAE反应。Amivantamab是在对cFAE产生的40种双特异性抗体组成的组进行无偏倚筛选后选择的，该组抗体来源于5种抗MET mAb，与8种抗EGFR mAb中的每一种联合使用，而不是根据它们的各自特性合理配对两种mAb。阻断MET和EGFR信号通路是双特异性抗体靶标产品概况的一部分，鉴于可用的亲本抗MET抗体是激动剂，这一点尤其具有挑战性。因此，以bsAb形式进行筛选至关重要，不仅可以确保单价抗原结合实现预期的信号减少，而且要确保MET和EGFR抗原的任何桥接不会导致受体激动。从一开始就以最终形式进行筛选，从而降低了信号转导可能受到MET-EGFR桥接（通过具有不同几何形状的bsAb）的完全影响的风险。cFAE工艺的进一步调整旨在绕过在混合和还原之前纯化亲本抗体的要求。早期变化包括混合两种表达亲本半抗体的大肠杆菌培养物，然后通过蛋白A捕获从组合的细胞裂解物中分离出所需的bsAb。然而，该工艺用于HTP bsAb生产受到为最大限度地提高bsAb纯度（测量半抗体表达水平和调整相对细菌培养体积）而引入的额外步骤的限制，而由于缺乏PTM，特别是N-连接糖基化（例如Asn-297非糖基化将减少Fc与FcγR受体和C1q的相互作用，除非进行Fc工程化）。通过使用哺乳动物表达系统生产含有两种亲本抗体的细胞超级清液，可以避免这两个限制，因为标准的哺乳动物细胞培养基条件已被证明会促进cFAE。Steinhardt等人通过引入氨基酸突变以消融结合到一个亲本抗体HC中，并添加过量的含有该伴侣的细胞上清液，使cFAE后残留的任何过量亲本抗体种类在最终bsAb捕获步骤中不应结合蛋白A，从而获得了较高的最终bsAb纯度水平。这种修饰可确保最终的bsAb纯度对细胞上清液中亲本抗体浓度的准确测定的依赖性较低，提高了与自动化流程的兼容性。然而，获得足够的bsAb样品进行筛选所需的每种反应混合物中的细胞上清液体积反而可能会限制工艺小型化和>100bsAb的面板的生产。如上一段所述的原始工艺，包括相对较少的起始亲体抗体的早期纯化步骤，使得cFAE步骤可以使用更浓缩（且更准确定量）的蛋白质样本，从而提高潜在的工艺通量。规格链交换（FORCE）是cFAE工艺的进一步改编，旨在实现具有高材料纯度和超出IgG样形式的bsAb基质的组合生产。48个包含旋钮或孔突变的虚拟六组氨酸标记的Fc链最初与每个亲本HC（分别包含孔或旋钮突变）和LC一起表达，以产生单价异二聚体。使用互补异二聚体（旋钮加孔）的cFAE反应产生正确的bsAb，而任何剩余的异二聚体或成对的虚拟Fc分子都可以通过单个镍亲和纯化步骤去除。使用液体处理系统开发了异源二聚体表达和纯化的自动化以及cFAE工艺本身，并用于生产示例4mAbA×4mAbB×9规格组合（总共144个HER1/2×DR5 bsAbs）。随后通过HTP桥接ELISA进行筛选，使bsAb形式更有利于鉴定双抗原结合。cFAE产生的扩展格式面板对于在要筛选的T细胞工程三特异性抗体中实现一个CD3和两个不同TAA结合部分的最佳定位和抗原结合亲和力也至关重要。在这个例子中，形式筛选对于评估CD8T细胞介导的选择性杀死表达两种抗原的细胞与仅表达单一抗原的细胞至关重要。总之，在整个bsAb发现过程中使用“最终格式”面板可以对专性bsAb进行早期功能筛选，并防止重新格式化步骤后潜在的苗头化合物损耗，但可能不适用于所有模式（图1）。在早期阶段，组合生产方法是HTPbsAb检测组合生产最节省资源的途径，其中cFAE已经成熟，可以生产IgG样和扩展IgG格式检测组合（图2）。没有Fc区的BsAb形式，适用于需要短bsAb血清半衰期或小bsAb大小以增加组织或肿瘤渗透性的应用，不能通过cFAE生产。对于这些形式，使用上述第三和第四个建议解决方案中详述的工艺组合抗体片段提供了生成大型组合的替代途径，但不一定是最终形式。在所有形式中，使用类似于临床生产过程的表达系统生产bsAb在发现工作流程的后期阶段都很重要，以测试过程兼容性（图1，引导图）。【NO.3】实现大型双特异性抗体组合生物物理验证的解决方案除了上述考虑因素外，与bsAb分析相关的可行性和复杂性是选择合适的HTP bsAb生产方法的重要因素。FDA指南建议bsAb表征应符合最终监管申报的标准mAb实践，但分子质量和稳定性概况因bsAb形式而异，并且与标准mAb相比，在bsAb检测活动期间通常需要更复杂的分析方法。在先导化合物优化和早期化学、制造和控制（早期CMC）阶段，PTM的综合生物物理表征（例如，Met/Trp氧化、Asn脱酰胺、Asp异构化、Asn连接糖基化）、聚集、碎裂、疏水性和热稳定性，在强制降解研究的辅助下，可以识别临床开发后期可能发生的潜在问题（图1）。这有助于对铅bsAb进行分类，并提供了一个机会，可以开始定义通过后期开发和临床生产进行监测的关键质量属性。相比之下，由于检测组合尺寸较大且材料数量有限，生成的bsAb检测组合需要更实用的生物物理分析方法，以支持早期靶标识别和先导化合物发现活动（图1）。与标准mAb活动一样，在这些早期阶段，应根据下游筛选分析的样品要求选择bsAb表征方法。至少应通过减少MS来确认bsAb身份，而在用于内毒素敏感细胞的细胞筛选测定之前，应测量内毒素水平。聚集体物质会干扰结合和功能分析，因此应进行定量，通常通过分析SEC进行定量，特别是如果使用更易聚集的bsAb形式，例如包含scFv模块或附加结构域的bsAb形式。正如我们所讨论的，与3-4条链的重组共表达相比，生成大型bsAb的组合方法可以在整个组合中产生更简单的纯度曲线和更一致的纯度水平。例如，通过cFAE产生极少量的含有错误配对LC的物种，尽管HC同源二聚体和半抗体片段仍然经常存在。这些杂质通常保留抗原结合，因此可能会使筛选数据的解释复杂化。它们还表现出与正确的bsAb相似的分子特性，这使得它们的定量变得困难。传统的色谱方法通常可以优化以表征分子特异性杂质，但无法确定大型、多样化bsAb检测组合中存在的每种物质的身份。MS通过提供异质肽混合物的无残留、无标记鉴定和某种程度的定量分析，代表了这一分析挑战的解决方案。下面将更详细地讨论MS在分析bsAb组合体中的应用。表1.用于表征和/或纯化IgG样双特异性抗体的液相色谱方法列表。使用这些独立方法分析（或纯化）的双特异性抗体规格的示例在“离线MS”下提供，而这些方法与质谱联用的示例则列在“在线MS”下。3.1 使用色谱分离分析双特异性抗体组合的质谱方法通过将液相色谱方法与电喷雾离子离子MS（ESI-MS）相结合，可以利用所需产物和相关杂质之间的物理化学性质差异来识别存在的每种物质，并以相对HTP的方式准确测定样品纯度。使用最普遍的方法是反相液相色谱MS（LCMS），它使用有机相梯度根据样品成分在变性条件下各自的疏水性分离样品成分（表1）。如果正确和错误配对的物质表现出足够不同的疏水曲线，则可以优化梯度以实现它们之间的色谱分辨率，从而允许根据紫外吸收光谱对每种物质进行绝对定量。然而，当分析完整形态的大bsAb检测组合或对称IgG形式时，使用平台方法不太可能获得所有样品的所有产物种类之间的绝对色谱分离。如前所述，因此可能需要正交方法来实现这一点。MS仪器的最新进展允许检测更高的质荷比范围，从而能够对天然状态下的生物制剂进行精确质量测定。这反过来又允许使用非变性液相色谱方法来分离异质bsAb混合物，尽管当前光照的MS联用示例有限（见表1）。“离线”（未与MS分析裂解偶联）疏水作用色谱（HIC）和IEX均已证明可有效分析HC同源二聚体的比例，并允许在纯化过程中分离所需的双特异性物质。这两种方法也可证明可有效分离轻链错误配对或缺失的杂质，尤其是当使用兼容缓冲液连接到“在线”MS分析时，如IEX.130色谱所示。使用这些方法将CorRect bsAb与杂质种类分离也可以通过蛋白质工程来改进，例如最大化两个半抗体bsAb组分之间的pI差异。22SEC可以分离质量差异显著不同的bsAb杂质，例如半抗体。但是，通过降低缓冲盐含量和促进疏水BIC与色谱柱的相互作用，还可以实现大小更相似的物质的色谱分离。这种混合模式SEC（mmSEC）技术已分离半抗体、同型二聚体和LC错误配对物种，并且还可以连接到“在线”MS.尽管使用mmSEC通常可以实现chro数学分离度，但运行时间通常大于30分钟，这使得分析大型bsAb组合体（>1000）不切实际。3.2 仅使用m/z信号分析双特异性抗体组合的质谱方法与产品相关杂质之间的色谱分离度不同，仅通过MS信号强度即可通过加标杂质来创建校准曲线，从而实现IgG样bsAb物质与错误配对的LC的绝对定量。该方法允许通过采用短时间（不到5分钟）脱盐反相梯度来定量HTP杂质。然而，由于不同物种的MS响应不同，尤其是质量差异很大的物质，因此需要对每种杂质进行加标才能进行准确定量，这在不同的异质检测组合中将非常耗费人力。作为一种潜在的解决方案，在没有杂质尖峰的可比质量种之间的相对定量已被证明可以以HTP方式提供杂质水平的合理估计。如果不进行色谱分离，正确的bsAb和所有杂质种类之间需要足够的质量差（>25Da），才能在去卷积质谱中实现分离。另一个挑战（尽管不太常见）是鉴定和定量两种液相色谱错误配对的杂质，因为该物质的质量与正确的双特异性相同。已经推导出了一个优雅的、基于概率的数学模型，用于根据相对链表达水平，与包含单个错误配对LC的物种相比，估计该物种的丰度。对bsAb样品进行酶消化以生成用于MS分析的Fabs可以进行实验验证，这一步骤可能保留给初始分析中错误配对水平较高的样品，以节省资源。通过cFAE等组合方法制备大型bsAb检测组合通常需要使用自动化液体和微孔板处理，以确保准确性并最大限度地减少手动样品制备时间。Waldenmaier等人最近报道了一种全自动mAb表征工作流程，以支持细胞系选择，从细胞系上清液中纯化mAb开始，然后进行完整、还原和肽图分析、LCMS分析和数据处理。该程序的样品制备阶段可能会被修改以分析>1000bsAb的面板，以支持早期筛选campaigns，从而节省时间并提高数据质量和一致性。然而，液相色谱方法的仪器分析时间仍然限制了样品通量，这可以通过使用替代的样品引入方法来解决。固相萃取的最新进展使第一个ultra-HTP方法的开发成为可能，该方法通过使用RapidFire与OrbitrapMS仪器联用来分析IgG样bsAb检测板。Sawyer等人能够以每个样品15秒的速率定量分析IgG4bsAb的裂解组，并在7ppm的准确度内实现质量差异为160Da的糖型的基线质量分辨率。尽管当杂质质量与正确的bsAb非常相似时，这种方法仍然受到限制，但它为非常大的bsAb检测组合提供了第一个真正的HTP纯度筛选方法，此后已应用于各种bsAb形式。Pu等人通过红外基质辅助激光解吸电喷雾电离（IR-MALDESI）以每个样品1.5秒的速率进一步提高了1.5秒，证明了类似的mAb糖型分离度，但通量取决于分析前的HTP样品脱盐。最近，Zacharias等人还利用声波喷射ESI-MS以每个样品1秒的速度实现了糖型分离和mAb的相对定量，而无需额外的样品制备。使用原型高分辨率四极杆飞行时间仪器的这些结果非常令人鼓舞，证明了高质量精度（<1.5Da质量误差），尽管这需要在分析的质量范围上做出妥协，以实现更短的采样时间。因此，以相同的速度同时检测半抗体杂质和完整bsAb种类不太可能可行。HTP MS的这些令人兴奋的发展有可能与自动化样品制备和数据分析相结合，从而能够在一天内生成1000个分子的细胞上清到bsAb纯度数据。它们提供了提高先导化合物发现阶段表征水平的机会，并为bsAb命中分类提供了更多数据。然而，在开发后期，仍然需要提供更高色谱图形分辨率的方法来确定样品纯度水平，并具有更高的准确性，以验证分子质量（图1，早期CMC）。【NO.4】结论与展望能够生产大型bsAbpanel（100秒至1000秒分子），包括各种规格，在bsAb发现过程的多个阶段具有潜在优势。早期，在生物学相关的功能测定中通过无偏倚表型筛选进行靶标对鉴定为假设驱动的选择提供了一种替代方案，扩大了可用的靶标空间并增加了找到新配对的机会。在先导化合物发现阶段，一旦mAb选择活动完成，以bsAb形式进行功能筛选是非常可取的，并且在这个早期阶段测试更大、更多样化的检测组合的能力增加了鉴定具有所需作用模式的分子的机会。最近报道了另一种方法，即基于HTP单细胞的bsAb功能筛选管线，允许在不需要蛋白质表达和纯化的情况下筛选大约22300个CD19×CD3scFv-scFv格式的双特异性T细胞接合器抗体（BiTE）。这种简化的工作流程将更加复杂，以适应IgG样bsAb形式；尽管如此，它提供了一种非常有效的选择来提高早期bsAb筛选通量，即使通常需要“中间形式”而不是预期的“最终形式”。在先导化合物发现和先导化合物优化阶段，bsAb筛选级联的设计通常是在生产、验证和筛选更大的组合所需的额外资源之间取得微妙的平衡，以便同时优化多个属性，而如果使用多个较小的组合筛选这些属性，则需要延长时间表（图1）。HTP bsAb生产方法、自动化bsAb分析工作流程和小型化HTP筛选分析的开发共同打破了这种平衡，提高了筛选更大bsAb组合的可行性，并为压缩项目时间表提供了机会。此外，整合计算机辅助的、合理的bsAb设计策略可能有助于简化筛选面板内容；例如，结构模型可用于对bsAb形式或抗原结合表位进行分类。近年来，在开发机器学习策略方面取得了快速进展，这些策略首先预测并其次优化生物治疗药物特性，旨在减少实验筛选的要求。然而，为了训练准确的机器学习模型，必须首先生成大型和高质量的实验数据集。因此，即使新的机器学习策略在未来几年更频繁地集成到bsAb发现过程中，HTP bsAb的生产和筛选仍将是一项关键能力。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

If approved, Lunsumio and Polivy could offer an off-the-shelf, chemo-free regimen for patients with second-line large B-cell lymphoma. Roche has demonstrated the power of combining two of oncology’s hottest modalities—bispecifics and antibody-drug conjugates (ADCs)—in a Lunsumio-Polivy regimen in large B-cell lymphoma (LBCL).The combination of the CD20xCD3 bispecific Lunsumio and the CD79b-directed ADC Polivy significantly reduced the risk of progression or death by 59% versus the traditional R-GemOx regimen in patients with previously treated LBCL who are not eligible for stem cell transplant. R-GemOx includes Roche’s own Rituxan and the chemotherapies gemcitabine and oxaliplatin.Patients in the Lunsumio-Polivy group went a median 11.5 months without disease progression versus 3.8 months for R-GemOx, according to the primary analysis of the phase 3 Sunmo study presented at the International Conference on Malignant Lymphoma.Roche said it will submit the trial results to global health authorities, including the FDA. While Lunsumio is currently approved as an intravenous infusion to treat follicular lymphoma, the Sunmo trial uses a subcutaneous formulation of the drug. Polivy, meanwhile, received the FDA’s approval as part of a combination for certain previously untreated patients with LBCL in 2023.The positive Sunmo readout could give Roche another shot at second-line LBCL after the regulatory prospects of its other CD20xCD3 bispecific, Columvi, were thrown into doubt in the U.S.In its own phase 3 study, Columvi, used in tandem with GemOx, led to a 63% reduction in the risk of disease worsening or death in patients with previously treated diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). The median progression-free survival was 12.1 months for Columvi-GemOx and 3.3 months for control. The Columvi regimen also significantly reduced the risk of death by 41% compared with R-GemOx at the primary analysis of the Starglo trial.Despite the positive readout, an FDA advisory committee agreed with an FDA internal analysis that the Starglo results are not applicable to a U.S. patient population. The Starglo study enrolled 48% of its total population in Asia but just 9% of patients in the U.S. In addition, an FDA subgroup analysis found a negative patient survival trend in participants from non-Asian countries.Given the bleak feedback, the Starglo regimen looks unlikely to be approved in the U.S., even though the European Commission has cleared it in second-line DLBCL. Overall survival data remained immature in the Sunmo trial of the Lunsumio-Polivy regimen. That metric currently numerically favored Lunsumio-Polivy, with a preliminary 20% death risk reduction. But there’s no breakdown of survival data by subgroups. The study is continuing toward its final overall survival analysis. A statistically significant overall survival showing is not required to win an approval in second-line LBCL in the U.S. The FDA has previously approved CAR-T therapies from Gilead Sciences and Bristol Myers Squibb in the disease setting based on the event-free survival endpoint.However, regional representation might become a sticking point for Roche with the FDA again. Sunmo enrolled 20—or about 10%—of its 208 patients in the U.S. and Canada. Latin America represents 41% of the study participation and East Asia 38%.But in a piece of good news for Roche, the progression-free survival analysis for the small North America cohort showed a massive 87% benefit in favor of Lunsumio-Polivy.Unlike Starglo, Sunmo also enrolled patients with high-grade B-cell lymphoma and follicular lymphoma grade 3b in addition to the 78% of individuals with DLBCL. Disease progression data favored Lunsumio-Polivy in each of the three subgroups, with DLBCL’s 62% the biggest among the three lymphoma types.The treatment effect looked similar for patients who received just one prior line of therapy versus at least two.In terms of toxicity, the rates of treatment-related grade 3 or 4 adverse events were similar, at 52.6% and 51.6%, for Lunsumio-Polivy and R-GemOx, respectively. And treatment-related deaths were recorded in 1.5% and 3.1% of patients in the groups, respectively.“If approved, this off-the-shelf treatment combination of [Lunsumio] and [Polivy] could be administered over a fixed period of time, without mandatory hospitalization or traditional chemotherapy, which could provide a meaningful option for patients with relapsed or refractory LBCL,” the Sunmo study’s lead author, Jason Westin, M.D., from the MD Anderson Cancer Center, said in a statement Friday. Between its two CD20xCD3 T-cell engagers, Roche angled Columvi toward the more aggressive DLBCL in its development plan. The Swiss pharma is also running the phase 3 Skyglo study, testing the combination of Columvi, Polivy and the R-CHP regimen in first-line DLBCL.Meanwhile, AbbVie and Genmab are running the phase 3 Epcore NHL-2 trial for its rival CD20xCD3 bispecific Epkinly in a combination with R-CHOP in newly diagnosed DLBCL.