Etranacogene dezaparvovec

摘要:体内基因疗法正迅速成为单基因遗传病治疗的新范式。近三十年来，血友病A（HA）和血友病B（HB）一直是基因疗法发展中的模型疾病。这一努力即将结出硕果，已完成的关键腺相关病毒（AAV）载体基因增加试验报告了令人鼓舞的结果，并且预计在不久的将来，当前一代的HA和HB AAV载体将获得监管批准。在这里，我们回顾了AAV基因疗法在HA和HB中的临床发展，并审视了最近从血友病和其他单基因疾病的AAV临床试验中浮现出来的突出问题。 1.引言 先天性血友病A（HA）和血友病B（HB）是由于凝血因子VIII（FVIII）或因子IX（FIX）的缺乏而引起的X连锁出血性疾病。血友病的出血特点主要是关节和肌肉出血，尽管出血到封闭空间可能是致命的。出血表型的严重程度由因子活性预测。严重疾病的患者因子活性低于正常值的1%，并且经常自发出血，而中度疾病的患者因子活性为正常值的1-5%，在轻微创伤后出血，有时也会自发出血，轻度疾病的患者因子活性为正常值的5-40%，通常只在受伤时出血。在现代血液银行出现之前，血友病是一种致命的儿科疾病；然而，血友病护理的持续进步显著改善了结果，以至于现在预计在资源丰富的国家血友病患者的预期寿命是正常的。重要的是，目前血友病治疗的成本使得世界上80%的血友病患者无法常规获得护理。目前的护理标准是反复输注FVIII或FIX浓缩物以改善止血，这是对出血的响应或预防出血的预防性措施。最近，一种模拟FVIII功能的双特异性抗体emicizumab已获准用于HA，其他针对HA和HB的新方法也处于不同的临床开发阶段。Emicizumab通过皮下注射给药，现在在美国用于大多数有无FVIII同种抗体的HA患者的预防。大多数在1980年代之前出生的血友病患者因污染的血浆衍生因子浓缩物而获得医源性HIV、HBV和/或HCV感染，这一风险目前已通过使用高效的病毒灭活程序和重组蛋白消除。血友病的预防性治疗基于因子水平和出血表型之间的关联，目标是将严重表型（<1%正常）转换为中度或轻度范围。实际上，这需要每周多次静脉输注FVIII或FIX浓缩物以维持因子活性谷值>正常值的1%，尽管随着延长半衰期因子的出现，这种频率已经降低。最近，一种模拟FVIII功能的双特异性抗体emicizumab已获准用于HA患者，其他针对HA和HB的新方法也处于不同的临床开发阶段。Emicizumab通过皮下注射给药，现在在HA中广泛使用。 2.当前临床开发中的血友病基因治疗策略 对于严重的血友病A（HA）和血友病B（HB），基因治疗提供了一种理想化的预防方案，即单次给予基因传递产品就能提供长期持续的因子水平，足以减轻出血。尽管在过去三十年中研究了多种血友病基因治疗策略，但最先进的方法是使用以肝脏特异性启动子控制的、包含密码子优化的F8或F9变体转基因的系统性给予的重组腺相关病毒（AAV）载体（表1）。HA和HB AAV载体在临床开发中的区别在于结果，包括转基因衍生因子活性水平、表达的持久性、受体间的异质性以及年化出血率（ABR）。迄今为止，只有内源性因子水平≤2%且无晚期肝病的成年男性接受了基因治疗。尽管在HA和HB基因治疗中反复证明了概念验证的成功，但尚未实现所有患者稳定因子表达足以消除或几乎消除出血的目标。 野生型AAV是一种非致病性、复制缺陷的DNA细小病毒。AAV载体由一个二十面体蛋白衣壳组成，包围着基因有效载荷，并在每端由一个倒置末端重复序列所衬托。倒置末端重复序列是表达载体中唯一的病毒来源成分，对于将载体基因组包装到衣壳中以及转导后的环状表观DNA形成至关重要。重组AAV载体是通过使用人类HEK293细胞的瞬时转染或Sf9昆虫细胞的杆状病毒感染的方法制造的。成功的靶组织转导遵循一个不完全理解的多步骤途径，从衣壳被细胞表面受体识别到核中形成环状表观载体基因组。尽管AAV载体基因组主要是非整合性的，但严格的检查显示罕见的整合事件。 载体血清型由组成衣壳的蛋白定义，这影响载体的组织趋向性、宿主对载体的免疫反应以及制造考虑。正在评估自然发生的AAV血清型和生物工程化的衣壳用于血友病基因治疗（表1）。当前基因治疗产品使用的肝脏特异性启动子是人类α1-抗胰蛋白酶（hAAT）启动子的迭代，具有来自ApoE或修改的转甲状腺素启动子的增强元件。 表 1:正在进行的血友病A和血友病B AAV基因治疗试验 缩写：AAV，腺相关病毒；UCL，伦敦大学学院；sc，自互补；ss，单链；vg，载体基因组。 由于全长F8 cDNA（7 kb）超出了AAV载体的包装能力（约4.7 kb），因此基于AAV的HA基因治疗方法使用B域缺失的FVIII变体。虽然B域占F8 cDNA的40%，但它对凝血活性并非必需。大多数研究使用FVIII-SQ变体，这也用于商业重组FVIII产品。一项试验正在评估一种新型B域缺失FVIII变体（FVIII-V3），它在残留B域替代连接链上增加了额外的糖基化位点以改善蛋白质分泌。 F9 cDNA（1.6 kb）很容易包装在AAV载体内。早期基于AAV的HB基因治疗研究使用了野生型FIX。然而，当前AAV方法用于HB使用的是FIX-R338L（FIX-Padua）变体，这是一种自然发生的错义突变，其活性大约是野生型FIX的八倍。R338L替换导致活化的FIX-R338L与活化的FVIII之间的相互作用增强，但它不会改变与野生型FIX相比的FIX-R338L活化或失活。 3.抗AAV抗体的作用 预先存在的AAV中和抗体可能限制目标组织的转导，因此限制治疗效果，尽管预先存在的体液AAV免疫的临床意义尚未完全理解。AAV抗体被量化为总AAV结合抗体或特定的AAV中和抗体（NAbs），一些研究报告了高度的一致性。然而，NAb检测方法并不标准化，根据方法的不同，结果呈现异质性，这使得个别研究观察的普遍性变得复杂。报告的NAb滴度是限制载体转导50%所需的血清稀释度。 抗AAV NAbs在自然感染野生型AAV或系统性重组AAV载体给药后发展；然而，载体给药后发展出的AAV NAb滴度通常至少比环境暴露后发展出的滴度高一个数量级。环境暴露导致大约30%的NAb血清流行率，尽管这在地理、使用的检测方法和血清型方面差异很大。由于AAV血清型2（AAV2）是地方性的，人类通常对AAV2有最高的NAb血清流行率，这些通常在儿童时期发展。对接受系统性AAV载体的第一批受试者的小组分析显示，多达15年后仍持续存在多血清型交叉反应的AAV NAbs；这些结果与人类自然感染后NAb的持续性以及临床前动物模型中系统性AAV载体给药后的NAb持续性一致。重要的是，没有临床数据支持有效策略来克服系统性AAV载体给药后发展出的NAb滴度（即，>1:1,000）。因此，当前数据表明，重复给药AAV载体（相同或替代血清型）将无效。 预先存在的NAbs所施加的效力限制在系统性给药AAV载体的首次人体研究中被识别，该研究在HB男性中进行。在这里，与NAb滴度为1:17的受试者相比，NAb滴度<1:5的受试者观察到更高的FIX转基因水平。基于这些有限的数据，随后的血友病基因治疗大多排除了NAb滴度>1:5的患者（表1）。然而，即使是低滴度NAbs也可能影响效力。我们在评估FIX-R338L用于HB的首次成功试验中观察到，唯一一个有可测量NAb滴度（1:1）的接受者比其他七个完全维持转基因表达的接受者有更低的FIX活性水平，他们的滴度为阴性（<1:1）。 最近，NAbs在限制效力方面的作用受到了对HB的系统性AAV5载体（AMT-061，现在为etranocogene dezaparvovec）的临床开发的质疑。在最初的I/IIa期研究中，排除了AAV5 NAbs阳性的参与者。然而，使用更敏感的基于荧光素酶的NAb检测的回顾性分析显示，在接受载体给药前，10名接受者中有3人有可检测的AAV5 NAbs（范围1:21–1:340），没有明显的转基因表达差异。在非人类灵长类动物的临床前研究中，高达1:1,000的NAb滴度同样没有显示出降低转基因表达。因此，在随后的IIb期和III期研究中，NAb滴度不是排除标准。发表的IIb期数据显示，在3名基于荧光素酶的NAb滴度在1:20到1:50之间的接受者中，FIX活性水平为30-60%。在III期研究的54名受试者中报告了类似的FIX活性水平；然而，具有最高NAb滴度（>1:3,000）的受试者没有反应。这些结果并不是证明预先存在的NAbs对系统性AAV效力无关紧要，而是表明区分可治疗和难治性NAb滴度的阈值取决于NAb检测的特性、给药的载体以及载体剂量。实际上，AMT-061的给药剂量是以前以NAb滴度>1:5作为排除标准的AAV载体研究的四十倍[每公斤2 × 10^13个载体基因组（vg/kg）]（例如，5 × 10^11 vg/kg）；这与动物研究一致，后者证明了载体剂量与排除转基因表达所需的阈值NAb滴度之间的非线性关系。AAV载体对血友病的监管批准可能包括基于相关关键研究的纳入标准。 由于预先存在的抗AAV抗体目前极有可能阻止载体再给药并限制有资格接受AAV基因治疗的患者数量，因此正在进行的工作是开发方法来根除或避免预先存在的抗体以及预防载体给药后的产生。到目前为止，没有动物数据证明能够克服系统性AAV载体后观察到的NAb滴度的量级（即，>1:1,000）。此外，到目前为止，还没有成功的人类系统性AAV再给药。鉴于AAV对血友病的当前临床开发状态和短期内潜在的显著活性改进，当前缺乏证明的载体再给药策略是临床医生和血友病患者在决定基因治疗产品时最重要的考虑因素之一。应向患者提供咨询，使他们充分意识到当前的临床开发状态可能只允许一次终身系统性AAV载体给药；这很重要，以防止如果一种载体最终不如另一种载体，患者会有“买方的遗憾”，并强调在给药前全面了解每种载体的所有可用信息的重要性，以确保做出明智的决定。 4.AAV治疗的短期安全性考虑 迄今为止，在血友病患者中评估的系统性AAV载体剂量（2 × 10^11 至 6 × 10^13 vg/kg）范围内，尚未出现重大安全问题，尽管已有描述的无症状肝毒性和免疫反应。然而，研究血友病中使用的载体剂量更高的AAV基因治疗试验最近揭示了在使用>1 × 10^14 vg/kg载体剂量时观察到的重大安全问题，并表明系统性AAV载体给药的剂量限制毒性（47-50）（补充表1中综述）。虽然剂量限制毒性在药物开发中并不是一个新概念，但现在有证据表明这一普遍概念适用于系统性AAV载体。 4.1AAV短期毒性的出现 在其他疾病队列中观察到的AAV毒性与血友病基因治疗的直接相关性尚未定义。至少，这些新出现的观察结果为使用最低治疗载体剂量提供了理由，并支持治疗医生将AAV作为治疗类别的理解（补充表1）。例如，在评估系统性AAV载体剂量>1.1 × 10^14 vg/kg的一些神经肌肉试验中，观察到在载体后2周内出现的血栓性微血管病（TMA），并有补体激活的证据，符合非典型溶血性尿毒症综合征。虽然发表的文章很少，但报告的数据概述了TMA的终末器官毒性，包括恶性高血压、需要血液透析的肾衰竭，以及对eculizumab的反应性。然而，这种管理并不是普遍有效的，至少有一例患者因TMA并发症死亡。 除了TMA，AAV载体后短期和长期背根神经节（DRG）毒性的可能性最近在一项对256只非人类灵长类动物的荟萃分析中被识别，这些动物接受了33种不同载体，具有可变的血清型、表达盒和给药途径（脊髓内、脑脊液内和系统性）。一些动物显示出轻微的DRG毒性的组织学证据，而临床症状和严重的组织学发现只在两个动物中发现。这种主要是组织学发现的病因尚不清楚，但被假设与转导的DRG细胞中的未折叠蛋白反应有关。迄今为止，这种毒性的临床确认仅限于一名接受了脊髓内给药AAV载体治疗肌萎缩侧索硬化症的试验参与者；症状在使用糖皮质激素后有所减少，但在发表时并未改善。目前尚不清楚DRG毒性是否取决于AAV衣壳、剂量、盒式磁带或给药途径，还是可能的AAV载体平台毒性。 4.2 AAV的肝毒性和免疫反应 所有AAV血清型都能有效转运至肝脏，无论目标细胞是什么。因此，系统性AAV传递的主要安全考虑是肝毒性。所有针对血友病的AAV基因治疗试验都显示出无症状的肝细胞毒性，尽管发生的频率和过程因使用的载体和剂量而异。这种肝细胞损伤模式以转氨酶升高为特征，其中丙氨酸氨基转移酶的升高超过天门冬氨酸氨基转移酶的增加，而胆红素或γ-谷氨酰转移酶没有相应增加。在大多数但并非所有情况下，这伴随着因子活性的下降，这种下降可能或可能不会对免疫调节有反应。在给药后，目前正在进行血友病A关键试验的单一AAV载体导致多月转氨酶升高，其病因不明，与因子活性下降或对免疫调节的反应无关。大多数参与者因转氨酶升高接受了免疫调节，但没有证据表明其有效性或确定治疗病理。 然而，在血友病试验中观察到的大多数转氨酶升高发生在针对AAV衣壳的细胞毒性免疫反应的情况下。这种AAV“衣壳免疫反应”被假设是由衣壳特异性细胞毒性CD8+ T细胞识别主要组织相容性复合体I分子上的AAV衣壳肽段并清除所致；如果足够多的转导肝细胞被靶向，这理论上构成了一个安全问题。然而，到目前为止，AAV衣壳细胞免疫反应在很大程度上一直是血友病基因治疗的效力考虑因素，导致多次试验中部分或全部转基因表达的丧失。衣壳免疫反应的特征是转氨酶升高、因子活性下降，通常但并非总是外周血液中的单核细胞对AAV衣壳肽段在干扰素-γ抗衣壳酶联免疫吸附点（ELISpot）检测中有反应。值得注意的是，ELISpot检测在临床试验中的预测价值变化很大，并且由于技术上的复杂性，不太可能在许可后转化。尽管如此，即使是轻微的转氨酶升高和因子水平下降也已被证明对支持衣壳免疫反应相当敏感。衣壳免疫反应通常在载体给药后12周内首次观察到。 一旦有衣壳免疫反应的证据，就需要用免疫调节来维持转基因表达。已经尝试了各种策略，以糖皮质激素为主。重要的是，免疫调节并不总是成功的，可能受到载体相关和接受者相关元素的影响。迄今为止，合理设计的免疫调节方案尚未出现。最后，免疫调节的持续时间非常多变，从几周到超过1年不等，随之而来的安全问题。为了最好地评估免疫抑制的风险/效益概况，了解正在治疗的是什么以及确认干预措施既必要又有效至关重要。 虽然在血友病的AAV基因治疗后没有观察到肝衰竭，但在针对两种其他遗传病的AAV载体中已经观察到。具体来说，用于脊髓性肌肉萎缩症（SMA）的onasemnogene abeparvovec（Zolgensma®），剂量为1.1 × 10^14 vg/kg，带有肝毒性的警告标签。许可后，两名儿童在输注后6-8周出现急性肝衰竭，对糖皮质激素干预有反应。虽然确切的病因尚不清楚，但AAV衣壳细胞免疫反应在时间上呈现载体后、肝活检标本中有CD8+ T细胞浸润，以及类固醇反应性方面得到了强烈支持。最后，与在血友病试验中观察到的肝细胞毒性以及Zolgensma不同，在使用迄今为止人类AAV介导基因转移中使用的最高铁剂量的X连锁肌管性肌病（XLMTM）研究中，观察到肝胆汁毒性，导致四名试验参与者（3.5 × 10^14 vg/kg队列中的17人中有3人；1.1 × 10^14 vg/kg队列中的7人中有1人）肝衰竭和死亡。XLMTM的肝胆汁损伤模式和不明确的自然病史，可能包括潜在的肝病，与衣壳免疫反应不一致。这些严重肝毒性与血友病基因治疗的相关性尚不清楚，但其发生仍然支持使用尽可能低的AAV载体剂量，并在开处AAV基因治疗之前了解所有潜在的AAV毒性。 5.AAV治疗的长期安全性考虑 系统性AAV载体给药的主要假设长期安全问题仍然是肝脏和目标器官毒性以及遗传毒性的风险。虽然AAV主要是非整合性的，但在动物和人类在环境AAV暴露或载体给药后的测序数据显示，低频AAV整合事件倾向于活跃转录位点。给新生小鼠系统性给予AAV载体表明，在没有直接人类同源物的Rian位点的AAV整合导致了克隆性并几乎完全穿透肝细胞癌（HCC）。随后的研究表明，HCC风险与载体剂量和细胞分裂程度相关，并且通过使用肝细胞特异性启动子而被消除，但被非肝细胞特异性启动子增强。在大型动物血友病模型中，最近也证明了系统性AAV载体后的AAV整合和克隆性。然而，同样重要的是，这些动物被跟踪了10年，没有肿瘤发生的证据；尽管如此，这项研究提供了第一个大型动物数据，突显了AAV介导整合的风险。理解血友病患者接受AAV后的肝细胞癌理论风险因几乎所有严重的血友病患者>45岁因医疗原因获得了HBV和/或HCV，导致与普通人群相比HCC发病率增加而变得复杂。血友病和其他疾病队列中的AAV临床试验数据令人放心，尽管队列规模和纵向随访有限。在血友病基因治疗接受者人群中，一名有长期HCV感染史的单一参与者在载体后1年发展为HCC。最近对肿瘤组织的测序分析发现了预期的低频随机AAV整合，没有克隆性，并且存在与HCV相关HCC中发现的突变，表明AAV载体输注没有促进患者的HCC。除此之外，在数百名血友病基因治疗试验参与者中没有HCC的报告，即使是在接受系统性AAV载体的第一批参与者（HB患者）的15年随访数据中也是如此。总之，到目前为止，没有临床证据直接支持AAV载体输注作为HCC发展的危险因素。然而，这种理论风险只有在载体给药后几十年才会预期发展。鉴于AAV载体给药后肿瘤发生的长期风险存在多个未知因素以及血友病人群中HCC风险增加，作者的观点是，接受AAV基因治疗的血友病患者应该在载体后数十年内通过血清甲胎蛋白水平、肝功能研究和肝脏超声监测，以监测HCC和长期肝毒性。最终，成人血友病人群之外的队列更接近于小鼠在AAV给药后HCC发展的风险因素。具体来说，婴儿由于肝脏快速生长和由此产生的高细胞分裂率，接受具有普遍启动子的高系统性AAV载体剂量（例如给患有SMA的婴儿的Zolgensma）更密切地模仿了小鼠模型中确定的遗传毒性风险因素；因此，这些婴儿是一个重要的队列，需要仔细跟踪，以回答关于人类AAV遗传毒性和系统性AAV载体给药后HCC风险的问题。 6.转基因蛋白的短期和长期安全性考虑 转基因蛋白的主要安全性考虑包括：(a) 免疫反应，无论是否对自身抗原有交叉反应；(b) 促血栓形成的风险。在考虑迄今为止在血友病A（HA）和血友病B（HB）基因治疗试验中观察到的FVIII和FIX的异质性表达时，促血栓形成的风险尤为重要。超生理水平的FVIII和FIX活性是静脉血栓形成的独立危险因素。流行病学数据显示，超生理水平FVIII活性[优势比（OR）8.8–21.3]的静脉血栓形成风险高于FIX（静脉血栓形成OR 1.8–4.0），尽管在任何情况下都不受欢迎。事实上，一名表达超生理水平FIX活性（200–520%）的HB研究对象在他的动静脉瘘中发展出血栓，并接受了抗凝治疗。类似地，由于一名受试者超生理FVIII表达和静脉血栓形成，辉瑞公司赞助的III期AAV基因治疗试验最近暂停。基于这些原因，HA或HB基因治疗的治疗窗口可能在正常因子水平的上限结束。 除了超生理表达外，理论上促血栓形成的风险可能由增强止血功能的变异蛋白赋予，例如FIX-R338L，它在所有目前正在进行的HB基因治疗工作中使用。重要的是，FIX-R338L的调节方式与野生型FIX相同，这与临床前数据一致，后者证明血栓形成风险与FIX活性相关，与野生型与FIX-R338L表达无关；综合这些结果支持FIX-R338L本身不是促血栓形成的结论。 此外，虽然可能对表达的转基因产生多种免疫反应，但到目前为止，没有试验参与者对转基因蛋白发展出NAbs；值得注意的是，当前血友病基因治疗试验的入选标准严格排除最有可能发展出抑制物的患者（例如，当前或过去有抑制物病史或有<50–150因子暴露的患者）。然而，小型和大型动物数据表明，肝细胞表达转基因会诱导转基因耐受；这已经为多种蛋白证明，包括FVIII、FIX和FIX-R338L。此外，现有的临床前数据表明，肝脏导向的基因转移可能诱导转基因产物免疫耐受。因此，在肝脏导向的基因治疗后对转基因蛋白持续的免疫反应是不太可能的。事实上，基因治疗的未来扩展适应症可能包括在预先存在FVIII抑制物的HA患者中诱导耐受。国家心肺血液研究所赞助的“FVIII抑制物科学现状”研讨会的共识建议明确支持追求基因治疗用于HA的FVIII耐受诱导。然而，最近在接受AAV肌肉导向基因治疗的杜氏肌营养不良症患者中观察到针对转基因蛋白的抗体；这些抗体被假设与自身抗原交叉反应，突显了AAV基因治疗在单基因疾病中的一些持续未知因素。 7.血友病基因治疗的有效性数据 在具有持续转基因表达的临床试验中，大多数具有持续转基因表达的试验参与者已经显示出表型改善（图1）；基因治疗相对于当前血友病护理的潜在优越疗效是没有争议的。此外，尽管因子表达水平存在异质性，但短期内年化出血率（ABR）的降低相对均匀。然而，个别载体，特别是血友病A载体，可能会基于表达的持久性和长期疗效来区分自己。 图 1. (a) 血友病A和(b) 血友病B AAV基因治疗临床试验参与者在AAV载体注射前后的年化出血率（ABR）。数据提取方式如下：BMN270（valoctocogene roxaparvovec）代表平均ABR（n = 134名参与者）；SPK-8011代表在AAV衣壳免疫反应外维持表达并被跟踪超过1年的参与者的平均ABR（n = 15）；SB-525（giroctocogene fitelparvovec）代表仅在载体注射后的参与者的平均ABR（n = 4）；AAV-wt-FIX（scAAV2/8-LP1-hFIXco）代表报道的中位数ABR（n = 10名参与者）；AMT-060代表平均ABR（n = 10名参与者）；AMT-061（etranacogene dezaparvovec）代表所有出血事件的平均ABR（n = 54名参与者）；SPK-9001（fidanacogene elaparvovec）代表平均ABR（n = 10名参与者）。 虽然流行病学研究为避免超治疗表达及随之而来的安全问题提供了强有力的理由，但确切的最低期望因子活性仍然不清楚，可能因患者的活动水平和关节健康等特征而异。可以从现有的血友病A自然史数据中模拟目标最低期望因子活性，这些数据显示一阶段FVIII活性≥12%可赋予ABR<1。此外，emicizumab预防治疗在>50%的试验参与者中赋予ABR<1，并估计具有10-30%的体内FVIII止血等效性；这些发现和血友病自然史数据普遍支持类似的目标最低表达。实际上，这些近似值到目前为止得到了对累积可用基因治疗数据的分析支持，在其中持续的FVIII活性>10-20%的一阶段测定在大多数接受者中可靠地允许ABR<1（图2）。 图 2. 年化出血率（ABR）与因子VIII（FVIII）活性之间的关系。(a) 所有基因治疗接受者接受0.5–2 × 10^12个基因组/kg的SPK-8011（黑色方块）、4–6 × 10^13个基因组/kg AAV5-FVIII I/II期（红色圆圈）和6 × 10^13个基因组/kg AAV5-FVIII III期（蓝色三角形）的ABR和FVIII活性。绘制的FVIII活性水平是通过单阶段测定或使用1.6的校正因子从色原测定结果转换而来。黑色垂直线代表正常FVIII水平的10%。蓝色阴影框表示ABR ≤1的接受者。(b) 基因治疗接受者中ABR ≤1的百分比，其FVIII活性由单阶段测定确定。来自基因治疗接受者的ABR数据被分组为每组10个，然后作为分组组中最大FVIII水平的函数进行绘制。 然而，根据AAV载体的不同，观察到的转基因表达变化10-100倍。因此，不可能针对个体患者的因子阈值需求。此外，在具有人类肝细胞嵌合的小鼠克隆群体的研究表明，仅转导效率就有高达七倍的变异。这些数据与影响从载体输注到稳态转基因表达的每个步骤的多个生物变量一致，并强调了该领域可能不得不在不久的将来容忍患者间转基因表达的变异。 使我们能够清楚定义目标和可接受转基因表达的治疗范围变得复杂的是，对测量的转基因FIX或FVIII活性与体内止血功能的关联程度的信心。具体来说，通过一阶段（OSA）或色谱法（CSA）测定转基因衍生的FVIII-SQ和FIX-R338L会有所不同。在人类和小鼠中，FVIII:C通过OSA测量比CSA高出大约1.6倍，这是二十年重组FVIII-SQ蛋白临床使用中未见到的观察结果。类似地，通过OSA测定的FIX-R338L活性高于通过CSA测定的FIX活性。然而，与转基因衍生的FVIII-SQ不同，与重组FIX-R388L的相对检测差异得以维持，并且总体上与我们对FIX-R338L酶功能的了解一致。 8.转基因表达的持久性 尽管在成功但变量的因子表达情况下，短期内的临床效益相对均匀且出色，但不同载体在长期稳定表达方面存在异质性（图3）。大型动物数据显示，无论是FIX还是FVIII表达，在载体输注后长达8年的时间里都稳定或没有减少。迄今为止，可用的HB临床试验数据模仿了大型动物数据的观察结果；发表的数据长达3年，摘要数据长达8年，证明了FIX表达的持久性和稳定性。关于HA表达持久性的数据存在冲突。 具体来说，在目前进行HA III期试验的载体中，两者从第1年到第2年都几乎失去了一半的FVIII水平。在这些载体中，valoctocogene roxaparvovec（AAV5-FVIII或BMN-270）已经在I/II期试验参与者中连续减少了6年的FVIII水平。在更大的III期试验参与者队列中观察到了类似的结果（n = 17），从第1年到第2年失去了40%的表达，并在目前可用的3年随访数据中继续减少FVIII活性（图3）。有趣的是，与valoctocogene roxaparvovec观察到的FVIII水平下降非常相似的是，接受SB-525（现在为giroctocogene fitelparvovec）并在2年后接受随访的I/II期数据的参与者（n = 4）（图3）；这个载体处于暂停的关键试验中。与valoctocogene roxaparvovec和giroctocogene fitelparvovec的观察结果不同，接受SPK-8011并在没有衣壳免疫反应的情况下维持FVIII表达的参与者（n = 5）在载体输注后长达3年内显示出明显的稳定FVIII水平（图3）。虽然giroctocogene fitelparvovec（SB-525）和valoctocogene roxaparvovec（BMN27）的长期FVIII药代动力学看起来相似，但它们与SPK-8011的观察结果明显不同，这为当前HA AAV介导的基因添加策略中大约稳定的多年FVIII表达是可能的提供了原理证明。 图 3. AAV基因治疗后多年因子VIII (FVIII)活性。数据提取自公开发表的出版物或摘要。点代表中位数FVIII水平（SB-525除外，只有平均值可用），误差条是四分位间距。数据来自接受3 × 10^13、6 × 10^13和0.5–2 × 10^12 vg/kg剂量的SB-525、AAV5-FVIII和SPK-8011的AAV载体的队列。接受SPK-8011治疗的两名参与者由于载体注射后3个月内的衣壳细胞免疫反应而失去了所有FVIII表达，不包括在内。绘制的SPK-8011参与者数据分别代表第1年的n = 15，第2年的n = 11，以及第3年的n = 5，反映了可用随访数据的持续时间。FVIII活性通过单阶段测定或使用1.6的校正因子从色原测定结果转换得出，用于AAV5-FVIII结果。 在HA临床试验中观察到的表达持久性差异的原因是什么尚不清楚。鉴于当前策略旨在维持染色体外转基因的稳定，由于细胞分裂和损失，预期会出现一定程度的表达下降，尽管是逐渐的，正如目前的HB工作所证明的那样。图3中呈现的综合数据可能表明高水平的转基因FVIII是不可持续的；然而，仔细审查valoctocogene roxaparvovec后个体接受者的FVIII水平并不表明FVIII水平和FVIII下降之间有明确的关系。这需要进一步研究。目前对两个正在进行III期试验的HA载体观察到的FVIII表达下降的假设机制包括（a）由于载体或FVIII毒性导致的转导细胞丢失，（b）基因沉默，（c）未检测到的对AAV衣壳或表达转基因的免疫反应，或（d）个别载体的特性阻碍了稳定的串联染色体外载体表达盒DNA的形成。由于FVIII未折叠蛋白反应导致转导肝细胞丢失的假设得到了在重组FVIII哺乳动物表达系统中观察到这一现象以及在小鼠模型中通过肝脏导向AAV介导的基因转移后的超治疗表达FVIII的先前观察结果的支持。然而，尽管采样和/或时机考虑限制了解释，但在HA受试者的肝活检中没有未折叠蛋白反应的证据。不同AAV产品用于制造平台如何导致转基因FVIII水平下降也未知。鉴于我们对AAV载体输注后发展持久、高滴度、多血清型、交叉反应AAV NAbs的了解，以及我们目前无法克服高滴度AAV NAbs，FVIII水平的稳定性是关于临床试验注册或许可AAV产品选择决策的关键考虑因素。潜在的接受者需要完全理解他们只能接受一次AAV基因治疗，并且在他们的利弊计算中必须考虑转基因FVIII表达的丧失。 9.未来方向 全面考虑下一代血友病A（HA）和血友病B（HB）的基因治疗方法超出了这篇综述的范围。许多新方法正准备在当前进展的基础上进行。这些包括使用FVIII变体的下一代AAV载体以改善分泌或止血功能，以及用于基因编辑的AAV载体和脂质纳米颗粒。尽管仍处于临床前开发阶段，但预计这些方法中的一些将很快进入临床。此外，系统性递送以靶向肝脏以及使用慢病毒载体进行体外造血干细胞转导正在临床前或首次人体临床试验中进行。 目前的努力排除了整个儿科人群，以及缺乏常规治疗途径的患者（世界上大部分血友病人群）。这些人群可能是基因治疗可能产生最大影响的人群。 10.结论 在基于AAV的血友病和其他单基因遗传病的基因添加方面取得的进展建立了一种新的治疗范式。了解AAV平台以及对单个载体迄今为止可用信息的全面了解是必要的，以便能够真正知情同意使用研究性或许可载体的治疗。血友病社区热切期待当前一代许可的AAV载体用于HA和HB，预计将很快进入临床。重要的是，尽管当前血友病基因治疗在概念验证方面取得了反复的成功，但能够稳定、持久地表达FVIII或FIX以改善所有患者的出血仍然是一个未实现的希望。这定义了下一代基于基因的血友病治疗的发展目标。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

Hands passing money/Taylor Tieden for BioSpace When Orchard Therapeutics announced the $4.25 million price tag in March for its newly approved rare disease gene therapy Lenmeldy, it became the most expensive on the market. But since 2019, the FDA has approved five others that cost more than $2 million. Some insurers, even when legally required, are not having it when it comes to paying out the cost of a treatment. A November 2023 ProPublica investigation found that insurance provider Priority Health quietly nixed coverage of gene therapies as a cancer treatment, even though under Michigan state law the payer was required to cover clinically effective cancer drugs. The gene therapy in question, CAR-T, was the last hope for patient Forrest VanPatten to recover from an aggressive case of lymphoma. According to ProPublica, his CAR-T treatment was estimated to cost $475,000. VanPatten died while waiting for the results of his third request for coverage. Globally, many healthcare systems are choosing not to cover gene therapies at all. Even though every health regulatory body reviews the same scientific and trial information, Canada and countries across Europe have completely different gene therapy coverage models than the U.S., according to a December 2021 study in Health Policy. “The primary underlying reasons for access restrictions in all regions appear to be scientific uncertainty at the time of approval, limited evidence, and the high cost of these therapies,” the study authors wrote. But even with the high price tag and what some call questionable evidence that a treatment will provide a lifetime benefit, private American payers are already shelling out for gene therapy treatments, said Graig Suvannavejh, the managing director of biopharma and biotech at Mizuho Securities. However, debate remains over what conditions warrant six-figure prices and how payers can recoup that money if a gene therapy fails. “This will continue to be an evolving dynamic over the next 10 to 20 years,” Suvannavejh said. How Do Insurers Pay Biopharma Firms for Gene Therapy? At this juncture, both public and private payers can pay for gene therapies either upfront or in annual installments over a handful of years. Both types of agreements can, and largely do, build in a caveat that if a patient does not see a significant benefit over time, the payer can receive a rebate of part of the gene therapy's cost. These are known as outcome- or value-based agreements. “Gene therapy [means] that you’re given it one time [and] you’re stuck with it, good and bad,” Suvannavejh told Biospace. “The issue then is if it is meant to be given as a one-time treatment, are you actually getting the benefits for the duration of your life?” Suvannavejh said that other factors, such as existing therapeutic options beyond gene therapy and the disease’s fatality rate, are part of the coverage discussion. If a condition has a high fatality rate and few other options, there may be greater willingness to agree to a high price tag. Right now, he added, gene therapy payments tend to be upfront in a lump sum. Bob Lojewski, senior vice president and general manager of CSL Behring North America, said that private payers have been largely receptive to the $3.5 million price tag of the company’s HEMGENIX, a gene therapy treatment for hemophilia B. Currently, payers are covering “the vast majority of the U.S. population” who may need HEMGENIX, he said. “To date, every patient referred for HEMGENIX has been covered through insurance, and we expect access for eligible people interested in this one-time treatment will continue,” he said. Lojewski added that the CSL team has seen an “accelerating rate” of patients referred for treatment in the past six months, potentially due to the agreements in place to cover the therapy. He did not say whether insurers were paying by lump sum or in installments. Internal CSL figures estimate that between annual bleed rates and required therapies to address hemophilia B, a patient with the disease can cost an insurer $20 million over the course of their life. That puts the expenditure of $3.5 million for a gene therapy to reverse or cure the condition into perspective. When that is extrapolated out, HEMGENIX could save the U.S. healthcare ecosystem tens of billions of dollars over the next 20 years, Lojewski said. However, saving all of that money in the long run comes with tens of millions of dollars in upfront costs to private companies or the federal government, while it may take decades to realize the cost savings from that investment. According to the Alliance for Regenerative Medicine, an analysis by NEWDIGS at Tufts University estimates that gene therapy expenditure in the U.S. will reach $7.5 billion by 2030. In context, that’s approximately 0.1% of national projected healthcare spending for that year. Public Payers Negotiate Costs for Gene Therapies Medicare and Medicaid both cover many patients affected by conditions addressed by new gene therapies. Medicaid covers two-thirds of patients with sickle cell disease, which bluebird bio’s Lyfgenia and Vertex Pharmaceuticals’ and CRISPR Therapeutics' Casgevy, listed at $3.1 and $2.2 million respectively, are designed to treat. Furthermore, Medicaid provides healthcare coverage for over half of children with spinal muscular atrophy, some cases of which can be treated with Novartis’ $2.1 million Zolgensma treatment. But public payers may be negotiating discounts on those list prices down year over year, while it’s unclear whether private payers are negotiating regularly for treatments to be significantly less than their list prices. Take Zolgensma. With a $2.1 million listing price, public insurers paid $1.89 million per claim in 2019, and by 2022, that figure dropped to $1.36 million, nearly a 40% discount from its list price, according to the Centers for Medicare & Medicaid Services (CMS). In 2022, CMS spent roughly $87.25 million on some 63 Zolgensma treatments. Like private insurers, public payers are setting up rebate programs in case these therapies do not deliver on their promises, although this strategy isn’t commonly used just yet. “Supplemental rebates only accounted for 9% of all Medicaid drug prices in fiscal year 2022,” an Alliance for Regenerative Medicine representative told Biospace. Karen Fischer is a freelance science writer based in New Mexico. Reach her at kfischerwrites.com.