干货分享|浅谈细胞培养基的基本成分

2022-09-05

抗体

所有的细胞培养基都需要相似的基本营养物质，对维持生命和细胞生长至关重要。基于细胞的化学组成，水，各种来源的碳、氮和磷酸盐，氨基酸，脂肪酸，维生素，微量元素，和盐浓度都提供所需的浓度，以满足细胞的生长,。根据营养物质的消耗速率，需要补充关键组分以保持细胞的高活力，并延长培养时间。虽然已经开发出了适合多种细胞类型的培养基，包括微生物，植物，昆虫和哺乳动物，不同的培养基在基本营养成分方面可能大体相似，但本章节主要关注无血清、化学成分限定的CHO细胞培养基，主要是为了重组抗体的表达。作为在大规模动物培养中不可缺少的因素之一，培养基对细胞的状态，高密度的维持以及产量都发挥着重要的作用。为支持细胞生长，所有培养基都包含基本的营养物质，水，碳源，氮源，维生素，氨基酸，脂肪酸，微量元素，磷酸盐。培养基含有超过70 种营养成分，对各种成分进行合理组合成为优化的关键，在此之前，需要了解培养基的基础成分。培养基中各主要组分如下：1水哺乳动物细胞对水中的杂质高度敏感，包括内毒素，细菌，微量元素，微量有机物等。为了防止杂质对细胞培养基的污染，以及培养基中未控制的离子和微量元素的浓度造成细胞性能的不一致，需要用高纯水用于培养基的配置。一般来说，纯水系统包括蒸馏，去离子，微滤，反渗透处理。水的纯度一般用电导率或电阻(>18MΩcm)衡量或低有机碳含量(≤15ppb)，而且必须不含有内毒素。常用的是注射用水，高纯度且无内毒素。2氨基酸氨基酸可以分为必须氨基酸(用于维持活细胞的氮元素平衡) 和非必需氨基酸(可以由前体细胞合成)。必须氨基酸：组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯基丙氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸，半胱氨酸，谷氨酰胺。非必须氨基酸：L-丙氨酸，L-精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，脯氨酸，丝氨酸，酪氨酸[1]。非必须氨基酸在细胞密度较低对细胞生长不会产生影响，在生物反应器中进行高密度细胞培养时，细胞产生这些氨基酸的速度无法满足自身生长的需求，会成为限速因素，甚至导致细胞进入凋亡。如L-天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸是大多数CHO细胞系的自限氨基酸。不同的细胞以不同的速率利用这些氨基酸，并不是所有的商业化培养基都含有全部的非必须氨基酸，因此需要在培养初期对培养基进行筛选。培养基中氨基酸浓度的小改变都会影响细胞的密度和生长，抗体糖基化。在融合蛋白表达研究中发现通过代谢流组学分析优化氨基酸的浓度可以提高细胞密度50%，产量提高25%。在一个更加复杂的研究中，Torkashvand通过几个Plackett-Burman (PB)实验优化了影响细胞密度和产量的关键氨基酸的浓度，再通过响应面法分析了这些氨基酸的交互效应，在不影响抗体质量的情况下，抗体表达量提高了70%。除了提高细胞密度和抗体产量，一些氨基酸的添加对反应器培养的细胞还有保护作用，减轻或消除氨和PCO2的负面效应，保护细胞应对培养中产生的氮缺乏，高渗透压和高PCO2。Vivian M研究了在高PCO2环境压力下哪些氨基酸具有保护效应[2]。PCO2的增加会抑制细胞的生长，同时伴随着胞内pH和糖酵解的下降。通过研究每种氨基酸在三种浓度梯度(5mM 15mM 25mM)对高PCO2和高渗透压环境下( 195mm Hg PCO2/435mOsm)细胞的保护效应，对照环境为40mm Hg PCO2/320mOsm。在hybridoma和CHO细胞中，发现具有保护效应的四种氨基酸，甘氨酸甜菜碱，甘氨酸，天冬酰胺，苏氨酸。Hybridoma细胞中，这四种物质还增加了葡萄糖的消耗速率。在CHO细胞中，PCO2的增加降低了tPA的生产率，15mM甘氨酸甜菜碱glycine betaine在高PCO2和高渗透压环境下提高了20%的生产率，以及葡萄糖的消耗速率。当培养环境中Na+和Cl-浓度增加，许多信号分子包括酶和RNA是不稳定的，而细胞内这些保护性的氨基酸的积累可以降低胞内有机离子Na+和Cl-的积累，并稳定胞内分子。氨基酸还可以作为信号分子降低细胞凋亡速度[3]。防止细胞凋亡的氨基酸有甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，脯氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，组氨酸。通过添加丙氨酸（2mM），谷氨酰胺，天冬酰胺可以降低凋亡速度，提高稳态活细胞浓度。在CHO-K1细胞中，当亮氨酸浓度低于10uM，缺乏亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸可以提高转运系统L的活性1-4倍，以及转运系统L相关氨基酸的利用速度，随之而来的就会促进这些氨基酸的更快速率的消耗。因此这四种氨基酸的浓度需要比代谢通量或组学分析中计算出的需求浓度更高，并在培养中仔细监控浓度变化[4]。氨基酸的氧化导致二级和三级结构的改变，并导致生物学后果，包括活性和半衰期的降低，更快的清除和免疫原性聚集体的形成。美国礼来公司发现当使用CD培养基代替含有水解物的培养基培养CHO K1SV细胞时，可以提高产量40%，但是使用LC=MS肽图分析表明在抗体分子的互补决定区发现有特定的色氨酸残基氧化大幅度增加。研究发现通过增加色氨酸，铜离子和锰离子在CD培养基和补料中的浓度，降低补料中半胱氨酸的含量，可以不影响细胞生长和表达，降低色氨酸氧化60%，并在反应器中得到重复验证。通过使用优化的培养基和补料，发现8%的酸性峰会转变为主峰，抗体纯度和糖基化不变[5]。铜离子和铁离子也会促进蛋白的氧化，此研究中相反的结果是因为Cu+催化ROS，而一定浓度的Cu2+(硫酸铜)可以压制还原剂。锰离子与铁离子竞争阻止Fenton反应，进而阻止ROS形成，锰离子还会影响糖基化。半胱氨酸一般被认为是抗氧化剂，但它的作用是随着浓度和辅因子上的分布而变化的。在此研究中的解释是，半胱氨酸作为过渡金属的还原剂，催化产生ROS的Fenton反应，因此通过降低半胱氨酸，可以降低导致色氨酸氧化的ROS量。培养基中高浓度的赖氨酸和组氨酸能有效的降低抗体中的酸性峰，同时不影响产量。高浓度的赖氨酸和组氨酸还可以稍微降低指数生长期的细胞密度，提高培养后期抗体生产阶段的细胞活力。然而，高浓度的赖氨酸对羧肽酶有抑制作用，导致C端赖氨酸变体。因此，需要根据单位抗体需求量改变两种氨基酸浓度。培养基中丙氨酸的浓度都相对较低，在细胞培养中，细胞消耗丙氨酸速率低或利用其他氨基酸生成丙氨酸。当培养基中乳酸足够多时，丙氨酸的产生速率与氨基酸的浓度呈正相关。丙氨酸的积累对细胞的生长几乎没有抑制作用，除非丙氨酸的浓度超过3mM。当乳酸和丙酮酸缺乏时，通过谷氨酸降解，丙氨酸倾向于转变为丙酮酸并释放氨到培养基中，导致培养基中氨的积累[6]。在抗体表达过程中，CHO细胞以较高的速率消耗精氨酸。精氨酸的缺乏会导致指数生长期的CHO细胞阻滞在GO或G1期，过多的精氨酸可以有效的降低抗体的酸性峰比例。然而，不同于赖氨酸，高浓度的精氨酸会抑制细胞生长，降低细胞活力。另外，精氨酸浓度的增加还会双倍提高C端赖氨酸变体的数量，从而增加产品的异质性。天冬酰胺和天冬氨酸是培养基中重要的非必须氨基酸，在关键代谢途径中起着重要的作用。相比较其他氨基酸，细胞消耗天冬酰胺和天冬氨酸速率更高，尤其是在指数生长期。这两种氨基酸同葡萄糖，谷氨酰胺，谷氨酸在三羧酸循环和能量代谢中都很重要[7]。天冬氨酸和天冬酰胺通过转氨酶反应在谷氨酰胺和谷氨酸之间的转变中作为氨的供体和受体，并产生谷氨酸和草酰乙酸[8]。当缺乏天冬酰胺，细胞会用更高浓度的天冬氨酸，谷氨酸，丝氨酸，谷氨酰胺，精氨酸来补偿，甚至会用更高的速率消耗氨基酸，导致的氨基酸可利用的降低会影响蛋白合成和基因表达[9]。培养基中天冬酰胺和天冬氨酸的缺乏对CHO细胞表达的单克隆抗体的产生有害。细胞在生长期时天冬酰胺的缺乏是抗体多肽序列中天冬酰胺位点丝氨酸的错误加入的主要原因。而且天冬酰胺在抑制DNA损伤和细胞凋亡中起着重要的作用。培养基中天冬酰胺的浓度可以调整抗体的半乳糖基化糖型分布。低浓度的天冬酰胺可以降低氨的积累和胞内ph，随后增加了β-1,4半乳糖转移酶的活性和表达，导致G0F转变为G1F/G2F[10]。补料中提高天冬酰胺的浓度虽然提高了乳酸和氨，但最终提高了产量。可以通过提高补料中天冬酰胺/谷氨酰胺的比例降低氨的浓度。作为唯一一个含巯基的氨基酸，半胱氨酸是一个特殊的非必须氨基酸。半胱氨酸残基上巯基间的二硫键的形成支持CHO细胞结构蛋白和重组抗体三级和四级结构的折叠。半胱氨酸的缺乏对CHO细胞的生长是致命的且不可逆转的，导致细胞活力3天内下降40%。当半胱氨酸浓度下降到0.1mM，单克隆抗体表达量下降40%，半胱氨酸的浓度大于1mM对哺乳动物细胞产生毒性，这可能是由于脂质过氧化和羟基自由基的形成，在铜离子的存在下会加速此形成[11]。在哺乳动物中，半胱氨酸的浓度由肝脏调节，在培养基中没有此调节机制时，培养基中半胱氨酸的浓度需要被仔细设计和控制。半胱氨酸是培养基中最不稳定的氨基酸，在ph中性时可以氧化成为胱氨酸，胱氨酸的低溶解度也会降低培养基中半胱氨酸的溶解度，Merck的S-磺基半胱氨酸可以作为培养基中半胱氨酸的替代物和抗氧化剂，增加二硫键，降低聚体[12]。CHO细胞以相对较低的速度消耗甘氨酸，在培养基优化效果研究中也不是一个主要的成分。在CHO细胞中，甘氨酸是胸苷合成的副产物。在CHO DG44(DHFR缺陷型)细胞中，阻断胸苷的生物合成导致甘氨酸的缺乏。因此在培养DG44的CHO细胞系的含有MTX的扩增培养基中，需要仔细设计甘氨酸的浓度。丝氨酸是CHO细胞消耗第二高的氨基酸。CHO细胞会消耗70%的丝氨酸生成甘氨酸，促进胸苷的合成[13]。尽管丝氨酸很重要，培养基中丝氨酸的浓度低到1mM并未影响细胞生长，只降低了指数生长期甲酸和甘氨酸的产生，但培养基中丝氨酸的耗竭产生了负效应，包括促进天冬氨酸的消耗，丙氨酸，乳酸和氨的产生，最终抑制细胞的生长[14]。所以在培养基中丝氨酸一般设定在相对较高的浓度，一些研究也表明，丝氨酸的添加可以提高产量和最高活细胞密度。酪氨酸是CHO细胞表达抗体的关键氨基酸。低浓度的酪氨酸会干扰蛋白质翻译，降低抗体单位生产率[15]。酪氨酸缺乏与苯丙氨酸错误插入到酪氨酸残基上呈正相关，从而导致产品序列变体的产生。保持酪氨酸的浓度在1mM以上可以有效清除酪氨酸位点上的错误插入[16]。然而酪氨酸是难溶的氨基酸，但是在培养基中又需要高浓度的酪氨酸。Merck的磷酸化酪氨酸或者含有酪氨酸的二肽可以提高了酪氨酸的溶解度[17]。3维生素培养基中包含的维生素包括B-复合维生素叶酸，烟酰胺，吡哆醛，泛酸盐，核黄素和硫胺，这些都是辅酶的组成成分，以及胆碱和肌醇作为脂质合成的基质。维生素的高还原能力可以保护细胞免受氧化自由基的伤害。尽管需求量是微量的，维生素是培养基中的必须成分，尤其是在CD培养基中。许多商业培养基中都包含B族维生素及其衍生物，包括生物素，叶酸，肌醇，烟酰胺，胆碱，4-氨基苯甲酸，泛酸，吡哆醇，核黄素，硫胺素和钴胺素。维生素的添加可以CHO细胞表达mAb单位产量3倍以上。随着培养基中所有维生素浓度的增加，添加叶酸，钴胺素，生物素和4-氨基苯甲酸可以提高细胞生长密度和表达量。许多维生素都会强光，高温，长期的空气暴露敏感，在培养基中由于含有铁和胱氨酸的存在，吡哆醛会随着时间的推移形成沉淀。用吡哆醇取代吡哆醛则可以显著改善保质期。对于低密度生长的细胞，维生素B12是非常重要的。抗坏血酸或维生素C在适合细胞生长的pH和温度下是非常不稳定的，硫胺素和泛酸对热敏感。抗坏血酸和生育酚对空气氧化敏感。可以用抗坏血酸2-磷酸镁盐替代。一些B族维生素如核黄素，叶酸，亚叶酸和B12，硫胺素和钴胺素，抗坏血酸对于光线是非常敏感的，含有这些维生素的培养基需要避光保存，否则这些成分会很快降解。因此，培养基的保存必须注意暗光和低温保存。4微量元素培养基中的微量元素有效浓度非常低，有时甚至低于标准分析仪器的检测阙值。一些微量元素在调整代谢通路，酶和信号分子活性上起着非常关键的作用。5葡萄糖等能源物质葡萄糖和谷氨酰胺是培养基中两种主要的能源物质。葡萄糖是核苷，氨基糖和一些氨基酸的碳源。CHO通过糖酵解利用1M葡萄糖生成丙酮酸，再通过柠檬酸循环氧化丙酮酸生成36M ATP。葡萄糖通过分解代谢产生ATP，在大多数培养基中，只有5%的ATP来自于三羧酸循环的有氧糖酵解过程，副产物是二氧化碳。丙酮酸也可以被认为是能源物质，因为它在通过TCA循环产生ATP中起着关键作用。由于氧吸收的限制，80%的葡萄糖会通过厌氧糖酵解转为乳酸，乳酸盐改变ph和渗透压，是细胞培养过程中需要重点监控的代谢副产物之一，高浓度的乳酸会抑制细胞生长。研究发现，在培养早期，葡萄糖的浓度并不会显著影响乳酸的产生速率，而在培养的中后期，高浓度的葡萄糖会导致乳酸积累的增加。为了降低葡萄糖代谢的副产物，已经研究了一些替代葡萄糖的能源物质。在CHO细胞培养基中，半乳糖是一个重要的可选择的碳源，在糖酵解中也可生成丙酮酸。通过分析半乳糖的代谢途径发现，在同时含有葡萄糖和半乳糖时，细胞优先利用葡萄糖，然后利用半乳糖，这样导致了更低的乳酸积累和更高的乳酸消耗，也延迟了细胞活力的下降。而完全用半乳糖替代葡萄糖，虽然氨和乳酸浓度下降，却导致细胞密度下降，以及细胞活力提前下降，这或许是因为半乳糖激酶的低活性。半乳糖同时会影响与糖基化相关基因的表达。通过调整培养基中半乳糖，尿苷，氯化锰可以调整抗体的半乳糖基化水平。通过两种不同的机制，半乳糖的添加还会影响抗体的唾液酸化。通过增加额外的唾液酸化位点，增加的半乳糖基化也增加了唾液酸化水平。然而，唾液酸酶基因表达谱和细胞内酶活性研究表明半乳糖的增加也会提高去唾液酸化水平。CHO培养基中，还有其他己糖可以用来替代葡萄糖。包括果糖，甘露糖等。使用甘露糖替代葡萄糖，促进细胞生长，降低乳酸积累，而不改变抗体结构，从而提高单位生产率。然而，培养基中含有高浓度的甘露糖，不仅会抑制细胞内细胞内α-甘露糖苷酶，还会增加抗体甘露糖基化水平，因此导致ADCC活性提高和人体内抗体的清除速率。同葡萄糖和半乳糖一样，果糖的添加也可以降低乳酸的浓度，延迟细胞活力下降。然而，果糖完全代替葡萄糖时，也会导致细胞密度和产量的下降。对于大多数正常的细胞来说，大约一半的能量来自葡萄糖，一半来自L-谷氨酰胺。L-谷氨酰胺的问题在于它会随着时间的推移和温度的变化分解为氨和吡络烷酮羧酸。L-谷氨酰胺在室温(25℃)条件下就会加速分解，在冷冻温度下，大约30%的谷氨酰胺也会在6个月内消耗殆尽。所以谷氨酰胺配置200mM一般分装保存在-20℃，有效期尽量在6个月以内。在37℃，谷氨酰胺在2-3天内耗尽，产生的氨影响细胞生长。当氨的浓度达到10mM，对动物细胞会有毒害作用。在抗体表达阶段可以通过添加谷氨酸替代谷氨酰胺降低氨和乳酸的产生速率，在含有谷氨酸的培养基中，通过优化葡萄糖的浓度，可以提高葡萄糖和氮源的利用率，同时降低氨和乳酸的积累。在CHO细胞培养基中，丙酮酸作为一种能源物质也可以替代谷氨酰胺降低氨的积累。因为丙酮酸是乳酸产生的一个中间体，同时也是丙氨酸脱氢反应的产物，在培养基中添加丙酮酸，在乳酸耗尽时抑制丙氨酸的消耗，降低丙氨酸代谢产生的氨[18]。6缓冲体系平衡盐溶液主要含有阴阳离子以及离子缓冲对，用以保持细胞生理所需的pH范围。生理溶液中四种主要阳离子是钠(Na+)，钾(K+)，钙(Ca2+)，镁(Mg2+)。所有这四种离子对维持膜电位和养分运输很重要。阳离子Na+和K+在确定渗透压和维持渗透平衡中发挥关键作用。阳离子Ca2+和Mg2+作为细胞彼此贴附的基质非常重要，并且是作为酶反应的辅助因子。平衡溶液中的主要阴离子是磷酸盐(PO4-)，氯化物(Cl-)和碳酸氢盐(HCO3-)。这些阴离子在缓冲体系中扮演着重要的角色，用以维持细胞的7.2-7.6的最佳pH值。基础培养基中一般选择有机磷酸盐和两性离子缓冲盐作为缓冲体系。当使用碳酸氢钠的培养基时，二氧化碳的最佳比例因培养基的配方而异。一般来说，对于含有2-3g/L的碳酸氢盐的培养基，温度在36-37℃时，培养箱或摇床气体环境中CO2含量控制在6%，培养基应该能达到适合细胞生长的pH值。7脂类脂质是膜结构的重要组成部分，也是能量的来源，并且还是细胞信号，转运和生物合成的重要组成成分。脂类也是内质网和高尔基体的关键组分，是负责蛋白质合成，折叠，翻译后修饰以及分泌的细胞器。通常，CHO细胞自己可以合成脂质，重组CHO细胞可以适应并在无脂质的培养基中生长，并且没有明显的细胞增殖速率和抗体表达的下降。然而，研究表明，在无血清的培养基中添加脂质对细胞活力和抗体糖基化有益。实际上，脂质和脂质前体对CHO细胞生长的效果是视添加的两者类型而定的。磷脂是大多数哺乳动物细胞膜的重要成分，无论无血清培养基中是否含有生长因子，磷脂的补充，如磷脂酸或溶血磷脂酸，已证实可以促进CHO的生长。作为磷脂的主要成分，与混合脂类相比，胆碱和乙醇胺能显著促进细胞生长。一些经典的培养基如DMEM和RPMI-1640中也含有胆碱。脂肪酸和胆固醇在培养基中溶解度不高，并且不稳定。脂肪酸和胆固醇的不同前体和类似物作为替代也对细胞的生长和良好状态有益。培养基中少量的乙醇可以增加脂质的溶解度而不影响细胞的生长。尽管培养基中脂肪酸的添加很重要，但高浓度的脂肪酸会引起CHO细胞的脂毒性，因此脂肪酸仍需要维持在较低的水平。8多胺类图1 多胺的功能多胺是在哺乳动物细胞中普遍存在的分子，在多种代谢中起着关键的作用，包括DNA合成和转录，核糖体功能，离子通道调节和细胞信号转导[19]。几种多胺都是由尿素循环的中间体鸟氨酸合成的。培养基中添加多胺对支持和促进细胞生长都至关重要。图2 多胺结构、生物合成和相互转化CHO细胞培养基中的多胺一般包括腐胺，亚精胺和精胺。腐胺是合成亚精胺和精胺的前体，亚精胺和精胺在细胞中可以相互转换。这三个多胺均可以提高细胞活力和密度，精胺是效果最显著的。许多CHO培养基中都含有不同的多胺，多胺的分解代谢会产生氧化类物质，包括醛类，丙烯醛和氨，这些物质会影响细胞的生长，最终影响细胞的活力。因此，培养基中多胺的添加要控制在细胞毒性的下限浓度。9培养环境渗透压是培养基的一个重要参数，所有离子，包括盐，脂肪酸，氨基酸，缓冲液，都会影响渗透压，当渗透压高于450 mOsm/kg，会导致细胞密度，产量和活力的下降，细胞直径和倍增时间的延长[20]。当渗透压低于450 mOsm/kg，渗透压的增加对细胞的生长影响微弱，在抗体表达阶段，高渗透压（最大到400mOsm/kg）提高抗体表达量20%，渗透压提高到450就会导致乳酸和氨的积累显著增加。因此CHO细胞的传代和表达培养基渗透压一般在250-350mOsm/kg，补料培养基会在培养后期提高渗透压。工程问题也是培养基设计的一个重要方面。机械搅拌，起泡产生的剪切力会损害细胞，在CD培养基中尤其明显。起泡会导致排气管堵塞，压力过大或者污染。Pluronic F-68和消泡剂可以降低剪切力伤害，控制起泡。因此，优化Pluronic F-68和消泡剂的浓度以最大程度的避免剪切力和泡泡的伤害，同时最小化对反应器中氧传递系数和Kla的负面影响。10展望可以良好支撑细胞表达和生长的培养基需要考虑到方方面面，通过不断优化组成成分，物理化学特性，获得能进行大规模表达抗体的稳定的培养基。更好的理解培养基才能促使培养基的发展，使不同的细胞系获得高表达和产品质量。细胞培养基已经从早期含有血清的培养基发展到了复杂的含有水解物的培养基，完全化学成分限定的无蛋白的培养基配方。通过平衡基础培养基和补料培养基的组成，优化细胞吸收到的营养成分，控制最终的渗透压，通过化学计量方式的补料方式，共同优化细胞培养工艺和培养基组成，以最大限度的提高表达和一致性。参考文献：[1].Ritacco, F.V., Y. Wu and A. Khetan, Cell culture media for recombinant protein expression in Chinese hamster ovary (CHO) cells: History, key components, and optimization strategies. Biotechnology Progress, 2018. 34.[2].Vivian M, D., et al., Selected amino acids protect hybridoma and CHO cells from elevated carbon dioxide and osmolality. Biotechnology and bioengineering, 2002. 78(7).[3].F, F.K. and S. K, Protection of B lymphocyte hybridoma against starvation-induced apoptosis: survival-signal role of some amino acids. Immunology letters, 1996. 52(2-3).[4].A, M., L. C D and O. D L, Regulation of amino acid transport system L by amino acid availability in CHO-K1 cells. A special role for leucine. Biochimica et biophysica acta, 1985. 819(2).[5].Laurie B, H., et al., Chemically defined media modifications to lower tryptophan oxidation of biopharmaceuticals. Biotechnology progress, 2016. 32(1).[6].Li, J., et al., Feeding lactate for CHO cell culture processes: impact on culture metabolism and performance. Biotechnol. Bioeng., 2012. 109(5): p. 1173-86.[7].Ma, N., et al., A single nutrient feed supports both chemically defined NS0 and CHO fed-batch processes: Improved productivity and lactate metabolism. Biotechnology Progress, 2009. 25(5): p. 1353-1363.[8].Dean, J. and P. Reddy, Metabolic analysis of antibody producing CHO cells in fed-batch production. Biotechnol. Bioeng., 2013. 110(6): p. 1735-47.[9].Seewöster, T. and J. Lehmann, Influence of targeted asparagine starvation on extra- and intracellular amino acid pools of cultivated Chinese hamster ovary cells. Applied Microbiology and Biotechnology, 1995. 44(3): p. 344-350.[10].McCracken, N.A., R. Kowle and A. Ouyang, Control of galactosylated glycoforms distribution in cell culture system. Biotechnology Progress, 2014. 30(3): p. 547-553.[11].Takeshi, N., et al., Comparison of cytotoxicity of cysteine and homocysteine for renal epithelial cells. Nephron. Experimental nephrology, 2005. 100(1).[12].Hecklau, C., et al., S-Sulfocysteine simplifies fed-batch processes and increases the CHO specific productivity via anti-oxidant activity. J. Biotechnol., 2016. 218: p. 53-63.[13].M R, N., et al., Evidence for intracellular partitioning of serine and glycine metabolism in Chinese hamster ovary cells. The Biochemical journal, 1996. 313 ( Pt 3).[14].Duarte, T.M., et al., Metabolic responses of CHO cells to limitation of key amino acids. Biotechnology and Bioengineering, 2014. 111(10): p. 2095-2106.[15].Marcella, Y., et al., Understanding the intracellular effect of enhanced nutrient feeding toward high titer antibody production process. Biotechnology and bioengineering, 2011. 108(5).[16].Feeney, L., et al., Eliminating tyrosine sequence variants in CHO cell lines producing recombinant monoclonal antibodies. Biotechnology and Bioengineering, 2013. 110(4): p. 1087-1097.[17].Sohye, K., et al., Utilization of tyrosine- and histidine-containing dipeptides to enhance productivity and culture viability. Biotechnology and bioengineering, 2012. 109(9).[18].Altamirano, C., et al., Improvement of CHO Cell Culture Medium Formulation: Simultaneous Substitution of Glucose and Glutamine. Biotechnology Progress, 2000. 16(1): p. 69-75.[19].Pegg, A.E., Mammalian polyamine metabolism and function. IUBMB Life, 2009. 61(9): p. 880-894.[20].Kiehl, T.R., et al., Observations of cell size dynamics under osmotic stress. Cytometry Part A, 2011. 79A(7): p. 560-569.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。