Glycine

IND2025主会场授课已被预定，大会第一天下午茶歇前授课时间段预定开始，咨询热线：177 0186 0390。点击图片，查看IND2024会后报告 疼痛药物拥有巨大的市场潜力，对于疼痛的治疗需要根据其病因选择合适的治疗方法。根据疼痛的发病机制可以将其分为四类：伤害性、炎症性、神经性和功能失调性疼痛。   伤害性疼痛是由外周伤害感受器检测到有害的组织损伤刺激后被激活而引起的，刺激的持续存在可导致骨关节炎等病理状态。伤害性疼痛的治疗包括阻断伤害感受器感受外界刺激，如TRPV1和TRPA1；阻断感受器的动作电位传输，如Nav1.7和Nav1.8；用N型钙通道阻滞剂或神经递质受体拮抗剂阻断伤害感受器向大脑和脊髓的刺激传递；用阿片类药物阻断皮层区域激活。 炎症性疼痛是一种由组织损伤引起的疼痛，它引起免疫细胞和受损细胞的伤害感受器的激活。因此，通过非甾体抗炎药(NSAIDs)和环氧化酶2 (COX-2)抑制剂可以减少前列腺素E2的产生，免疫反应的降低可以减轻炎症性疼痛。 神经性疼痛不是病理的症状，而是神经系统损伤引起的周围和中枢神经系统病理改变的结果，并且疼痛通常在病理治疗后仍然存在。神经性疼痛可由糖尿病、化疗、脊髓损伤、神经创伤和中风等引起。治疗策略包括通过加巴喷丁类药物减少兴奋，增加双胺摄取抑制剂的抑制，或拮抗N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体。 功能失调性疼痛是由除以上三种因素引起的疼痛，主要是由于机体的功能失调而引起的，如纤维肌痛、肠易激综合征和颞下颌关节紊乱等。 止痛药发现的努力是针对每种类型的疼痛量身定制的。除了关注促进有效镇痛外，疼痛药物发现工作还应关注提高治疗率和避免耐受性和强化效应。疼痛也可以分为急性和慢性。急性疼痛是由损伤或疾病引起的，与骨骼肌痉挛和交感神经系统激活有关。急性疼痛具有有用的生物学目的，一旦疾病或损伤得到治疗，疼痛就会消失。另一方面，慢性疼痛比疾病或损伤持续的时间更长，被认为是一种独立的疾病状态。慢性疼痛可能源于心理状态，没有生物学目的，没有可识别的终点，治疗需要多学科的方法。 尽管努力开发新的更安全的镇痛药，但是阿片类药物和阿司匹林等非甾体抗炎药(NSAIDs)仍然是治疗疼痛的主要药物，其他用于治疗疼痛的药物包括三环抗抑郁药(TCA)、抗惊厥药(加巴喷丁类)、NMDA受体拮抗剂和曲坦类药物。在过去的一个世纪里，对疼痛机制的理解增加了，导致了一些靶点的确定，包括受体，如α2-肾上腺素能，大麻素，γ-氨基丁酸(GABA)，5-羟色胺(5-HT)1B/D,NMDA，阿片，TRPV1和降钙素基因相关肽(CGRP)受体等；酶，如COX-2和sepiapterin还原酶和离子通道，如电压门控钠通道。目前，阿片类药物仍然是治疗急性疼痛的主要药物，因此，应继续努力开发更安全的阿片类药物。 一、 开发更安全的阿片类止疼药 阿片样受体属于7次跨膜G蛋白偶联受体(GPCR)的超家族，分为mu、kappa和delta阿片样受体(分别为MOR、KOR和DOR) 。阿片类药物是唯一被证明对治疗大多数人群疼痛有效的药物类别。然而，阿片类药物在治疗神经性疼痛方面效果较差，并且会产生诸如耐受性、成瘾性、呼吸抑制、便秘、恶心和嗜睡等不良反应。由于与阿片类药物相关的这些问题，药物的发现工作已被用于开发副作用较小的阿片类药物疗法。这些方法包括开发偏向性阿片受体激动剂，多功能阿片受体，阿片受体的变张调节剂，以及使内源性阿片肽药物化。 1.1 阿片受体变构调节剂 变构调节剂结合在受体的变构位点，可以调节正构配体与受体的亲和力以及生物学效应。变构调节剂根据其对正构位点活性的影响可以分为正变构调节剂，负变构调节剂和静默变构调节剂。正变构调节剂增强了正位位点配体的结合亲和力和/或功效，而负变构调节剂降低了正构位点配体的结合亲和力和/或功效。静默变构调节剂不对正构位点活性产生任何影响，但是它可以竞争性拮抗正负变构调节剂。 MOR的正变构调节剂可用于增强阿片激动剂如吗啡和内源性阿片的效力，并降低产生镇痛所需的剂量，因此MOR的正变构调节剂被开发用于提高疗效降低副作用。BMS-986121 ，BMS-986122和BMS-986187已报道的MOR正变构调节剂。  1.2 偏向激动剂       通常，GPCR与一个或多个异源三聚体G蛋白功能偶联，然而，现在已经证明GPCR可以介导多种信号通路，如β-抑制素信号通路。能够选择性地通过一个途径而不是另一个途径发出信号的化合物被称为“功能性选择性”或“偏倚性”激动剂。阿片样物质通过G蛋白级联和β-抑制素途径发出信号。偏向性激动剂可以优先通过G蛋白信号传导，增强镇痛，减少呼吸抑制、耐受和依赖等不良反应。MOR的偏向激动剂Oliceridine 已被批准上市，与吗啡相比，拥有更好的治疗指数。进一步增加G蛋白信号传导对β-arrestin2信号传导的偏好可能会导致新型阿片类药物治疗疼痛的发展并显著减少不良反应。 1.3 双位/二价阿片受体的配体 二价配体是含有两个药团的化合物，两个药团由大小/长度不同的连接体分开，连接体可以是刚性的或柔性的。这两种药效团可以是相同的(同二价)或不同的(异二价)。代表性分子有MDAN-21,CYM51010,NNTA和INTA等。 1.4 阿片肽类似物       阿片肽类似物主要是模拟内源性的阿片肽，其代表性结构有以下两个化合物： 二、NMDR受体拮抗剂 NMDA受体是一种配体和电压调节离子通道，位于突触后膜，几乎在所有脊椎动物突触中表达，调节Na+和Ca2+离子的通透性。NMDA受体属于嗜离子性谷氨酸受体家族(iGLuR)，在神经元发育、可塑性、和存活中起重要作用。NMDA受体的过度刺激引起高Ca2+内流，从而促进兴奋性毒性，发条现象和中枢致敏，这可能导致急性和慢性疼痛状况的发展。4因此，NMDA受体拮抗剂可用于减轻痛觉。       氯胺酮（Ketamine ）是已知的NMDA受体拮抗剂，用于治疗急性和慢性疼痛。美沙酮（Methadone），金刚烷胺（amantadine）和美金刚（memantine）也能拮抗NMDA受体，产生止痛作用。右美沙芬（Dextromethorphan）可拮抗NMDA受体并在几种慢性疼痛情况下产生镇痛作用。新型的NMDR受体拮抗剂NYX-2925 和RL-208 也被报道。 三、非甾体抗炎药       非甾体抗炎药是世界范围内使用最广泛的非处方药(OTC)和处方药。非甾体抗炎药是治疗许多炎症性疾病的首选药物，如关节炎、肌肉和关节损伤。这些药物也用于治疗一系列急性和慢性疼痛，包括轻微疼痛、月经痉挛、术后疼痛和偏头痛。非甾体抗炎药通过阻断参与前列腺素合成COX-1和COX-2的活性来产生抗疼痛作用。包括非选择性COX抑制剂，如阿司匹林，双氯芬酸，布洛芬和萘普生等。选择性COX-2抑制剂，如塞来昔布，罗非昔布和伐地昔布等。一些包含非甾体抗炎药和碳酸酐酶活性的化合物也被报道，如29和30。 四、去甲肾上腺素转运蛋白（NET）抑制剂      NET属于Na+/Cl -依赖转运蛋白家族，可以转运血清素、多巴胺、甘氨酸和GABA等。它是一种位于交感神经元上的突触前转运蛋白，参与去甲肾上腺素信号的失活，这对于防止去甲肾上腺素的不成比例的升高至关重要。因此，NET可以调节大脑中的肾上腺素能神经传递以及周围器官。NET抑制剂在多种精神疾病中发挥重要作用，包括焦虑、抑郁、精神分裂症、肥胖和慢性疼痛。    度洛西汀（Duloxetine）和米那普仑（milnacipran）是血清素（SET）转运体和NET转运体的双重抑制剂，被批准用于治疗重度抑郁症，有效缓解慢性疼痛，如纤维肌痛、骨关节炎和糖尿病性神经病变。最近，一种新的选择性NET抑制剂TAS-303和双重NET和SET抑制剂ZY-1408分别对疾病如抑郁症和压力性尿失禁有效。因此，应该继续努力筛选新型NET抑制剂治疗慢性疼痛。        除了上述四类经典的靶标外，还有一些较新的靶标处于开发状态，包括一些受体，离子通道和酶。 血管紧张素Ⅱ受体      血管紧张素II因其在肾素-血管紧张素系统(RAS)中的作用而闻名，RAS与脉管系统、心脏、肾脏和大脑有关。在多种细胞和组织类型中，血管紧张素Ⅱ以相似的亲和力结合GPCR亚型血管紧张素II 1型和2型受体(分别为AT1R和AT2R)。除了控制血压外，血管紧张素Ⅱ在神经性疼痛中起重要作用，AT1R拮抗剂和AT2R配体均产生镇痛作用，AT2R配体产生的不良效应比AT1R拮抗剂少。AT1R拮抗剂坎地沙坦(candesartan)和氯沙坦(losartan)减轻了神经性疼痛模型中的异位性疼痛和痛觉过敏。两项多中心、随机、双盲、2b期研究证实了AT2R拮抗剂EMA401对减轻疼痛性糖尿病神经病变患者疼痛强度的临床疗效。AT2R拮抗剂EMA 200和激动剂C21均可产生抗疼痛作用。目前正在研究血管紧张素 II受体的选择性激动剂和拮抗剂，以开发新型镇痛药。 降钙素基因相关肽(CGRP)受体     CGRP是一种中枢和外周作用的神经肽，具有强大的血管扩张作用的神经递质，涉及几种疼痛途径，特别是偏头痛。Erenumab(一种单克隆抗体)，由Amgen和Novartis开发，是FDA批准治疗偏头痛的首个CGRP拮抗剂(2018年)。虽然olcegepant是第一个开发的小分子高亲和CGRP受体拮抗剂，但的Ⅰ期临床试验已停止。其他小分子CGRP受体拮抗剂，如ubrogepant和rimegepant，分别于2019年和2020年获得FDA批准用于治疗偏头痛。另一种小分子CGRP受体拮抗剂BI 44370 TA。目前正在美国和欧洲进行临床试验。 溶血磷脂酸（LPA）受体       LPA是一种小溶血磷脂，含有一个磷酸甘油头基团和一个单一的脂肪酸片段，在中枢神经系统的发育和生理中起重要的作用。LPA具有高亲和力结合并激活被称为LPA受体的GPCR。LPA受体分为六个亚型(LPA1 - 6)。LPA的产生和信号传导通过作用于神经元和免疫细胞，在诱导神经性疼痛中起重要作用。因此，针对LPA受体或产生LPA的酶，可能用于神经性疼痛的治疗。事实上，据报道，LPA1和LPA3受体介导小鼠糖尿病神经性痛觉过敏和痛觉减退的发生。已确定的LPA受体拮抗剂包括Ki-16425(非选择性)和ONO-9780307 (LPA1受体选择性)。Ki-16425能阻断LPA诱导和部分坐骨神经结扎神经性疼痛模型的异动行为。使用强效LPA1受体拮抗剂BMS-986020进行的2期临床试验表明，LPA1受体拮抗剂有效治疗特发性肺纤维化;然而，研究因肝毒性而终止。化合物如49和UCM-05194是LPA1激动剂也已被在小鼠免于神经损伤(SNI)神经性疼痛模型中，显示出显著的减轻神经性疼痛的疗效。因此，阻断LPA1受体的LPA1拮抗剂和导致受体脱敏的LPA1激动剂都可以用于神经性疼痛的新型治疗。 Nav1.7 and Nav1.8 编码Nav1.7的SCN9A 基因发生沉默突变时，病人感觉不到疼痛，但具有触觉和压力敏感性，嗅觉丧失，并且对组胺引起的瘙痒没有反应，而该基因发生功能获得性突变时，患者会发生极度疼痛障碍如阵发性极度疼痛障碍和外周性红斑性肢痛症。非选择性Nav抑制剂，包括利多卡因、美西汀、和卡马西平，对慢性疼痛有临床疗效。然而，由于部分不参与疼痛信号传导Nav亚型介导的不良效应，这些药物的临床应用受到限制。例如，抑制中枢神经系统表达的Nav1.1会导致中枢神经系统相关的不良反应;抑制心肌细胞中Nav1.5可诱导不良的心血管效应。目前为止，已报到了9个亚型，即Nav1.1~1.9。选择性Nav1.7抑制剂DS1971a在小鼠中对神经结扎引起的热和机械超敏反应具有镇痛作用，其他报道的选择性Nav1.7抑制剂有PF-05089771，PF- 05150122 ，PF-05186462 和XEN402 。但是在疼痛性糖尿病周围神经病变患者的临床试验中，PF-05089771 不能减轻疼痛，但能减轻灼烧感觉。XEN402能减轻遗传性红斑性肢痛症患者的疼痛。此外，选择性Nav1.7拮抗剂GX-201的研究显示，其体内停留时间较长，对炎症性和神经性疼痛的疗效有所改善，这表明Nav1.7抑制剂在临床研究中的失败可能是由于高血浆蛋白结合或高血浆清除率等药物特性差，导致靶点占用不足。对Nav1.7抑制剂的开发应该追求部分抑制剂，因为完全消除病人对疼痛的正常反应。 由SCN10A基因编码的Nav1.8似乎在疼痛的病理生理中发挥作用，且可能会消除中枢神经系统的不良反应，因为它位于中枢神经系统外的背根神经节。Nav1.8选择性阻断剂A-803467能够削弱大鼠的神经疼痛和炎症疼痛。因此，共同靶向参与伤害性传递的Nav通道，如Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9，或开发高选择性Nav抑制剂仍然是开发新型镇痛药的可行途径。 神经紧张素（Neurotensin ） 神经紧张素结合三种受体:神经紧张素1、2和3 (NTSR1、NTSR2和NTSR3)。神经紧张素通过NTSR1/2s介导伤害性反应，例如，非选择性NTSR1/NTSR2激动剂ABS212， JMV2007， JMV2009和NT69L在啮齿动物急性疼痛模型中产生抗伤害性反应，该作用NTSR1/2拮抗剂SR48692逆转。NTSR1激动剂PD149163和NTSR1 PAM PP-001均在大鼠急性和慢性疼痛模型中产生镇痛作用。如前所述，NTSR1和NTSR2激动剂均可产生镇痛作用，然而，神经紧张素的不良反应如低温和低血压是通过NTSR1激活介导的。最近有报道选择性NTSR2激动剂JMV431在大鼠的甩尾、福尔马林和CFA试验中产生抗痛感而不诱导低温。CGX-1160是一种神经紧张素a类似物，在脊髓损伤后中枢性神经性疼痛患者的Ⅰ期临床试验中产生抗痛觉作用。因此，高度选择性神经紧张素受体激动剂仍然是开发具有低滥用潜力的新型镇痛药的可行途径。 P2X3和P2X7嘌呤受体拮抗剂       除了作为细胞代谢的主要能量来源外，三磷酸腺苷(ATP)还通过激活P2X3和P2X7嘌呤能受体调节神经传递。ATP是一种伤害性调节剂，它作用于外周和中枢增强过程，导致超敏反应。选择性P2X3受体拮抗剂A-317491，其选择性比其他P2受体高100倍以上，在炎性疼痛的CFA模型和神经损伤的CCI模型中产生抗疼痛感觉。另一方面，A-317491在有害刺激的急性伤害感觉模型中不产生抗伤害感觉，这表明P2X3受体仅在组织受伤或致敏时有反应。P2X7受体拮抗剂A-438079在类似于P2X3受体拮抗剂的致敏条件下产生抗伤性。除了P2X3和P2X7拮抗剂外，P2Y14受体拮抗剂66和67在CCI诱导的神经损伤小鼠模型中逆转了慢性神经性疼痛。P2X3、P2X7和P2Y14受体可能是开发新型非阿片类镇痛药的理想靶点。 电压门控钾Kv7通道 电压抑制的K+通道在控制神经元兴奋性中起重要作用，打开神经元Kv7通道的化合物对动作电位启动有抑制作用，因此它们在神经性疼痛中具有应用潜力。氟吡汀(Flupirtine)是Kv7钾通道的开启剂，用于治疗对非甾体抗炎药或阿片类药物难治的患者的疼痛。Kv7.2负性突变的小鼠对疼痛的敏感性强于野生型。Kv7.2抑制剂XE991会增强小鼠痛感，这种增加作用可被Kv7离子通道开启剂retigabine所挽救。其他Kv7.2离子通道开启剂如71、ICA-27243和SCR2682在啮齿动物急性伤害性疼痛模型中产生抗痛觉性。此外，在使用福尔马林试验的等密度分析研究中，观察到Flupirtine和吗啡之间的协同作用。 GPR18,35,55      与GPR18相关的信号传导机制尚未完全建立，该受体介导的生理功能尚未完全了解。已经提出了许多GPR18的激动剂，包括Abn-CBD，Δ9-tetrahydrocannabinol，O-1918，N-arachidonoyl glycine , resolvin D1 和resolvinD2。这些化合物与大麻素相关，表明GPR18可能与CB1和CB2一起被归类为大麻素受体。。PSB-CB5是通过分子建模和计算研究发现的首个有效的GPR18拮抗剂。PSB-KK-1415被发现是一种有效的、选择性的GPR18激动剂，据报道在炎症性疼痛的动物模型中发挥抗炎和抗伤害性作用。选择性GPR18配体仍然是目前项目的重点，旨在发现安全有效的镇痛药。 GPR35参与了许多疾病，如疼痛、高血压和癌症。虽然GPR35的内源性配体尚不清楚，但色氨酸代谢物kynurenic acid、2-acyl lysophosphatidic acid和趋化因子CXCL17被认为是GPR35的内源性配体。GPR35激动剂，包括bufrolin、cromolyn、lodoxamide和zaprinast。在小鼠坐骨神经损伤实验中，化合物kynurenic acid和zaprinast降低热和触觉超敏反应，增强吗啡治疗神经性疼痛的疗效。已报道的GPR35拮抗剂包括ML-145和CID2745687。鉴定GPR35的激动剂和拮抗剂不仅有助于了解GPR35的生理学，而且有助于开发新型镇痛药。 GPR55与嘌呤受体和趋化因子受体家族有关，可能是一个非典型的大麻素受体，因为它的氨基酸与两种大麻素受体CB1和CB2序列同源性较低。GPR55的第一个假定的内源性配体是磷脂溶磷脂酰肌醇，激动剂包括Abn-CBD, Δ9-tetrahydrocannabinol，2-AG，N-arachidonoylethanolamine和O-1602，拮抗剂有CID16020046 和SR141716A 。GPR55刺激产生炎症性疼痛，因此暗示GPR55是疼痛的治疗靶点。 HMGB1 HMGB1是一种没有特异性配体的炎症生物标志物，其在抗疼痛感受中的作用仍有待阐明。然而，现有证据表明，HMGB1的抑制导致异位性疼痛的减少。HMGB1抑制剂glycyrrhizin在小鼠炎症性疼痛模型中产生减轻机械异常性痛和热痛觉过敏。另一种HMGB1释放抑制剂丙酮酸乙酯，减轻了小鼠急性胰腺炎伴随的胰腺痛感过敏。目前已经开发的针对HMBG1的化合物有限，因此，药物化学应继续努力追求高选择性HMBG1抑制剂，因为这些化合物可能导致新型镇痛药的开发。 神经营养生长因子(NGF)和原溶酶受体激酶A（TrkA） NGF通过诱导痛觉过敏在疼痛信号的传递中起作用，以高亲和力与TrkA的细胞外结构域结合，并以低亲和力与75 kDa的神经营养因子受体p75结合，导致一系列事件，这些事件负责NGF的生理效应，包括其促疼痛特性。人源化抗NGF抗体RN624的 3期临床试验目前正在进行中，用于治疗骨关节炎、慢性腰痛和癌症疼痛。NGF-TrkA途径的小分子药物发现工作主要集中在开发结合NGF、拮抗TrkA受体或抑制TrkA激酶活性的化合物。化合物ALE-0540、PD90780和Ro 08-2750与NGF结合，阻止NGF与TrkA和p75的结合。第一批开发的TrkA激酶抑制剂主要是泛Trk抑制剂，具有显著的脱靶激酶活性和不良反应。pan-Trk抑制剂的例子包括103和PF-06273340(104)。这些化合物在CFA诱导的疼痛模型中显示出剂量依赖性的抗痛觉性，其疗效高于非甾体抗炎药。三个Trk亚型的x射线晶体结构从2012年开始被解决，这导致使用基于结构的药物设计开发对TrkA选择性优于TrkB和C.的化合物。Array BioPharma使用诱导拟合方法和基于结构的药物发现开发了选择性TrkA抑制剂AR786。默克公司还报道了一种选择性TrkA激酶抑制剂106，其选择性分别比TrkB和TrkC高230倍和190倍。其他尚未披露结构的TrkA选择性抑制剂包括CT340、GZ389988、vm902a和Ono-4474。抗NGF疗法在临床试验中的成功，刺激了靶向NGF-TrkA通路的发展。虽然NGF/TrkA通路产生抗痛觉的机制尚未完全阐明，但已经提出TRPV1通道、AT2R和鞘氨醇-1-磷酸(S1P)受体可能参与其中因此，靶向NGF/TrkA通路和上述受体仍然是开发新型镇痛药的可行途径。 Sepiapterin还原酶（SPR）抑制剂 SPR是参与合成(6R)-L-erythro-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin (BH4)的末端酶，BH4是芳香族氨基酸羟化酶、烷基甘油单加氧酶和一氧化氮合酶等酶的重要辅因子。在啮齿动物模型中，BH4水平升高与更大的疼痛和过敏有关。因此，抑制SPR可能是开发新型镇痛药的可行途径。SPR的x射线晶体结构揭示了其抑制剂Nacetylserotonin（NAS）的结合袋，这有助于SPR抑制剂的药物设计。SPRi3在神经性疼痛SNI模型小鼠中产生剂量依赖性抗触觉异动效应，并在神经性疼痛慢性CCI模型小鼠中降低机械异动。化合物108显著减轻了由板内CFA引起的热痛感过敏，并降低了炎症足部的BH4水平。其他SPR抑制剂包括109、110、QM385和被批准用于支气管哮喘的曲尼拉斯特。磺胺吡啶(Sulfasalazine)，一种FDA批准的抗炎药物，被发现通过其代谢物磺胺吡啶(113)抑制SPR活性。通过抑制SPR活性降低BH4水平是缓解神经性和炎症性疼痛超敏反应的可行方法。有趣的是，完全抑制SPR不会导致BH的过度减少，因为BH4可以通过替代途径产生。缺乏BH4会导致严重的认知迟缓、肌张力障碍、震颤和高苯丙氨酸血症。因此，靶向SPR可能导致较少的不良反应，因为没有完全阻断BH4的合成。 可溶性环氧化物水解酶(sEH)抑制剂 sEH是一种主要存在于肝脏和其他组织(如肾、肠、脑和脉管系统)中的酶，其作用是代谢或水解环氧脂肪酸(EpFAs)。EpFA是由花生四烯酸通过COX、脂氧合酶(LOX)和细胞色素P450 (CYP450)酶生成的类二十烷类前列腺素和白三烯。CYP450酶作用于长链多不饱和脂肪酸，如二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸，通过双键的环氧化作用形成EpFA。EpFA包括环氧二十碳三烯酸、环氧二十碳四烯酸、和环氧二十碳五烯酸。与COX和LOX代谢物主要是促炎不同，EpFAs主要是抗炎和促溶解。 sEH将EpFA水解为二醇，而二醇缺乏环氧化前体的活性，二醇具有高极性，易于偶联，并且快速排出。因此，sEH抑制剂阻止EpFAs的降解，从而延长其抗炎作用。其他EpFA降解途径如β-氧化，链延伸和CYP450氧化已被报道。因此，抑制sEH不会导致EpFA的积累，这将导致脱靶效应的减少。早期的sEH抑制剂(AUDA, 和AEPU)被设计为模拟sEH的天然底物，这些化合物被设计为模拟开放环氧环的假设过渡态。这些化合物具有高度亲脂性，熔点高，生物利用度差，并迅速代谢成无活性的化合物。这些先导化合物导致了新一代化合物的发展，如GSK2256294， TPPU和t-TUCB，它们更稳定，具有类似药物的性质，具有高效力，并且改善了药代动力学谱。基于TPPU结构的一系列新化合物被设计，用来寻找更多的低熔点和高水溶性化合物。其中，EC5026的效价、水溶性、熔点和半衰期得到了改善，目前正在进行治疗神经性疼痛的临床试验。 克服阿片类药物不良反应同时保持其镇痛活性的一种策略，是将低剂量高效阿片类药物与通过非阿片类受体类型发挥镇痛作用的化合物结合。这种联合疗法假定所产生的镇痛将是相加的或协同的，而副作用是降低的。理想情况下，非阿片类药物的副作用与阿片类药物不同，因此这种组合不会增加单个化合物产生的任何给定的副作用。一种非阿片类药物与阿片类药物产生协同镇痛，同时伴有较小程度的不良反应，有时被称为“阿片类药物节约”效应。这样的组合将比单独使用化合物获得更大的治疗指数。以下是一些靶点/化合物与阿片类药物联合产生协同作用：α2-肾上腺素能受体激动剂，AMPA受体，CB2受体激动剂，GABAB，加巴戊二烯类，糖皮质激素，咪唑啉I2, MAGL/FAAH抑制剂，NMDA受体拮抗剂，非甾体抗炎药，孤儿受体GPR119，P2X3和P2X7嘌呤受体拮抗剂，过氧化物酶体增殖激活受体(ppar)，代谢性谷氨酸受体(mGluR)，血清素/去甲肾上腺素再摄取抑制剂，sigma受体，S1P受体1和TRPV1。 α 2肾上腺素能受体激动剂 α2肾上腺素能受体激动剂具有良好的镇痛作用，并广泛应用于围手术期，特别是作为麻醉药和镇痛药的辅助药物。α2肾上腺素能受体有三种类型，分别是在中枢神经系统中发现的α2A和α2C，它们负责镇静、镇痛、和交感神经溶解作用，而在血管平滑肌中发现的α2B负责血管加压作用。MOR和α2肾上腺素能受体激动剂之间的协同作用是由斯波尔丁首次报道的，他观察到吗啡和可卡因定皮下注射可以相互增强。右美托咪定像其他α2肾上腺素能受体激动剂一样，减少麻醉和阿片需求，产生镇静和镇痛，并减少阿片诱导的痛感过敏。开发更具选择性的α2A或α2C肾上腺素能受体激动剂，与阿片类药物产生强大的镇痛协同作用，可进一步提高治疗指标。 大麻素CB2受体激动剂和MAGL/FAAH抑制剂 2-AG和anandamide是内源性亲脂性配体，可激活大麻素CB1和CB2受体。CB1激动剂的临床使用受到限制，因为CB1介导的不良反应(精神活性、戒断、和运动障碍)，而CB2激动剂缺乏这些与大麻素相关的不良反应。CB2激动剂LY2828360与吗啡共给药，在抑制紫杉醇诱导的机械异痛感和阻断吗啡诱导的野生型小鼠奖励中产生协同抗异痛感作用，而不产生奖励或厌恶。2-AG和anandamide分别由脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)和单酰基甘油脂肪酶(MAGL)代谢。因此，抑制这些酶可能会增强大麻素活性。URB937是一种不透脑的FAAH抑制剂，通过激活CB1减少紫杉醇诱导的异位性疼痛，并与吗啡产生协同镇痛作用，但不增强吗啡的不良反应。BIA-10−2474是一种可透脑的FAAH抑制剂，在一项I期临床试验中，出乎意料地在5名健康志愿者中产生了严重的神经系统不良反应，导致1名受试者死亡。因此需要开发不透脑的FAAH 和MAGL抑制剂。GABA受体激动剂 GABA是中枢神经系统中一种抑制性神经递质，参与许多生理过程的调节。巴氯芬(Baclofen)是一种选择性GABAB受体激动剂，临床上用于治疗偏头痛、肌肉骨骼疼痛和三叉神经痛。巴氯芬与吗啡共给药产生协同抗疼痛作用，并拮抗吗啡的奖励效应。GABAB受体的阳性变构调节剂ASP8062 可产生镇痛作用，但不良反应少于巴氯芬。因此，应进一步研究GABAB阳性变构调节剂与阿片类药物的联合使用。此外，α1 GABAA受体已被证明与苯二氮卓类药物相关的不良反应有关，而α2、α3和α5 GABAA亚型介导脊髓镇痛。PF-06372865是一种不含α1 GABAA活性的GABAA受体激动剂，可逆转啮齿动物神经性、炎症性和术后疼痛模型的病理性痛觉过敏，目前正在进行临床Ⅱ期试验。 Gabapentinoids Gabapentinoids是电压依赖性钙(Ca2+)通道辅助α2δ (α2δ−1和α2δ−2)亚基的配体，并作为该通道的阻滞剂。尽管加巴喷丁类药物在临床上用于治疗癫痫、神经性疼痛和一些超说明书用途，但关于加巴喷丁类药物急性抗痛觉的研究相对较少。关于加巴喷丁类药物与MOR的相互作用，加巴喷丁的急性抗痛觉性作用似乎是通过阿片受体介导的，因为在小鼠中使用弹尾、夹尾和热板试验，加巴喷丁的抗痛觉性作用被纳洛酮拮抗。此外，通过甩尾实验，加巴喷丁和普瑞巴林增强了吗啡和羟考酮在大鼠中的抗伤害感受作用。在一项随机对照临床试验中证实了普瑞巴林在小鼠中可减少了阿片类药物的消耗。非竞争性NMDA受体拮抗剂 阿片类药物治疗后NMDA受体的激活，可能会降低阿片类药物的镇痛作用，而NMDA拮抗剂治疗可能会增强阿片类药物诱导的抗镇痛作用。也有研究表明，阿片类药物与NMDA受体拮抗剂的联合使用增加了在神经性疼痛状态下对阿片类药物的敏感性。高选择性NMDA拮抗剂(+)-MK-801当与吗啡共给药时，可减少神经性疼痛，可减少耐受性的发展，并逆转阿片类药物耐受性。然而，使用NMDA拮抗剂与阿片类药物的治疗指标非常狭窄，不良效应如严重的拟精神效应是常见的。EU1622-1，偏向的NMDA 正变构调节剂，降低Ca2+的通透性，同时增加激动剂的效力。Sigma-1 受体拮抗剂    sigma-1受体是一种配体调节的伴侣蛋白，它调节与其相互作用的蛋白质(受体、酶)的信号传导。Sigma-1受体拮抗剂单独产生抗痛觉作用，特别是在致敏条件下，如炎症、缺血性和由神经创伤或化学损伤引的神经性疼痛。然而，与阿片类药物不同，sigma-1受体拮抗剂在没有致敏刺激的情况下不会产生抗痛觉，而只在超敏条件下产生，并将伤害性阈值恢复到正常。S1RA，一种选择性sigma-1受体拮抗剂在尾弹试验中没有作用，但增强了抗疼痛感受作用，但没有增强丁丙诺啡、可待因、芬太尼、吗啡、羟考酮和曲马多的不良反应。与S1RA联合给药阻止了吗啡耐受性和奖励效应的发展。CM304是一种sigma-1受体拮抗剂，对sigma-1受体的选择性高于sigma-2受体，比S1RA剂量依赖性地减少了CCI和顺铂神经性疼痛模型中的异位性疼痛。因此，选择性sigma-1受体拮抗剂联合阿片类药物有可能作为神经性疼痛、炎性疼痛和术后疼痛的联合疗法。 5-羟色胺(5-HT) 去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)和5-HT1A激动剂 神经递质去甲肾上腺素和5-羟色胺在抑制脊髓伤害性刺激中起重要作用。milnacipran是一种SNRI，剂量依赖性地减少了大鼠术后疼痛模型中的超敏反应，并与吗啡具有协同相互作用。此外，阈下浓度的DAMGO(阿片激动剂)和5-HT显著降低GABA能微型抑制性突触后电流频率，提示联合治疗的镇痛效果.最近，compound 133，一种强效和选择性5-HT1A激动剂，在福尔马林和热平板试验中产生镇痛作用。因此，应该进一步研究MOR和选择性5-HT1A激动剂的联合治疗，因为这些联合治疗可能会降低MOR激动剂产生的奖励效应，耐受性和呼吸抑制。 靶向参与阿片信号传导的细胞内蛋白 G蛋白信号(RGS)调控因子蛋白与G蛋白的活化G-α亚基结合，增强其GTPase活性，加速其返回至无活性G-α- GDP状态，导致信号终止。有超过30种RGS蛋白，包括RGS9-2和RGS4，已被证明以激动剂依赖的方式调节阿片样物质的作用。此外，下调RGS蛋白RGSz1导致镇痛效果增强，并降低阿片类药物的奖励作用。噻二唑烷酮(TDZDs)通过共价修饰RGS蛋白中半胱氨酸残基来抑制RGS- g -α相互作用，其中CCG-203769和CCG-50014是对RGS4最有效的抑制剂。RGS同工异构体的瞬时半胱氨酸暴露机制不同，这可能对下一代RGS抑制剂的合理设计有潜在的帮助。因此，开发RGS蛋白的小分子抑制剂可能是发现减少阿片类药物不良作用的新疗法的可行途径。热休克蛋白90(Hsp90)是多种蛋白质的激活和稳定所必需的伴侣蛋白，抑制热休克蛋白90已被证明可以减少阿片类药物依赖和戒断的躯体体征。应进一步研究Hsp90调节剂用于阿片类药物协同治疗，以减少阿片类药物的不良反应。此外，信号激酶如ERK1/2、JNK MAPKs和p38 MAPK的激活可能在阿片类药物诱导的耐受、依赖、痛觉过敏/异常性疼痛和便秘以及KOR相关的厌恶和烦躁不安的不良反应中发挥作用。MOR或KOR激动剂与RK、JNK或p38抑制剂联合治疗可提高阿片类药物的治疗指数。然而，由于这些信号激酶广泛表达并参与许多生物过程，它们的抑制可能会增加非阿片类药物不良反应的风险。专注于阿片样物质细胞内信号蛋白调节剂的药物发现工作应该考虑筛选化合物的毒性。 双作用或多功能阿片配体 利用联合治疗的一种有效方法是设计对MOR和其他非阿片类疼痛靶点具有双重或多功能活性的化合物。Tapentadol是美国FDA批准的第一种同时具有MOR激动剂和SNRI活性的中枢作用镇痛药,由于具有双重作用模式，它被用于治疗中度至重度急性和慢性非癌性疼痛和神经性疼痛。Cebranopadol和compound 138是痛感肽/孤儿蛋白FQ肽(NOP)和MOR受体激动剂，在啮齿动物急性和神经性疼痛模型中显示出治疗急性和慢性疼痛的疗效。另一种化合物EST73502是一种MOR激动剂和sigma-1受体拮抗剂，在急性和慢性疼痛动物模型中具有与羟可酮同等的镇痛活性。与羟考酮相比，化合物139产生更少的阿片类戒断症状和肠道转运抑制化合物140，一种TRPV1拮抗剂和MOR激动剂双配体在小鼠福尔马林实验中产生抗伤害感受作用。Mitragynine，已被证明与阿片肾上腺素能和血清素能受体结合,通过甩尾试验在小鼠中产生抗疼痛感觉。因此，除了已知介导疼痛信号的受体靶点外，靶向MOR的双重或多功能配体仍然是开发新型镇痛药的可行途径。 阿片类药物是用于治疗疼痛的主要药物类别，过度使用阿片类药物治疗疼痛已导致阿片类药物过量危机。因此，需要新的镇痛药或治疗策略来遏制持续的阿片类药物流行。疼痛药物发现的一个主要挑战是缺乏适当的人类疾病的临床前替代模型。例如，像甩尾试验这样的急性抗触感试验测量的是啮齿类动物的反射行为，而不一定是抗疼痛感。此外，神经性疼痛模型的损伤后时间(约14天)不能恰当地反映人类的神经性疼痛。如果没有合适的疼痛模型，药物研发工作将受到阻碍，因为大多数候选药物通常在临床前阶段表现出良好的镇痛效果，副作用较少，但在临床试验中产生的效果与安慰剂相似。因此，非常需要适当的临床前疼痛模型。 目前正在进行临床疼痛试验的非阿片类候选药物包括：χ-conopeptide，一种选择性变抗NET抑制剂;CGX-1160，一种神经紧张素a类似物;BI44370 TA, CGRP受体拮抗剂;EC5026，一种sEH抑制剂。许多化合物和联合疗法仍处于临床前阶段。以非阿片类药物为目标将有助于克服与阿片类药物相关的滥用倾向、耐受性和呼吸抑制。与MOR激动剂相比，作用于非阿片类靶点的化合物的主要挑战是获得的镇痛效果较差。因此，针对导致特定疼痛的多种机制类型可能有助于提高镇痛效果。 综上所述，镇痛药物开发的重点是开发具有低滥用潜力的化合物。为了克服这一挑战，必须努力开发更安全的阿片类药物，减少滥用风险，或采用联合疗法等治疗策略，允许使用较低剂量阿片类药物，从而减少阿片类药物的相关不良反应。最后，努力已经并将继续关注开发具有与阿片类药物相似或更有效的非阿片类药物作用机制的新型镇痛药，这将在急性和慢性疼痛的治疗中是无价的。参考文献：Novel Approaches, Drug Candidates, and Targets in Pain Drug Discovery END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 OTC2024类器官前沿应用与3D细胞培养论坛圆满落幕，点击图片可查看会后报告，咨询OTC2025类器官论坛请联系：王晨 180 1628 8769

1.概述 生物制药的开发要求与小分子化学药物有显著不同，因为它们分子尺寸较大，分子结构多变。这些特性以独特的方式影响身体的免疫系统。 首先，由于大多数蛋白质药物通过注射途径给药，蛋白质药物配方的科学主要关注注射剂型。由于蛋白质结构在许多给药环境中不稳定，因此给药途径的选择受到限制。诸如胃肠道的酸性、大分子尺寸、高亲水性阻碍了生物膜的吸收，以及高剂量-反应敏感性等因素限制了生物利用度的显著变化。 其次，蛋白质具有易氧化的功能团结构特征，包括蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸。这些需要常见的稳定化方法。此外，大分子特有的构象变化和聚集，需要特定的配方成分。 第三，蛋白质对储存、运输和处理过程中的温度、光线和搅拌敏感。由于小分子药物中不常考虑的各种因素，配方挑战更加复杂，可能会影响生物制药的质量和功效。 生物制药的配方根据给药途径而显著不同，主要是注射途径，但进步正在使非侵入性途径多样化。选择给药途径时要考虑实用性和可能性因素，需要详细了解生物制药与给药途径环境的相互作用。过去二十年的计算工具有助于快速创建决策矩阵，以优化配方。 由于解剖和生理特征，每种给药途径都面临不同的生物屏障。为了克服这些障碍，已经开发了各种配方方法，结合了信息技术、生物技术、纳米技术和复杂的医疗设备的进步，包括电力或磁力和声波，以最大化非侵入性药物输送的有效性。 配方旨在将生物制药活性物质输送到给药部位，穿过生物屏障进入血流，并最终到达作用部位。鉴于产品在货架寿命期间降解的可能性很高，已经开发了包括许多专利在内的专有技术，以使剂量形式有效地将药物输送到作用部位。 本章附录详细介绍了蛋白质和肽的理化性质，这对于设计配方至关重要。由于生物制药开发成本高昂，科学家们参与评估与生物制药制造和输送系统相关的知识产权。第8章提供了有关知识产权管理的详细信息，对于参与生物制药配方的科学家来说是必读的。 管理生物制药的稳定性涉及化学修饰分子或选择合适的辅料。这些组合确保了稳定性，而不影响产品的安全性或功效。结构修饰，如创建蛋白质支架和分子的PEG化等技术，在第1章中有详细阐述。 2.蛋白质结构 2.1.基础 全面了解蛋白质结构及其在配方这些产品时的相关风险，对于理解生物制药产品的复杂性至关重要。蛋白质由氨基酸链组成，具有反应性基团，形成多维结构，其化学和物理性质基于这种反应性。 蛋白质不稳定性源于化学和物理反应。化学不稳定性涉及多肽或蛋白质结构内共价键的形成或溶解，导致氧化、脱酰胺、还原和水解。物理或构象不稳定性包括解离、变性、积聚和沉淀。当化学事件（如氧化）引发物理反应（如聚集）时，蛋白质降解途径会协同作用。与小分子药物不同，生物制药的物理变化除了PK（药代动力学）概况外，还会显著影响安全性。 表12.1列出了几个引起不确定性的配方变量，这些变量基于化学和生物制药分子的化学原理。然而，生物制药对保护和功效有独特的影响。 了解导致生物制药配方中化学和物理不稳定性的复杂降解机制历来具有挑战性。然而，分析化学的进步显著促进了这一理解。FDA批准的附录《蛋白质和肽的理化性质》，截至2020年3月，是关键产品属性的全面汇编。这个数据库使配方师能够通过比较和选择基于相似分子属性的稳定配方，采取有针对性的科学方法开发配方。 与小分子药物相比，生物制药对溶液化学的微小变化不太容忍。它们在组成和构象方面的稳定性限制在狭窄的pH和渗透压范围内。为了在整个产品的货架寿命期间保持溶解性，通常需要支持性配方成分用于多个分子。即使是冻干蛋白质产品也容易降解，这与小分子药物不同，后者在大多数冻干配方中往往非常稳定。 表12.2简洁地概述了蛋白质配方开发中遇到的普遍稳定性问题以及可能的解决方案。然而，鉴于每个分子的独特性，这个列表应该作为指导而不是详尽的指令。 2.2.物理降解 蛋白质降解源于多种因素，包括疏水表面、沸腾、冻干、重构、与有机溶剂的相互作用、搅拌以及其他物理和化学影响。物理应激因素可能导致变性、吸附、积聚或沉积在容器壁上。 2.2.1.结构变化 生物大分子如抗体具有三维的三级结构，对于它们的折叠状态至关重要，涉及与功能氨基酸基团和外部环境的复杂的分子内和分子间相互作用。非共价相互作用（静电、范德华、氢键、疏水作用）在维持天然结构的稳定性中起着关键作用。外部来源破坏这种相互作用平衡会导致结构变化，使大分子不稳定。例如，在水溶液中，更可溶的氨基酸残基与溶剂分子相互作用，而非极性残基被屏蔽，形成疏水核心。 氨基酸序列决定了蛋白质折叠成其生物活性形式。然而，蛋白质也可以展开，从其天然结构转变为中间或变性状态。这些变体倾向于组装成更稳定的复合物，如聚集体，因为具有更高的自由能。聚集体由多个单体组成，通过共价或非共价键结合在一起。例如，稀释可以由于单体的结合而解离天然单体簇聚集体。沉淀或不可逆的聚集体可能由于不同单体的成核而发生。聚集是由多种应激因素引起的，最常见的是制造过程中的温度、机械搅拌和冷冻/解冻压力。例如，IgG4在较低的pH值和较高的温度下比IgG1形成更多可溶性聚集体，这是由于较低的变性温度和三级结构变化导致的较低构象稳定性。 由于蛋白质三级结构对环境物理压力敏感，mAbs在制造过程的任何阶段都可能发生结构变化，从蛋白质表达到处理和储存。结构转变归因于制造过程中的非生理条件，导致最终产品中的结构变体。缓冲液选择、制造技术、容器类型等应激因素可能加剧这些问题。 2.2.2.聚集 聚集的蛋白质在生物制药中引起重大关注，降低了生物活性并增加了免疫原性。大分子蛋白质复合物可以触发免疫反应，将蛋白质识别为外来物质，并促使抗原反应。 缓冲液选择对产品稳定性有显著影响。例如，醋酸盐缓冲液会导致IgG3配方沉淀，而使用精氨酸和组氨酸则不会。调整缓冲液盐浓度可以减轻相变。冻干制剂的pH值对于防止重组疫苗抗原聚集至关重要，通常需要额外的稳定剂，如海藻糖。 成品mAb基生物制药产品中应避免非天然蛋白质。当从瓶中抽取蛋白质溶液时，可能会发生聚集，导致剂量不一致。例如，聚集的IFN-促进了中和性抗药物抗体（NAb）的发展，阻碍了IFN受体的结合，从而降低了临床效果。诱导的NAbs可以破坏内源性蛋白质的正常功能，特别是激素和细胞因子。NAb干扰内源性促红细胞生成素导致接受重组人促红细胞生成素的患者出现Eprex®相关的严重贫血和纯红细胞再生障碍（PRCA）。NAb的形成是由于聚集，通常由含有聚山梨酯80和硅油等成分的预充注射器促进。因此，生物制药的配方或制造过程的任何进展都需要在ICH Q5E指南（https://database.ich.org/sites/default/files/Q5E%20Guideline.pdf）的指导下进行进一步研究。Eprex的创造者没有进行必要的研究，并认为微小的配方变化不会影响促红细胞生成素的保护或功效。 聚集是蛋白质生产和储存中的普遍问题。暴露于液-气、液-固或液-液界面会增强蛋白质的聚集倾向。机械搅拌，包括摇晃、搅拌、移液或通过管道泵送，以及冷冻和解冻也有助于聚集。溶剂条件如温度、蛋白质浓度、pH值和离子强度会影响形成的聚集体的性质和数量。 导致蛋白质聚集形成的几种机制包括域交换（ds）、链结合（sa）、边-边结合（ee）和β-链堆叠。聚集体包括蛋白质多聚体如二聚体、三聚体、四聚体和大聚合物。这些聚集体可以是非共价的或共价的（二硫键连接）。非共价聚集体在清澈溶液中完全可溶，在浑浊溶液中部分可溶，在容器底部沉积时大部分不溶。蛋白质中暴露的疏水基团之间的相互作用触发非特异性蛋白质-蛋白质相互作用，导致聚集。虽然共价聚集是不可逆的，但弱结合的非共价聚集体可能是可逆的，但在大多数情况下会进展为多聚体。强烈结合的非共价聚集体通过稀释不可逆，并且可以沉淀。 聚集体根据其大小范围进行分类：（1）亚微米颗粒（<1 µm），也称为可溶颗粒；（2）亚可见颗粒（1-100 µm），以及（3）可见颗粒（>100 µm大小）。 聚集模型以各种形式和大小存在。在“天然到展开到聚集”模型中，疏水相互作用导致变性或展开的分子聚集。这些相互作用是由于释放出的埋藏疏水区域引起的，诱导聚集形成。随着温度的升高，展开加剧，由于反应通常遵循一级动力学，反应速率在这个模型中上升。“天然到中间体到展开”模型涉及中间阶段产生聚集体。这些错误折叠的中间体在热力学上是稳定的，并且是天然状态集合的一部分。因此，蛋白质聚集不一定是异常状态，即使在有利于天然状态的条件下也可能发生。 蛋白质聚集包括两个阶段：成核扩展到成核过程后的临界质量。尽管浊度测量可以跟踪聚集程度，但它们并不总是可靠的预测因子。当天然和折叠的蛋白质相互作用时，可能会发展出具有升高的非天然分子间片层形成的不可逆非天然结构。溶液条件如pH值、盐种类、浓度、共溶物、辅料和表面活性剂显著影响聚集体的起始、速率和最终形态。聚集体的确切存在由天然状态的相对内在热力学稳定性决定。 生物制药可以在生产、运输和长期储存的各种工艺阶段聚集，由于生产、下游处理、配方和灌装中必要的物理和化学操作。蛋白质溶液（摇晃、搅拌或剪切）在空气-液体界面的搅拌有助于蛋白质分子结合和展开，暴露疏水区域，促进聚集。 搅拌引起的聚集在重组因子XIII、人生长激素、血红蛋白、促红细胞生成素和胰岛素等蛋白质中观察到。防止显著的蛋白质活性丧失或可见颗粒物形成需要最小化制造和产品使用中搅拌引起的泡沫。多剂量配方中使用的防腐剂，如苯甲醇，通过产生部分展开的蛋白质构象加速蛋白质聚集。增加防腐剂的量可以增加疏水性，降低水溶性。苯酚和甲酚显著破坏蛋白质，其中甲酚导致蛋白质沉淀，苯酚促进可溶性和不溶性聚集体的形成。 冷冻和解冻可能在生长过程中发生多次，这可能会减少产品的货架寿命，并对蛋白质聚集产生显著影响。当水-冰晶体在容器边缘形成时，这种效应被称为“盐析”（热量传递最大的地方）。蛋白质和辅料在容器最终冻结的中心变得越来越浓。由于高盐和蛋白质浓度，冷冻期间会发生沉淀和积累，这在解冻时不会完全逆转。例如，促甲状腺激素在-80°C、4°C或24°C下储存时，其效力可以保持长达90天，但由于亚基解离，在-20°C下冷冻时会失去超过40%的效力。 重复的冷冻和解冻循环对亚可见和可见颗粒的产生有累积效应。冷冻期间缓冲液组分的结晶可以诱导pH值变化，磷酸钾缓冲液比磷酸钠缓冲液表现出更小的pH转变。氧化可以加速pH依赖反应，导致沉淀物在几分钟内出现。 与制造过程相关的聚集原因列于表12.3。 请注意，液体在冷冻浓缩过程中被冻结，当它融化时，水会以冰的形式被移除。 在带有硅油润滑的预充注射器中分配蛋白质会带来挑战。基于硅油的类型和数量，不同注射器品牌在350纳米处的蛋白质吸收量变化是常见的。与注射器中的硅油接触可能会导致正确折叠的单克隆抗体形成中间体，根据硅油浓度的不同，可能会导致部分展开、可溶性聚集体形成和可见沉淀。不溶性颗粒是由亚可见和可见颗粒结合而成，亚可见颗粒的直径为0.1-1微米。 基于蔗糖的配方可能由于蔗糖水解过程中的蛋白质糖基化而随时间引起蛋白质聚集。聚集体的形成可以由配体如离子促进。与金属表面的相互作用可能导致外延变性（一种矿物在另一种矿物的晶体基础上生长晶体层，与基底具有相同的晶体学取向），而来自大气、制造过程或容器系统的外来颗粒也可能会触发聚集，例如硅油。在复合药房中处理蛋白质常常导致多倍聚集。 开发防止蛋白质聚集或沉淀的配方需要全面评估最佳pH和渗透条件。可以添加表面活性剂、多元醇或糖类以防止不可逆的变性聚集。 非离子洗涤剂（表面活性剂）被用来提高产品稳定性并防止聚集。由于蛋白质和表面活性剂之间发生疏水相互作用，这些化合物通过降低溶液的表面张力和结合到它们表面的疏水位点，从而减少可能导致聚集体形成的蛋白质-蛋白质相互作用的潜力。Tween 20和Tween 8是非离子洗涤剂，可以在表面活性剂浓度低于临界胶束浓度（CMC）时防止可溶性蛋白质聚集体的形成；螯合剂可以防止金属诱导的蛋白质聚集。 2.3.化学降解 化学不稳定性涉及蛋白质结构内共价键的形成或破坏。氧化、脱酰胺、还原和水解是蛋白质最常见的化学修饰。尽管蛋白质分子有成千上万个活性功能团，但这些团的类型是有限的，因为它们由固定数量的氨基酸组成。表12.4突出了蛋白质降解的热点。 图12.1描绘了用于制造大多数生物制药的抗体最常见的化学降解途径。 图12.1 蛋白质降解的常见途径 二酮哌嗪是二肽酯和酰胺的氨基酸降解中间体。在第二和第三个残基之间，N-末端氮对酰胺羰基发生亲核攻击。因此，含有甘氨酸作为第三个残基或脯氨酸作为N-末端第二个残基的肽特别容易受到攻击；这种反应在中性或碱性介质中最为常见。X-脯氨酸[(X = 甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、β-环己胺和精氨酸]的二酮哌嗪受脯氨酸的顺反平衡和肽键周围的电荷分布的影响。顺式类型有利于环闭合。图12.2显示了一个二酮哌嗪配方的例子。在pH 7.0时，改变脯氨酸残基前的氨基酸对二酮哌嗪形成速率有显著影响。 图12.2 重组生长激素降解中二肽哌嗪的形成 另一种化学修饰中间体是焦谷氨酸。由于末端谷氨酰胺会自发环化形成焦谷氨酸，所以Gln-Gly的反应速度比Gln-Gly快得多。N-末端谷氨酸环化导致-17 Da的质量变化和-1或关键残基的丢失；N-末端谷氨酸环化不会导致电荷变化，但质量会移动18 Da。 尽管预测特定化学反应的影响具有挑战性，但它们对酸度的一致影响如表12.5所示。 2.3.1.脱酰胺 脱酰胺是一种化学反应，从氨基酸中提取酰胺功能团，是mAb基生物制药产品中最常见的化学降解。它可能导致异构化、消旋化和蛋白质截断作为潜在结果。蛋白质脱酰胺的速率受到(n+1)th残基侧链分支的显著影响。残基的电荷通常不重要，除了组氨酸、丝氨酸和苏氨酸的情况。相反，(n−1)th残基对脱酰胺速率只有轻微影响。脱酰胺的半衰期从一天到一千多天不等，取决于羧基侧残基的身份。蛋白质的二级结构也会影响脱酰胺速率。某些蛋白质的螺旋结构变化可以减慢脱酰胺速率。脱酰胺引起的结构变化可能对蛋白质的理化和功能稳定性产生各种影响。 空间障碍也会影响脱酰胺速率。体积较大的天冬酰胺残基可能会阻碍脱酰胺反应中中间体琥珀酰亚胺的形成。通过用体积较大的亮氨酸或脯氨酸残基替换甘氨酸残基，速率可以降低30到50倍。由于反应所需的自由水有限，冻干配方中脱酰胺速率通常较低。 脱酰胺反应的关键特点包括： • 在天冬酰胺和谷氨酰胺上发生的非酶反应。 • 水解反应需要水。 • pH影响路径。 • 在略酸性到基本条件下，环亚胺途径被激活。 • 在酸性条件下，直接水解发生。 • 在pH范围3-4内，最小速率被优化。 • 在pH范围7-12内，缓冲液具有催化作用。 • 对于天冬酰胺，速率比谷氨酰胺高5-10倍。 • 形成正常和β-肽键。 • N+1残基影响速率。 • isoAsp-Y到Asp-Y的可转换性。 表12.6展示了脱酰胺观察到的多种影响的例子。 2.3.2.pH pH、缓冲液和离子强度显著影响脱酰胺。使用pH范围在3-5内的配方可以减少肽脱酰胺。根据溶液的pH值，使用胰岛素异构体或天冬氨酸形式的AsnA-21和AsnB-3。 脱酰胺可以在较低的pH下发生，主要是通过不依赖琥珀酰亚胺的机制。例如，胰岛素A链中Asn的脱酰胺在pH 5时受到青睐，介导中间体环状酸酐的出现；尽管有在较低pH下发生脱酰胺的例子，但这主要是通过不依赖琥珀酰亚胺形成的机制。序列和局部结构等因素，包括空间效应，影响脱酰胺速率。天冬酰胺羧基端的氨基酸显著影响脱酰胺速率，随着侧链大小和分支的增加而降低。 随着pH的升高，脱酰胺速率上升，磷酸盐和碳酸盐缓冲液作为脱酰胺催化剂。在低pH下，肽和蛋白质天冬酰胺侧链的酰胺基团去质子化。天冬酰胺残基的氮原子通过酰胺阴离子肽羰基碳的氮原子进行亲核攻击。在这一系列反应中，肽链被切割，产生琥珀酰亚胺肽片段。琥珀酰亚胺环被水解后形成天冬酰胺基和天冬酰胺基肽。 通过不稳定的环亚胺形成脱酰胺在pH > 5.0时发生，随后自发水解。在高度酸性条件下（pH 1-2），直接水解酰胺侧链优于环亚胺形成。间接水解酰胺主要负责肽键断裂。 2.3.3.消旋作用和异构化 异构化是一种常见的化学降解途径，其结果与脱酰胺类似。它经常直接发生在天冬氨酸残基上，或通过琥珀酰亚胺中间体间接发生。像脱酰胺一样，异构化在中性到碱性pH水平下更为普遍，并受到空间效应的影响。 最常见的非酶降解结果之一是结构异构化和消旋作用，尤其是由于中性pH脱酰胺导致的天冬氨酸到异天冬氨酸残基的异构化。异构化通常涉及天冬酰胺、天冬氨酸和谷氨酸胺，所有这些都含有琥珀酰亚胺中间体。由于这种机制，天冬氨酸的降解速度比天冬酰胺慢得多。脱酰胺产生异天冬氨酸和天冬氨酸的比例为3:1，受位置和流动性的影响。天冬氨酸-异天冬氨酸脱酰胺和异构化的机制类似，涉及环状分子内亚胺中间体。 异构化可以诱导消旋作用作为脱酰胺反应的一部分。在天冬酰胺脱酰胺过程中形成的琥珀酰亚胺中间体容易发生消旋作用，产生d-天冬氨酸残基。除了甘氨酸，其他氨基酸在碱性pH下会发生消旋作用。个别酰胺残基的脱酰胺速率由它们的初级序列、三维结构和溶液特性（如pH、温度、离子强度和缓冲离子）决定。通常，谷氨酸胺残基的脱酰胺速率低于天冬酰胺残基。 2.3.4.温度 储存温度影响脱酰胺速率，使用的缓冲液会有所不同。具有高温度系数的胺类如Tris和组氨酸在储存温度与配制温度不同时会改变pH。配方pH的变化会影响脱酰胺速率，因为脱酰胺和异构化都是pH依赖性反应。间接地，受温度影响的水解离常数通过氢氧根离子浓度的变化影响脱酰胺速率。 2.3.5.辅料 有机溶剂通过降低溶液介电常数来降低脱酰胺速率。添加如甘油、蔗糖和乙醇等共溶剂会降低介电强度，导致异构化和脱酰胺速率显著降低。将介质的介电强度从80（水）降低到35（PVP/甘油/水配方）会导致肽脱酰胺浓度降低六倍，原因是离子中间体的稳定性降低。在含有苯酚的中性溶液中制备的胰岛素通过稳定三级结构（-螺旋形成）来消除脱酰胺，减少中间体亚胺的形成。 2.3.6.水解 水解与脱酰胺类似，导致琥珀酰亚胺形成、消旋作用和异构化。在水解循环中，-x-天冬氨酸-y被称为不稳定的，在稀酸中比其他键反应快100倍。天冬氨酸-脯氨酸键比其他天冬氨酸-x或x-天冬氨酸键更容易水解8-20倍。天冬氨酸-甘氨酸在高度酸性条件下（pH 0.3至3）易受攻击。其他肽键在N-末端比-x-丝氨酸或-x-苏氨酸更快地断裂。 肽键如水解天冬氨酸-甘氨酸和天冬氨酸-脯氨酸会导致蛋白质断裂。天冬氨酸-Y比其他任何肽键更容易水解100倍。水解通常发生在天冬酰胺残基脱酰胺之后，如在胰岛素配方中观察到的。 天冬氨酸-甘氨酸和天冬氨酸-脯氨酸肽键最容易在水解蛋白质中被切割。铰链区，即抗体最灵活的域，也容易水解。将pH从9改变到5可以改变重组单克隆抗体（mAb）肽的水解位点，导致该区域以外的增加切割。 多聚体蛋白质可以在解离成单体（或单肽链蛋白质）后降解成肽片段（或两个或更多亚基）。非酶促肽键断裂产生的分子量低于完整的母蛋白质。 为了最小化水解断裂，配方必须适当缓冲，以维持每种蛋白质类型的适当pH。例如，即使在室温下，降钙素在简单的pH下会水解，但在pH七下不会。缓冲液组成也会影响水解。在磷酸盐缓冲溶液中重组人巨噬细胞集落刺激因子会断裂，但在相同pH和离子强度的组氨酸缓冲溶液中不会。 限制蛋白水解酶在蛋白质纯化中的作用至关重要，无论是来自制造过程（例如，宿主细胞蛋白）还是外部污染（例如，外来微生物）。 2.3.7.二硫键 二硫键在三维结构中起着至关重要的作用，影响生物制药产品的活性和抗原性。各种化学压力可以破坏这些键，导致活性显著丧失。交联，无论是通过二硫键形成介导还是不是，都可能导致化学降解。在涉及二硫键的交联情况下，反应通过形成新的二硫键或交换现有的二硫键发生。分子内二硫键可以改变三级结构，而分子间或域间二硫键可以影响四级结构或导致共价聚集体形成。在较高的pH水平下，从半胱氨酸残基硫醇基（-SH）形成活性硫醇离子（S）是有利的，可能会增加二硫键形成的可能性。 2.3.8.糖基化 糖肽键的存在和定位影响低pH条件下肽水解的速率。位置不影响铰链区切割，但减少了CH2域的断裂。（更多信息，请参见图12.1。）酸性和简单的水解肽键可能会产生不同的结果。在酸性和简单pH溶液下，重组人巨噬细胞刺激因子产生不同的肽片段。酶促蛋白质断裂可能来自残留或污染的蛋白酶，或者在某些情况下，来自酶促蛋白的自溶。 大多数蛋白质会经历糖基化，有些会经历翻译后修饰，如磷酸化，改变它们的降解途径和动力学。相反，还原糖与高度敏感的氨基团如赖氨酸-氨基和N-末端-氨基团通过Maillard反应相互作用。糖基化影响酸化（正电荷丧失）、不溶性、交联和生色团形成。溶液颜色的变化可能表明对pH、温度、氨基酸团pKa、相邻氨基酸、糖还原浓度和蛋白质浓度敏感的意外糖基化反应。糖基化的浓度依赖性是一个重要问题，现在有几种mAbs在高浓度下配制，以最小化皮下注射或输注的剂量体积，而不是静脉注射。 2.3.9.氧化 多硫酸盐或聚山梨酯中的污染物，以及从一次性管道中浸出的氧化剂如过氧化氢，连同氧气、金属离子和其他辅料，会导致蛋白质氧化。残基Met、Cys、Trp、His和Tyr容易氧化，改变蛋白质的物理化学性质，导致聚集或断裂。氧化氨基酸的位置关系到蛋白质的功能或表位样域，可能会影响其效力和免疫原性。系统中的氨基酸与氧自由基相互作用，使蛋白质和肽段容易受到氧化损伤。蛋氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)特别容易氧化(Tyr)。Met和Cys含有硫原子，而His、Trp和Tyr含有芳香族原子。氧化的主要产物列于表12.7。 表12.8列出了一些蛋白质氧化的关键催化剂。 导致氧化的外部因素包括光暴露、与微量过渡金属离子的相互作用以及辅料降解产物的存在（例如，聚山梨酯降解产生的过氧化氢）。氧化可能导致聚集增加。蛋氨酸残基是最常被氧化的，产生的主要副产品是亚砜和砜。氧化速率受到氧化敏感基团周围局部结构的影响（例如，表面暴露和空间位阻）和溶液pH值。虽然提高溶液的pH值在某些情况下可以加速氧化，但这种情况并不常见。氧化可以降低效力并诱导构象变化，导致聚集，这取决于氧化部位。通常不能从降解途径的知识中推断出临床保护。例如，甲状旁腺激素的生物活性取决于Met-8或Met-18（Met-8与Met-18）是否发生单次或双次氧化。同样，人干细胞因子（SCF）中Met-36和Met-48的氧化分别使效力降低40%和60%，增加了SCF二聚体的恒定解离速率2-3倍，暗示了亚基的结合和三级结构的改善。这些例子强调了需要彻底评估任何分子由于降解而发生的行为变化。Met、Tyr、Trp、His和Cys是mAbs中常见的氧化敏感残基。虽然氧化不如去酰胺化和异构化常见，但对于某些蛋白质来说，氧化是一种主要的降解方式，例如OKT3（IgG2），在5°C储存时，几个Met残基和游离Cys发生氧化。作为缓冲剂的物种：缓冲剂主要影响污染物，具有金属螯合能力，并可能与活性氧物种发生潜在的相互作用。Tris作为铁和铜的螯合剂和羟基自由基清除剂。柠檬酸也作为螯合剂，而磷酸（弱）和酒石酸作为缓冲剂。在芬顿化学中，需要碳酸氢根离子，但对此要求的概括并不直接。螯合剂：大气中的金属离子浓度影响金属离子催化的氧化。Fe3+、Ca2+、Cu2+、Mg2+或Zn2+在0.15-ppm氯化物盐中的存在对人类胰岛素样生长因子-1的氧化速率没有影响。然而，当金属浓度提高到1 ppm时，氧化显著增加。Cys、Met和His在金属存在下特别容易氧化。强效1:1螯合剂（例如，EDTA、去铁霉素、次氮基三乙酸）可以根据化学计量学（螯合剂/Fe比率）影响氧化速率。氧化速率增加，直到所有Fe被隔离，达到最大比率1。在比率为1.1到1.2时，观察到几乎完全的蛋白质抑制。需要显著过量（5-20）来抵消效果差的螯合剂（例如，邻苯二胺）的影响。螯合-Fe（III）复合物抑制位点特异性氧化，同时增加非位点特异性氧化。这些复合物阻止铁与潜在位点结合，并促进与金属结合位点不同的ROS物种的形成。肽键水解，焦谷氨酸（更酸性；z=−1）、去酰胺化（更酸性；z=−1）、琥珀酰亚胺（更简单或中性）、糖基化（更酸性；酸性或必需）。半胱氨酸：半胱氨酸氧化在碱性pH下更常见，这会使硫醇基团去质子化。这种氧化导致形成分子间或分子内二硫键，进一步氧化形成硫酸。过渡金属强烈催化较高pH下半胱氨酸的氧化（最佳pH约为6）。然而，与Met或Cys相比，这种反应对温和氧化剂如过氧化氢的敏感性较低。在没有附近硫醇形成二硫键的情况下，氧化可以产生硫酸、亚硫酸和磺酸。在还原环境中，半胱氨酸氧化导致硫醇离子对二硫键的亲核攻击，形成新的二硫键和单独的硫醇离子。新形成的硫醇可以进一步与另一个二硫键反应，再生半胱氨酸。蛋白质降解产生分子间二硫键连接，积累错配的二硫键和混乱的二硫键桥，改变蛋白质的构象和亚基结合。在金属离子或邻近硫醇基团存在下自发氧化的半胱氨酸残基的副产品包括亚硫酸和半胱氨酸酸。人成纤维细胞生长因子(FGF-1)可能发生铜催化的氧化，导致同源二聚体。半胱氨酸氧化影响蛋白质中硫醇基团的空间取向，氧化速率与这些基团之间的距离成反比。这可能导致形成大的寡聚体或非功能性单体，如含有容易氧化的半胱氨酸的基本成纤维细胞生长因子(bFGF)，形成分子间或分子内二硫键，诱导蛋白质构象修饰。半胱氨酸氧化对蛋白质中硫醇基团的空间取向有显著影响。氧化速率与这些硫醇基团之间的距离成反比，可能导致长期发展成大的寡聚体或非功能性单体，如含有三个容易氧化的半胱氨酸的基本成纤维细胞生长因子(bFGF)，形成分子间或分子内二硫键，触发蛋白质构象修饰。半胱氨酸二硫键增加了蛋白质侧链的体积，导致不利的范德华相互作用。辅料：过氧化物（例如，在聚山梨酯中）和微量金属，特别是Fe和Cu，显著影响常见的辅料有机体。高浓度的糖和多元醇通过金属螯合机制抑制由聚山梨酯和聚乙二醇(PEGs)引起的过氧化物污染。聚山梨酯和聚乙二醇(PEGs)的过氧化物污染，通常用作药物辅料，可能导致氧化。与Tween-80中的过氧化物量相关的rhG-CSF的氧化程度，过氧化物诱导的氧化比大气氧气引起的氧化更为明显。预充式注射器等初级包装容器封闭系统中的塑料或弹性材料也可能浸出过氧化物。与Tween-80中的过氧化物量相关的rhG-CSF的氧化程度，过氧化物诱导的氧化似乎比大气氧气更极端。塑料和弹性体浸出的过氧化物。外源变量：pH、温度和辅料缓冲。组氨酸：组氨酸残基在与咪唑环反应时（金属或光催化氧化）高度容易氧化，产生额外的羟基物种。在光和金属氧化期间，氧化的组氨酸可以产生天冬酰胺/天冬氨酸和2-氧组氨酸（2-O-His），作为导致蛋白质聚集和沉淀的瞬态部分，使2-O-His作为单独的降解产物分离变得复杂。通过单线态氧的光氧化通常与光敏剂一起发生。氧化的倾向和速率受到周围残基和氨基酸构象的影响，导致有色溶液。光：光氧化水平按以下顺序：非位点特异性过程（例如，过氧化氢、光）以更高的速率氧化埋藏残基。光诱导氧化主要针对Trp和His。紫外线光对于保护蛋白质免受光诱导损伤至关重要。光氧化可以改变蛋白质的一级、二级和三级结构，影响其长期稳定性、生物活性和免疫原性。即使在关闭光源后，影响蛋白质的生化级联反应也可以持续。效果取决于提供给蛋白质的能量和大气中的氧气。当化合物在特定波长下吸收足够的光时，它获得足够的能量进入称为光氧化的激发状态。激发的分子将其能量转移到分子氧中，将其分裂成活性单线态氧原子。色氨酸、组氨酸和酪氨酸在氧气存在下被光修饰。酪氨酸光氧化产生各种羟基酪氨酸副产品。氧化的酪氨酸残基的交联导致蛋白质聚集。在暴露于强光下的人生长激素中，氧化主要发生在组氨酸-21。肽主链的光降解也是可能的。或者，能量蛋白质可以直接光敏其他蛋白质，通常通过低pH蛋氨酸和色氨酸残基。辅料和浸出物可以协同促进蛋白质氧化和降解。一些配方组分影响光氧化的速率，如磷酸盐缓冲液比其他缓冲系统更快地加速蛋氨酸降解。有助于稳定蛋白质结构的稳定辅料，如多元醇和糖，可以降低氧化速率，而变性/展开试剂增加蛋白质氧化。抗坏血酸增强人类睫状神经营养因子的氧化，而使用如抗坏血酸这样的还原剂可以促进氧化。 光氧化有可能改变蛋白质的一级、二级和三级结构，影响其长期稳定性、生物活性和免疫原性。即使光源关闭，光暴露的影响也可能引发一系列影响蛋白质的生化事件。这些效应取决于蛋白质从环境中获得的能量和氧气水平。当化合物在特定波长下吸收足够的光时，它获得足够的能量进入激发状态，这种现象称为光氧化。在这种激发状态下，分子将其能量转移到分子氧中，导致产生活性单线态氧原子。色氨酸、组氨酸和酪氨酸在氧气存在下特别容易受到光的影响。酪氨酸光氧化产生单羟基、二羟基、三羟基和四羟基副产品。此外，氧化的酪氨酸残基可能导致某些蛋白质聚集。大气中金属离子的浓度可以催化氧化反应。例如，0.15 ppm的Fe3+、Ca2+、Cu2+、Mg2+或Zn2+氯化物盐的存在并不会显著影响人类胰岛素样生长因子-1的氧化速率，但当金属浓度提高到1 ppm时，氧化显著增加。光氧化水平的层次结构如下：色氨酸> Trp > Met > Tyr；其中Trp和His是光诱导氧化的主要目标。非位点特异性途径（例如，H2O2、光）在氧化埋藏残基时遇到困难。紫外线光在保护蛋白质方面发挥着至关重要的作用。值得注意的是，由于光氧化，一级、二级和三级胺可以发生结构变化。 3.配方组成 产品的给药途径和理化性质，如其他药物的性质一样，决定了生物制药配方的组成。药物分子的大分子尺寸和高分子量导致膜透过性低，从而限制了可用的给药途径。被动扩散有助于分子量低于500 Da的药物通过胃肠道和皮肤的膜。然而，人视网膜的内外层限制了大于76 kDa的大分子的扩散，大于150 kDa的无法进入内层视网膜。鼻粘膜对大于一kDa的分子表现出低膜透过性。生物制药的水溶性限制了大多数给药途径，因为大于3-5 kDa的蛋白质被认为是肽类分子，大于150 kDa的抗体被归类为此类。鉴于大多数蛋白质药物的log P值小于零，它们通过生物膜的渗透具有挑战性，使蛋白质药物输送到细胞内目标变得复杂。[参见本章末尾的附录。]生物膜的亲脂性和3-10个细胞间隙阻碍了蛋白质的扩散，需要主动运输或内吞作用才能被细胞吸收。然而，内体陷阱仍然是蛋白质内吞途径的主要缺点，导致溶酶体酶降解。影响吸收的另一个理化性质是生物制药的表面电荷，由蛋白质的氨基酸序列和周围pH决定。去酰胺化、异构化或翻译后的改变通常导致蛋白质的净电荷和酸性和碱性变体的形成。由于其表面电荷，蛋白质药物可以与细胞表面或组织组分的分子相互作用，影响蛋白质在体内的吸收、分布和消除。 3.1.辅料和性质 预配方涉及评估生物制药产品的生化和生物物理特性，这些特性基于其氨基酸序列，受pH、离子强度和辅料等因素的影响。系统方法，如实验设计（DoE）或经验相图，有助于建立稳定性指示测定法，并在压力下定义主要辅料（EPD），导致结构和功能变化。生物制药配方中的辅料没有作为成品获得许可，而是从众所周知的有机或无机分子到复杂且难以分类的结构。辅料的选择受到不同司法管辖区的法规要求的影响。美国食品药品监督管理局（FDA）维护了一个可搜索数据库（IID），列出了批准的浓度、剂量形式和给药途径（www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/iig/index.cfm），而日本药品辅料词典（JPED）汇编了日本批准药物中使用的辅料（www.yakuji.co.jp/wpyj-002/wp-content/uploads/2020/05/jpe2018 order form.pdf）。加拿大卫生部公布了一份允许的非药用剂清单，但欧洲药品管理局缺乏类似的欧洲产品的清单或数据库。表12.10列出了生物制药产品中常用的不同类型药物辅料和一些例子。 虽然配方的成分差异很大，但表12.11列出了最常用的数量范围。剂量标准决定了配方中活性成分的量，浓度与产品的溶解度有关。蛋白质溶解度指的是在共溶剂中可溶的蛋白质的平均量，产生一个透明溶液，没有沉淀的蛋白质、晶体或凝胶。离子强度、盐型、pH、温度和特定辅料等因素影响蛋白质溶解度，影响水的表面张力和蛋白质与水和离子或自相互作用的结合。蛋白质与某些辅料或盐的结合改变了蛋白质的构象或掩盖了参与自相互作用的特定氨基酸，影响溶解度。一些盐、氨基酸和糖优先水合蛋白质，通过稳定更紧凑的构象改变溶解度。 使用多种辅料来稳定蛋白质配方。为了提高产品的安全性和有效性，使用辅料和配方缓冲液（表12.8）。根据分析，生物制药药物配方中最常用的成分是： • 缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和醋酸盐，确保pH尽可能稳定。 • 稳定剂，如表面活性剂和糖，包括聚山梨酯、白蛋白、甘露醇、蔗糖和山梨醇。• 糖和电解质，如氯化钠，是改变渗透压和电导率的成分的例子。图12.3显示了大约200种生物制药注射药物中最常用组分的百分比。 图12.3 生物制药中常见配方成分的百分比出现率 3.1.1.pH 在提到的配方变量中，pH是最关键之一。其他配方方法在解决物理性质问题方面面临重大挑战，如由于溶解度和稳定性导致的沉淀。pH优化是一个简单但有效的解决方案，以应对这些问题。pH触发各种化学反应，包括去酰胺化、环状亚胺形成、二硫键错乱、肽键断裂和氧化。需要仔细评估其他功能性辅料的性质。例如，用于在冻干和固态储存期间稳定蛋白质的蔗糖需要彻底检查。调整蛋白质溶液的pH和离子强度，加入糖、氨基酸、多元醇和使用表面活性剂是防止氧化和沉淀的有效策略。深入评估最佳pH和渗透条件是配方生产中的关键要素，以避免蛋白质聚集或沉淀，这是不可逆的，并且可以通过表面活性剂、多元醇或糖来防止。 3.1.2.表面张力 表面活性剂，如聚丙烯酸钠，具有疏水和亲水部分（例如，烷基链羧基和羧酸盐基团）。非离子洗涤剂，称为表面活性剂，用于增强稳定性并防止聚集。这些化合物通过降低溶液的表面张力和与蛋白质上的疏水位点结合，从而减少导致聚集形成的蛋白质-蛋白质相互作用的可能性，从而建立稳定性。值得注意的是，非离子洗涤剂如Tween 20和Tween 80防止在临界胶束浓度（CMC）下形成可溶性蛋白质聚集体。当引入到IgG溶液中时，聚山梨酯（Tween）80稳定小聚集体并防止它们增大成更大的颗粒。 3.1.3.渗透压 “等渗”溶液的渗透压与人类血液的渗透压相匹配，通常在250到350 mOsmol/kg之间。包括磷酸盐、甘氨酸盐、碳酸盐和柠檬酸盐缓冲剂，使用钠、钾或铵离子作为对离子，维持水溶液对酸、碱或溶剂稀释导致的pH变化。 3.1.4.保护剂 新型辅料在增强蛋白质/肽稳定性方面发挥着至关重要的作用，因为常用的辅料只提供有限的稳定化作用。例如白藜芦醇（一种天然酚类）、羟丁酸盐、多胺、辛酸和醌-色氨酸衍生物等例子说明了这一趋势。此外，如戊烷-1,5-二胺盐和樟脑-10-磺酸盐等疏水盐可以将mAb溶液的粘度降低十倍。然而，使用不常见的辅料可能需要广泛的安全性测试，可能包括体内研究。冻干保护剂在与感兴趣的蛋白质一起使用时，有助于防止或最小化蛋白质在冻干和随后储存期间的化学和物理不稳定性。防腐剂用于抑制细菌活性，并且可以是配方中的可选成分。例如，通过添加防腐剂，开发多用途配方变得更容易。各种防腐剂如十八烷基二甲基苄基氯化铵、六甲铵氯化物、苯扎氯铵（一种由长链烷基苄基二甲基氯化铵组成的混合物）、苯扎氯铵和芳香醇如苯酚、丁基和苄醇、烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和m-甲酚，以及烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯。一种常见的防止聚集的方法是通过限制蛋白质的流动性来减少分子碰撞。表面活性剂（例如聚山梨酯20和80）、碳水化合物（例如环糊精衍生物）和氨基酸（例如精氨酸和组氨酸）等辅料通过吸附到空气-液体界面并保护蛋白质来帮助防止聚集。然而，某些辅料如聚山梨酯80可能导致胶束形成，增加免疫原性的风险。环糊精稳定商业上可用的基于抗体的药物在水凝胶配方中。普朗尼克F68、海藻糖、甘氨酸和氨基酸如精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和组氨酸，这些在许多商业蛋白质治疗产品中发现的辅料被认为是安全的（GRAS）。Avastin®（贝伐珠单抗，25 mg/mL）包含如海藻糖脱水物、磷酸钠和聚山梨酯20等成分。组氨酸盐酸盐、组氨酸、海藻糖脱水物、聚山梨酯20、蛋氨酸和注射用水都是皮下注射赫赛汀®（曲妥珠单抗，600 mg）的辅料。螯合剂用于防止金属诱导的蛋白质聚集。 3.1.5.稳定剂 使用大型聚合物辅料可以稳定蛋白质，其中中性聚合物作为拥挤剂通过消除空间排斥来稳定蛋白质。例子包括PVP、Ficoll70、羟乙基（heta）淀粉或PEG 4000。最近涉及含有海藻糖的右旋糖酐和糖聚合物的组合旨在增强工艺和储存稳定性。此外，由于它们在蛋白质-多离子相互作用中的作用（甲基丙烯酸），聚阴离子/聚阳离子如肝素、右旋糖酐硫酸盐、戊糖多硫酸盐、多磷酸、聚谷氨酸和聚（丙烯酸）或聚（丙烯酰胺）是潜在的稳定剂。阳离子壳聚糖和带负电的乳酸脱氢酶（LDH）之间的活性导致在气流喷雾过程中显著稳定。然而，当受到搅动时，负电荷的肝素和角质细胞生长因子2（KGF-2）活性促进蛋白质聚集。强烈的相互作用可能导致蛋白质不稳定，以优先相互作用机制为例。负责形成与各种人类疾病相关的淀粉样纤维的纤维化过程涉及晶体和非天然蛋白质物种之间的相互作用。（在某些条件下并随着时间的推移，蛋白质失去其天然折叠状态并形成淀粉样纤维，这种机制与多种人类疾病有关。具有不同表面特性的外来表面，如纳米颗粒，可以破坏这种纤维化过程。） 在蛋白质配方中使用重组透明质酸酶有助于快速组织分布，允许比正常更大的注射体积。然而，将聚合物或蛋白质纳入蛋白质配方增加了复杂性，给配方表征和稳定性研究带来了挑战。 3.2.液体配方 在设计液体配方时，会考虑各种相互作用，如静电、范德华力、氢键和疏水性。高浓度的糖类如蔗糖、海藻糖和乳糖，以及聚水醇如山梨醇、甘露醇和聚乙二醇，有助于维持生物制剂的天然构象。这可以防止它们与蛋白质表面相互作用。由于表面张力增加，不使用蔗糖。“盐析”过程通过添加少量盐来增强蛋白质的溶解度。虽然盐作为渗透压调节剂，但有时可能对构象稳定性产生负面影响。因此，根据Hofmeister系列，使用反离子及其浓度来改变稳定性概况 - 这是预配方筛选中的关键考虑因素。例如，不同缓冲物种在不同浓度下影响离子强度可以实现相同的pH状态，从而影响蛋白质稳定性。Zn2+与人类生长激素的结合说明了配体结合如何保持天然蛋白质状态。表面活性剂防止蛋白质在界面（空气-水和固体-水）上的吸附、变性和聚集。它们通过不同地结合到天然和变性蛋白质状态来影响蛋白质稳定性。表面变性也可能由于搅动、冻融应力测试或低表面活性剂浓度如聚山梨酯20、聚山梨酯80、普朗尼克F68或其他擅长减少可溶性和不溶性聚集体的物质而发生。解决金属离子、玻璃瓶中的钡、瓶塞中的硫化剂、预充式注射器中的钨氧化物和硅油渗透等问题至关重要。EDTA去除瓶塞中的金属浸出物。与预配方类似，根据Hofmeister系列的反离子及其浓度对稳定性概况产生重大影响。不同浓度的缓冲物种影响离子强度可以产生相同的pH状态，从而影响蛋白质稳定性。结合配体如Zn2+到人类生长激素也有助于维持天然蛋白质结构。抗菌防腐剂通常用于多剂量生物制药产品，占所有这类产品的三分之一。它们可以诱导蛋白质聚集，使生物制药稳定化复杂化。常用的防腐剂包括m-甲酚、苯甲醇或苯酚、苯氧乙醇和氯丁醇。建议在使用前筛选各种防腐剂，无论是单独使用还是组合使用。 3.3.冻干配方 冻干通过适当的辅料增强蛋白质稳定性，通过降低蛋白质流动性和限制构象灵活性。这一过程最小化了由于水分去除导致的水解反应。适当的辅料，如冻干保护剂，可以防止冻干和最终产品储存期间的聚集形成。实现足够的稳定性取决于冻干保护剂与蛋白质的摩尔比。特别是室温储存时，通常需要300:1或更高的比例。然而，这样的比例可能会导致不希望的粘度增加。由于不含防腐剂的水溶液中蛋白质不稳定，可能需要冻干。当稳定性、储存和运输要求与目标产品概况一致时，冻干成为液体配方的重要替代品，尤其是对于高度热敏产品和活病毒疫苗项目。冻结是冻干的先决条件，随后是真空辅助的一次和二次干燥。然而，干燥过程带来了其独特的挑战。冷冻期间可能会发生变性，由冷冻浓缩条件、冻结表面界面或冷变性引起。在冷冻浓缩阶段的配方应考虑局部盐和缓冲液浓度的影响，以及增加的被困氧气浓度。同样，在冻干产品中，由于缓冲液结晶导致的pH变化必须纳入配方设计空间。在生理pH下用低浓度的磷酸钾缓冲液（包括10 mM）进行缓冲，比磷酸钠缓冲液更受青睐，因为磷酸钠在冷冻期间会发生显著的pH变化。柠檬酸、Tris和组氨酸是良好的缓冲选择，如果pH范围合适的话。为了最小化氧化，可以使用抗氧化剂（例如抗坏血酸）和清除剂（例如硫脲）。除了冷冻保护剂，可能还需要冻干保护剂，即外部稳定剂。例如，山梨醇在液体预配方筛选中可能是一个很好的稳定剂，但由于其低玻璃化转变温度，在干燥配方中不受欢迎。具有高玻璃化转变温度的冻干保护剂，如蔗糖和海藻糖，作为固体水替代品，保持干燥状态下的天然状态。然而，使用还原糖（例如乳糖）需要在风险评估中仔细评估。辅料组合，特别是在多重稳定剂系统中，可能由于相分离的可能性（例如PEG-右旋糖酐）而受到限制。由于其在较低pH下酸水解的能力，海藻糖比蔗糖更受青睐。为了防止低浓度产品的“爆炸”，在冻干产品中添加了1%固体的增量剂。例子包括无定形增量剂，如蔗糖、海藻糖、乳糖、棉子糖、右旋糖酐、羟乙基淀粉（HES）或结晶的如甘氨酸和甘露醇，用于无定形或高共晶温度（Teu）结晶辅料。甘露醇的选择受到甘露醇水合物存在的限制，这在制造过程中可能会导致玻璃破裂（由于高填充量、不正确的冷冻程序和高浓度）。等渗性在缓解疼痛方面起着作用。在冻干产品中实现等渗性是具有挑战性的，因为在重新配制过程中蛋白质和辅料的浓度都很高。如果蛋白质浓度超过100 mg/mL，500:1的蛋白质摩尔比可能会导致高渗制剂。虽然冻干广泛用于蛋白质药物，但它有缺点，导致开发了替代干燥方法（例如，喷雾干燥、喷雾冷冻、超临界流体干燥、泡沫干燥）用于胰岛素、胰蛋白酶、人类生长激素和单克隆抗体等蛋白质。 3.4.高浓度配方 通常需要高浓度用于皮下给药的较低体积。然而，随着蛋白质浓度的增加，其物理性质可能会发生剧烈变化，影响混浊度、粘度和蛋白质聚集/免疫原性。由于这些改变的性质，生物治疗产品的制造、给药和市场性面临风险。皮下途径的体积限制为1.5 mL。需要大剂量的配方，超过1 mg/kg或每剂100 mg，配制浓度超过100 mg/mL。为容易聚集的蛋白质开发高浓度配方是具有挑战性的。在较高浓度下，蛋白质相互作用可以诱导可逆的自结合，导致不溶性聚集体的形成。增加的浓度增加了可逆寡聚体（如二聚体和四聚体）的可能性，由于分子碰撞的增加。聚集体可以通过例如二硫键交换之类的机制形成，即使在较高浓度下，即使是微小的天然结构构象变化。高浓度溶液意味着溶质占据了大量的空间。另一个定义是当分子大小与范德华表面之间的距离一致时，称为“高浓度”，由于分子接近。实现高浓度配方的主要障碍是目标蛋白质的溶解度，受分子性质（序列、电荷分布）和溶液条件（pH、离子强度等）的影响。溶解度定义了在30,000 g离心30分钟后，溶液中没有可见颗粒、沉淀或团块的最大蛋白质量，与共溶剂一起。除了溶解度，混浊度、粘度和聚集等因素在mAb配方中至关重要。混浊度在浊度单位中用散射光度法表示，源于可逆的蛋白质-蛋白质和液-液相分离。蛋白质-蛋白质相互作用在高浓度下显著影响混浊度和粘度，可能导致可逆的自结合、增加的粘度、混浊度和聚集在紧密堆积的分子中。粘度的增加直接影响高浓度下的可制造性和可注射性。切向流过滤（TFF）是大规模制造（临床和商业）中用于缓冲液交换和蛋白质浓缩的常用技术。高粘度导致背压超过泵的能力，由于空化和通过狭窄管道快速泵送引起的剪切应力。这种高压力给mAb带来压力，至少通过延长生产时间来增加制造成本。高粘度显著影响皮下剂量给药。滑动力，通过测量通过注射器推动液体的力来确定皮下注射的容易程度，主要受粘度的影响。随着粘度的增加，注射部位的疼痛增加，可能会降低患者的依从性。解决蛋白质稳定性和高粘度的一个新概念涉及“纳米簇” - 在存在拥挤剂如海藻糖的情况下开发的密集包装的蛋白质分子。在非常高的浓度（高达320 mg/mL）下，这些形成了纳米簇（35-80 nm）的胶体稳定分散体。纳米簇中的蛋白质分子比在大量溶液中更紧密地包装。虽然蛋白质之间的距离较短可能会增强相互作用，但它们可能会损害蛋白质稳定性。纳米簇概念需要进一步开发。 3.5.配方示例 以下是一些商业产品配方的列表。 • 奥普瑞韦金注射液（白细胞介素[IL]-11）。 • 白细胞介素注射液（IL-2）。 • 干扰素阿尔法-2a注射液。 • 干扰素贝塔-1b。 该产品单独包装为0.54%溶液（2毫升稀释剂用于冻干产品）。• 干扰素β-1a注射液。 • 干扰素阿尔法-n3注射液。 • 干扰素阿尔法康-1注射液。 • 干扰素伽马-1b注射液。 • 注射用英夫利昔单抗。 • 注射用达克珠单抗。 • 注射用重组凝血因子VIIa。 • 注射用重组来替普酶。 • 注射用重组阿替普酶。 4.给药途径 每种给药途径都有其自身的局限性，这些局限性基于解剖学大小和位置、微环境、复杂的生理条件以及制剂。直肠中液体的体积和粘度影响药物吸收。 不同生物环境中的pH条件影响基于蛋白质的药物的离子化、化学稳定性和吸收及其输送机制。例如，蛋白质药物在生理pH值下变得不稳定。高度酸性的胃环境（pH 1-3）会导致胃中蛋白质药物的不稳定，而较高的pH值则减少了回肠和结肠中的化学降解。因此，眼部输送系统中的缓冲剂起着至关重要的作用，因为高渗溶液会导致前房组织暂时脱水，而低渗溶液可能导致水肿。 口服蛋白质输送和生物利用度面临胃肠道酶降解的挑战。蛋白酶在小肠中的活性较高，但在结肠中则低得多。因此，结肠靶向输送系统作为一种可行的蛋白质药物输送机制受到了关注。这种方法可以增强药物吸收和作用持续时间。结肠靶向药物输送系统在治疗局部肠道疾病（如结肠癌、溃疡性结肠炎、克罗恩病和阿米巴病）方面也非常有用。尽管非口服途径绕过了肝脏首过效应，但酶屏障创造了一个“假首过效应”。例如，低代谢酶活性会阻碍通过鼻和肺途径的蛋白质药物输送。 粘液和上皮细胞膜作为非注射药物的主要吸收屏障。粘液覆盖所有粘膜上皮，作为抵御机械损伤和有害物质进入眼睛、呼吸道和胃肠道的第一道防线。它在物理上保护大分子，并且由于其亲水性和负电荷，与药物相互作用，减慢药物扩散并限制肠道吸收（图12.4）。 图12.4 不同给药途径的吸收障碍 粘液由粘液型糖蛋白组成，全身厚度差异很大。例如，气道粘液厚度在5到55微米之间，而鼻道粘液非常薄，形成了多孔表面。在眼睛中，覆盖结膜的前角膜粘液凝胶厚度为30-40微米。胃肠道粘液层的厚度因位置和消化系统活动而显著不同，胃和结肠最厚，范围在10到170微米以上。尽管结肠缺乏蛋白水解活性，但药物必须穿透这层较厚的粘液层，使其成为蛋白质吸收的有利部位。 肠外途径，不包括口腔和消化道（例如，直肠），通常通过静脉推注、静脉滴注、皮下注射和肌肉注射输送生物制药。尽管其精确性，肠外注射由于侵入性、不适、感染风险、高成本和低患者依从性而面临挑战。 开发非侵入性药物输送途径，如口服、鼻、肺、眼科、直肠或经皮，由于生物制药的大分子大小、亲水性、低渗透性和化学/酶不稳定性而面临挑战。替代药物输送方法有两个主要缺点。首先，药物的给药途径对多肽不友好；例如，口服给药的蛋白质在通过胃肠道或通过鼻粘膜吸收之前会受到恶劣条件的影响，这可能导致显著的代谢。给药后，通过各自的屏障层充分吸收药物可能是实现药理反应的重要因素。在疏水载体中包封、渗透增强剂、电输送或化学修饰以增加疏水性，都是提高亲水性（因此吸收差）化合物吸收的策略。鉴于纳米技术的进步，正在开发具有调节粒径和表面修饰的新纳米配方，这些配方提高了蛋白质药物的目标选择性、系统半衰期和生物利用度。 然而，像通过口服将药物输送到胃肠道的设备这样的新方法，由于剂量变异性，面临批准挑战，类似于吸入胰岛素的撤回。此外，胃肠道出血的风险和剂量限制阻碍了它们的批准。 4.1.静脉给药 静脉推注、静脉滴注和皮下输送是输送生物制药最常用的方法。通常，生物利用度差或高度可变的药物，如肿瘤药物，通过静脉给药以确保精确剂量。可能在皮下组织引起刺激的药物更适合静脉注射。然而，由于与药物治疗相关的显著成本，这种方法不建议自我给药。制剂挑战最小，除了要求药物必须是溶液或非常细的乳液以防止静脉阻塞。一些最初设计用于静脉注射或滴注的生物制药最近被重新配制为皮下给药，使患者能够自我给药。 4.2.皮下给药 胰岛素是第一个被接受用于皮下使用的生物制药。静脉推注或滴注仍然是需要精确剂量计算的药物最常见的途径，特别是肿瘤药物，通常由医疗专业人员给药。然而，由于经济原因，最近从静脉给药转向皮下给药。2013年至2014年在欧洲引入曲妥珠单抗和利妥昔单抗的皮下制剂后，许多药物现在被重新配制为皮下剂量形式，远离静脉给药。这种转变使得类风湿性关节炎、多发性硬化症或原发性免疫缺陷的自我注射治疗成为可能，推荐混合剂量（不基于体重）。 皮下给药的生物制药产品与静脉给药的生物制药产品具有不同的药代动力学特征。皮下给药的生物制药产品通常以从皮下细胞外基质缓慢吸收的速率为特征，导致Cmax水平低于静脉给药获得的水平。 分子进入血流的模式遵循特定的模式，归因于大分子通过血管内皮层的渗透性降低。因此，淋巴系统作为进入循环系统的替代途径。尽管这一功能，淋巴吸收对完全穿透皮下注射的分子构成了障碍。与间质糖胺聚糖、蛋白质和酶降解的相互作用共同促成了皮下注射分子的不完全生物利用度。 与小于20 kDa的小分子相比，分子量超过20 kDa的生物制药产品通过血毛细血管的运输有限，主要通过淋巴系统进入循环系统。与静脉给药相比，皮下给药的生物治疗更具免疫原性，因为暴露于淋巴系统的程度更高。目前，监管机构要求对皮下剂量进行免疫原性测试，而不是静脉剂量。需要通过皮下和静脉途径给药的生物药物，需要证明皮下给药比静脉给药的安全性。 皮下给药的生物制药产品由于注射分子的生物利用度不完全，通常范围在50%到80%之间，特别是对于单克隆抗体（mAbs）。对于在皮下给药部位或淋巴系统的前系统代谢中涉及的酶及其在物种间的转化的理解仍然有限。对于mAbs，皮下生物利用度与静脉给药后的清除率呈负相关；表现出较低静脉清除率的mAbs显示出更高的皮下生物利用度。造血细胞，如巨噬细胞或树突细胞，在皮下首过清除和静脉给药后的系统清除中发挥作用。由于生物利用度差，皮下输注通常需要比静脉输注更高的剂量，导致皮下制剂的成本更高。 为了提高生物治疗药物的皮下生物利用度，可以给药或开发使用分散增强剂透明质酸酶的皮下输注。这种酶有助于注射液体在皮下组织中的扩散，可能由于在间质组织中增强的分散而增加共注射分子的生物利用度。通常以缓冲水溶液给药的皮下注射可能会引起疼痛，尤其是含有柠檬酸缓冲液的溶液。例如，Humira，一种畅销的生物制药药物，最初含有柠檬酸缓冲液，注射时会引起不适。基因序列专利到期后，AbbVie重新配制了不含缓冲液的药物，声称大蛋白本身起到缓冲作用，这是开发者所知的事实。重新配制的版本更浓，减少了注射体积和炎症，如AbbVie的新专利所述，现在保护了公司。 皮下给药提供持续活性，如胰岛素glargine所见，它在皮下注射后沉淀，允许长时间释放。聚合物科学的最新进展已经导致了用于持续药物释放、高组织相容性和患者自我给药的水凝胶的开发。水凝胶产生一个可变形的药物库，随着时间的推移稳定地向周围组织释放高浓度的药物。然而，大多数水凝胶与药物的化学结合而不是共价结合，导致药物在几小时到几天内快速释放，限制了它们适用于长期药物输送。 4.3.口服给药 虽然口服给药是最常见的途径，但由于渗透性问题和化学不稳定性，蛋白质药物几乎不可能通过口服给药。口服制剂通常表现出不一致的生物利用度，对于具有狭窄治疗范围的生物药物尤其成问题。正在研究通过棕榈酸或月桂酸脂肪酰化创建的亲脂性胰岛素和促甲状腺激素释放激素衍生物，用于口服给药。这些转化的药物分子形成类似囊泡的结构（Prosome®, Pharmacosome®），显著提高了患者的药物生物利用度和循环时间。 微球、脂质体或纳米粒子将多肽药物封装在聚合物、磷脂或碳水化合物颗粒输送系统中。 4.4.鼻/肺给药 由于其广阔的表面积（约80-140平方米）、薄的肺泡上皮（0.1-0.5毫米）和充足的血液供应，肺部提供了快速和高药物吸收。肺给药避免了肝脏首过效应，是非侵入性的，有效剂量较低，可以局部或系统使用，肺给药是有利的。尽管肺组织与胃肠道相比表现出较低的酶活性，但肺泡上皮具有几种免疫学特性。然而，肺给药有一些缺点，包括由于药物迅速清除而导致的短持续时间。吸入药物沉积在肺部，被清扫到口腔，在那里被肺泡巨噬细胞吞噬并消除。因此，在有效给药之前，实现持续药物释放需要一种方法来规避或暂停肺部的正常清除机制。通常，分子量在6000到50,000 D之间的蛋白质在吸入后表现出高生物利用度。因此，肺给药作为一种有前途的蛋白质药物输送方法受到了显著关注。 目前只有少数药物正在开发用于肺给药，包括白介素-1受体（哮喘治疗）、肝素（血液凝固）、人类胰岛素（糖尿病）、α-1抗胰蛋白酶（肺气肿和囊性纤维化）、干扰素（多发性硬化症和乙型及丙型肝炎）以及降钙素和其他肽（骨质疏松症）。针对特定组织或器官的吸入输送也可以用于基因治疗。Inhale等创新的干粉配方、包装和填充技术使以前接受注射的患者能够独立且无痛地将药物吸入深肺部，促进自然有效的血流吸收。 鉴于其在肺药物给药效果中的关键作用，选择合适的输送系统对于肺药物给药的配方设计至关重要。雾化器（例如，喷射雾化器、超声波雾化器和振动网雾化器）、定量吸入器和干粉吸入器是常用于以气溶胶形式给药的治疗工具。 各种基于纳米技术的方法已经广泛研究，以成功地通过肺途径输送蛋白质。纳米粒子通常作为肺部蛋白质输送载体是有希望的，因为它们能够以受控的方式靶向和释放药物。小于200纳米的纳米粒子也可以避免被肺泡巨噬细胞检测到，从而实现更好的吸收和药物作用。除了聚合物纳米粒子，其他纳米载体如脂质体和固体脂质纳米粒子都已被用作通过肺给药输送蛋白质药物的纳米载体。后续部分将更详细地探讨这些纳米载体。 吸入性胰岛素，一种粉末形式的胰岛素，通过吸入并通过肺部吸收。吸入性胰岛素比皮下注射的胰岛素作用更快，导致更高的峰值血液浓度和更快的代谢。辉瑞在2006年推出了第一种吸入性胰岛素药物Exubera，最初由Inhale Therapeutics（后来更名为Nektar Therapeutics）开发。然而，由于销售不佳，它在2007年被撤回。FDA在2014年批准了Mannkind的单体吸入性胰岛素Afrezza。Highlands Pharmaceuticals的Dypreza吸入性胰岛素在2013年获得欧洲销售批准，在2016年获得美国销售批准。实现吸入性胰岛素的精确剂量可能是具有挑战性的，特别是通过特定系统给药时。 虽然鼻途径提供了增加的生物利用度和易于给药的优势，但它也可能导致向大脑输送。大分子容易通过肺部，使肺给药成为蛋白质输送的可行非侵入性选择。吸入性胰岛素比皮下注射的胰岛素吸收得更快，导致对餐食的生理反应更好。然而，由于剂量不一致，吸入性胰岛素装置被召回。通过鼻途径给药的物品列在表12.14中。 4.5.经皮给药 许多细胞因子被局部应用，但使用脂质体输送人类表皮生长因子显著提高了其效果。肽类药物可以利用皮肤的毛囊皮脂腺途径通过非离子表面活性剂制成的脂质体（niosomes）。例如，由甘油二月桂酸酯胆固醇和聚氧乙烯-10-硬脂醚制成的囊泡增强了干扰素α和环孢素的吸收。转移体（由卵磷脂/胆酸钠混合物制成）也被用于通过局部应用在体内输送胰岛素。 渗透增强剂，如N-烷基氮杂环庚酮（Azone）用于去甘氨酰精氨酸加压素，暂时破坏皮肤的完整性或物理化学特性，以促进肽通过皮肤传输。体外研究表明，非离子表面活性剂n-癸基甲醚磺氧化物增强了亮脑啡肽通过无毛小鼠皮肤的吸收，而尿素/乙醇/薄荷脑/樟脑/水杨酸甲酯羟丙基纤维素凝胶通过增加水合作用和表现出角质溶解作用，改善了九肽亮丙瑞林（促黄体激素释放激素类似物）的吸收。 最近，研究人员探索了电穿孔法，使用皮肤渗透性的电刺激来增强短肽（模型三肽，加压素）、生长激素释放因子（氨基酸1-44）、胰岛素和促黄体激素释放激素的输送。超声波振动在体内输送胰岛素方面取得了一定的成功。 微针提高了患者的依从性，并为亲水性和高分子量药物，包括蛋白质药物，提供了一个多功能平台，以克服皮肤屏障而不引起疼痛。由硅、塑料、可生物降解聚合物和碳水化合物组成的微针是一种无痛的工具。第一代微针使用坚固的针头穿透皮肤膜并增强药物渗透性。虽然固体微针在输送胰岛素方面似乎有效，但由于输送性能差、给药复杂、剂量不精确和感染风险，其使用受到限制。最近的进步包括直接将药物有效载荷涂覆在微针表面，从而产生更强大的微针。涂覆微针的各种方法如浸涂、铸造和沉积被使用。可生物降解微针确保在可生物降解聚合物基质水解后持续释放药物。在构建这些微针时，优先选择具有高分子量和交联密度的聚合物。 声波导入法利用超声波波增强皮肤中的药物渗透性。超声波波导致角质层中的空气囊膨胀和振荡，破坏脂质双层并形成促进药物渗透的腔隙。通过声波导入法输送药物的程度取决于药物的物理化学特性、超声波暴露的持续时间和脉冲“开”长度。虽然声波导入法有助于生物制药的经皮输送，但由于超声波暴露可能导致蛋白质不稳定，因此需要谨慎。将声波导入法与化学增强剂、电穿孔和电穿孔等方法结合使用，与单独使用声波导入法相比，显著改善了药物通过皮肤输送。 电穿孔，一种在经皮输送蛋白质和肽类中的新方法，使用超短脉冲和电强度改变皮肤，使亲水化合物渗透。与直接将药物推进皮肤的电穿孔不同，电穿孔主要改变膜渗透性以增强药物渗透。 4.6.眼部给药 由于血-视网膜屏障和外排转运体，眼部蛋白质输送面临挑战。配方粘度影响眼部药物输送，其中更高的粘度增加了角膜接触时间，但诱发了反射性流泪和眨眼。 两种产品，抗血管内皮生长因子（anti-VEGF）寡核苷酸和单克隆抗体（Lucentis；Ranibizumab），已获得眼部给药的批准。传统的局部应用剂量形式，如眼药水，由于生物利用度和治疗效果低而受到困扰。因此，出现了新的策略来克服眼部输送障碍，并通过眼部途径提高蛋白质生物利用度。例如，化学伴侣和重组人透明质酸酶的联合给药有助于通过眼部途径输送蛋白质。为了解决眼部疾病治疗中蛋白质聚集的问题，设计了一种涉及化学伴侣的新策略，作为蛋白质聚集抑制剂，以防止易聚集蛋白质序列的错误折叠和自组装。此外，将重组透明质酸酶与生物制药药物结合使用，长期以来一直用于通过分解透明质酸（一种重要的组织成分）来增强药物通过眼部组织屏障的渗透。对聚合物胶束、脂质体、纳米球、纳米晶片和树枝状聚合物等纳米载体的研究集中在通过眼部途径控制和靶向输送蛋白质，旨在克服眼部输送障碍。表12.15列出了通过眼睛给药的药物。 纳米晶片是小型的透明圆形或矩形薄膜，包含药物装载的纳米储液器阵列，与眼药水相比，以更受控和持久的方式释放药物（持续时间从几小时到几天）。使用的聚合物包括聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素。将纳米晶片放置在患者的指尖上，即使持续眨眼也不会脱落。它们缓慢释放药物，延长药物在眼部的停留时间，增强眼部组织的吸收，并提高治疗效果。此外，随着药物的释放，纳米晶片逐渐溶解，使眼部表面不留下聚合物。 在眼部给药中，可以使用装载药物的隐形眼镜。这些镜片延长了药物在眼中的停留时间，从而增强了药物对角膜的渗透。由于药物分子从镜片基质中缓慢扩散，因此可以实现持续的药物释放。将药物封装在纳米载体中，并将这些装载的纳米载体分散在镜片基质中，进一步提高了停留时间和药物释放率。然而，使用隐形眼镜的缺点包括在储存和输送过程中药物的渗漏，以及与表面粗糙度相关的安全问题需要解决。 4.7.直肠给药 蛋白质药物非常容易受到物理化学和酶的破坏，因此受益于吸收增强剂、蛋白酶抑制剂、前药和纳米制剂。胰岛素、肝素、降钙素、重组人粒细胞集落刺激因子（rhGCSF）和人绒毛膜促性腺激素需要吸收增强剂。然而，某些用于直肠药物输送的增强剂可能会引起粘膜的刺激和损伤。蛋白酶抑制剂通过最小化蛋白质降解来增强直肠生物利用度。使用前药可以保护蛋白质免受肽酶和粘膜酶的降解，从而提高蛋白质和肽的吸收。基于纳米技术的药物制剂方法进一步帮助通过直肠给药途径提高蛋白质药物的输送。 5.制剂技术 5.1.水凝胶和原位形成凝胶 水凝胶是由交联的亲水性和生物相容性聚合物组成的三维聚合物网络，由于它们与水的热力学相容性而在水性介质中膨胀，具有多种临床应用。这些应用包括隐形眼镜、生物传感器、组织工程组件和药物输送载体。水凝胶有助于更安全、更舒适地输送蛋白质药物。用于蛋白质输送水凝胶的著名聚合物包括2-羟乙基甲基丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酸（MAA）、聚（乙二醇）（PEG）和聚（乙烯醇）（PVA）。 基于水凝胶的颗粒制剂以活性状态释放蛋白质，并至少维持三个月的治疗浓度。水凝胶是在生理条件下不溶于水并在水性介质中显著膨胀的聚合物材料，通过交联形成。交联涉及共价连接聚合物主链，有时包括强非共价相互作用，防止聚合物完全溶解。基于亲水性聚合物的水凝胶吸收水分，由于高水分含量，使其网络膨胀，使它们具有生物相容性并适合组织再生。然而，尽管在药物输送中具有潜在优势，但由于水凝胶的高水分含量，设计延长药物释放的制剂变得具有挑战性。 水凝胶的机械性能在制药应用中至关重要。调整水凝胶交联程度是必要的，因为更高的交联会产生更强但更脆的结构。共聚产生既坚固又弹性的水凝胶。生理刺激，如pH值、离子强度和温度，通常用于设计水凝胶。响应性水凝胶根据环境刺激改变其膨胀行为、网络结构、渗透性和机械强度。pH触发的药物释放系统在恶劣的胃环境中保护蛋白质，促进更有效的口服输送。带有在pH变化响应下电离的基团的离子水凝胶导致水凝胶网络膨胀，称为pH响应水凝胶。 纳米凝胶是交联聚合物纳米粒子，其流体动力学尺寸范围在10到100纳米之间，分散在水性介质中，同时保持其固定构象，提供量身定制的属性。它们可以控制其规模、表面电荷、网络密度和化学功能团，以满足特定的结构和功能需求。 用于鼻输送的与高度亲水性和多功能纳米凝胶共价结合的胰岛素分子显示出有希望的结果。与胰岛素共价结合的基于聚（N-乙烯基吡咯烷酮）的纳米凝胶穿过血脑屏障，在鼻内给药后显示出对淀粉样蛋白ß诱导的功能障碍的神经保护作用，与游离胰岛素相比。 5.2.纳米粒子 纳米粒子通过将蛋白质封装在聚合物基质中，以10-1000纳米的尺寸范围增加蛋白质在胃肠道中的物理化学稳定性。作为口服蛋白质载体，无毒、无免疫原性的纳米粒子至关重要。它们在胃肠道中的吸收、分布、消除和体内作用中发挥关键作用。小于100纳米的纳米粒子更容易通过肠粘膜吸收，而大于500纳米的吸收率显著降低。纳米粒子表面的定制配体可以靶向受体介导的运输途径。 纳米粒子可以通过局部、眼周、脉络膜上或玻璃体内输送。然而，纳米粒子的玻璃体内注射可能会导致由于聚合物颗粒的光散射特性而引起的玻璃体混浊。输送蛋白质纳米制剂的挑战包括生物活性的丧失、由于与纳米粒子基质的相互作用而导致的低蛋白稳定性，以及全面的纳米封装方法，限制了使用纳米粒子的眼部输送系统的开发。 纳米粒子的制备利用天然和合成聚合物。常见材料包括聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、壳聚糖、明胶、聚甲基丙烯酸甲酯和聚烷基氰基丙烯酸酯。壳聚糖是由葡萄糖胺和N-乙酰葡萄糖胺组成的脱乙酰壳聚糖共聚物，由于其生物相容性、粘膜粘附性和低毒性，成为蛋白质输送载体的极好选择，通过打开紧密连接来提高细胞摄取。 海藻酸盐是一种天然阴离子聚合物，作为制药工业中常用的药物载体。其阴离子表面电荷在与阳离子材料静电相互作用时促进凝胶形成。然而，海藻酸盐珠的高孔隙度通常导致药物泄漏。将海藻酸盐与壳聚糖或右旋糖酐硫酸盐等物质结合可以缓解这个问题。 各种合成聚合物以及基于天然聚合物的纳米粒子，作为蛋白质药物的口服输送载体。代表性聚合物是聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），由乳酸和乙醇酸形成，创建了一个名为PLGA的开环共聚物。其出色的生物可降解性和生物相容性使PLGA成为口服蛋白质输送的杰出药物输送工具。 对谷胱甘肽敏感的氧化还原激活纳米载体，作为细胞氧化还原调节剂，被提出作为药物和基因输送的有效机制。 近年来，使用纳米粒子通过鼻腔输送蛋白质药物引起了极大的兴趣。粘膜粘附性纳米粒子，特别是，倾向于在鼻腔中停留更长时间。壳聚糖纳米粒子已广泛研究用于通过鼻腔输送胰岛素。其正电荷使与鼻粘膜膜的接触时间延长，从而增强胰岛素的生物利用度。壳聚糖-N-乙酰-L-半胱氨酸纳米粒子和聚乙二醇-g-壳聚糖纳米粒子的鼻内给药显示出胰岛素生物利用度的改善。在鼻内疫苗接种中，壳聚糖、PLGA和聚苯乙烯聚合物纳米粒子在抗原吸收方面证明是有效的。三甲基壳聚糖纳米粒子延长了抗原的停留时间，提高了IgA和IgG的效率。同样，粘膜粘附性壳聚糖纳米粒子的鼻内给药显著改善了大脑中神经生长因子的吸收。 聚合物纳米粒子因其生物相容性和表面修饰及共聚的便利性，通常被用作肺部药物递送的载体。在天然聚合物载体中，壳聚糖、海藻酸盐和明胶较为常见。在合成纳米载体用于肺部药物递送的领域中，泊洛沙姆、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚乙二醇脱颖而出，成为最常用的材料。 聚合物纳米粒子和基于聚合物的热凝胶方法在眼科药物递送中证明是有益的。 碳纳米管，是圆柱形的碳结构，具有独特的物理化学性质，表面容易操作，属于富勒烯家族。由于其出色的机械性能、高热导率和穿透细胞膜的能力，这些纳米管非常适合用于靶向或控制药物递送、生物传感和生物成像。 纳米粒子表现出脂质流动性特性，通过改变角质层中的细胞外脂质影响皮肤渗透性。 脂质基纳米载体，如脂质体、固体脂质纳米粒子和纳米结构脂质载体，已被广泛研究用于眼科蛋白质递送。延长药物释放可能有助于减少与多次玻璃体内注射相关的眼部并发症风险，如玻璃体出血、眼内炎、视网膜脱离和白内障。 固体脂质纳米粒子提供了多种优势，包括物理稳定性、靶向性、控制释放、快速放大和非毒性，这归功于它们由生理脂质组成。它们通过角膜增强药物吸收，从而增加水溶性和脂溶性药物的眼部生物利用度。 尼奥斯姆，是由非离子表面活性剂自组装形成的纳米囊泡，类似于脂质体，因其化学稳定性、生物可降解性、生物相容性、无免疫原性和低毒性而更受青睐，用于局部眼科药物递送。它们展现出结构灵活性，可以包裹脂溶性和水溶性药物。由于添加了Solulan C24（非离子表面活性剂），Discomes这种尼奥斯姆具有较宽的结构（12-16毫米），对眼科给药有利，由于其大小和形状，可以防止排入系统池，舒适地适应眼睛的陷凹。然而，它们的发展仍处于初期阶段。 尽管聚合物纳米粒子在各种递送途径中显示出好处，但在开发用于直肠给药方面进展有限。用于直肠药物递送的聚合物纳米粒子常用材料包括壳聚糖及其衍生物，如PLGA、PLA和甲基丙烯酸共聚物。这些纳米粒子的表面修饰提供了额外的好处，如位点特异性或延长循环时间。 纳米尺寸的脂质体被用于大分子的直肠给药，一些研究正在研究脂质体配方。对于粘膜免疫，建议使用更新的含有乙型肝炎表面抗原的纳米脂质体，由1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱双层包裹固体脂肪中心（主要是甘油三棕榈酸酯）并使用单磷酸脂A作为佐剂，含有乙型肝炎表面抗原用于粘膜免疫，在大鼠经结肠给药后显示出更高的稳定性和显著的体液和细胞免疫反应。固体脂质纳米粒子也被用于直肠药物递送，但尚未提供其优于传统配方的证据。 考虑到角质层的疏水性质，脂溶性载体中的纳米载体应有效地穿透它。纳米乳液是通过高压均质化、相位反转温度和微流体化产生的，由两个不相溶的液体相组成的低粘度各向同性分散系统。它们的主要缺点在于由于热力学不稳定的性质，在长期储存期间物理不稳定。通过优化粒径和表面活性剂组成，纳米乳液达到亚稳态。虽然由于其不稳定性，在经皮抗原递送中不太常见，但纳米乳液在用作纳米分散体时，在经皮免疫中显示出前景。 聚合物胶束，尺寸在10到100纳米之间，由形成亲水链外壳和疏水链核心的两亲性嵌段共聚物组成。它们在水介质中自组装，在浓度超过其临界胶束浓度时形成有序的超分子结构。Poloxamer 407、Poloxamer 188、甲氧基聚（乙烯）-聚（己内酯）、聚（丁二烯氧化物）-聚（乙烯氧化物）-聚（丁二烯氧化物）、聚羟乙基天冬酰胺和异丙基丙烯酰胺是一些用于创建聚合物胶束以进行眼部分布的聚合物。 树枝状分子，是能够捕获和结合高分子量分子的小聚合物载体，展现出具有良好定义、均匀和单分散的径向对称性的树状结构。常用的树枝状分子包括聚酰胺胺、聚胺、聚酰胺（多肽）、聚（芳基醚）、聚酯和碳水化合物。 5.3.脂质体 脂质体作为载体，将蛋白质包裹在水核内，增强蛋白质药物的膜通透性。脂质体与细胞膜的结构相似，有助于肠道吸收。然而，由于在胃肠道中的化学和酶稳定性，它们作为口服蛋白质载体存在缺点。为了解决稳定性问题，表面涂层对于脂质体中的口服药物递送至关重要。各种方法，如使用与细胞膜上特定受体相互作用的配体改变脂质体表面，呈现出有希望的可能性。凝集素，一种植物衍生的糖蛋白，是与粘膜碳水化合物受体特异性结合的潜在配体。 脂质体，由磷脂双层构成的囊泡，在其水核或双层结构内包裹亲水和疏水化合物。这些磷脂分子由于其两亲性质，在水分子中分子排列，将亲水的磷酸头基暴露在水环境中。在烃链连接后，形成脂质膜。在加水搅拌后，这层脂质膜转变为覆盖的囊泡。脂质体可以是单层（单室）或多层（多层），小单室囊泡的尺寸范围为20-100纳米，大单室囊泡（大单室囊泡）的尺寸范围为100-1000纳米。生产脂质体的方法包括干脂水合、冷冻-解冻挤出、反向蒸发和双重乳化。主要步骤包括脂质膜水合、机械分散以形成脂质体和溶剂去除。虽然通常使用剧烈摇动，但它导致多分散的多层囊泡。通过狭窄孔口挤出可以操纵脂质体尺寸，以产生单分散的小单室囊泡脂质体。脂质体制备过程中的几种物理压力，包括热、有机溶剂和搅拌，可能会影响蛋白质稳定性。 脂质体聚合物颗粒中的蛋白质表现出延长释放。双层解稳导致脂质体破裂，释放包裹的药剂。像磷脂头基的质子化和酸催化的双层水解这样的过程有助于体内生物层解稳，从而改变药物的动力学概况。表面PEG化减少了与生物流体的蛋白质相互作用，防止脂质体聚集并增强稳定性。 Archaeosomes，一种从各种古细菌的极性脂质衍生的基于脂质的口服递送系统，具有在极端条件下稳定的独有结构特征，包括高温、不同pH水平以及在磷脂酶和胆汁盐的存在下。这种改善的胃肠道稳定性潜力使得它们作为蛋白质载体，包括疫苗中蛋白质载体的使用引起了相当大的兴趣。药物载脂质体的鼻腔给药已被证明在鼻内分布生物制药和肽方面有效，促进了通过纳米粒子的直接鼻到脑药物递送。 脂质体是将治疗剂递送到皮肤中非常有效的载体，因为它们与皮肤脂质的相同成分。它们被表皮迅速吸收，达到深层皮肤。此外，水合层通过脂质体双层与角质层内细胞脂质的分子混合增强吸收。 通过在脂质体中包裹蛋白质，开发了一种非侵入性大分子经皮递送系统。先进的脂质体增加了大分子通过角质层的渗透，克服了通过皮肤进行药物递送的限制。为了增强大分子进入皮肤，脂质体配方被整合到溶解微针阵列中。 脂质体作为蛋白质药物的高效肺部载体脱颖而出，因为它们增强和持续的药物释放、生物相容性、生物可降解性和非免疫原性。通过脂质体改变药物的物理化学性质（增加疏水性）和减少粘液纤毛清除，可能通过增加表面粘度增强药物通过肺泡上皮的渗透。这导致了脂质体配方的开发，用于将蛋白质药物递送到肺部。 除了脂质体，固体脂质纳米粒子（SLN）也被研究为通过肺上皮递送生物制药的载体。例如，含有SLN的喷雾干燥粉末解决了惯性低的问题，防止纳米粒子在肺部沉积。 6.总结 药物递送需要一种剂量形式，以预定的速率和浓度将活性分子递送到作用部位。生物制药产品，作为在各种给药环境中不稳定的大分子，通常依赖于肠外途径。与化学产品不同，生物制药产品的安全性和有效性在很大程度上取决于应用的配方和制造技术。探索新的给药途径的研究旨在扩大生物制药应用。本章概述了各种类别的生物制药的模型配方。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。