Glycine

中文摘要 目的   建立邻苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）柱前衍生化反相高效液相色谱法（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）并验证，以检测百日咳抗原中间产物中氨基酸的含量。 方法   采用OPA柱前衍生化RP-HPLC检测百日咳抗原中间产物百日咳毒素脱毒液中L-天冬氨酸钠盐、丝状血凝素脱毒液中甘氨酸及黏附素脱毒液中L-赖氨酸的含量，并对该方法的专属性、系统适用性、线性、准确度、耐用性、检测限和定量限进行验证。 结果   OPA柱前衍生化RP-HPLC检测配置溶液，对照品和供试品溶液可见对应的氨基酸色谱峰，供试品溶液的保留时间和峰面积相对标准偏差均小于2.0%。氨基酸浓度在5~100 μg/ml时，浓度与峰面积线性关系良好，检测氨基酸样品的加标回收率均在80%~120%之间。用磺基水杨酸和盐酸稀释剂处理供试品后，2种稀释剂检测值之间的相对误差在±5%范围内。定量限为5 μg/ml，检测限为2 μg/ml。 结论   成功建立了检测百日咳抗原中间产物中氨基酸含量的OPA柱前衍生化RP-HPLC检测方法，该方法的专属性、系统适用性、线性、准确度、耐用性良好。 正文 百日咳是由百日咳鲍特菌感染引起的急性呼吸道传染病，严重时可导致婴幼儿死亡，百日咳疫苗的大规模使用能够显著减少该疾病的发生。根据工艺的不同，百日咳疫苗分为全细胞和无细胞百日咳疫苗（acellular pertussis vaccine, aP），aP由百日咳抗原，包括丝状血凝素（filamentous haemagglutinin，FHA）、百日咳毒素、黏附素及菌毛蛋白等组分组成。在生产过程中，百日咳毒素纯化液经PBS和甘油稀释后，使用L-天冬氨酸钠盐和戊二醛脱毒，得到百日咳毒素脱毒液；FHA纯化液用PBS稀释后，使用甘氨酸和甲醛脱毒，得到FHA脱毒液；黏附素纯化液用碳酸盐缓冲溶液稀释后，使用L-赖氨酸和戊二醛脱毒，得到黏附素脱毒液。目前，关于组分百日咳抗原中间产物中氨基酸含量的衍生化分析方法主要包括异硫氰酸苯酯法、2，4-二硝基氟苯法、邻苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）柱前衍生化反相高效液相色谱法（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）等。 OPA柱前衍生化RP-HPLC检测技术制备简单、反应迅速、灵敏度高，但需要及时进样。OPA在室温下巯基乙醇环境中，与一级氨基酸反应生成具有强荧光性的异吲哚衍生物。OPA本身不散发荧光，在色谱分离时不会形成干扰峰。OPA柱前衍生化RP-HPLC检测方法使用自动进样器进行在线衍生，可以精确控制衍生反应的时间，有效避免衍生反应时间变化对测定结果的影响。本研究拟对OPA柱前衍生化RP-HPLC检测方法的流速和洗脱程序进行优化，并对百日咳抗原中间产物中的L-天冬氨酸钠盐、FHA脱毒液中甘氨酸及黏附素脱毒液中L-赖氨酸共3种氨基酸的含量进行检测，旨在为类似产品中氨基酸含量的检测提供依据。 1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂 LC-20AD型高效液相色谱仪、AJS-02色谱柱（规格：150 mm×4.6 mm，3 μm）均购自日本岛津公司；5430R型离心机购自美国Eppendorf公司。 赖氨酸和L-天冬氨酸钠盐均购自美国Sigma公司，甲醇、乙腈均购自德国默克公司，磺基水杨酸和盐酸均购自北京益利精细化学品有限公司，OPA衍生试剂购自日本岛津公司，甘氨酸、磷酸、十二水合磷酸氢二钠和十水合四硼酸钠均购自国药集团化学试剂有限公司。0.22 μm聚偏氟乙烯〔poly（vinylidene fluoride），PVDF〕滤膜购自天津津腾实验设备有限公司。 1.2 供试品 百日咳毒素脱毒液（批号：20211213）、FHA脱毒液（批号：20211214）、黏附素脱毒液（批号：20211216）均由北京民海生物科技有限公司制备。 1.3 OPA柱前衍生化RP-HPLC检测方法的建立 1.3.1   溶液配制   流动相A：分别称取9.0 g十二水合磷酸氢二钠和9.5 g十水合四硼酸钠，加超纯水溶解，加入0.1 mol/L 盐酸调pH至8.0，加超纯水至2 L，混匀。流动相B：分别量取900 ml甲醇和900 ml乙腈，加超纯水至2 L，混匀。OPA衍生试剂：取OPA衍生试剂A液1支，加入OPA衍生试剂B液60 μl，混匀。稀释剂：取超纯水100 ml，加磷酸500 μl，混匀。对照品溶液：分别吸取不同体积的1 mg/ml L-赖氨酸储备液、1 mg/ml甘氨酸储备液、1 mg/ml L-天冬氨酸钠盐储备液及纯化水，混匀，配制各氨基酸终浓度分别为5、20、40、60、80和100 μg/ml的对照品溶液。系统适用性溶液：分别吸取1 mg/ml L-赖氨酸储备液、1 mg/ml甘氨酸储备液、1 mg/ml L-天冬氨酸钠盐储备液各40 μl及880 μl纯化水，混匀。 1.3.2　供试品溶液处理　使用1.5%磺基水杨酸溶液稀释供试品百日咳毒素脱毒液，稀释15倍；使用1.5%磺基水杨酸溶液分别稀释FHA脱毒液、黏附素脱毒液，均稀释2倍。室温条件下静置2 h，取溶液1 ml，14 000×g离心10 min，取上清液并用0.2 μm PVDF滤膜过滤后注入玻璃样品瓶。平行进样2次。同时将1 ml纯化水注入HPLC玻璃样品瓶作为空白溶剂。 1.3.3　色谱条件　采用OPA柱前衍生化检测法检测供试品溶液，先采用在线衍生法将空白溶液、系统适用性溶液、对照品溶液或供试品溶液进行衍生后进入色谱柱进行分离，具体步骤为：分别取15 μl硼酸盐缓冲液、2 μl供试品或对照品、2 μl OPA衍生试剂和12 μl水、20 μl稀释剂混匀，静置0.5 min后上样。HPLC检测的具体参数设定如下：色谱柱为AJS-02（规格：150 mm×4.6 mm，3 μm），流速1.0 ml/min，检测波长为338 nm，进样量2 μl，柱温40 ℃，流动相包括流动相A和流动相B，具体洗脱程序见表1。 1.4 方法验证 1.4.1　专属性　取空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液按照1.3.3方法上样，记录色谱图。可接受标准：空白溶剂中的3种氨基酸不出峰，阳性对照（系统适用性）溶液出现3种氨基酸对应的色谱峰，供试品黏附素脱毒液的色谱图中出现L-赖氨酸对应色谱峰，供试品FHA脱毒液溶液中出现甘氨酸对应色谱峰，供试品百日咳毒素脱毒液中出现L-天冬氨酸钠盐对应色谱峰。 1.4.2　系统适用性　取1.3.1制备好的系统适用性溶液，按照1.3.3的方法连续上样5次，记录L-赖氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸钠盐溶液的色谱图、峰面积及保留时间。可接受标准：各氨基酸保留时间和峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均不高于2.0%。 1.4.3　线性与范围　分别取5、20、40、60、80和100 μg/ml的L-赖氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸钠盐对照品溶液，按照1.3.3的方法上样，进行3次试验。以标准溶液浓度为x轴，氨基酸的峰面积为y轴，建立回归曲线，计算决定系数（R2）。可接受标准：R2≥0.99。 1.4.4　准确度　取FHA脱毒液0.5 ml，分别加入浓度为10、40和70 μg/ml的甘氨酸储备液进行混合；将百日咳毒素脱毒液用1.5%磺基水杨酸稀释15倍后，取0.5 ml分别加入浓度为10、40和70 μg/ml 的L-天冬氨酸钠盐储备液混合；将黏附素脱毒液用1.5%磺基水杨酸稀释2倍后，取0.5 ml分别加入浓度为10、40和70 μg/ml 的L-赖氨酸储备液混合。将以上混合液按照1.3.3的方法进行上样，并按下列公式计算回收率。可接受标准：回收率在80%~120%之间。 1.4.5　检测限和定量限　分别配置2、3、5、10 μg/ml的L-赖氨酸、甘氨酸和L-天冬氨酸钠盐对照品溶液，按照1.3.3的方法进样，确定氨基酸含量检测方法的检测限和定量限。可接受标准：以上检测限检测值的信噪比均大于3，以上定量限检测值的信噪比均大于10，且定量限对应浓度的氨基酸溶液的回收率在80%~120%之间。 1.4.6　耐用性　将供试品百日咳毒素脱毒液、FHA脱毒液和黏附素脱毒液分别用1.5%磺基水杨酸和0.1 mol/L盐酸稀释5倍，按照1.3.3的方法进样后，分析2种稀释剂稀释供试品后检测值之间的相对误差，计算公式如下。可接受标准：2种稀释剂稀释供试品后检测值之间的相对误差在±5%之内。 2 结果 2.1 专属性 如图1所示，空白溶剂中无氨基酸对应色谱峰，阳性对照溶液可见3种氨基酸色谱峰：L-天冬氨酸钠盐对应色谱峰在约2.0 min时出现，甘氨酸对应色谱峰在约9.3 min时出现，L-赖氨酸对应色谱峰在约22.1 min时出现。黏附素脱毒液的色谱图中可见L-赖氨酸对应色谱峰，FHA脱毒液的色谱图中可见甘氨酸对应色谱峰，百日咳毒素脱毒液的色谱图中可见L-天冬氨酸钠盐对应色谱峰，以上结果均符合要求，表明该方法具有良好的专属性。 2.2 系统适用性 结果见表2，系统适用性溶液连续上样5次的L-赖氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸钠盐溶液保留时长的RSD均在0.1%~0.4%之间，峰面积的RSD均在0.2~0.5%之间，均小于2.0%，均符合要求，表明该方法具有良好的系统适用性。 2.3 线性与范围 试验结果发现，L-赖氨酸、甘氨酸、 L-天冬氨酸钠盐3种氨基酸溶液的浓度在5~100 μg/ml时，3次试验标准曲线的R2均大于0.99，符合要求，表明该方法在5~100 μg/ml范围内浓度与峰面积呈现良好的线性关系。 2.4 准确度 通过分析上样结果，发现对百日咳毒素脱毒液进行L-天冬氨酸钠盐加标试验时，3个不同加标浓度10、40、70 μg/ml的回收率分别为101.6%、98.2%和99.0%；对FHA脱毒液进行甘氨酸加标试验时，3个不同加标浓度10、40、70 μg/ml的回收率分别为109.9%、101.0%和99.6%；对黏附素脱毒液进行L-赖氨酸加标试验时，3个不同加标浓度10、40、70 μg/ml的回收率分别为99.8%、98.9%和101.2%。以上回收率均在可接受标准范围内，表明该检测方法的准确度良好。 2.5 检测限和定量限 不同浓度氨基酸溶液检测结果的信噪比见表3。检测结果显示，L-天冬氨酸钠盐、甘氨酸和L-赖氨酸的浓度为2 μg/ml时，所对应的信噪比均大于3，可作为检测限；L-天冬氨酸钠盐、甘氨酸和L-赖氨酸的浓度为5 μg/ml时，所对应的信噪比均大于10，且该浓度3种氨基酸溶液的回收率均在96.8%~104.9%之间，符合要求，将该浓度作为定量限。 2.6 耐用性 结果见表4，2种稀释剂处理供试品后相对误差在﹣2.1%~3.3%之间，在可接受范围内，说明这2种稀释剂稀释供试品后对其中氨基酸含量检测基本无影响，此检测方法的耐用性良好，考虑对高效液相色谱仪及色谱柱的维护，选择使用1.5%磺基水杨酸处理样品更为合适。 3 讨论 氨基酸的检测方法有分光光度法、化学法、色谱法等。其中，氨基酸的高效液相色谱分析方法主要分为直接分析和间接分析2种。直接分析法包括蒸发光散射检测法和高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法；间接分析法有柱前衍生法和柱后衍生法。柱前衍生法分析氨基酸，使用的衍生试剂主要有OPA、异硫氰酸苯酯、二硝基氟苯、9-氯甲酸芴甲酯、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯和丹磺酰氯等。本法采用OPA对样品进行柱前衍生后，进行氨基酸检测。 田志伟等的研究中采用OPA柱前衍生法检测人免疫球蛋白中甘氨酸含量，张亿等同样采用OPA柱前衍生法检测复方制剂中盐酸赖氨酸含量。盛凤仙和张幼捷采用OPA柱前衍生法检测人凝血酶制品中甘氨酸的含量，采用手动衍生法；目前尚无疫苗相关产品中多种氨基酸同时检测的方法报道。 本研究结果显示，OPA柱前衍生法检测3种氨基酸（L-天门冬氨酸钠盐、甘氨酸和L-赖氨酸）系统适用性良好；检测限为2 μg/ml，定量限为5 μg/ml；在5~100 μg/ml范围内线性关系良好，R2大于0.99，准确度良好，可应用于百日咳抗原中间产品百日咳毒素脱毒液中L-天冬氨酸钠盐、FHA脱毒液中甘氨酸及黏附素脱毒液中L-赖氨酸含量的同时检测。该法减少了流动相的使用量，降低了系统压力并且提高了工作效率，也为其他生物制品中氨基酸的检测提供了参考。 作者 聂晓齐1,2  杜闪2  朱留强2  王艺霞2  王斌2  张钰东2  邓海清2  尹珊珊2  韩飞1 1沈阳药科大学药学院, 沈阳 110016；2北京民海生物科技有限公司研发四室, 北京 102629 聂晓齐和杜闪对本文有同等贡献 通信作者： 尹珊珊, Email: yinshanshan@biominhai.com； 韩飞, Email: hanfei_spu@163.com 引用本文：聂晓齐, 杜闪, 朱留强, 等. 组分百日咳抗原中间产物中氨基酸含量的邻苯二甲醛柱前衍生化RP-HPLC检测 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(3): 145-150.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230824-00007 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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摘要：大型分子抗体生物制剂因其卓越的目标特异性、药代动力学和药效学特性、安全性和毒性概况以及多样化工程的适应性，已经彻底改变了医学领域。在这篇综述中，我们重点关注临床前抗体的可开发性，包括其定义、范围以及从候选物到领先优化和选择的关键活动。这包括生成、计算和模拟方法、分子工程、生产、分析和生物物理特性、稳定性和强制降解研究以及流程和配方评估。最近，显然这些活动不仅影响领先选择和可制造性，而且最终与临床进展和成功相关。作为可开发性成功的蓝图，我们探索了新兴的可开发性工作流程和策略，包括对影响所有可开发性结果的四大分子属性的概述：1）构象，2）化学，3）胶体，和4）其他相互作用。我们还检查了风险评估和缓解策略，这些策略增加了将正确候选物带入临床的可能性。 1.引言 生物制剂的发现和开发，特别是抗体和工程化抗体模式，在过去几十年中得到了扩展，目前全球市场上有100多种抗体生物制剂，大约有1000种研究性分子正在进行临床试验。蛋白质和抗体治疗成功针对的治疗适应症包括免疫肿瘤学、心血管、感染性和自身免疫疾病，以及神经退行性适应症。此外，抗体适合工程化以增强多功能性并产生极其多样化的特性，包括多特异性靶向、增强或降低效应功能、增加半衰期。单克隆抗体可以通过选择技术、筛选和工程化设计来增加目标结合并增强可开发性特性。成功的可开发性对领先优化和选择至关重要，并确保强大的处理、稳定性、传递、给药、药代动力学（PK）/生物利用度、安全性，并且与临床成功率相关。 抗体产生和筛选后，关键的临床前可开发性活动包括分子工程、计算和模拟评估、生产、分析和生物物理特性、稳定性和强制降解研究以及流程和配方评估。我们还讨论了适当的分析方法及其使用时机。在可开发性评估中遇到的常见问题和风险，如聚集、自相互作用、疏水性、去酰胺化和氧化，进行了探讨。几个非可开发性活动对大分子发现和开发至关重要，如功能性生物测定法的开发、生物标记物开发、PK/药效学研究和体内疗效，这些可能影响领先选择。然而，这些活动不是这篇综述的重点。在这里，我们将可开发性属性定义为与分子固有属性相关或受其影响的任何事物，与影响领先选择、开发甚至安全性和有效性的靶标生物学和作用机制的效果区分开来。影响所有可开发性属性和结果的分子属性在此被组织为四大类别：1）构象，2）化学，3）胶体，和4）其他相互作用。这些分子类别或属性的定义以及用于审查它们的分析方法和关键标准的例子。最近显然，这些属性不仅影响化学、制造和控制（CMC）属性和结果，还影响给药后现象。我们还检查了可开发性风险评估和缓解策略，这些策略对每种分子都是独特的，并受到负债的性质和数量以及潜在缓解措施的影响。总体而言，这篇综述侧重于大分子或蛋白质可开发性，特别适用于液体配方的单克隆抗体（mAbs）及其工程版本，这是治疗适应症的首选大分子。 尽管其他模式，如抗体-药物偶联物（ADCs）和/或蛋白质-寡核苷酸偶联物，可能提供额外的治疗益处以及可开发性和开发挑战，但它们不在这篇综述的范围之内。 2.抗体产生 2.1.领先到领先 治疗性抗体的临床前可开发性包括使用结合和/或活性评估对产生的领先分子进行初步筛选。然后，在瞬态真核表达和纯化后，进一步筛选这些分子以进一步评估相关的物理化学特性。图1显示了与分子可开发性相关的主要临床前活动流程图，包括领先或抗体产生。虽然抗体产生本身通常不被视为核心可开发性活动，但它肯定可以影响分子属性的范围，因此影响可开发性结果。在进行可开发性评估时，考虑使用的方法是很重要的，无论是小鼠免疫（随后进行杂交瘤筛选）、噬菌体或酵母展示技术，还是合成库。不同的选择技术可能在抗体属性方面产生不同的结果。例如，噬菌体展示产生可能会增加可开发性问题的可能性，如降低溶解度、增加疏水性和增加非特异性导致半衰期差。这些结果可能源于噬菌体选择的多轮，这是为了产生高亲和力分子，但也可能在互补决定区（CDRs）中积累过多的电荷或疏水性，导致更差的可开发性结果。此外，在噬菌体展示中，非特异性结合并不像在动物免疫方法中那样是一个重要的选择压力，后者中产生的抗体被排除用于自身免疫。为了弥补这种自然选择的缺乏，可以在噬菌体展示筛选过程中手动排除疏水CDRs，或者可以采取额外的选择措施来筛选出未折叠或不稳定的可变域。 图1. 示意图突出了大分子治疗性抗体可开发性的各个发现和早期开发阶段。也列出了后期CMC开发的关键交付物。 同样，酵母展示亲和成熟通常增加了疏水性、聚集率和自相互作用倾向，因为结合像在噬菌体展示中一样被迭代最大化。然而，使用酵母展示的一个主要优点是存在真核蛋白质生产机制，需要维持翻译后修饰。此外，存在选择酵母展示变体增加热稳定性的策略。为了增加候选多样性，可能会进行多次领先产生活动，因为一种方法可能在结合、序列和可开发性配置文件方面产生高冗余。理想情况下，应该产生具有多样化结合亲和力和抗原表位的抗体，以最大限度地增加获得具有理想功效、安全性和作用机制的区分抗体的可能性。此外，从这样一个多样化的抗体池中，可以选择和/或进一步优化具有有利可开发性配置文件的抗体。抗体候选物种交叉反应性也是一个重要考虑因素，可能需要单独产生活动以生产动物研究的物种特异性替代品，特别是啮齿动物。 通过小鼠或大鼠免疫产生的抗体通常需要前期的工程化和人源化处理，这将大大增加初始候选物的筛选和特性分析的数量。总体而言，抗体的人源化提出了挑战，例如需要额外的耗时的体外筛选变体和增加的免疫原性风险。建议在解决主要负债的计算和纠正的同时，针对共识人类种系进行人源化，以避免后期需要纠正的严重负债，从而延误选择工作。主要负债被视为潜在严重的化学或物理化学负债。主要负债因素包括位置，特别是负债是否位于可变框架或更令人担忧的可变CDR区域，以及潜在的严重程度，其中流程和配方措施不太可能可接受地减轻风险，给药后的降解将显著，和/或对活性和/或功能有显著影响。应该最初排除或在计算中纠正有问题的主要序列基序，特别是那些含有游离半胱氨酸、共识天冬酰胺糖基化位点（Asn或N后跟XS/T）除保守的N297糖基化外，以及NG去酰胺化基序。 如果潜在修饰的位置在可变CDR区域并且可能影响目标结合或活性，这一点尤其正确。尽管评估人源化变体和化学负债纠正变体进一步扩大了初始筛选工作，但稍后可能会揭示具有减少免疫原性和较少负债的更可开发的候选物。如果需要多特异性格式化，则早期候选物的数量进一步增加，通常首先筛选单价、双价抗体，然后进行多特异性格式化和定制的几轮。所需的或可用的格式，例如抗原结合片段（Fab）、单链可变片段（scFv）或来自羊驼免疫的可变重链抗体片段（VHH），也是一个重要的考虑因素。除此之外，还有许多其他多特异性格式。这样大量的抗体模式工具箱，除了它们如何不对称地排列成多特异性，确实可以创建大量的构造来评估。在实践中，可开发性筛选漏斗可以从领先优化和选择中扩大和收缩，如图2所示。为了减少需要筛选的抗体变体的总数，免疫转基因、人源化动物，如Trianni小鼠，可以产生完全人类抗体并绕过体外人源化的需要。然而，需要在这一代技术中进行大量投资，并且完全人类mAbs也可以通过其他技术产生，如噬菌体展示和单一人类B细胞克隆。根据所需的效应功能和作用机制，还可以评估各种同种型，通常是IgG1或IgG4，或调节其效应功能的变体。 图2. 展示了一个假想的抗体发现和可开发性活动的各个发现阶段的示意图。最终，可能数百或数千个候选物被筛选成相对较少的、有利的候选物。然而，在这个过程中，随着从之前选择的候选物中以迭代方式创建额外的变体、结构、负债纠正或多特异性框架，选择漏斗可以扩大和缩小。在左侧（黑色字体）是可开发性活动，如筛选、工程和选择，这些活动可能会增加来自优选子集的候选物数量，如在创建人源化或校正变体时的情况。在右侧（绿色字体）是采用的可开发性分析和评估，这些评估被分为不同的层级。在这个例子中，最初的命中通过有限的分析筛选出更有利的子集，包括高通量结合/活性、纯度、Tm/Tagg和计算评估（Tier 1测定）。为了筛选出较少的候选物，应该采用扩展特性测定，包括cIEF、HIC、DSC和自相互作用（根据通量需求和材料可用性，通过kDiff和/或AC-SINS），一个短期的、单时间点的加速稳定性保持以评估完整性，如果可用的话进行颗粒分析，以及非特异性测定（Tier 2测定）。随后，最终采用完整的可开发性评估，包括强制降解、完整的纯化过程和配方稳定性评估（Tier 3）。应当注意，当从之前的候选物创建变体（如人源化、格式化或校正）时，或者甚至测试新的批次时，应该重复前一阶段的分析或层级，以便为任何潜在的领先候选物获得完整的特性集（层级1-3）。对于每个阶段，建议的蛋白质材料量可能因样品准备和分析样品需求而异。 3.领先优化和选择 3.1.候选筛选 无论产生方法和领先数量如何，分子首先需要在亲和捕获后可接受地表达并具有可接受的纯度特性。筛选分子的基本工作流程通常从杂交瘤表达开始，然后是蛋白A（ProA）捕获，主要评估结合特性以及对不到一毫克（mg）材料的有限纯度和分析测试。更可行的候选物，可能在数十到数百的规模上，然后可以转移到瞬态中国仓鼠卵巢（CHO）表达以生产mg数量，然后通过ProA捕获并筛选高通量“Tier 1”测定（图2）。这些包括尺寸排除高效或超高效液相色谱（SE-HPLC/UPLC）、毛细管十二烷基硫酸钠电泳（cSDS）、表面等离子共振（SPR）的结合/活性，以及温度依赖的熔化和聚集（Tm/Tagg）评估。虽然表达和纯化通常可以在CMC开发后期进行优化，但瞬态表达和纯化材料的初始纯度和异质性问题可以表明不稳定或折叠不良的分子。对瞬态领先进行初始纯度和异质性评估至关重要，以早期发现潜在问题，例如在表达和/或亲和纯化期间发生的聚集和剪切倾向。SE-HPLC或UPLC建议用于初始评估聚集，这是CMC释放和稳定性质量属性，可能会导致给药后的免疫原性或降低效力。与分析SEC（或SEC-MALS）偶联的在线静态（多角度）光散射可以进一步表征或确认蛋白质聚集体的性质。虽然这是在未受压力的分子上进行的，但它们可能在亲和捕获前的培养上清或低pH ProA洗脱步骤中容易聚集。可以通过变性还原cSDS直接评估抗体主链剪切，并通过非还原cSDS直接解离域，这些是CMC关键纯度和质量属性。剪切可能是酸性或碱性催化或酶性质的，而抗体域解离通常源于未形成或断裂的域间二硫键。此外，剪切产物的存在可能会导致下游聚集和颗粒形成，这不仅影响药物产品属性，而且可能影响安全性和效力。cSDS阐明的其他常见表达杂质是表达期间形成的重链二聚体或由于轻链（LC）的降解性丢失。cSDS也可以阐明并量化多特异性表达中的同源二聚体和不匹配杂质。为了进一步完善候选物，建议还筛选温度依赖的解链（Tm），这通常伴随着补充的温度依赖的聚集（Tagg）。虽然在较低的过程和储存相关温度下的聚集倾向可能或可能不会反映在更高温度下，动力学驱动的解链中，但可能存在相关性，并且有选择候选物的提议指南。这是因为溶液中的聚集是一个复杂的现象，不仅仅通过动力学Tm测量来预测。应对这些最初表达的领先或首选子集进行体外结合SPR或基于细胞的测定，以验证结合或活性特性，并应假设各种杂质属性，如聚集和剪切，可能会影响结合或活性。一旦选择了理想的候选物，应在启动一系列工程和格式化、下游表达、纯化、扩展特性以及配方和稳定性研究之前，通过完整质量谱（MS）确认其身份。3.2.额外或扩展特性 在选择最终候选物之前，需要进行额外的特性分析，以最大化选择具有理想质量和可开发性特性的良好候选物的可能性。在整个过程中，将非可开发性工作，如体外功能测定和/或动物模型研究，纳入考虑也是至关重要的。重要的是要在功能属性和可开发性属性之间取得平衡，因为改变一个属性，如亲和力，可能会影响另一个属性，如稳定性，反之亦然。通常，各种领先分子及其变体在目标结合亲和力和表位方面可能相似，以及它们在功能测定中的输出。这对于具有相似序列的人源化变体和多特异性构造尤其如此，其中共享类似的结合臂，但构造可能在链长度、方向或格式（如Fab与scFv）上有所不同。在这些情况下，额外的可开发性特性提供了一个极好的机会，根据它们的物理化学属性进一步区分这些分子。这可以在几个到几十个领先上完成，这取决于生成活动以及是否需要人源化、负债纠正和/或多特异性格式化。表1提供了扩展特性可开发性测定、它们测量的属性及其理由的全面总结。此外，这些测定也显示在图2所示的假设可开发性工作流程图中，作为“Tier 2”测定，包括温度依赖的解链（Tm），最好通过热量测定，等电点（pI）和电荷异质性，疏水性，自相互作用，亚可见颗粒评估，以及多特异性或非特异性相互作用。还包括了一个短期稳定性保持以评估完整性作为Tier 2活动。 3.3.温度依赖性解链 为了进一步评估构象稳定性，差示扫描量热法（DSC）可以作为黄金标准来准确测量熔化温度（Tm）的起始点和转变。一个足够高的Tm可能表明在较低温度下具有良好的或可接受的构象稳定性。理想情况下，抗体治疗的Tm起始点应大于50°C，远高于标准的加速储存温度40°C以及生理温度。因此，可以预期感兴趣的分子在生理条件下在构象上是完整的，并且在没有过度的温度依赖性解链的干扰下经受加速压力。如前所述，Tm也可能与在过程条件下的聚集倾向、甚至颗粒形成倾向相关，在配方稳定性上，或者在经受各种强制降解条件时。然而，情况并非必然如此，因此当试图区分候选物时，应将其他属性与Tm一起权衡。 3.4.等电点 通过毛细管等电聚焦（cIEF）对电荷异质性的表征至关重要，以验证pI是否可接受，并将适应平台纯化和配方工作。抗体通常具有基本的pI，这导致在酸性配方中由于分子间固有的电荷排斥而具有有利的胶体稳定性。然而，pI过低的抗体可能难以从电荷相似的宿主细胞蛋白（HCPs）中纯化出来，并且在低pH值的代表性配方中配方，这种pH值平衡了构象、胶体和化学稳定性，通常商业mAbs的pH值约为6。此外，电荷异质性的差异与新生儿受体（FcRn）依赖的PK半衰期和效力的差异有关。过高的pI与不良的非FcRn依赖的PK和生物利用度结果有关，并且通过选择性工程化可变框架或CDR区域进一步降低pI在某些情况下改善了半衰期。同样，过度的可变域电荷与小鼠、猕猴和人类中的快速清除有关。由于配方中高pI抗体通常表现出优异的胶体属性，同时通过电荷介导的非特异性结合和清除呈现PK风险，因此在提名领先候选物时应平衡胶体属性与组织分布和PK风险，并避免可能挑战纯化和配方活动的低pI。因此，抗体基治疗的pI范围在7-9之间是适当的。 3.5.疏水性和自相互作用 疏水相互作用色谱（HIC）是评估领先分子疏水性和异质性的常用方法。高度疏水的分子可能有增加的聚集倾向，与其它表面或分子非特异性相互作用，或自相互作用。特别是，抗体可变域CDRs中的疏水斑块可能表现为负面的可开发性结果。作为额外特性的一部分，应评估分子的自相互作用，或胶体稳定性。自相互作用可能导致高粘度，特别是对于双价抗体，这会损害诸如泵送、灌装和过滤等过程步骤以及注射性，特别是皮下注射剂的注射性。评估小规模或中等规模（1-2毫克）的自相互作用的典型方法涉及使用动态光散射（DLS）测量流体动力学半径（Rh）和扩散相互作用参数（kDiff）。与DLS一样，静态光散射（SLS）方法可用于获得第二维系数（B22），这是自相互作用倾向的另一个指标。测量zeta电位或总表面电荷也是表征潜在自相互作用的一个选项。在非常小的微克（µg）规模上，使用亲和捕获自相互作用纳米粒子光谱（AC-SINS），一种基于抗体偶联的金纳米粒子的测定，通过UV吸收移位揭示自相互作用，已经成功进行了高通量的自相互作用评估。也有报道其他基于纳米粒子的测定可以预测粘度。随着材料可用性的增加，可以在更高浓度（100毫克/毫升或更高）下直接评估（动态）粘度，以确定自相互作用是否显著。 3.6.完整性和针对性强制降解 分子如何在过程和储存期间保持完整性可以在早期筛选期间通过进行短期加速稳定性保持的小规模努力来评估，这通常涉及有限数量的材料，通过在代表性配方中将样品在40-50°C下保持一周。应使用分析SEC和cSDS来评估基本完整性特性，如聚集和剪切。此外，如果在计算中预测显示可能潜在热点的主要化学负债，它们可以通过有针对性的强制降解来评估，然后再进行正式的稳定性和强制降解评估。例如，如果CDRs的主要序列评估揭示了N-去酰胺化基序，如NS，分子可以在更全面评估之前经受高pH压力，这将需要更多的时间、材料和单独的规模扩大表达。表2中列出了许多其他可以通过计算序列或同源模型评估的化学负债。 3.7.颗粒 可见和亚可见（蛋白质）颗粒分析也是CMC开发中的关键工作，并且与聚集一样，是生物制剂的关键质量属性（CQA），可能导致不必要的免疫原性。因此，在领先选择之前对未受压力和受压力样品上的颗粒形成进行评估是有价值的。典型的表征和量化亚可见蛋白质颗粒的方法使用光遮挡、流成像和更近期的基于膜的技术。然而，颗粒形成高度依赖于过程和配方，因此在未定义、扩大规模的下游过程、灌装完成和配方活动之前进行评估有局限性。具体而言，在制造过程中遇到的剪切、泵送、混合和摇动压力很难在下游过程开发之前模仿。此外，聚山梨酯（PS）-20或PS-80的添加主要在早期CMC活动中进行评估，并用于防止由于过程和运输相关的机械和搅拌压力而引起的聚集和颗粒形成。从本质上讲，颗粒分析在领先选择和CMC进入之前区分领先候选物可能很有用，但在最终过程和配方变量不明确时，不用于评估绝对颗粒计数。如果无法进行颗粒分析，基于吸光度的简单浑浊度测定可以作为不太敏感的替代品来监测颗粒形成。此外，通过SE-UPLC在热应力样品上早期评估可溶性聚集速率或通过DSC在各种配方中评估解链倾向，可能与某些治疗性抗体的颗粒形成倾向相关。 3.8.多特异性或非特异性 最后，评估分子与过程组分、配方辅料或体内其他生物分子的粘性或相互作用倾向，这可能影响PK和生物利用度，是非常有价值的。分子可能如何非特异性地结合到其他分子可以通过多特异性试剂（PSR）和杆状病毒粒子（BvP）测定和交叉相互作用色谱（CIC）来评估。值得注意的是，临床阶段抗体的有利PSR和BvP属性与临床阶段进展相关。同样，适当地，在毒理学和1期研究之前，在人体血清中对领先分子进行短期完整性或生物基质体外稳定性研究也是适当的。 3.9.额外特性 对未受压力的领先分子进行额外的特性分析也可能是必要的，并且有价值，例如测量可集中性（至150 mg/ml及以上）、在不同配方pH值和浓度下的粘度、在不同配方pH条件下的聚乙二醇（PEG）溶解度，以及在不同配方条件下的DLS相互作用参数。如果临床或商业目标产品档案（TPP）需要高浓度配方以支持高剂量或通过预充注射器进行皮下注射，这一点尤其关键，因为这些额外的活动旨在表征高度浓度依赖的抗体或蛋白质行为。此外，特定多特异性分子（如Duobodies）的游离巯基含量可以通过反相色谱、基于荧光的定量或MS来测量，以确定二硫键在组装期间是否正确形成，或调查由于二硫键断裂可能导致的稳定性问题。 3.10.最终领先选择和CMC进入 为确认用于研究性新药（IND）支持研究的最终领先候选物，该分子应对平台纯化和配方方法有适应性，并且具有可接受的稳定性和强制降解属性。这在图2中强调为“Tier 3”活动。适当评估和缓解重大可开发性问题和负债有助于确保对过程、产品质量、临床供应和多年来临床开发的批次可比性的控制。还应考虑TPP需求和要求，以适应特殊情况，如高浓度配方或替代药物产品展示。 3.11.纯化过程 领先分子应可接受地良好表达，理想情况下应适应基于平台的纯化策略。虽然最终领先可能基于瞬时表达材料被选中，但来自稳定细胞系的材料可能在纯度和产量上表达更高，并且具有更具代表性的核心糖基化谱。经过所有平台纯化步骤（如ProA亲和、低pH灭活、阴离子交换（AEX）流穿和阳离子交换（CEX）结合及洗脱过程）后，最终领先应具有可接受的产量和纯度。在抛光过程中也常使用混合模式离子交换树脂。如果出现需要过程改进的问题，如产量和/或纯度低，这可能影响领先选择或需要重新设计分子。如果采取过程缓解策略，理想情况下，缓解措施简单且易于制造。一个例子是在过程步骤中简单添加稳定剂，如pH调整，以防止聚集或颗粒形成。 3.12.稳定性和强制降解 应在40°C下进行短期加速稳定性研究，通常在溶液中进行长达一个月的更高蛋白质浓度，以及强制降解评估，以确定分子是否具有可接受的可开发性和CMC风险。（加速）稳定性评估是为了确定分子是否具有主要完整性或异质性问题，评估蛋白质浓度依赖的行为，特别是聚集，预测液体配方的长期稳定性，并确定是否需要显著的配方优化或缓解。因为降解机制可能遵循阿累尼乌斯动力学，这项加速研究也可能预测长期的常温储存稳定性和保质期。然而，温度依赖现象，如聚集，可能是复杂的，并不遵循阿累尼乌斯动力学，然而在更高温度下加速这一过程对于在发现阶段节省时间是必要的。理想情况下，对稳定性进行评估的平台配方可以适应毒理学研究和1期剂量要求，可以轻松地向下转换，并使用常见的“通常认为安全”（GRAS）辅料，如组氨酸和蔗糖。蔗糖或类似的糖也应使用，以进一步协助稳定，特别是用于冻干保护和达到等渗性。使用蔗糖的另一个优点是，如果可开发性工作未能在液态中充分稳定分子，它适用于冻干。用于评估这些受压样品的完整性和异质性的分析方法应代表标准的CMC释放和稳定性测定，如SE-HPLC、cSDS和cIEF。此外，应进行肽图MS和结合评估，以确定是否发生特定部位的化学修饰，它们发生在哪里，以及它们对结合和活性的潜在影响。因此，在进行更彻底的配方评估之前，包括在代表性容器封闭中优化pH和辅料（通常是玻璃瓶或预充注射器（直接皮下注射的情况）），通常对潜在问题以及过程和配方工作如何缓解它们有很好的了解。例如，在更高的抗体浓度下，自结合可能导致高粘度，导致过程、稳定性和/或注射性结果差。如果存在自相互作用问题，它们可以通过降低pH的配方工作来缓解，或使用粘度修饰剂，如精氨酸，NaCl，甘氨酸，和最近，咖啡因。 用于评估化学稳定性的常见强制降解条件是低pH、高pH、生理pH和化学和/或光压力。在领先选择之前评估一些配方条件允许可开发性科学家更好地了解配方和pH依赖的行为，如果各种pH在加速、固定温度下进行评估，这也可以从强制降解条件中利用。例如，低pH、代表性配方pH、生理pH和高pH都可以在40°C下评估一周。因此，如果观察到化学负债，如剪切、去酰胺化或异构化，可以从研究结果中了解其pH依赖的行为，进一步表明负债如何影响过程、配方工作和给药后行为。此外，大多数化学负债在pH或反应物浓度方面是伪一级的，因此它们在较低的蛋白质浓度下可以评估它们的倾向。因此，这些强制降解评估揭示了如何通过配方pH或是否需要工程和/或替代分子选择来缓解问题的线索。这种方法的一个例子是评估去酰胺化机制和速率，无论是实验上还是计算上，与配方pH相比。 3.13.修正工程 尽管不理想，但在最终领先候选物上进行全面的可开发性评估，当已经投入了大量的发现时间和资源时，如果出现重大负债，如过高或过低的pI、聚集、去酰胺化或自相互作用等令人担忧的风险，可能需要进行修正工程。在确定化学或物理负债的严重性时，必须考虑其性质、位置和降解速率。此外，其对pH值、温度和抗体浓度的依赖性很重要，其对目标结合以及免疫原性或不良药代动力学等其他属性的影响至关重要。虽然负债的性质和数量在整体可开发性风险中占有重要地位，但潜在缓解措施的数量和性质也很重要。一个常见的例子是聚集，它可以通过工程纠正，但通常通过纯化去除、调节配方pH值或使用精氨酸或蔗糖等稳定剂来改善。表2中总结了主要负债、它们的常见发生方式和潜在缓解策略。 一个可能需要分子工程的常见负债是天冬酰胺去酰胺化，因为它通常是伪一级碱催化的，并且在更高的pH值下加速，包括生理pH值。常见的热点基序通过主要N、N+1序列签名（如NG、NS、NT和NN）来阐明。这些主要序列基序的存在使去酰胺化成为可能，而去酰胺化的潜力进一步因位于表面暴露区域（如CDRs）和主链灵活性和构象而增强。由于去酰胺化在更高的pH值和温度下加速，它通常不是低pH值、低温液体配方中的储存问题。然而，如果发生去酰胺化，它在生理细胞培养条件和生理pH值及温度下的给药后是不可避免的，它将在高温下持续数周。此外，去酰胺化在蛋白质中非常普遍，并且是更强大的化学降解机制之一。因此，如果可变区域（如重链（HC）-CDR3）存在热点去酰胺化位点，应进行修正，这反过来可能影响异质性、活性和功能。有实例表明，当在生理pH值和温度下观察到5-10%的去酰胺化率时，治疗分子已被选择进行修正。较低水平可以在进入开发时进行监测，但可能可以继续进行，无需修正，因为总体水平不太可能达到显著百分比。如果去酰胺化影响结合或活性，关键关键属性，修正的需求就会增加，因为这也会增加关键性。天冬酰胺去酰胺化位点也可以突变为天冬氨酸，去酰胺化产物之一，并评估目标结合以确定其影响。此外，可以将通过肽MS确定的mAb可变位点去酰胺化率与保守的Fc去酰胺化位点（即NGQPENNYK）进行比较，以确定热点去酰胺化的准确性和相对严重程度。 像去酰胺化一样，另一个常见负债是甲硫氨酸/色氨酸（Met/Trp）氧化，这可以通过强制氧化研究有效评估。轻度氧化可以氧化敏感的Met和Trp残基，而常用的化学氧化剂叔丁基过氧化氢和偶氮双（2-脒基丙烷）二盐酸盐分别倾向于特异性地氧化Met和Trp残基。如果氧化被证明相当广泛，可以尝试进行修正工程，但通常暴露的CDR Trp残基更难以纠正并保持生物活性。与去酰胺化不同，氧化风险可以通过使用抗氧化剂如乙二胺四乙酸的配方工作更容易地缓解，这些抗氧化剂与从过程或药物容器组分中浸出的金属氧化剂螯合，并且甲硫氨酸作为竞争性过氧化氢清除剂。此外，可以使用琥珀色或防紫外线玻璃瓶进一步保护液体药品免受光氧化。虽然Met/Trp氧化是CQA，需要适当的缓解，必要时应尝试进行修正，但市场上有成功的商业产品在批准的配方中没有抗氧化剂的情况下，具有反应性CDR Met氧化。 4.早期CMC开发 4.1.配方开发 在对提名的领先候选物在分子属性和潜在重大负债方面有了很好的了解之后，应进行更全面的配方开发评估。这通常发生在IND申请提交之前以及制造和灌装完成工作的发现和早期CMC界面。配方开发活动包括优化配方pH值、聚山道/表面活性剂类型和浓度，并在相关产品展示中评估诸如搅拌和冷冻/解冻等不同压力。此外，可以确认以前的可开发性工作，特别是稳定性和强制降解评估。 在考虑配方优化方法时，阐明pH依赖行为的以前的强制降解评估也可以帮助确定是否通过改变配方来减少一个负债可能会加剧另一个不需要的负债，如聚集或剪切。例如，降低配方pH值以增加胶体稳定性和减少自结合也可能促进聚集、剪切或天冬氨酸（D）异构化。同样，提高pH值可能会促进额外的负债，如N-去酰胺化。在图3中，这个概念针对各种潜在负债与pH值进行了图解。重要的抗体属性，如构象和胶体稳定性，以及聚集、剪切和去酰胺化等负债，显示为对溶液pH值的增加倾向或风险。然而，应当注意，这些现象仍然是抗体依赖的，某些负债可能根本不显著或根本不存在，特别是在可变域中。因此，最终配方应旨在平衡所讨论分子的各种分子属性和负债的稳定化。 图3. 示意图显示了潜在负债及其发生的倾向与溶液pH值的关系。箭头指示每个属性倾向增加的方向。 如果可开发性风险太大或即使在优化的液体配方中也可能无法管理，可以使用冻干法来稳定药物产品形式中的分子，但随后需要额外的加工和给药/重建期间的步骤。如果长期储存稳定性是一个问题，可以考虑在早期开发中使用冷冻液体小瓶，待3期过程和配方锁定后进行额外的配方改进或优化。然而，额外的冻融周期可能会导致不需要的并发症，如分子变性和容器封闭完整性问题。 4.2.分析开发 总的来说，冷藏液体配方是临床开发中最直接和多功能的呈现形式。支持这一点的因素有：1）只需要评估一种呈现形式，2）不需要额外的冻干或冷冻过程，3）在给药期间不需要重新组合或解冻，4）液体形式很容易适应瓶装和预充注射器容器封闭系统。然而，治疗性抗体可能容易在液体状态下在过程、储存和体内降解。因此，在领先选择之前，至关重要的是要理解治疗性抗体在溶液中的物理化学行为，以及在模拟过程、配方和类似生理条件下的不同条件下的行为。 分析方法开发和CMC释放和稳定性分析的确认，以评估关键质量属性（CQAs），是在最终领先选择后的另一个关键交付领域。通常，发现阶段使用的分析方法可以利用到早期CMC评估和确认，因为它们通常是平台驱动的。例子包括尺寸排除高效液相色谱（SE-HPLC）和毛细管十二烷基硫酸钠电泳（cSDS），可能需要一些修改或优化，但可以利用常见的分离柱、流动相、样品准备程序和毛细管。在CMC开发的后期，对杂质识别和方法验证有了更多的了解。然而，由于在CMC开发之前选择了领先，就如何检测和量化杂质和/或异质性的分析方法做出了假设。幸运的是，用于评估CQAs的分析方法可以充分检测和量化聚集、剪切、pI和电荷异质性，通常不需要广泛的优化或定制。此外，全面的发现阶段可开发性评估应评估其他分子属性，如Tm、疏水性和自相互作用，以便更好地了解治疗分子的分子属性，从而使下游开发风险更加明确。 4.3.过程开发 对于大分子生物制剂的另一个关键交付物是稳定的细胞系开发（CLD）。这可以跟在彻底表征和瞬时表达的候选物的最终领先选择之后进行，其中稳定的CLD旨在优化滴度表达，同时保持理想的纯度属性，不引入新的负债。通过这样做，开发和选择单一克隆，通常源自CHO-K1或CHO-S，优化细胞生长和活性，以产生高质量和滴度的抗体产品。CLD活动可以在风险上的多个领先候选物上提前开始，以缩短最终领先选择阶段的时间表，特别是在稳定池的细胞系生成阶段，特定基因转座酶靶向的进步可能进一步加速稳定克隆的选择。在CLD稳定克隆选择过程的后期，应专注于最终领先候选物。评估多个领先候选物用于稳定CLD生产的这种方法对于多特异性抗体特别有利，其中亚单位化学计量和正确组装可以在瞬时表达努力之外进行优化。虽然瞬时表达多特异性变体然后纯度表征可能选择具有改进组装和减少常见杂质形成的变体，如同源二聚体或半分子形成，但稳定的CLD可能在这方面进行改进或完全依赖于以合理的滴度和纯度组装所需产品，以促进下游处理工作。例如，Wang及其同事通过稳定细胞系的生成和选择最佳克隆，展示了改进的双特异性表达和减少的同源二聚体杂质。这样的高质量表达减少了下游纯化和灌装/完成活动的负担和风险，以生产可接受的产量和纯度的产品。此外，核心Fc N-糖基化异质性通常由细胞系表达参数和条件定义。稳定的CLD可以确认这是否受到控制并且是理想的异质性，但也可以确定分子变体是否影响这种异质性，如果CLD在最终领先选择之前应用于它们，特别是对于Fc工程变体。 虽然调查基本分子属性的领先候选物通常只需要亲和纯化，但通过确定的储存稳定性和强制降解研究评估的最终领先应该通过类似于制造的完整纯化过程进行纯化。如前所述，这将包括ProA亲和、低pH保持、AEX流穿和CEX结合和洗脱过程。这些纯化步骤应该将感兴趣的分子纯化到高纯度和可接受的异质性。低pH保持步骤通常在pH 3.5-4.0下进行，主要灭活内源性和偶然病毒，但也可能导致抗体剪切或聚集。或者，如果分子在低pH下不稳定，可以使用洗涤剂进行病毒灭活。AEX流穿步骤主要去除带负电荷的分子，如HCPs、DNA和RNA，这些基本纯度特性分析（如SE-UPLC和cSDS）不敏感。CEX步骤旨在完全抛光感兴趣的分子，并进一步去除聚集体、错误组装或断裂的分子，或不需要的异质性，包括过量的糖基化或电荷异质性。选择CEX树脂用于特定抗体的纯化通常是经验性的，但建议采用默认或平台方法，直到需要进一步优化。为了配方药物物质，超滤/透析（UF/DF）是一个关键活动，其中感兴趣的分子被缓冲液交换和浓缩到所需的配方，通常在添加聚山道之前。在可开发性和早期开发工作中，产品质量属性侧重于由诸如SE-HPLC/UPLC、cSDS、cIEF和颗粒分析等分析定义的散装纯度特性，特别是当决定领先分子或配方时。然而，为了提供用于动物研究、良好实验室规范毒理学研究和随后的临床研究的材料，这些研究需要在良好生产规范条件下生产的药物，其他过程和释放分析评估潜在污染物至关重要，如CHO DNA水平、生物负荷和内毒素。 5.四大可开发性属性 影响所有可开发性结果的四大属性是构象、胶体、化学和其他相互作用。许多属性，如聚集，被清楚地理解为主要由解链驱动，因此被归类在“构象”类别中。其他可开发性结果并不那么明显或容易分类。其他问题，如制造中的问题机械问题或辅料质量的问题，可能影响开发结果，但如果它们与治疗分子无关，则在这里不被视为可开发性问题。治疗分子与辅料或药物产品容器之间的问题相互作用是分子可开发性问题，因为它们与分子的固有属性有关。例如，分子可能在过滤或UF/DF操作过程中由于自结合引起的高粘度而出现过程失败。在表3中，我们总结了许多常见的可开发性和/或CQAs，这些属性影响领先选择和CMC开发，以及潜在的安全性和有效性，并将每个属性归类为四大类别之一或多个。还包括了确保成功可开发性结果的关键标准的例子。应该注意的是，虽然每个类别可以独立描述，但它们并不完全独立，因为一个属性可能影响另一个。例如，化学去酰胺化和/或氧化可能在构象不稳定或聚集中出现，反之亦然。 5.1.构象稳定性 构象稳定性属性可以影响聚集速率、DSC（或Tm）的温度依赖性解链、化学变性倾向以及不溶性颗粒的形成。CMC稳定性和释放分析分析，如尺寸排阻色谱（SEC）和亚可见颗粒分析，明显地分别评估了可溶性和不溶性聚集，这主要是由蛋白质解链驱动的，尽管它们也可能受到其他因素的影响，如天然表面静电和疏水性。聚集通常是由部分解链分子之间的共价和非共价结合混合而成的，并且依赖于pH值、温度和浓度。如果有问题，聚集的性质可以通过圆二色谱或傅里叶变换红外光谱进一步探索，以评估变性或解链时二级和三级结构的变化。此外，可以通过DSC分析解链的可逆性，以衡量配方中聚集可能的可逆性。构象稳定性也会影响除聚集和温度依赖性解链之外的许多其他结果。例如，表达或纯化产量差可能是由于表达时不完全折叠或在纯化过程中遇到的各种pH值或离子强度环境中解链所致。高度构象状态的存在可能导致通过各种方法（如HIC）确定的异质性增加。部分解链抗体形成的可溶性聚集体和不溶性颗粒不仅存在CQA问题，还存在免疫原性风险。给药后，结构不良或构象多样性分子可能导致增加的免疫原性或不良的药代动力学/生物利用度，因为在解链/聚集状态下展示的一系列表面可能触发免疫反应或简单地被快速清除。 5.2.化学稳定性/特性 化学稳定性受翻译后修饰（PTMs）的影响。如上所述，天冬酰胺去酰胺化和甲硫氨酸/色氨酸氧化是影响质量和功能属性的两种最常见的PTM。通常，位置、溶剂可及性和局部主链构象和/或灵活性支配固有的分子反应性。这些修饰和其他修饰通过质谱进行特定位点的评估，但其他方法如反相（RP）-HPLC或HIC可能有助于监测氧化的异常变化，同样，cIEF用于监测去酰胺化。还有许多其他修饰存在，如焦谷氨酸形成、非酶促的赖氨酸糖化、天冬氨酸异构化、主链剪切或断裂以及二硫键还原和错配。其他修饰，如天冬酰胺糖基化，是酶促的，受表达条件和分子固有序列及结构属性的驱动。CQAs包括许多化学修饰，特别是天冬酰胺去酰胺化、甲硫氨酸/色氨酸氧化和天冬氨酸异构化，这些修饰对成功的CMC开发至关重要，因为它们也会影响活性、安全性和有效性。在最近的一项研究中，单克隆抗体的天冬氨酸异构化与增加的免疫原性相关。此外，抗体甲硫氨酸氧化已被证明通过影响与FcRn受体的结合而对体内半衰期产生负面影响。治疗性抗体CDR区的N-去酰胺化已被证明会影响目标结合数级，保守的Fc去酰胺化（在N325）已被证明通过减少FcγRIIIa结合而影响抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。这一类还包括由表面特性定义的属性，如pI和疏水性，尽管这两种属性都可能导致其他不良结果，特别是聚集、自相互作用或非特异性相互作用。 5.3.胶体稳定性 胶体稳定性指的是分子非共价自结合形成“胶体”或更大复合物的能力，这些复合物影响整体溶液流变学和粘度。在这里，我们将自相互作用与聚集区分开，因为后者由（部分或完全）解链分子的复杂网络组成。像自相互作用一样，聚集可以是可逆的，但它主要是不可逆的，特别是在高阶聚集体中。因此，聚集体是长寿的，可以通过尺寸排阻色谱、分析性超速离心或甚至场流分离等色谱技术进行评估。在自相互作用或自结合的情况下，折叠的、天然的分子以高度瞬态和浓度依赖的方式可逆地结合，这不能直接通过使用分析样品量在稀薄浓度下进行的色谱技术直接检查。特别是在双价抗体中，自结合可以在更高的配方浓度下导致大的寡聚复合物。因为双价性增强了导致粘度增加的抗体寡聚化，当格式化为多特异性抗体时，自相互作用风险可能会发生变化，其中Fab价可能会改变。此外，已报道抗体自相互作用导致稳定性和溶解度降低，甚至可能发生相分离和凝胶化。在一份报告中，去除一个横跨HC-CDR1和HC-CDR2的疏水表面纠正了体外自相互作用，改善了血清半衰期和非特异性组织结合，暗示自相互作用的高倾向也可能通过相同的界面与其他分子的非特异性相互作用相关。由于自相互作用通常是由至少一个相互作用分子中的CDR残基介导的，这些残基也介导目标结合，因此在保持理想活性的同时，可能很难通过工程或突变来纠正自相互作用。此外，可能很难从结构上预测两个分子将如何自相互作用或自结合。最近，通过晶体学和建模工作，已显示抗体通过CDR装置以对称的“面对面”方式自相互作用。其他报告已经证明了Fab-Fc自相互作用，这可以通过IgG1/IgG4同种型转换来缓解。值得注意的是，配方辅料和调节配方pH已被证明在几个实例中通过减少蛋白质-蛋白质相互作用来降低粘度。由重链在表达期间的独特自相互作用驱动的重链二聚体形成，最近也被报道为可开发性问题。 5.4.其他相互作用 其他相互作用包括那些可能影响过程、药物产品或体内行为的治疗分子之间的相互作用。例如，治疗分子与过程组分、配方辅料、药物产品容器之间的相互作用，以及与表达HCPs和体内生物分子的相互作用。治疗分子可能与过程组分（如过程泵和过滤器）不利地相互作用或吸附，或帮助促进从不锈钢中渗出铁、铬、铜和镍等金属，这可能导致产品氧化和不稳定。其他常见的相互作用可能是与分析柱树脂的相互作用，如尺寸排阻HPLC，这可能使直接分析CQAs复杂化。治疗分子也可能与配方辅料不利地相互作用，尤其是聚山道，这可能导致不稳定性，如聚集体的形成或氧化降解。有趣的是，假定通过与治疗抗体的相互作用在纯化去除中存活下来的酶促HCP，已被报道可以降解聚山道，这反过来又导致了抗体稳定性和颗粒问题。如果在纯化过程中没有去除，酶促或蛋白水解HCP也可以直接降解感兴趣的抗体，除了呈现一般的免疫原性风险。其他污染风险，如脂多糖内毒素，可能通过与感兴趣的抗体的相互作用存活下来。抗体与药物产品容器的相互作用，特别是与瓶塞橡胶或注射器塞子硅涂层的相互作用，可能导致颗粒形成，通常与外来颗粒或硅油滴结合，尽管配方是这些现象的主要驱动因素。抗体相互作用或吸附可能在产品给药期间与各种附件发生，如静脉袋或泵送设备。 给药后，目标分子可能与各种生物分子特异性或非特异性地相互作用，可能导致药代动力学不良、生物利用度和效力不佳。一个例子包括去除IgG1和IgG4抗体上的电荷“斑块”，不影响pI，结果在小鼠中改善了半衰期和分布，这与体外减少非特异性结合相关（对CHO细胞和肝素）。还有其他例子，高度特异性与其他生物分子的相互作用导致了负面的临床结果，例如，抗程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）抗体camrelizumab与血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）和其他两种分子之间的强结合相互作用，导致了强大的VEGFR2激动作用和血管瘤。值得注意的是，其他抗PD-1疗法，如nivolumab和pembrolizumab，不会导致VEGFR2激动作用，因此这种副作用是camrelizumab非特异性（激动剂）效应所独有的。虽然这些不需要的相互作用在发现阶段几乎不可能完全预测，但最近开发了各种分析方法，可能有助于预测它们发生的可能性。杆状病毒粒子测定（BvP）通过ELISA或流式细胞术评估对各种蛋白质池的非特异性结合，并已与人类的清除率相关。PSR测定是使用CHO膜提取物评估对感兴趣分子的非特异性结合的类似方法，已与其他用于预测非特异性的测定相关。肝素色谱用于将体外保留时间与小鼠和生理模型中的抗体清除率相关。在Jain及其同事的一项研究中，与这些预测非特异性测定相关的可开发性标志物对于处于开发后期的治疗性抗体有所减少。与高级临床阶段的相关性表明，这些非特异性测定可能预测影响临床终点（如安全性和有效性）的体内相互作用。这似乎引入了在IND前阶段评估复杂非特异性相互作用的新兴趋势，以增加临床成功的可能性。可开发性早已被证明对于预测CMC开发结果和制造成功特别有用。然而，由于没有文献引用将CMC失败作为临床失败的直接原因，人们普遍认为临床结果不能通过可开发性评估来预测。然而，将非特异性纳入可开发性评估及其最近与临床成功的相关性表明情况可能并非如此。事后看来，作为可开发性属性的改进多特异性与临床进展的相关性意味着临床失败可能以前是由次标准的可开发性属性引起的。其他更常用的表征工具，如HIC，可以评估疏水性，这通常与非特异性结合和整体“粘性”相关。其他报道用于评估潜在非特异性相互作用的方法是CIC和站立单层吸附色谱。如果最近显示可预测非特异性相互作用的测定尚未纳入可开发性工作流程，标准的过程和分析方法可能会提供线索。例如，治疗分子可能非特异性地结合到纯化和分析树脂上，或者通过HIC计算或实验性地显示出高表面疏水性。34 这些信息可以在决定领先时考虑。 6.计算机计算工具的进步 6.1.预测计算 近年来，使用计算工具来预测抗体的可开发性和质量属性变得越来越普遍。通常，这些工具基于序列和/或结构导出的参数，筛选和/或将初始命中或候选物筛选成更有希望的领先分子。使用抗体同源模型和计算表面属性，已经可以预测聚集、粘度、化学不稳定性、和药代动力学清除等可开发性属性。本质上，这些方法可以在表达、纯化和表征之前，将数百个候选物计算筛选成相对较小的子集。为了计算预测浓度依赖的粘度，通常评估净可变域或总抗体电荷以及表面疏水性指数。 有趣的是，Tomar及其同事根据全长同源模型获得的疏水性和静电参数，预测了16个单克隆抗体的总抗体粘度曲线。他们发现与总可变重（VH）和可变轻（VL）电荷、疏水表面积、zeta电位和令人惊讶的WALTZ聚集倾向有最大的统计显著性。在对60个IgG1单克隆抗体的研究中，抗体同源模型的分子动力学模拟将粘度与疏水性、净电荷和电荷分布相关联。此外，快速体内清除与高度带电和/或疏水性CDRs相关。在这项研究中，分子动力学模拟输出，如潜在反应性残基的溶剂可及性，也与实验色氨酸氧化和天冬氨酸异构化率相关。值得注意的是，对100多个临床阶段抗体治疗的研究表明，平均重链-CDR3长度比评估的成千上万的临床前抗体序列短，表明较短的长度被选择，因为它们导致更好的可开发性结果。在同一研究中，对于CDR区域，类似的发现被报道在疏水性斑块度量方面。许多基于网络的工具使用基于结构的表面行为计算来预测蛋白质的稳定性或可开发性概况，如治疗性抗体分析器（TAP）、SAP（空间聚集倾向）、Abpred（抗体预测数据库）用于疏水性预测，以及SAbPred（结构抗体预测数据库），包括建模、注释、人源化和可开发性预测工具。迄今为止，有许多例子表明，计算模型已经成功预测了大量抗体的聚集、粘度、化学稳定性和体内行为的实验结果。 6.2.机器学习和人工智能 在此基础之上，使用机器学习（ML）和人工智能（AI）来预测可开发性属性，如粘度和聚集倾向。序列、结构和分子动力学已被用于训练机器学习算法，然后尝试预测分子属性。最近的例子包括使用ML预测亲和力和特异性、去酰胺化、甲硫氨酸氧化、疏水性、和粘度。最近，AI被探索用于通过预测蛋白质-溶剂相互作用来揭示最佳抗体和蛋白质配方。在蛋白质结构预测方面，AlphaFold和AlphaFold2最近已商业化推出，用于预测蛋白质结构甚至其复合物。ABlooper（抗体“Looper”）被开发为一种深度学习工具，可以从抗体序列中轻松预测CDR结构。虽然它们在制药行业的使用可能并不普遍，但AI/ML的出现可能成为常规，作为最初的计算努力的一部分，在任何实验努力之前筛选和评估分子属性和相互作用。 7.结论 抗体和蛋白质治疗的可开发性是推动和推进领先候选物优化和选择进入IND支持和临床研究的关键活动。适当和彻底的可开发性研究不仅检查将代表过程和药物产品适应性潜在CQAs，而且阐明可能影响给药后安全性和有效性以及最终临床成功的分子属性。最近在计算方法和非特异性评估方面的进展也有助于简化和实现更有针对性的可开发性评估。我们提出这四大属性的大型分子抗体和蛋白质治疗作为影响所有可开发性结果的属性：1）构象，2）胶体，3）化学，和4）其他相互作用。在发现阶段可开发性和早期开发活动中对这些属性及其风险进行全面检查，提供了最好的可能性，即强大和高质量的领先候选物被提升，潜在的CMC和临床开发风险是可控的。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。