血友病的腺相关病毒基因治疗

2023-07-27

基因疗法临床结果临床3期临床研究

摘要体内基因治疗正迅速成为治疗单基因疾病的一种新的治疗模式。近三十年来，血友病A(HA)HA)和血友病B(HB)被作为基因治疗发展的疾病模型。随着关键腺相关病毒(AAV)载体基因加入的试验完成和相关令人鼓舞的结果报告，以及监管部门普遍预计在不久的将来将批准当前这代HA和HB AAV载体，AAV基因治疗的这方面的努力很快就要取得成果。在这里，我们回顾HA和HB的AAV基因治疗的临床发展，并调查最近AAV在血友病和其他单基因疾病的临床试验中出现的突出问题。引言先天性血友病A(HA)HA)和血友病B(HB)分别由于凝血因子VIII(FVIII)或凝血因子IX(FIX)缺乏而导致的X染色体连锁出血性疾病。尽管封闭的空间出血可能致命，但血友病的出血以关节和肌肉出血为主。出血类型的严重程度可通过因子活性来预测。严重疾病患者的正常因子活性<1%，经常发生自发性出血，而中度疾病患者的正常因子活性在1-≤5%，通常在轻微创伤后出血，有时是自发出血。而轻度疾病患者因子活性在5%-40%，通常只在创伤后出血。在现代血库出现之前，血友病是一种致命的儿科疾病；然而，随着血友病治疗的不断进步，血友病患者的病情能够得到显著的改善，特别是在资源丰富的国家血友病患者有望拥有正常的预期寿命。重要的是，目前血友病治疗的费用使世界上80%的血友病患者无法获得常规治疗。目前血友病的护理标准是反复输注凝血因子VIII或凝血因子IX浓缩液以改善止血功能，使患者能在出血时止血或预防性出血。最近，一种模仿凝血因子VIII某些功能的双特异性抗体emicizumab已被批准用于HA，其他治疗HA和HB的新方法正处于临床开发的不同阶段。Emicizumab的给药方式是皮下注射，目前在美国用于预防大多数有或没有凝血因子VIII同种抑制抗体的HA患者。20世纪80年代以前的大多数血友病患者由于使用受污染的血浆衍生因子浓缩物，继发医源性艾滋病毒、乙肝和/或丙型肝炎病毒感染，目前通过使用高效的病毒杀灭程序和重组蛋白消除了这一医源性感染的风险。血友病的预防治疗是基于凝血因子水平和出血表型之间的关系，目的是将重度表型(<1%正常)转变为中等或轻度范围。虽然注射频率随着延长半衰期因子的出现而减少，但实际上还需要每周多次静脉注射FVIII或FIX浓缩液，以维持因子活性低谷>正常的1%。01当前临床发展中的血友病基因治疗策略对于重度血友病A和血友病B的患者，基因治疗提供了一种理想的预防方案，在该方案中，单次给药基因递送产品可提供足以缓解出血的持续长期因子水平。尽管在过去的三十年里已经研究了多种血友病的基因治疗策略，但最先进的是使用肝细胞导向的系统管理的重组腺相关病毒(AAV)载体，这种重组腺相关病毒(AAV)载体在肝脏特异性启动子的控制下包装密码子优化的F8或F9变体转基因基因(表格1)。关于HA和HB的 AAV载体在临床开发中的区别在于结果，包括转基因衍生因子活性水平、表达的持久性、受体之间的异质性和年出血率(ABR)。到目前为止，只有内源性因子水平≤为2%且没有晚期肝病的成年男性接受了基因治疗。虽然在HA和HB基因治疗中已有多次概念验证成功，但稳定的因子表达足以消除或几乎消除所有患者出血的目标尚未实现。野生型AAV是一种非致病性、复制缺陷的DNA微小病毒。AAV载体由围绕基因有效载荷的二十面体蛋白衣壳组成，两侧各有一个反向末端重复序列。反向末端重复序列是病毒来源的表达盒的唯一组成部分，对于将载体基因组包装到衣壳中和转导后游离型DNA的形成是必不可少的。利用瞬时转染人HEK293细胞或杆状病毒感染Sf9昆虫细胞的方法制造重组AAV载体。靶组织的成功转导遵循一条不完全了解的多步骤途径，该途径涉及从细胞表面受体识别衣壳到在核中形成环状游离载体基因组。虽然AAV载体基因组主要是非整合的，但严格的检查仍然显示罕见的整合事件。载体血清型由组成衣壳的蛋白质定义，衣壳影响载体的组织趋向性、宿主对载体的免疫反应和载体制造考虑。对自然产生的AAV血清型和经过生物工程改造的衣壳进行血友病基因治疗的评估(表1)。用于当前基因治疗产品的肝脏特异性启动子是带有来自ApoE的增强子元件的人α-1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子的迭代或经修饰的转甲状腺素启动子。表1 正在进行的血友病A和血友病B AAV基因治疗试验由于F8cDNA(7kb) 全长超过了腺相关病毒载体(∼4.7kb)的包装能力，因此基于AAV的HA基因治疗方法使用B结构域缺失的FVIII变异体。虽然B结构域占F8基因的40%，但它不是凝血活性所必需的。大多数研究使用FVIII-SQ变异体，它也用于商业重组FVIII产品。一项单独的试验正在评估新的B-结构域缺失的FVIII变异体(FVIII-V3)，该变异体在剩余的B-结构域替换连接子上增加了额外的糖基化位点，以改善蛋白质分泌。F9 cDNA基因(1.6kb)很容易包装在AAV载体中。基于AAV的HB基因治疗的早期研究使用了野生型FIX。然而，目前HB治疗的AAV方法使用FIX-R338L(FIX-Padua)变体，这是一种自然发生的错义突变，导致FIX活性比野生型FIX提高约8倍。R338L替换导致激活的FIX-R338L和激活的FVIII之间的相互作用增强，但与野生型FIX相比，它不改变FIX-R338L的激活或失活。02抗AAV抗体的作用尽管先前存在的体液AAV免疫的临床意义尚不完全清楚，但先前存在的AAV中和抗体可限制靶组织转导，从而限制治疗效果。一些研究报告高度一致，AAV抗体被量化为总AAV结合抗体或特别是AAV中和抗体(NAbs)。然而，NAb分析不是标准化的，根据的方法学不同会产生不同的结果，从而使个体研究观察的概括性复杂化。报道的NAb滴度是限制病毒载体转导在50%所需的血清稀释度。在自然感染野生型AAV或注射系统重组AAV载体后产生抗AAV NAb；然而，载体注射后产生的AAV NAb滴度通常至少比环境暴露后产生的AAV NAb滴度高出对数倍。环境暴露导致了大约30%的NAb血清阳性，尽管这一比例因地理位置、使用的化验方法和血清型而有很大差异。由于AAV血清型2(AAV2)是地方性的，人类对AAV2的NAb血清阳性率通常最高，这种疾病通常在儿童时期发展。对第一批接受系统性AAV载体的受试者进行的小队列分析显示，AAV给药后可产生持续长达15年、多血清型交叉反应的NAbs；这些结果与人类自然感染后产生的NAb持久性和临床前动物模型中系统性AAV载体的注射一致。重要的是，没有临床数据支持一种有效的策略来克服AAV NAb滴度的大小，这种滴度是在全身AAV给药后发展起来的。因此，目前的数据表明，重复注射(相同或不同血清型)AAV载体不会有效果。在对系统注射AAV载体的患者进行的第一次人类研究中，确定了先前存在的NAbs施加的疗效限制，该研究在男性HB中进行。在这里，NAb滴度<1：5的受试者与效价为1：17的受试者相比，FIX转基因水平更高。根据这些有限的数据，随后的血友病基因治疗大多排除了NAb滴度>1：5的患者(表1)。然而，即使是低滴度的NAbs也可能影响疗效。我们观察到，在评估FIX-R338L治疗HB的第一次成功试验中，唯一具有可测量的NAb滴度(1：1)的受者的FIX活性水平低于其他7名完全持续表达转基因的受者，后者的滴度为负值(<1：1)。最近，针对HB的全身性AAV5载体(AMT-061，现为etranocogene dezaparvovec)的临床开发已经对NAbs在限制疗效中的作用提出了质疑。在最初的I/IIa阶段研究中，AAV5 NAbs阳性的参与者被排除在外。然而，用更灵敏的基于荧光素酶的NAb法进行的回顾性分析显示，10名受者中有3名在载体注射前可检测到AAV5 NAb (范围1：21-1：340)，而转基因表达没有明显差异。在NAb滴度高达1：1000的非人灵长类动物中进行的临床前研究同样没有显示转基因表达减少。因此，在随后的IIb和III期研究中，NAb滴度不是排除标准。公布的IIb期数据显示，3名基于荧光素酶的NAb滴度在1：20至1：50之间的接受者的FIX活性水平为30-60%。在第三阶段研究中，54名受试者报告了类似的FIX活性水平；然而，NAb滴度最高的受试者(>1：3,000)没有反应。这些结果表明，区分可治疗和难治的NAb滴度的阈值取决于NAb检测的特性、给药的载体和载体剂量，而不是证明先前存在的NAb与全身AAV疗效无关。事实上，AMT-061的载体剂量[每公斤2×1013个载体基因组(Vg/kg)]是以NAb滴度>1：5作为排除标准(例如，5×1011 Vg/kg)的AAV载体研究的40倍；这与动物研究表明的在载体剂量和阻止转基因表达所需的阈值NAb滴度之间非线性关系是一致的。AAV载体用于血友病的监管批准可能包括基于相关关键研究的纳入标准的抗AAV抗体截止值。由于先前存在的抗AAV抗体目前极有可能阻止载体重新运用，并限制符合AAV基因治疗条件的患者数量，因此以开发消除或避免先前存在的抗体以及防止在载体管理后形成的方法开发工作正在进行。到目前为止，还没有动物数据表明有能力克服系统给予AAV载体后观察到的NAb滴度的大小(即>1：1,000)。此外，到目前为止，还没有成功的系统AAV给药。鉴于血友病AAV的临床发展现状和短期内有显著改善活性的潜力，目前缺乏有效的载体再给药策略是临床医生和血友病患者在决定基因治疗产品时最重要的考虑因素之一。患者应该得到咨询，以便他们充分意识到目前的临床发展状态可能只允许一次终生系统性AAV载体注射；这对于防止一种载体最终逊于另一种载体时的“买方悔恨”非常重要，并强调在注射之前全面了解每种载体的所有可用信息的重要性，以确保做出明智的决定。03AAV治疗的短期安全性考虑到目前为止，在血友病患者中评估的300倍范围的系统使用AAV载体剂量(2×1011- 6×1013Vg/kg)没有重大的安全性问题，尽管有描述的无症状肝毒性和免疫反应。然而，研究比血友病患者使用的载体剂量更高的载体剂量的AAV基因治疗试验最近揭示了载体剂量>1×1014 VG/kg时观察到主要安全问题，并建议系统注射AAV载体的剂量限制毒性(在补充表1中综述)。虽然剂量限制毒性在药物开发中并不是一个新的概念，但现在有证据表明，这一常规概念也适用于全身AAV载体。3.1AAV新出现的短期毒性反应在其他疾病案例中观察到的AAV毒性与血友病基因治疗的直接相关性尚不明确。至少，这些新出现的观察结果提供了使用最低治疗载体剂量的理由，并支持治疗医生将AAV理解为治疗类别的必要性(补充表1)。例如，在评估系统AAV载体剂量>1.1×1014Vg/kg的一些神经肌肉试验中，观察到载体后2周内出现血栓性微血管病(TMA)，并有补体激活的证据，这与非典型溶血性尿毒症综合征相一致。虽然很少有文献发表，但已报道的数据概述了末端器官TMA的毒性，包括恶性高血压、需要血液透析的肾功能衰竭以及对eculizumab的反应性。然而，这种治疗并不是普遍有效的，结果包括至少一名患者与TMA并发症有关的死亡率。除了TMA，最近在对256个非人类灵长类动物的荟萃分析中确定了使用AAV载体后背根神经节(DRG)短期和长期毒性的可能性，这些非人类灵长类动物接受了33种不同的载体，具有不同的血清型、表达盒和给药途径(鞘内、脑池内和全身)。一些动物表现出轻微的DRG毒性的组织学证据，而只有两只动物有临床症状和严重的组织学发现。这一主要组织学发现的病因尚不清楚，但推测与转导的DRG细胞中未折叠的蛋白质反应有关。到目前为止，这种毒性的临床确认仅限于接受鞘内注射AAV载体治疗肌萎缩侧索硬化症的单一试验参与者；使用糖皮质激素可以减轻症状，但在发表时并未得到改善。目前尚不清楚DRG的毒性是否依赖于AAV衣壳、剂量、盒式磁带或给药途径，而不是可能的AAV载体平台毒性。3.2AAV的肝毒性和免疫学反应所有AAV血清型都能有效地向肝脏输送，而不考虑靶细胞。因此，肝毒性是AAV系统递送的主要安全考虑因素。所有血友病的AAV基因治疗试验都显示了无症状的肝细胞毒性，尽管频率和疗程取决于所使用的载体和剂量。肝细胞损伤的特点是转氨酶升高，其中丙氨酸氨基转移酶升高超过天冬氨酸氨基转移酶升高，而胆红素或γ-谷氨酰转移酶无相关升高。在大多数但不是所有情况下，伴随着因子活性的下降，可能对免疫调节有反应，也可能没有反应。给药后，目前正处于HA关键试验的单个AAV载体导致病因不明的数月转氨酶升高，与因子活性下降或免疫调节反应性证据无关。大多数参与者(n=115/134)在没有疗效证据或确定治疗病理的情况下接受了转氨酶升高的免疫调节。然而，在血友病试验中观察到的大多数转氨酶升高发生在对AAV衣壳的细胞毒性免疫反应的背景下。这种AAV“衣壳免疫反应”被认为是由于AAV衣壳特异性细胞毒性CD8+T细胞识别转导的肝细胞的主要组织相容性复合体I分子上的AAV衣壳多肽和由此产生的清除；如果有足够多的转导的肝细胞作为靶点，理论上这会造成一个安全问题。然而，到目前为止，AAV衣壳细胞免疫反应在很大程度上是血友病基因治疗的疗效考虑因素，在多个试验中解释了部分或全部转基因表达的丧失。衣壳免疫反应的特征是转氨酶升高，因子活性下降，在干扰素-γ抗衣壳蛋白酶联免疫吸收斑点(ELISpot)试验中，经常(但并非总是)外周血单个核细胞与AAV衣壳多肽发生反应。值得注意的是，ELISpot分析在临床试验中具有可变的预测价值，而且由于技术密集型，不太可能在获得许可后可翻译。尽管如此，即使是转氨酶的轻度升高和因子水平的下降也被证明对支持衣壳免疫反应相当敏感。衣壳免疫反应通常在接种AAV载体后12周内观察到。一旦有证据表明存在衣壳免疫反应，就必须进行免疫调节，以维持转基因表达。免疫调节采取了各种策略，其中糖皮质激素调节占主导地位。重要的是，免疫调节并不是普遍成功的，可能同时受到与载体相关和与受体相关的因素的影响。到目前为止，合理设计的免疫调节方案一直难以捉摸。最后，免疫调节的持续时间是高度可变的，从几周到>一年不等，由此产生对安全的关注。为了更好地评估免疫抑制的风险/益处，必须了解正在治疗的是什么，并确认干预是必要的和有效的。虽然在血友病的AAV基因治疗后还没有观察到肝功能衰竭，但针对另外两种遗传病的AAV载体已经观察到。具体地说，onasemnogene ababparvovec(Zolgensma®)以1.1×1014 Vg/kg的剂量被批准用于肌萎缩侧索硬化症(SMA)，但盒装显示肝毒性安全警示。取得许可后，两名儿童在输液后6-8周出现急性肝功能衰竭，对糖皮质激素干预有反应。虽然确切的病因尚不清楚，但AAV衣壳的细胞免疫反应与载体给药后的时间、CD8+T细胞浸润的肝活检标本和类固醇反应性相关。最后，与在血友病试验和Zolgensma中观察到的肝细胞毒性不同，一项关于X连锁肌管性肌病(XLMTM)的研究使用迄今在人类中使用的最高载体剂量进行AAV介导的基因转移，观察到四名试验参与者的肝胆毒性进展到肝功能衰竭和死亡(3.5×1014 Vg/kg组中17人中有3人；1.1×1014 Vg/kg组中7人有1人)。XLMTM的肝胆损伤类型和不明的自然病史，可能包括潜在的肝病，与衣壳免疫反应不一致。这些严重的肝毒性与血友病基因治疗的相关性尚不清楚，但它们的发生支持使用尽可能低的AAV载体剂量，并在开出AAV基因治疗处方之前充分了解潜在的AAV毒性。04AAV治疗的长期安全性考虑假设全身性AAV载体给药的主要长期安全性问题仍然是肝脏和靶器官毒性以及遗传毒性的风险。虽然AAV主要是非整合的，但环境AAV暴露或媒介注射后动物和人类的测序数据表明，低频率的AAV整合事件具有活跃转录位点的倾向。AAV载体对新生小鼠的系统注射表明，Rian基因(与人类没有直接同源基因)上的AAV整合导致克隆性和近乎完全的肝细胞癌(HCC)外显性。随后的一项研究确定，HCC的风险与载体剂量和细胞分裂程度有关，使用肝细胞特异性启动子可以消除肝癌风险，但使用非肝细胞特异性启动子可以增强肝癌风险。系统AAV载体给药后AAV整合和克隆的证据最近也在一个大型动物HA模型中得到证实。然而，重要的是，同样的动物被跟踪了10年，没有肿瘤发生的证据；尽管如此，这项研究提供了第一个大型动物数据来强调AAV介导的整合的风险。血友病患者使用AAV后发生肝癌的理论风险难以理解，因为几乎所有45岁以上的严重血友病患者都有医源性获得的乙肝病毒和/或丙型肝炎病毒，导致相对于普通人群而言，肝细胞癌发病率升高。AAV在血友病和其他疾病组中的临床试验数据令人放心，尽管在组规模和纵向随访方面有限。在血友病基因治疗接受人群中，有一名长期感染丙型肝炎病毒的单一参与者在使用AAV载体1年后发展为肝细胞癌。最近对肿瘤组织的测序分析发现，预期的低频随机AAV整合没有克隆，并且存在其他在与丙型肝炎相关的肝癌中发现的突变，这表明AAV载体输注对患者的肝癌没有贡献。除此之外，在数百名血友病基因治疗试验参与者中还没有关于肝癌的报道，即使是在第一批接受系统使用AAV载体的参与者(乙肝患者)的15年随访数据中也是如此。综上所述，到目前为止，还没有临床证据直接支持AAV载体输注是肝癌发生的危险因素。然而，这种理论上的风险只会在载体给药后的几十年内发展起来。考虑到AAV载体注射后肿瘤的长期风险以及血友病人群中肝癌风险的增加的多重未知，作者的观点是，接受AAV基因治疗的血友病患者应该通过血清甲胎蛋白水平、肝功能检查和载体后数十年的肝脏超声来监测肝癌和长期的肝脏毒性。最终，成人血友病人群之外的组与注射AAV后在小鼠中发现的发生肝细胞癌的危险因素更接近。具体地说，婴儿中的风险因素-肝脏快速生长和由此产生的高细胞分裂率，在普遍存在的启动子的情况下给予高系统性AAV载体剂量(例如给患有SMA的婴儿服用Zolgensma)-更接近于在小鼠模型中确定的遗传毒性风险因素；因此，这些婴儿是需要仔细跟踪的重要组，以回答系统AAV载体注射后人类AAV基因毒性和肝癌的风险问题。05转基因衍生蛋白的短期和长期的安全考虑转基因衍生蛋白的主要安全性考虑包括(a)对自身抗原有或没有交叉反应的免疫反应和(b)血栓形成前的风险。考虑到迄今为止在HA和HB基因治疗试验中观察到的FVIII和FIX的异质表达，血栓形成前的风险是显著的。超生理上水平的FVIII和FIX活性是静脉血栓形成的独立危险因素。流行病学资料概述了超生理FVIII活性的静脉血栓形成风险[比值比(OR)]8.8-21.3]高于FIX(静脉血栓形成OR 1.8-4.0)，尽管两种情况都不理想。事实上，一名HB研究对象表达了超生理的FIX活性水平(200-520%)导致在动静脉瘘形成血栓，随后给予抗凝治疗。类似地，最近由辉瑞公司发起，因为一个受试者超生理上水平的FVIII表达与静脉血栓形成导致AAV基因治疗试验暂停在第三期。由于这些原因，血凝素或HB基因治疗的治疗窗口可能在正常因子水平的上限结束。除了生理上的表达外，理论上还可以通过一种增强的止血功能变异蛋白(如FIX-R338L)来增加血栓形成前的风险，该蛋白目前已应用于所有的HB基因治疗工作中。重要的是，FIX-R338L的调控方式与野生型FIX相同，这与临床前数据一致，表明血栓形成风险与FIX活性相关，独立于野生型与FIX-R338L的表达;综上所述，这些结果支持FIX-R338L不是固有的血栓原性的结论。此外，虽然对表达的转基因可能产生多种免疫反应，但迄今为止还没有试验参与者开发出针对转基因衍生蛋白的NAbs;值得注意的是，目前血友病基因治疗试验的入组标准严格排除了最有可能出现抑制剂的患者(例如，目前或既往有抑制剂病史或因子暴露< 50-150的患者)。然而，小型和大型动物数据表明，肝细胞表达转基因诱导转基因耐受;这已被证明适用于多种蛋白质，包括FVIII、FIX和FIX-R338L。此外，现有的临床前数据表明，肝脏定向基因转移可能诱导转基因产物免疫耐受。因此，在肝脏定向基因治疗后，对转基因蛋白的持续免疫反应是不可能的。事实上，基因治疗的未来扩展适应症可能包括先前存在FVIII抑制剂的HA患者的耐受性诱导。由国家心脏、肺和血液研究所主办的“FVIII抑制剂的科学现状”研讨会的一致建议明确支持追求FVIII耐受性诱导的HA基因治疗。然而，最近在杜氏肌营养不良症患者接受AAV肌肉定向基因治疗后，发现了针对转基因蛋白的抗体;这些抗体被猜测与自身抗原有交叉反应，这突出了AAV基因治疗单基因疾病的一些未知因素。06血友病基因治疗的现有疗效数据在持续转基因表达的临床试验中，大多数持续转基因表达的试验参与者表现出表型改善(图1);相对于目前的血友病治疗，基因治疗的潜在疗效是无可争议的。此外，尽管因子表达水平不同，但在短期内，年化出血率(ABR)的降低相对均匀。然而，个别载体，特别是HA载体，可能可以根据表达持久性和长期疗效来区分自己。虽然流行病学研究提供了避免过度治疗表达和由此产生的安全问题的有力理由，但精确的最低期望因子活性仍不清楚，可能因患者特征(如因子活性水平和关节健康)而异。根据现有的HA自然历史数据，可以建立最小期望因子活性的模型，这些数据表明，一期FVIII活性≥12%意味着ABR <1。此外，emicizumab预防使>50%的试验参与者的ABR <1，并且估计体内FVIII止血当量为10-30%;这些发现和血友病的自然历史数据普遍支持类似的靶向最小表达。事实上，到目前为止，这些近似结论得到了累积的基因治疗数据分析的支持，在这些数据中，通过一期试验，持续的FVIII活性> 10-20%可靠地允许大多数受体的ABR <1(图2)。然而，根据AAV载体的不同，观察到的转基因表达变化为10 - 100倍。因此，不可能针对个别患者的因子阈值需求。此外，在与人肝细胞嵌合的小鼠克隆群体中进行的研究表明，仅在转导效率方面就存在高达7倍的变异。这些数据与影响载体输注和稳态转基因表达之间每一步的多种生物变量的存在是一致的，并强调了在不久的将来，该领域可能不得不容忍患者间转基因表达的可变性。使我们明确定义靶向和可接受的转基因表达的治疗范围的能力复杂化的是，测定的转基因FIX或FVIII活性与体内止血功能的相关性的置信度。具体来说，转基因衍生的测量FVIII-SQ和FIX-R338L通过一期(OSA)或显色试验(CSA)有所不同。在人类和小鼠中，OSA对FVIII:C的测量值约为CSA的1.6倍，这一观察结果在重组FVIII-SQ蛋白20年的临床应用中未见。类似地,FIX- R338L OSA测定的FIX活性测量值高于CSA测定的FIX活性。然而，与转基因衍生的FVIII-SQ不同，重组FIX-R388L的相对测定差异保持不变，总体上与我们对FIX-R338L酶功能的理解一致。图1 (a)血友病A和(b)血友病B AAV基因治疗临床试验的参与者在注射AAV载体前后的年出血率(ABR)。数据提取如下：BMN270(valoctocogene roxaparvovec)代表平均ABR(n=134名参与者)。SPK-8011代表在AAV衣壳免疫应答外保持表达的参与者的平均ABR，并随访超过1年(n=15)。SB-525(giroctocogene fitelparvovec)代表仅接受载体治疗的参与者的平均ABR(n=4)；AAV-wt-fix(scAAV2/8-lp1-hFIXco)代表报告的ABR的中位数(n=10名参与者)。AMT-061(etranacogene dezaparvovec)代表所有出血事件(n=54名参与者)的平均ABR。SPK-9001(fidanacogene elaparvovec)代表平均ABR(n=10参与者)。图2 年化出血率(ABR)与第VIII因子(FVIII)活性的关系。(a)所有基因治疗受试者的ABR和FVIII活性：SPK-8011：0.5-2×1012 Vg/kg (黑色正方形)、AAV5-FVIII阶段I/II ：4-6×1013 Vg/kg (红圈)和AAV5-FVIII阶段III ：6×1013 Vg/kg (蓝色三角形)。绘制的FVIII活性水平通过一步法确定，或使用1.6的校正因子从显色分析结果转换。黑色垂直线代表正常FVIII水平的10%。蓝色阴影框表示具有ABR≤1的受试者。(b)基因治疗受试者的ABR≤1与其FVIII活性的关系的百分比，通过单态试验确定。来自基因治疗受试者的递增ABR数据被分成10组，然后绘制成分组中FVIII最大水平的函数。07转基因表达的持久性尽管在成功但可变的因子表达情况下，短期临床获益相对均匀，但在长期稳定表达方面，载体之间存在异质性(图3)。大型动物数据显示，在载体输注后8年内，FIX或FVIII的表达稳定或没有下降。迄今为止，现有的HB临床试验数据模拟了在大型动物数据中观察到的情况;发表数据长达3年，抽象数据长达8年，均表现出持久稳定的FIX表达。关于HA表达的持久性的数据是相互矛盾的。图3 AAV基因治疗多年后的因子VIII(FVIII)活性。数据摘自公开出版的出版物或摘要。分数代表中位数FVIII水平(除了SB-525，只有平均值可用)，误差条是四分位数之间的范围。数据来自分别接受3×1013、6×1013和0.5-2×1012Vg/kg 的SB-525、AAV5-FVIII和SPK-8011 AAV载体剂量的组。接受SPK-8011的两名参与者在载体注射后3个月内由于衣壳细胞免疫反应而失去了所有FVIII的表达，因此不包括在内。绘制的SPK-8011参与者数据代表第一年的n=15、第二年的n=11和第三年的n=5，反映了现有后续数据的持续时间。使用AAV5-FVIII结果的校正系数1.6，通过一步法测定FVIII活性或从显色分析结果转换。具体而言，在目前HA III期试验的载体中，从第一年到第二年，两种载体都显示出近一半的FVIII水平下降。在这些载体中，valoccogene roxaparvovec (AAV5-FVIII或BMN-270)在I/II期试验参与者(n = 7)的6年随访中显示FVIII水平持续下降。在更大的III期试验参与者队列(n = 17)中也观察到类似的结果，显示从1年到2年FVIII表达减少40%，并且FVIII活性持续下降，直到目前可获得的3年随访数据(图3)。有趣的是，在接受SB-525(现在是giroctocogene fitelparvovec)并随访2年的参与者(n = 4)的I/II期数据中，观察到valoccogene roxaparvovec的FVIII水平下降(图3);这种载体正在进行一项关键试验，该试验最近通过了监管部门的要求，但目前还没有招募。与valoctocogene roxaparvovec和giroctocogene fitelparvovec的观察结果相反，接受SPK-8011并在衣壳免疫反应外维持FVIII表达的参与者(n = 5)在载体后3年内表现出明显稳定的FVIII水平(图3)。虽然giroctocogene fitelparvovec (SB-525)和valoctocogene roxaparvovec (BMN27)的长期FVIII药代动力学看起来相似，但它们与SPK-8011的观察结果明显不同，这提供了原则上的证据，即目前HA aav介导的基因加入策略可以实现大约稳定的多年FVIII表达。在HA临床试验中观察到的表达持久性差异的病因尚不清楚。鉴于目前的策略目标是维持游离转基因，预计由于细胞分裂和损失，表达会有一定程度的下降，尽管是渐进的，正如目前HB的研究所证明的那样。图3所示的综合数据可能表明，高水平的转基因FVIII是不可持续的;然而，仔细检查使用valoctocogene roxaparvovec后个体受体FVIII水平并没有显示FVIII水平与FVIII下降之间的明确关系。这需要进一步的研究。目前在III期试验中观察到的两种HA载体中FVIII表达下降的假设机制包括(a)由于直接载体或FVIII毒性导致的转导细胞损失，(b)基因沉默，(c)对AAV衣壳或表达的转基因的未检测到的免疫反应，或(d)单个载体的特性阻止了稳定串联的游离载体表达盒式DNA的形成。先前在重组FVIII哺乳动物表达系统中观察到的这一现象以及在小鼠模型中肝脏导向的AAV介导的基因转移后FVIII的过度治疗表达支持了这一假说，即转导的肝细胞的损失是由于FVIII未折叠蛋白反应所致。然而，没有证据表明HA受试者的肝活检中有未折叠的蛋白质反应，尽管采样和/或采样时间的考虑限制了解释。用于不同AAV产品的制造平台如何导致转基因FVIII水平下降也是未知的。考虑到我们所知道的AAV载体输注后持续、高滴度、多血清型、交叉反应的AAV NAbs的发展，以及我们目前无法克服高滴度的AAV NAbs，FVIII水平的稳定性是决定临床试验申报或许可AAV产品选择的关键因素。潜在的受试者需要充分了解，他们只能接受一次AAV基因治疗，并且FVIII转基因表达的丧失必须被考虑到他们的风险/收益计算中。08未来方向对HA和HB的下一代基因治疗方法的综合考虑不在本综述的范围内。许多新方法正准备在当前进展的基础上再接再厉。其中包括使用FVIII变体来改善分泌或止血功能的新一代AAV载体，以及用于基因编辑的带有脂质纳米颗粒的AAV载体。虽然仍处于临床前开发阶段，但其中一些方法有望很快投入临床。此外，以肝脏为靶点的全身给药以及使用慢病毒载体的造血干细胞体外转导正在进行临床前或首例人类临床试验。目前的努力将整个儿童人群以及缺乏常规治疗机会的患者(占世界血友病人口的大多数)排除在外。这些是基因治疗可能对其影响最大的人群。结论在血友病和其他单基因疾病的基于AAV基因引入的治疗方面取得的进展证明，AAV基因治疗建立了一个新的治疗范式。了解AAV平台以及迄今可获得的个人载体信息的全面知识对于实现对研究载体或许可载体治疗的真正知情同意是必要的。血友病社区急切地等待着当前一代获得许可的HA和HB AAV载体，预计不久将在临床上使用。重要的是，尽管在目前的血友病基因治疗中反复获得概念验证的成功，但能够减少所有患者的出血所需的稳定、持久的FVIII或FIX表达是一个尚未实现的希望。这确定了血友病下一代基于基因的疗法的发展目标。END