Irinotecan Hydrochloride

靶抗原的选择是ADC药物开发成功的主要因素。靶点是 ADC药物主要识别肿瘤细胞和被内吞的主要媒介，影响药物的成药性和竞争格局。下表为大家总结了目前已经上市的19款ADC的靶点信息，靶点分别为CD33、CD30、HER2、CD22、CD79b、Nectin-4、BCMA、EGFR、CD19、Tissue Factor、FRα和cMET。据统计在研的425款ADC药物中较为热门的靶点包括HER2、EGFR、CLDN18.2、TROP2、c-Met、CD19、PSMA、Muc1、BCMA和PDL1，大多数为验证成熟的靶点。已上市ADC信息汇总表今天为大家解读一篇关于筛选ADC合适靶点的文章，一起学习起来。在开发新型抗体偶联药物（ADC）疗法时，可采用适应症依赖型或适应症独立型策略来筛选合适靶点。适应症依赖型策略顾名思义，是通过聚焦特定疾病类型展开研究，进而选定针对该疾病的靶点及相应ADC。另一种适应症独立型靶点筛选方式，则是根据内化作用等功能特征而非特定疾病类型来识别靶点，随后再基于该靶点的表达情况选择匹配适应症。这两种策略并非互斥，且均需遵循合适ADC靶点的关键特征要求。本文将详细探讨这些特征以及两种ADC靶点筛选策略，同时还将阐述涉及双特异性ADC或联合疗法的靶向策略。2.1 最佳ADC靶点的特性ADC通过将强效细胞毒素与识别肿瘤相关抗原的抗体结合，实现细胞毒药物的肿瘤靶向递送，从而规避传统化疗药物引发的全身毒性。特定ADC疗效最大化与毒性最小化的关键始于靶点的精准筛选。理想ADC靶点应具备以下特征：1）仅存于肿瘤组织而在正常组织中不表达；2）在肿瘤内呈高密度均匀分布；3）与ADC结合后能快速内化；4）并完全定位于溶酶体以实现细胞毒素弹头的高效释放（表2.1）。表2.1 ADC最佳靶点的特征：理想与现实然而完全符合所有标准的靶点可能并不存在，因此实际开发中只需满足部分条件的靶点即可视为优选。优质靶点应满足：1）相较于正常组织在肿瘤中过表达（即肿瘤相关而非肿瘤特异）；2）在肿瘤中表达密度足以介导ADC产生使肿瘤消退或至少停滞的细胞毒性；3）与ADC结合后能高效内化并转运至溶酶体，且极少再循环至细胞表面，从而促进弹头的后续加工与释放（图2.1）。图2.1 ADC靶标的内化与溶酶体定位。将GFP转染细胞用针对ADC靶标的抗体处理4小时，该抗体通过偶联的pH传感器染料实现标记——当定位到溶酶体时会发出荧光。随后使用Cellomics成像仪对细胞进行分析，捕捉并量化内化及溶酶体定位事件（a和b）。如(a)所示，可清晰观察到抗体在细胞内的点状染色。图(b)展示了靶标抗体被内化的细胞高倍放大图像。通过共聚焦显微镜进一步验证抗体内化与溶酶体定位：将荧光标记抗体与细胞共孵育指定时间后，使用抗LAMP-1抗体进行溶酶体定位检测（c和d）。如(c)所示，0小时时间点可见抗体在细胞表面结合，但经过一小时后，明亮的共定位信号清晰表明抗体已进入溶酶体。现有假说认为，降低ADC毒性的关键在于使靶标在正常组织中的表达量最小化。但关于靶标"纯净度"需达到何种程度才能确保ADC安全有效，目前学界仍存争议。临床ADC靶标的mRNA表达谱显示，许多靶标在多种正常组织中存在低至中度表达。针对细胞表面靶标开发疗法时，仅关注mRNA表达谱存在局限性：虽然mRNA转录水平与蛋白表达存在相关性，但转录后调控机制可能削弱这种关联；此外，翻译后修饰或细胞定位改变也会降低靶标在细胞表面的丰度。因此，靶标蛋白表达及细胞定位分析通常比单纯依赖mRNA数据更具参考价值。蛋白质组学分析表明，血液系统恶性肿瘤和实体瘤的临床ADC靶标中，多数在广泛正常组织中呈现中度蛋白表达。典型案例如HER2在正常组织的表达——尽管该靶标在多种正常组织中水平较低，但曲妥珠单抗及其偶联药物Kadcyla®（由曲妥珠单抗与细胞毒素DM1偶联而成）仍表现出可接受的毒性，并成功获批用于治疗HER2过表达乳腺癌。值得注意的是，曲妥珠单抗偶联药物引发心肌病的发生率似乎低于曲妥珠单抗联合蒽环类药物的方案。另一案例是靶向NaPi2b的抗体偶联药物lifastuzumab vedotin（携带微管抑制剂MMAE），目前正针对卵巢癌和非小细胞肺癌开展临床试验。虽然NaPi2b在这两种适应症中过表达，但其在肺组织的表达曾引发安全性担忧。然而最新临床数据显示，该药物未出现肺部不良事件或剂量限制性毒性。这些案例表明，抗原在正常组织的表达未必导致不可接受的毒性。表达靶标器官未出现毒性或毒性轻微的现象提示：判断ADC耐受性时，需综合评估其整体构成和行为特征，而非仅关注抗原表达。诸如内化速率或弹头作用机制等特性，均可能影响药物的疗效与安全性。目前虽未建立ADC理想内化速率与活性之间的明确关联范式，但大量数据支持更快速的内化可能带来更佳疗效的观点。理论上，快速内化能加速偶联细胞毒素弹头的递送，从而增强细胞毒性效应。然而研究显示，作为曲妥珠单抗-美坦新偶联药物（T-DM1）抗体组分的曲妥珠单抗，其内化速率相较于其他已知ADC更为缓慢——但该药物仍展现出显著疗效。这种相对缓慢的内化特性可能解释了为何T-DM1对细胞表面HER2低表达的细胞和肿瘤疗效较弱。因此，在内化速率较慢的情况下，需要更高水平的细胞表面HER2表达才能结合并内化足够数量的ADC，从而实现有效的细胞杀伤。这也可能是T-DM1引发心脏毒性的因素之一，因为心肌细胞的HER2表达量显著低于HER2过表达肿瘤。若已知某ADC靶标在正常组织中存在表达，则必须评估该组织中弹头毒素的潜在毒性。针对同一抗原但搭载不同弹头的ADC可能呈现显著差异的毒性特征。例如，靶向癌胚抗原5T4的ADC药物PF-06263507（搭载auristatin类弹头MMAF）在食蟹猴中剂量高达10mg/kg时仍表现良好耐受性，未出现明显毒性；而早期搭载DNA靶向弹头卡奇霉素的抗5T4 ADC，在相似有效剂量下却无法被食蟹猴耐受。值得注意的是，针对其他靶点的卡奇霉素ADC（这些靶标具有不同的正常组织表达谱）在5T4靶向ADC出现毒性的剂量下仍表现安全，这表明毒性是靶标介导的，而非卡奇霉素偶联物的普遍脱靶效应。 以曲妥珠单抗-美坦新偶联药（T-DM1）为例，其弹头DM1的作用机制可能是该ADC在治疗剂量下未引发显著心肌细胞毒性的原因。成年人心肌细胞的增殖率极低，而微管蛋白抑制剂（如auristatin类和美坦新类）对高增殖率肿瘤细胞最为有效，对相对静止的细胞作用较弱。因此，T-DM1所观察到的轻微心肌毒性可能正是因为其弹头对低增殖细胞的杀伤作用有限。 目前，多个研究团队已报道基于曲妥珠单抗的ADC临床前研究，这些ADC搭载了可能对低增殖细胞具有毒性的不同弹头。未来值得关注这些ADC是否会引发额外毒性，尤其是心脏毒性发生率的潜在升高。 细胞表面抗原是否适合作为ADC靶点还取决于其他关键因素。如前所述，ADC/抗原复合物在细胞表面结合后的内化速率会影响药物疗效——但结合与内化仅是ADC释放活性弹头的第一步。后续关键在于：内化后的ADC/抗原复合物将经历怎样的命运？目前大多数在研ADC需要依赖溶酶体的蛋白水解作用来释放活性细胞毒素：通过酶切可裂解连接子，或通过抗体蛋白降解释放非可裂解连接子偶联的弹头。因此，ADC/抗原复合物必须被转运至内体/溶酶体系统才能完成有效加工。 判断某抗原是否适合作为ADC靶点，需明确其内化后的主要转运路径：是进入内体/溶酶体系统，还是通过其他途径？某些抗原会常规性循环回细胞表面，而抗体本身也可能通过FcRn介导的循环途径持续外排。虽然这种循环可延长抗体或ADC的半衰期，但若ADC/抗原复合物在溶酶体中的加工量不足，反而会削弱ADC活性或诱发耐药。近期抗体工程技术已能引导抗体/抗原复合物走向蛋白水解途径而非循环途径，但这些研究多在未偶联抗体中进行。目前尚不明确：经过pH依赖性结合改造或FcRn结合减弱的抗体是否适用于ADC。因此，必须明确靶标本身的主要导向路径是蛋白水解途径还是循环途径。 对于已知在正常组织中表达的靶标，还需探究肿瘤与正常组织是否存在不同的加工途径。例如，ADC/抗原复合物可能在癌细胞中被转运至溶酶体，而在正常细胞中循环回细胞表面——尽管目前尚无文献支持这一假说。这种潜在差异可能为提升ADC治疗窗口提供新思路。 综合这些因素，关键在于理解一种具有特定内化速率和特定弹头的ADC，会如何影响表达低至中度水平靶标的正常组织。此外，阐明ADC/抗原复合物在细胞表面结合并内化进入胞质后的命运也至关重要。遗憾的是，目前似乎尚未建立关于ADC最佳内化速率等参数的通用范式，ADC的安全性和有效性仍需通过个案实证来确定。基于这些ADC理想靶标特征，我们该如何筛选优质ADC靶点呢？如前所述，靶点识别策略可分为适应症依赖型和适应症独立型两类。2.2 适应症依赖型ADC靶点选择适应症依赖型ADC靶点筛选策略如同使用导航软件——已知治疗目标（目的地），但需探索具体实现路径（行进路线）。根据研究团队的专业优势和对未满足临床需求的评估，某些癌症类型可能获得优先关注。这种策略始终以明确目标为导向，关键在于尽早制定并实施临床开发计划。目前有50余种ADC处于临床研发阶段（表2.2，截止2016年数据），除少数特例外，靶点选择呈现高度多样性。其中多数靶向实体瘤抗原，也有相当数量针对血液系统恶性肿瘤。值得注意的是，FDA最早批准的两个ADC药物——曲妥珠单抗-美坦新偶联药（T-DM1）和靶向CD30的brentuximab vedotin（商品名Adcetris®），最初均作为"裸抗体"（未偶联药物）开发，且都始于特定适应症的研究。以HER2为例：其过表达是特定乳腺癌亚型的标志特征，鉴于其在肿瘤发生中的作用，早期就成为这些癌症靶向治疗的研究焦点。如前述，T-DM1由抗HER2抗体曲妥珠单抗与DM1弹头偶联而成。由于曲妥珠单抗的研发积累了丰富的HER2靶点数据和抗体特性资料，将其改造为ADC以提升疗效成为合理选择。表2.2 临床开发中的ADC（截至2016年7月数据）同样地，brentuximab vedotin（维布妥昔单抗）也源自裸抗体研发项目。通过聚焦在血液系统恶性肿瘤中高表达、而在正常组织中极少表达的抗原研究，CD30被确认为优质靶点。该靶点在霍奇金淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、皮肤T细胞淋巴瘤等血液恶性肿瘤中过表达，而在正常组织中仅见于活化的T/B细胞——静息态T/B细胞完全不表达。研究人员筛选出具有抗肿瘤潜力的抗CD30抗体cAC10，该抗体在霍奇金淋巴瘤和ALCL的临床前研究中表现优异并进入临床开发阶段。但将auristatin类弹头MMAE与cAC10偶联后，其疗效显著超越未偶联的cAC10抗体，使得该ADC的临床开发成为更优选择。CD30之所以被视为极具潜力的ADC靶点，关键在于其显著的肿瘤/正常组织表达差异。这种差异基因表达分析正是适应症导向型靶点筛选中最常用的策略之一。研究人员可采用多种方法进行此类分析，包括：1）计算机模拟分析（in silico approaches）2）肿瘤与正常细胞系的体外实验（in vitro analyses）3）患者肿瘤/正常组织活检样本的体内/离体研究（in vivo/ex vivo analyses）目前可公开获取的基因组数据库包括：癌症基因组图谱（TCGA）、国际乳腺癌分子分型联盟（METABRIC）和癌细胞系百科全书（CCLE）。这些数据库汇集了来自数千例患者样本的信息，涵盖广泛的癌症适应症，并提供差异基因表达、拷贝数变异、基因突变、甲基化状态、外显子测序、SNP基因分型以及与人类癌症相关的miRNA等数据。通过对这些数据库进行计算机模拟分析，有助于识别在特定癌症类型（如METABRIC专攻乳腺癌数据）中差异表达的膜相关蛋白基因，这些基因可能成为抗体偶联药物（ADC）的理想靶点。针对特定适应症的潜在靶点，还可通过对比同一组织或器官中正常细胞与恶性细胞的基因表达谱来识别。这类研究能揭示特定癌症类型中上调表达的基因，但需后续通过蛋白质检测验证靶点的差异表达水平。除依赖基因表达数据外，采用蛋白质组学方法直接鉴定癌症特异性高表达蛋白是另一种有效策略。定量蛋白质组学通常采用质谱技术分析正常/恶性组织细胞或活检样本中的蛋白水平。目前学界正在开发定量免疫组化（IHC）技术，用于原位测定候选靶点的相对蛋白表达量。以三阴性乳腺癌为例，这类蛋白质组学方法能鉴定出癌细胞特异性膜蛋白——这些蛋白在对应正常组织中要么完全缺失，要么表达量显著偏低。在鉴定出肿瘤差异表达的抗原后，关键要评估其是否适合作为ADC靶点：该抗原是否定位于细胞表面？抗体结合后能否有效内化？内化后是高效转运至溶酶体还是发生再循环？表达量是否足以递送足量细胞毒素？流式细胞术和共聚焦显微镜可分别用于检测细胞表面定位和溶酶体共定位。 ADC引发细胞毒性所需的靶点表达水平需通过实验确定，这既取决于靶点本身特性（如抗原表位分布），也与抗体的结合表位选择及亲和力等参数密切相关。在确定特定适应症的潜在靶点后，必须深入分析这些靶点在目标适应症中的临床表达特征。ADC开发过程中的关键决策（如靶点选择及药物设计）均需基于两大参数：靶点在选定适应症中的表达密度与表达普遍性。 简而言之，肿瘤靶点表达模式可分为五类：1）高表达且均一分布；2）高表达但异质性分布；3）低表达且均一分布；4）低表达伴异质性分布；5）完全不表达（图2.2）。为准确评估靶点在目标适应症中的表达密度与普遍性，需通过免疫组化（IHC）技术对肿瘤组织芯片或大量临床肿瘤样本进行系统检测——这种全面的蛋白表达分析将为ADC开发策略提供决定性依据。图2.2 肿瘤中靶基因的表达模式。通常，靶基因的相对表达水平是根据该靶基因在被检测组织中的表达强度（无、低或高）和表达密度（无异质性、异质性或均质性）来确定的。因此，靶基因的表达水平可以从无表达到高表达/均质表达不等。单纯的高靶点表达虽更为理想，但并不能完全预测ADC的疗效，因为靶点在肿瘤组织中的分布密度同样会影响药物效果。例如：针对高表达且均匀分布的靶点，采用较低药物抗体比（DAR）或低效价弹头的ADC可能已足够有效。这种均匀表达模式还能避免在ADC设计中引入"旁观者杀伤效应"（即游离弹头从凋亡细胞释放后对邻近靶阴性细胞的毒性）。若靶点在正常组织中表达较低，采用无旁观者杀伤效应的弹头偶联ADC，既能降低脱靶毒性，又可减少对正常组织的靶向杀伤。 对于靶点表达量低但分布均匀的肿瘤，可能需要采用高效价弹头偶联的ADC进行治疗，但这可能增加毒性风险。不过，这种低表达但均匀分布的特性也意味着无需依赖具有旁观者杀伤效应的弹头，反而可能限制整体毒性。相反，当靶点呈异质性表达时（尤其是计划作为单药使用时），旁观者杀伤效应可能至关重要——这类ADC既能选择性清除肿瘤中的靶阳性区域，又能对靶阴性区域造成足够损伤。但根据靶点表达水平的不同，可能需要采用高效价弹头偶联ADC，这同样会增大毒性风险。 采用适应症导向的ADC靶点筛选策略时，尽早确定靶点的临床表达模式对优化ADC设计具有决定性意义。 靶点表达谱分析对判断是否需要开发伴随诊断（用于患者筛选）至关重要。若某适应症患者群体绝大多数呈现靶点高表达且均匀分布，则可能无需基于靶点表达筛选患者，自然也不必开发伴随诊断。然而，对于靶点表达普遍性和密度存在显著差异的适应症，则需通过伴随诊断筛选出靶点表达量达到治疗阈值的患者。 考虑到目前已上市ADC药物的毒性问题，采用伴随诊断排除潜在无效患者（这些患者不仅难以获益，还可能承受药物不良反应）具有临床价值——部分学者认为这甚至涉及伦理考量。值得注意的是，判断"足够表达水平"的标准会因靶点特性、适应症类型及ADC药物组成而异。例如：HER2过表达的阈值约为每个细胞100万个分子，而处于临床评估阶段的CD70靶向ADC，其有效阈值低至每个细胞3.4万个分子，且表达水平与药物敏感性无明显相关性。与大多数ADC研究一样，抗原表达水平与药物活性（疗效/安全性）的关联性必须通过实证研究确定。 弹头的早期选择是指适应症导向型ADC靶点策略的另一关键要素。目前临床评估的ADC弹头主要分为两大类：微管蛋白抑制剂（MTIs）和DNA靶向剂。 1）微管蛋白抑制剂通过稳定或破坏微管蛋白聚合诱导细胞凋亡，包括： - 奥瑞他汀类（auristatins） - 美登素类（maytansinoids） - 微管溶素类（tubulysins） 2）DNA靶向剂通过烷基化/交联DNA发挥作用，涵盖： - 卡奇霉素（calicheamicin） - 吡咯并苯二氮䓬二聚体（PBD dimers） - 杜卡霉素类（duocarmycins） 而伊立替康活性代谢物SN-38则属于拓扑异构酶抑制剂 需特别说明的是，这些ADC弹头的作用机制虽与常规化疗药物类似，但其效力通常显著更强。 在选择ADC靶点时，必须综合考虑不同癌种对特定弹头类别的敏感性差异及弹头相关毒性。临床开发的核心目标之一就是评估哪类小分子对特定癌症适应症最有效，现有标准治疗方案正是基于这一原则确立。 以结直肠癌为例，获批药物（如卡培他滨、奥沙利铂、氟尿嘧啶和伊立替康）主要通过阻断DNA复制诱导细胞凋亡发挥作用。虽然仍有改进空间，但这些药物已展现出最佳疗效；而微管蛋白抑制剂（如长春花生物碱和紫杉烷类）对该癌种则无效。相反，乳腺癌化疗方案主要采用微管蛋白抑制剂（多西他赛、紫杉醇、长春碱等）。 需注意的是，虽然ADC递送的细胞毒素与全身给药可能存在敏感性差异，但选择ADC弹头时仍应遵循以下原则： a.优先选择：在该适应症中已证实最有效的细胞毒素类别；b.避免使用：既往证明无效的药物类别； c.毒性考量：弹头本身的脱靶毒性特征。 临床数据显示，ADC的毒性谱往往与游离弹头相似，提示多为脱靶效应。各类弹头均有其特征性毒性（与偶联抗体无关），例如： - 常见毒性：中性粒细胞减少症、血小板减少症（多数弹头） - 奥瑞他汀/美登素类：胃肠道毒性、周围神经病变 - 卡奇霉素：皮肤毒性、淋巴细胞减少症 基于这些特性，可针对性设计ADC方案： - 对于靶点在胃肠道肿瘤或正常胃肠组织表达的适应症，应慎用MMAE（甲基奥瑞他汀E）类ADC，以免加剧其固有的胃肠道毒性 - 鉴于ADC弹头的高效力，必须尽一切可能预防毒性发生 聚焦特定癌症适应症也有助于降低抗体偶联药物（ADC）的相关毒性。例如，由于血液系统靶点通常比实体瘤靶点更具组织特异性，靶向血液恶性肿瘤的ADC可能比靶向实体瘤抗原的ADC具有更好的耐受性。如前所述，仅有极少数靶点能被归类为肿瘤特异性靶点——以上皮性癌表达的抗原为例，因其源于上皮组织的特性，这些抗原在正常组织中同样表达的概率更高。血液系统靶点虽也可能在正常细胞中表达，但这类抗原通常仅存在于循环细胞群中，在实体组织中的表达极为有限。此外，血液细胞群通常比实体组织具有更强的再生能力，因此即使出现显著耗竭，这些细胞的再生能力也能在停止治疗后克服暂时性损伤。当然，这一结论的前提是靶点不同时表达在造血干细胞上，否则ADC的靶向作用可能导致关键血细胞群的永久性耗竭。相较于实体瘤，血液恶性肿瘤可能更易于采用ADC治疗，这得益于多重因素。目前学界认为，实体瘤治疗面临的主要障碍之一是：注入循环系统的ADC药物实际抵达或渗透至肿瘤部位的有效剂量过低。而血液恶性肿瘤则不存在这些障碍——其靶细胞群本就存在于ADC直接作用的循环系统中。此外，血液系统恶性肿瘤的靶点通常在患者群体中呈现同质性表达。鉴于这些潜在优势，目前已获批或进入后期临床试验的ADC药物中近半数靶向血液恶性肿瘤也就不足为奇。不过，早期临床试验中的ADC仍以实体瘤靶向为主，这表明尽管攻克实体瘤需要跨越更高门槛，但学界对新一代ADC仍充满信心，特别是曲妥珠单抗-美坦新偶联物在转移性乳腺癌治疗中的获批及显著疗效更强化了这一趋势。 提升ADC对实体瘤和血液恶性肿瘤疗效的潜在策略之一，是聚焦各类癌症相关的癌症干细胞（CSC）。根据假说，CSC是导致肿瘤治疗抵抗、后续复发及侵袭性增强的关键因素。利用ADC靶向攻击肿瘤中的CSC群体，有望获得更持久的临床响应。合适的靶点可能同时表达于CSC和普通肿瘤细胞，也可能为CSC特异性靶点。对于后者，可能需要具备"旁观者杀伤效应"的ADC，或联合普通肿瘤细胞疗法，以实现快速且持久的治疗响应。弹头选择对CSC靶向治疗同样关键：鉴于CSC处于静息状态或增殖速率较低，ADC需搭载能诱导这类低增殖细胞发生细胞毒性的弹头。 前文重点探讨了针对特定疾病类型的靶点筛选与ADC设计策略。然而，采用适应症无关的靶点发现方法同样具有可行性。 2.3 与适应症无关的ADC靶点选择若将适应症依赖型的ADC靶点选择比作导航软件——已知目的地却不知路线，那么适应症无关型（独立型）的ADC靶点选择则如同向旅行顾问描述理想度假体验，由其引导你前往未知的、却符合期待的秘境。后者通过筛选具有理想特性的靶点，再基于"该ADC在何处可能最有效"的假设来选定适应症。实现这种广谱靶点筛选的方法之一，便是表型筛选技术。 表型筛选是一种通过筛选能引发特定表型或细胞响应的分子来识别新靶点及活性分子的强效方法。传统应用场景包括：在特定疾病来源的细胞群中筛选化合物库，评估其诱导细胞毒性或调控特定信号通路的能力。该方法无需预先了解分子靶点或化合物作用机制，而是通过初筛命中结果逆向解析其作用机理。虽然此类筛选通常针对小分子库开展（事实上已用于ADC弹头发现），但同样适用于生物制剂筛选，并能以盲筛方式发现新型ADC靶点。例如：可利用单链抗体片段（scFV）库、噬菌体展示库、杂交瘤细胞甚至完整抗体库进行此类表型筛选。筛选过程可采用广谱肿瘤细胞系平台（如NCI60细胞系组）实现适应症无关性操作——不同于常规筛选关注化合物细胞毒性或致癌信号通路抑制能力，该方法可针对ADC所需特性（如细胞表面结合与内吞功能）直接筛选生物分子。尽管细胞表面定位是ADC靶点的重要属性，但并非所有细胞表面抗原在与抗体结合后都会发生内化或转运至溶酶体。因此，内化筛选对于ADC候选靶点的鉴定至关重要。目前已有多种内化检测方法可供采用，这些方法通常利用“pH敏感荧光染料”——其仅在核内体/溶酶体等低pH环境中激活发光特性。该技术可用于筛选杂交瘤细胞或其他抗体库，从而识别那些既能结合肿瘤细胞又能被内化的分子，这些分子往往具备成为优质ADC靶点的潜力。 当确认生物分子具有结合内化能力后，需进一步执行以下步骤： 1）靶点鉴定2）临床验证（确认靶点在相关肿瘤样本中的表达） 3）差异化筛选（通过正常细胞平行对照实验，筛选肿瘤细胞特异性结合内化的抗体与靶点） 最终可针对表达该靶点的癌症类型推进ADC开发。 尽管涉及内化及溶酶体转运检测的表型筛选属于新兴方法，但选择具有这些特性的ADC靶点已有先例。以CD74（MHC II类相关恒定链）为例：该靶点在绝大多数B细胞恶性肿瘤中表达，已知其作为抗原呈递过程的一部分会发生内化并转运至晚期核内体区室，这使其成为ADC治疗的理想候选靶点。基于此特性筛选出的抗体可介导极快速内化，由此开发的米拉珠单抗-阿霉素（milatuzumab-Dox）针对复发性多发性骨髓瘤、复发非霍奇金淋巴瘤（NHL）和慢性淋巴细胞白血病（CLL）开展临床研究。 另一个典型案例是CD79b——作为B细胞受体的信号组分，该抗原仅在B细胞及大多数NHL适应症中表达，且能在抗体结合后快速高效地内化并转运至溶酶体。这些特性使其成为极富前景的ADC靶点，由此开发的泊洛妥珠单抗维多汀（polatuzumab vedotin，一种与MMAE偶联的抗CD79b ADC）目前正针对弥漫大B细胞淋巴瘤和滤泡性NHL进行临床试验。这些成功案例为利用表型筛选鉴定新型ADC抗体及靶点提供了有力佐证。 如前述，通过分析肿瘤与正常细胞间差异基因/蛋白表达来筛选靶点，是适应症依赖型研发的常规策略。类似的基因组学与蛋白质组学方法同样适用于适应症无关型靶点发现。例如：通过生物信息学分析发现淋巴细胞抗原6复合体E位点（LY6E）可作为ADC靶点。基于TCGA和METABRIC数据库对35种人类肿瘤的基因组数据分析显示，LY6E在卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌和胃癌等多种肿瘤中相较正常组织显著过表达，目前已有以其为靶点的ADC进入临床前研究。 牛津基因组解剖计划（OGAP）作为专有蛋白质组数据库，收录了5000余种在恶性肿瘤中上调表达的跨膜蛋白。通过该数据库或Swiss-Prot、UniProt等公共数据库进行生物信息学分析（聚焦细胞表面蛋白），是另一种适应症无关性靶点发现策略。但需注意的是，正如前文强调，这些膜蛋白是否具备高效内化及溶酶体转运能力仍需实验验证。 2.4 结论与展望 近年来，ADC药物领域取得了重大进展。然而，优质靶点的筛选与最佳药物的构建仍主要依赖经验性测试，而非理性设计流程。目前虽已总结出若干提升ADC功能的指导原则——例如需要采用高稳定性的偶联化学和连接子以防止弹头非特异性释放，以及通过定点偶联技术提升产品均一性和稳定性——但该领域仍存在显著优化空间。在以下方面已获得更深入认知：1. 特定疾病适应症中最有效的ADC类型；2. 不同靶点表达谱下的最佳治疗方案；3. 弹头毒性差异：如微管抑制剂（MTI）类弹头对同样表达靶标的静止期或低增殖正常细胞毒性显著低于DNA损伤类弹头。随着当前众多ADC临床试验的推进，将会积累更多经验教训。但鉴于ADC结构的复杂性和参数组合的多样性，开发安全有效的ADC药物仍将持续依赖系统化的实验评估。这种"设计-构建-测试-学习"的迭代循环，目前仍是推动ADC技术突破的核心范式。尽管目前ADC临床试验中观察到的毒性多为脱靶毒性，但靶向毒性仍是需要通过谨慎选择靶点来解决的关键挑战。真正具有肿瘤特异性的ADC靶点数量极为有限，且我们对正常细胞中靶点表达何时会引发不可接受毒性的认知仍不完善。临床前体外模型对ADC疗效（尤其是安全性）的预测价值有限，因此早期体内研究在ADC开发中至关重要。在模型选择与结果解读时需特别注意：a. 模型局限性 - 部分癌细胞系异种移植模型不能准确模拟真实人类癌症- 应考虑使用更具代表性的模型（如患者来源异种移植模型、免疫健全的同源模型）b. 安全性研究挑战- 包括非人灵长类在内的安全模型，其靶点表达水平或模式可能与人类存在差异- 研究结果需结合靶点表达的种属差异进行审慎解读新型ADC策略有望拓展靶点选择范围，其中双特异性/多特异性ADC最具前景： - 双表位ADC（结合同一靶点的两个不同位点）：可显著增强亲和力或促进内化- 作用机制假说：多表位抗体可诱导抗体-受体复合物交联形成，从而将细胞内运输途径从循环转向溶酶体降解- 双靶点ADC（"二合一"药物）： 可同时杀伤不同癌细胞亚群- 最具突破性的应用：靶向肿瘤细胞共表达（而正常细胞不表达）的两种蛋白，通过更高亲和力实现肿瘤特异性结合因此，肿瘤靶点组合的鉴定将成为未来重要研究方向。提升ADC药物疗效与安全性的另一途径在于联合其他疗法。目前临床前与临床研究已开始探索具有叠加或协同效应的ADC组合方案。例如，最新研究表明某些ADC弹头可诱导免疫原性细胞死亡，因此与PD-1/PD-L1检查点抑制剂等免疫调节抗癌药物联用将产生增效作用。携带DNA损伤剂的ADC若与PARP靶向药等DNA修复抑制剂联用可能效果显著，或在DNA修复机制突变的肿瘤中引发合成致死效应。因此，针对这类联合疗法筛选ADC靶点，既能提升疗效又可降低用药剂量从而减少毒性反应。如何选择具有临床价值的优质ADC靶点仍是核心挑战——除肿瘤特异性靶点稀缺外，靶标表达异质性、内化效率低、抗原脱落及癌种分布局限等问题更增加了开发难度。新型ADC靶点发现策略（如表型筛选和肿瘤膜组学技术）与双特异性抗体等创新ADC技术的融合，将为这类抗癌疗法的研发开辟新前沿。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

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