Nitroxoline

一个药物的临床试验失败，就把这个药企的股价腰斩甚至判“死刑”，是否是对长线价值的误判？撰文| 邹继升编辑| 芳晨 顿河5月24日上午，康方生物的依沃西单抗揭盲了III期临床大部分数据，而接下来，便是戏剧性的股价闪崩，涨跌百分比一度超过42%，接近腰斩。投资者们对III期临床数据的不买账，很快便迎来了戏剧性反转：同日中午，国家药监局宣布通过优先审评审批程序批准依沃西单抗注射液上市。随之而来的，是股价的迅速回调。而这场戏剧性的股价背后所折射出的，是多数投资人对创新药临床数据的非理性看待，过度重视几个数字，而没有去深究其中的价值。反转再反转，临床数据如何解读实际上，此前绝大多数人都对康方生物的依沃西单抗寄予着厚望。非小细胞肺癌（NSCLC）在癌症领域一直是一个患者规模较大的适应证，目前较为常见的疗法是用酪氨酸激酶抑制剂（TKI）药物进行一、二线治疗，而目前主流的药物是三代酪氨酸激酶抑制剂，例如为产业界所熟知的奥希替尼。不过，目前许多药物都在耐药患者上折戟沉沙，包括默沙东研发的大名鼎鼎的K药。而这也是医生，患者和投资者共同期待康方生物所研创新药依沃西单抗的主要原因——它对耐药患者有着非常好的效果。国内方面，依沃西单抗已纳入多项突破性疗法认定。仅截止至2022年底，CDE就授予了依沃西单抗三项突破性疗法认定，国外方面，2022年12月，康方生物与summit达成了一场巨额的BD交易：授予其于美国、加拿大、欧洲和日本的开发和商业化依沃西的独家许可权。这场BD交易的首付款就是5亿美元，而潜在交易总金额，达到了50亿美元。从药企到投资者到院内医生与患者，从国内CDE到国外药企与美股投资人，所有人都对依沃西单抗寄予着非常高的期待值。而在5月24日，康方生物迎来了它的“黑色星期五”：股价大跌超42%。而近乎雪崩的恐慌背后，是大家对临床数据的“不买账”。具体来看，试验组和化疗对照组的中位无进展生存期（mPFS）分别为7.06月 vs 4.80月，而客观缓解率（ORR）分别为50.6% vs 34.4%。投资人看到这几个数据之后，做出的看空判断非常快，而这大概率是源于它们将这个数据简单地和另一家药企ORIENT-31III期临床作了对比。ORIENT-31研究设置了3个组，对照组为PD-1+化疗、化疗单独治疗组。三组mPFS分别为7.2个月、5.5个月（4.5, 6.1）和4.3个月。其ORR为43.9%、33.1%和25.2%。如果简单对比的话，对于mPFS而言，依沃西单抗比对照组所延长的无进展生存期确实比拿来与之对比的药物不占优势。这被业界认为是康方生物的数据披露后，资本市场集体看空的主要原因。不过，一些资深的医药投资者却仍然看好依沃西单抗，并认为目前康方生物存在着严重的低估，AK112也根本没到判“死刑”的程度。那么，其中的问题出在了哪里呢？这其中的奥秘，便是在III期临床试验中，纳入患者的基线情况。依沃西单抗入组的主要是经过三代EGFR-TKI治疗后耐药的患者，占比为86%，ORIENT-31入组的患者主要是经过一代或二代EGFR-TKI治疗后耐药的患者，占比77%，而接受过三代TKIs治疗的患者比例在34%-39%之间。作为一款本身就定位于治疗三代EGFR-TKI耐药患者的药物，康方生物受试者选择无疑对与其后的临床结果解读而言，具有优势。众所周知，经历过三代治疗的患者，与经过一代或二代治疗的患者相比，其身体状况、长期用药带来的不良反应等方面，有着更复杂的情况。因此，用该项临床试验的mPFS不能简单类比ORIENT-31的数据。事实上，二者的III期临床已经不是在同一个维度去竞争。康方生物所追逐的，是只用一个双抗降低毒性的同时，能够直接惠及三代耐药的群体。那么临床数据方面，既然mPFS并不能直接类比，而OS曲线要6月1日才会发表，那么有没有一个数据可以直观反映该药的效果呢？这便是肿瘤药物领域的金指标：HR（风险比值）。此次依沃西单抗的HR为0.46，表示相比于对照组，依沃西单抗降低了试验中54%的死亡风险，这个值越小，表示降低死亡风险的效果越显著。相比于HR值，mPFS值有诸多缺陷，例如其仅表示在随访的某一个时间点上疗效的差异，这就存在了时间上的局限性；此外，最重要的事，在不同的临床试验中，由于患者的基线不同，会很大程度影响患者进入临床终点的速度。因此，不同研究间单纯对比中位值来判断疗效差异缺乏合理性，中位值仅在同一研究不同研究组间有可比意义。而HR值对于研究数据的要求较低，受到个别患者状态的影响较小，并且可以通过单变量或者多变量COX模型进行校正，可包含的协变量包括年龄、性别、疾病分期和体能状态等方面，这使得其更加稳定。从产业角度来说，依沃西单抗象征着PD-1双抗时代的开启，目前来看，这个迭代的开局并不悲观，仍然非常值得期待。而之后，它也负有着更加重大的使命——挑战K药。 推荐阅读 * Biotech二哥之争：信达“历劫”归来？康方、复宏汉霖来势汹汹，再鼎疯狂补短板* 百济成万人大厂，和黄新药出海月入1亿！信达康方君实……创新七君争交2023成绩单！不止康方，创新药企股价的“共有之伤”事实上，股价易被临床数据所影响而导致不正常的上下波动，这并不是康方生物一家的问题，也不是康方生物一家特有的经历，许多创新药企业，都有着类似的遭遇。今年2月5日，亚虹医药的股价跌幅一度超过19%，而原因也是研发管线APL-1202的关键临床数据不理想，未能达到主要研究终点。APL-1202是一款口服的可逆性MetAP2抑制剂，具有抗血管生成、抗肿瘤活性及调节肿瘤免疫微环境的作用。此次适应证为化疗灌注复发的中高危非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）。它是全球第一个在抗肿瘤领域进入关键性/三期临床试验的口服、可逆性MetAP2抑制剂，也是国际上首个进入关键性/三期临床试验的NMIBC口服靶向治疗药物。作为一个首创药物，没有达到研究终点确实对其商业价值具有很大影响。但一组联用适应证的临床试验失败，真的值得让亚虹医药的市值在一天之内跌去20%吗？事实上，该药物根本不止这一个方案在做临床试验，其同时在NMIBC上布局了三项临床方案，分别是与化疗联用、单药对比化疗以及与免疫药物联用。而目前单药的临床方案已经进入了III期临床，与PD-1替雷利珠单抗也将在2024年Q3读出顶线数据。如果说二线治疗只是“开胃小菜”，那么一线治疗才是真正的“正餐”。根据西南证券研报计算，我国NMIBC一线中危新发患者2022年人数约3万人，而复发率却不到五成。两年、三年的复发率分别为44%与50%。因此，一线治疗才是真正值得关注的大体量市场。来凯医药的LAE002同样经历过类似事件。其核心管线LAE002是一种口服的小分子泛AKT激酶抑制剂，对标的是阿斯利康的卡帕塞替尼（capivasertib），而LAE002在临床前研究中的一些指标要优于卡帕塞替尼，被看做是是很不错的me better。LAE002选择的适应证路线与阿斯利康不同，阿斯利康选择优先拓展乳腺癌适应证，而来凯医药则优先拓展了铂耐药卵巢癌（PROC）。据国外分析师预测，卡帕塞替尼将会在2038年达到38亿美元的销售额。在今年1月，来凯医药公布LAE002联合紫杉醇治疗铂耐药卵巢癌（PROFECTA-II）的顶线数据，显示未能达到研究终点。当日，来凯医药跌幅达到36.31%。然而其管线依然在继续推进，目前，其HR+/HER2-乳腺癌适应证已经进入III期临床阶段，临床Ib期数据与阿斯利康的卡帕塞替尼疗效相当。由于其击中了HR+/HER2-乳腺癌适应证的CDK4/6耐药的痛点，将会成为这个适应证上非常值得期待的后线药物。不止港股的创新药企，哪怕是美股的大药企，也会面临着同样的问题。2020年5月中下旬，莫德纳研发的新冠疫苗在一期人体试验中取得了积极成果，45位受试者全部产生了抗体，其中8位产生了中和抗体。该消息推动美股周一创下一个多月来最佳涨势。然而，STAT News周二下午发布报道称，采访多位专家后得出结论，由于莫德纳未提供至关重要的数据，目前无法知道确定其疫苗效果。这直接导致了周二其股价的跳水，下跌了超10%。然而，后续莫德纳股价的走势却并没有被该新闻长期影响。其股价在2020年5月底是48美元左右，随着后续新冠疫苗的进度推进和最终上市，股价也随之一路走强，到了2021年，其股价最高点甚至达到了497美元，翻了十倍不止。创新药投资，越来越像是一场零和博弈。众多投资者都太渴望看到最后的那个临床数字。从短线的交易来看，许多投资者都在缜密计算着临床III期数据公布的日期，然后在该日期前一段时间开始“埋伏”该管线对应的药企，数据喜人，满载而归；试验失败，大亏离场。这样的交易，与其说是投资，不如说是“赌博”。而在最需要长线投资以及专业素养的医药投资领域，管线数据却被大多数短线投资者当做球赛的得分一般。而长线投资也不容乐观，许多投资者原本看好一个biotech，可以持有这个biotech的股票数年，但也可以因为它的临床数据揭盲后不及预期，加上网络舆论不到一小时的发酵，就出于恐慌迅速抛售该股票。在这做博弈的数十分钟内，许多长线投资者在被恐慌的情绪冲刷理智的过程中，会暂时忘记这个企业的其它管线，这个药物的前期数据，适应证从二线到一线治疗的拓展以及其它药物的后续管线承接，在“上头”的过程中暂时忘记了长线投资该有的逻辑。创新药投资永远是一场长线投资，药物的管线数据也不应该成为球赛的得分，来进行零和博弈。它很难，需要投资者有着较为专业的医药知识储备，对创新药真正的价值做出判断，是否这个临床数据真的不及预期；它也需要投资者在临床数据出来的恐慌情绪中保持镇定，去迅速判断该药物后续管线进展以及适应证市场空间大小，到底这个临床数据不及预期，对其影响究竟会造成多大的影响。如果再直接些说，那便是因为一个药物的临床试验失败，那么就把这个药企的股价腰斩甚至判死刑，是否是对该药企长线价值的误判？或许这应该具体问题具体分析，但是一位创新药投资者而言，在面对临床数据时应该理智大于情绪，加仓和减仓的依据应该是这款药物真正的长期价值，而不是网上的一些小道消息。毕竟创新药投资，回报的是那些真正能够挖掘到金矿并且坚守到其商业化而没有中途离开的人。参考资料：1.中国临床肿瘤学会（CSCO）非小细胞肺癌专家委员会, 抗肿瘤药物安全管理专家委员会.三代EGFR-TKI在EGFR突变NSCLC治疗中应用的专家共识（2022年版）[J]. 中国肺癌杂志. 2022;25(9):627-641.2.https://mp.weixin.qq.com/s/6bGVR3H7C1lHNnjKL36K0w3.https://baijiahao.baidu.com/s?id=1751521251918810909&wfr=spider&for=pc4.西南证券研究所研报回复“V”，了解电子期刊详情精彩推荐CM10 | 集采 | 国谈 | 医保动态 | 药审 | 人才 | 薪资 | 榜单 | CAR-T | PD-1 | mRNA | 单抗 | 商业化 | 国际化 ｜ 猎药人系列专题 | 出海启思会 | 声音·责任 | 创百汇 | E药经理人理事会 | 微解药直播 | 大国新药 | 营销硬观点 | 投资人去哪儿 | 分析师看赛道 | 药事每周谈 | 医药界·E药经理人 | 中国医药手册创新100强榜单 | 恒瑞 | 中国生物制药 | 百济 | 石药 | 信达 | 君实 | 复宏汉霖 ｜翰森 | 康方生物 | 上海医药 | 和黄医药 | 东阳光药 |  荣昌 | 亚盛医药 | 齐鲁制药 | 康宁杰瑞 | 贝达药业 | 微芯生物 | 复星医药 ｜再鼎医药｜亚虹医药跨国药企50强榜单 | 辉瑞 | 艾伯维 | 诺华 | 强生 | 罗氏 | BMS | 默克 | 赛诺菲 | AZ | GSK | 武田 | 吉利德科学 | 礼来 | 安进 | 诺和诺德 | 拜耳 | 莫德纳 | BI | 晖致 | 再生元

1.引言病毒是专性寄生虫。病毒繁殖周期的成功完成和随后向新宿主的传播依赖于策略的进化，这些策略允许病毒劫持宿主的细胞机制，调节宿主细胞的存活并逃脱宿主的防线。狂犬病毒(RABV)是一种可引起致死性脑炎的嗜神经病毒，在被感染动物(主要是狗，但也有蝙蝠和其他动物媒介)咬伤或抓伤后通过唾液传播。在进入神经肌肉连接处或通过突触间隙后，RABV颗粒通过轴突间隙逆行运输向细胞体传播。病毒复制发生在细胞体和树突中，从中释放新形成的病毒颗粒。RABV几乎只感染神经元(包括运动神经元和感觉神经元)，并从一个神经元传播到下一个神经元，从脊髓到脑干，再通过脑神经到达唾液腺。RABV病毒一旦进入唾液腺，就会随唾液排出体外，然后传播给新的宿主。在其旅程中，RABV在不同的步骤面临宿主的防御：首先，通过叮咬在皮肤或肌肉中传递的RABV颗粒被早期防御线(先天免疫反应)迅速检测到，这有助于局部消除微生物，并在外围(神经外)建立特异性免疫反应(B细胞和T细胞)。在感染肌肉细胞并进入神经后，病毒必须应对受感染肌肉和受感染神经元发起的先天免疫反应，这些免疫反应具有对抗感染的能力。一旦感染在神经元中稳定下来，受感染的神经元就会通过浸润的T细胞和限制神经元组织炎症的机制免受破坏。此外，NS（神经系统）对免疫稳态的中枢控制导致外周免疫反应性的不适当下调，这也可能促进病毒在NS中的传播(图11.1A)。保持神经网络的完整性直至脑干，为病毒到达唾液腺并传播到新的宿主提供了机会。RABV与免疫反应相互作用的知识主要是在实验性狂犬病小鼠模型中获得的，使用实验室适应的RABV株和有时通过肌肉或足底(脚垫)途径注射的RABV街毒株来模拟咬伤的自然传播。特别是使用攻击病毒标准株(CVS)可以在该模型中复制致死性狂犬病脑炎。这种病毒侵入脊髓和大脑区域并引起致命的脑炎。一些致病性减弱的RABV突变株只引起NS（神经系统）短暂感染。巴斯德病毒株(PV)就是这种情况，它导致一种非致命性流产疾病，其特征是NS的短暂和限制性感染，随后是不可逆的肢体瘫痪。这也是重组实验室RABV毒株设计的情况，希望能开发出新的狂犬病活疫苗。这些毒株已被减毒，它们失去了有毒力的RABV毒株的特征：它们刺激强烈的免疫反应，失去了神经侵入性和逃避宿主防御反应的能力。他们的研究揭示了一种毒性极强的RABV入侵NS并逃避宿主防御机制的特性。 图11.1（A）RABV（狂犬病毒）生命周期的成功实现依赖于神经元网络的保存。一旦RABV进入NS（神经系统），其进程不会被低效的宿主防御机制打断。这可能是由于该病毒的内在能力:(1)逃避由受感染肌肉细胞发起的先天免疫反应，  (2)逃避受感染神经元发起的先天免疫反应，(3)通过PD-L1等免疫逃避分子的上调，消除向NS迁移的保护性T细胞，(4)限制NS组织中的炎症反应，(5)触发神经介导的免疫抑制，从而抑制外周的免疫反应。(B)I型干扰素（IFN）在RABV感染中的双重作用可能是由于NS的区域间隔特性。我们可以区分感染神经元的网络(其中RABV通过病毒蛋白介导的机制逃避IFN反应)(白色矩形框)和由胶质细胞构成的神经网络(黄色框)的其余部分(其中可以产生I型IFN)(异型细胞IFN)。异型细胞I型IFN (IFN-β)的产生不受控制，因为胶质细胞没有被有效感染。RABV感染在IFN产生减少的神经网络中迅速传播，而异型细胞IFN- β可能通过上调I型IFN依赖的PD-L1(和HLAG)蛋白的表达来促进RABV感染，这些蛋白既是抗炎分子，也是免疫颠覆分子，允许消除迁移的T细胞。 2.狂犬病毒的先天免疫反应2.1 RABV触发宿主先天免疫反应及病毒规避机制先天免疫反应是抵御感染因子的第一道防线。它涉及1型干扰素(IFN-α/β)、炎症细胞因子和趋化因子的释放，补体的激活以及巨噬细胞、中性粒细胞和NK细胞进入感染组织的吸引。这种先天免疫反应是在病原体进入后的最初几个小时内触发的，不是病原体特异性的。它与适应性免疫反应形成对比，适应性免疫反应是针对特定病原体量身定制的，需要几天才能形成。先天免疫系统可以通过识别危险信号的“模式识别受体”(PRRs)和微生物表达的“病原体相关分子模式”(PAMPs)来感知微生物的存在。Toll样受体(TLRs)或视黄酸诱导基因(RIG)样受体(RLRs)是识别病毒dsRNAs和ssRNAs的重要PRRs(模式识别受体）。TLRs是一个有13名成员的家族。RLRs家族主要参与病毒检测，包括三种蛋白：RIG蛋白1 (RIG- i)、黑色素瘤分化相关基因5 (MDA-5)、遗传学与生理学实验室2 (LGP2)蛋白。其中一些受体位于细胞表面，检测细胞外环境中存在的危险信号。这就是TLR2和TLR4的情况。其他受体在细胞质(RLRs)或内体囊泡(TLR3, 7-9和13)中表达，能够检测细胞内病原体进入或复制的早期步骤中产生的危险信号。特定受体的招募取决于它们结合的基序和受体的定位。例如，TLR3仅感知长度大于40-50个碱基对的dsRNA，这一限制允许形成复杂的同型二聚体，将两个TLR3分子与dsRNA聚集在一起。RLRs检测病毒RNAs，但仅检测存在于细胞质中并在5’端编码三磷酸的病毒RNAs。由此产生的信号转导级联分别涉及TRIF、Myd88或IPS-1，分别作为TLR3、TLR3以外的TLRs和RLRs的适配器。它们会引发趋化因子、炎症细胞因子和干扰素（IFN）等抗病毒分子的产生。特别是，在TLR7或TLR9刺激后，血细胞亚群浆细胞样树突状细胞(pDCs)是I型IFN的重要来源。pDCs既参与早期抗病毒反应，也在成熟并获得抗原呈递能力后参与T细胞的活化。已知RABV通过检测病毒基因组的5’-三磷酸碱基配对，在其感染的细胞中触发RIG-I 介导的先天免疫反应。病毒已经进化出复杂的策略来逃避先天免疫反应。RABV就是这种情况。RABV的N和P蛋白是参与RNA合成和对抗宿主先天免疫反应的多功能蛋白。N蛋白限制RIG-I信号传导，而P蛋白抑制IRF3和IRF7磷酸化，抑制STAT1核易位，并在细胞质中隔离抗病毒蛋白，即早幼粒细胞白血病(PML)蛋白。因此，可以在体外观察到IFN反应的下调。例如，在RABV感染的人类有丝分裂后神经元(NT2-N)中，早在感染后6小时就可以看到IFN-β基因的转录，并且在感染后的前24小时产生IFN - β蛋白，此后转录和生产下降。然而，RABV触发的逃避机制仅适用于RABV感染的细胞，因为它依赖于靶细胞细胞质中N和/或P蛋白的存在。因此，IFN反应的规避机制不适用于未感染的细胞，如外周的前哨细胞(巨噬细胞，pDCs)，也不适用于NS中的胶质细胞，如星形胶质细胞，这使得这些未感染的细胞仍然能够产生先天免疫反应并产生异型细胞的1型IFN 。2.2 外周的先天免疫反应RABV通过咬伤或抓伤在皮肤、皮下组织或肌肉中接种。宿主体内的防御机制会迅速检测到侵入宿主的病毒。干扰素反应在进入部位触发，具有抗病毒作用。通过比较两组小鼠，亲代小鼠和缺乏I型IFN受体(IFNAR)的小鼠在后肢注射CVS后大腿肌肉中的病毒载量，间接获得了证据。与亲代小鼠相比，缺乏IFNAR的小鼠通过病毒RNA积累测量的病毒载量有所增加。这一观察结果表明，在感染的早期阶段，一些病毒颗粒可能很容易被消除。在注射部位产生I型IFN的细胞可能是前哨细胞(pDCs或巨噬细胞)。这些细胞的感染对于产生先天免疫应答是必不可少的，正如体外实验所示，在培养物中加入灭活的RABV可以激活巨噬细胞。然而，有体外实验证据表明RABV可以在体外感染骨髓来源的常规 DCs (cDCs) 和巨噬细胞。尽管是非生产性感染，RABV会在这些细胞中触发IFN、细胞因子和趋化因子的产生。在细胞培养中，在RABV存在的情况下，cDCs 的成熟受IFN控制，IFN的产生可能依赖于通过RIG-I 和 mda-5 受体而不是TLR7对胞浆内RABV RNAs的识别，这是cDCs 的一个特征。然而，与减毒株相比，毒力强的RABV株似乎触发较弱的DCs（树突状细胞）激活。实验采用高度减毒重组狂犬病病毒(rRABV)进行基因修饰，允许表达趋化因子或G蛋白的多个拷贝，以寻找更有效的狂犬病疫苗。这些RABVs 比亲本rRABV株更能激活外周的 cDCs 。比较犬RABV毒株(来自尼日利亚一只狗的DRV-NG11 或来自墨西哥一只狗的RABV)和高度减毒重组RABV毒株(CVS-B2C或TrisGAS毒株)激活 DCs的能力的实验表明，与减毒RABV毒株相比，犬RABV毒株在体外对 DCs的刺激较差，因此引发的抗体免疫反应低于减毒RABV毒株。来自墨西哥的犬RABV毒株对DCs 的激活较差是由于该病毒与 DCs 的结合程度较低。这些数据表明，DC激活与RABV毒株的致病性呈负相关。在臭鼬感染野生型RABV毒株的实验中发现，在注射部位的肌肉细胞可被感染。在体外，日本八尾町西原（Nishigahar）RABV毒株及其衍生株Ni-CE毒株在小鼠成肌细胞G-8细胞中可再现肌肉感染，这两个毒株然后在小鼠肌内注射后可分别引起致死性感染和亚临床感染。与NI-CE株相比，只有八尾町西原（Nishigahar）RABV毒株在肌肉细胞中触发稳定的病毒复制。研究表明，Nishigahara RABV株的磷酸化蛋白的INF拮抗剂主要通过磷酸化蛋白的 N端截断异构体促进肌肉细胞感染并进入周围神经。这些观察结果表明，RABV毒株感染肌肉细胞的能力与毒株的致病性相关。因此，似乎毒力强的RABV毒株在进入体内后，利用特定的机制使其至少部分地逃避宿主的先天免疫反应。这些机制可能有助于限制病毒颗粒的早期消除，并促进病毒进入NS。2.3 神经系统的先天免疫反应与生物体中的大多数组织一样，神经系统表达不同类型的受体，能够感知危险和病原体信号。中枢神经元表达TLR（Toll样受体）1-4以及TLR7和TLR8。它们表达维甲酸诱导基因样受体 RLRs (RIG-I and Mda-5) ，但不表达RLR LGP2－它似乎在神经元中被主动降解。周围神经丛和周围神经(背根神经节感觉神经元和坐骨神经纤维)表达TLRs (TLR3, 4和7)，其中TLR3表达突出。星形胶质细胞是病毒感染(包括RABV感染)期间IFN(干扰素）- β的主要生产者。除了星形胶质细胞外，神经元会对IFN和IFN生产者产生应答，在先天免疫反应中发挥积极作用，可分泌I型IFN[在大脑中主要是IFN-β，但不分泌IFN-α或III型IFNλ]。 2.3.1 RABV在感染的神经元中逃避IFN反应感染后，人类神经元可以通过激活IRF3和NF-kappa B产生经典的初级IFN反应，以及继发性IFN反应(激活STATs和IRF7)，导致细胞因子(IL-6, TNF- α)和趋化因子(CXCL10和CCL5)的产生。抑制IFN反应有利于RABV感染，这一点得到了证实:脑内感染RABV　P蛋白突变体的小鼠由于缺乏降低宿主IFN反应的能力而死亡 ，而且与亲代小鼠相比，CVS肌内注射后，NS中特异性缺乏IFNAR的小鼠死亡时间更早。这两个实验表明RABV感染对IFN信号敏感，P蛋白介导的IFN逃避在NS中是有效的。此外，研究表明，至少对于一种日本疫苗株(西原RABV株)而言，毒力取决于该毒株逃避先天免疫反应的能力，而这一过程受P和N蛋白逃避先天免疫反应的能力控制。因此，在受感染的神经元中逃避IFN反应可能是RABV通过神经元网络在NS中进展的关键，从而使病毒能到达脑干和唾液腺。2.3.2 RABV限制NS内的炎症反应炎症是宿主对细胞损伤或微生物进入的反应的关键组成部分，导致炎症介质的产生，包括补体、粘附分子、环加氧酶及其产物，以及细胞因子和趋化因子。当炎症部位位于神经系统中时，这些毒性因子的释放会产生严重后果，严重受累可导致神经系统病变并导致神经元死亡。在大脑中，神经元和神经胶质细胞都能产生抗病毒、炎症和趋化因子反应。星形胶质细胞可以通过产生促炎细胞因子和趋化因子来响应大脑中存在的先天免疫刺激。然而，小胶质细胞在神经炎症的诱导中起着重要作用，这一特征可能反映了先天免疫受体的密度或亚细胞定位。不同RABV毒株在小鼠NS中引发炎症反应的转录组和蛋白质组学分析表明，RABV感染可刺激趋化因子(CCL5、CCL2、CCL9和CXCL9)和炎症因子(IL-6、IL-12)的表达。然而，在RABV感染的NS中的炎症反应是短暂的，大多数标记物的表达在脊髓中迅速下调，在大脑中则略有延迟。RABV感染的神经系统中表达炎症标志物(如 TNF-α或IL-1)的细胞存在于被感染的神经元中，但不存在于邻近的胶质细胞或内皮细胞中。与博纳（Borna）病毒等其他脑炎病毒感染相比，RABV仅引发有限的炎症。此外，通过比较不同致病性RABV毒株引发的炎症反应，发现致病性越强的毒株引发的炎症反应越弱。例如，对感染野生型RABV毒株（街毒株），如从中国分离的犬RABV毒株或从北美分离的蝙蝠RABV毒株(银毛蝙蝠分离株)的小鼠的NS进行的转录组分析表明，与实验室毒株相比，先天免疫反应被刺激，但程度更有限。除了唯一的例外，即接种了编码趋化因子的重组RABV的小鼠因单核细胞和T细胞大量涌入大脑而死亡的实验，其他大多数实验证据都表明，炎症不会促进RABV感染，而是限制病毒通过NS的传播。在RABV感染之前，用促炎髓鞘碱性蛋白(MBP)免疫小鼠，提高了小鼠对强毒蝙蝠RABV毒株的存活率，相反，用类固醇激素和米诺环素(minocycline，一种具有抗炎特性的四环素衍生物)治疗可降低脑炎症，增加了死亡率。此外，重组RABV过度表达TNF- α通过诱导强烈的细胞浸润和小胶质细胞激活来减弱RABV的复制。感染NS中的这种低炎症反应可能有助于保持血脑屏障的完整，这与RABV致病性相关。非致病性RABV毒株触发血脑屏障的早期和短暂开放，而致病性毒株则不会。综上所述，这些数据表明，致病性RABV毒株在NS中引发中度炎症反应，并提示在感染过程中建立了调节机制以减少RABV诱导的NS炎症。神经炎症的局限性由几种机制引起。RABV感染避免了神经元凋亡，很少感染神经胶质细胞或仅短暂感染;感染的这两个内在特征有助于限制神经炎症。此外，在RABV感染过程中，NS中抗炎分子的表达上调。抗炎可溶性蛋白TNFR1和2就是这种情况，它们可以干扰TNF（肿瘤坏死因子）与其受体的结合。细胞因子信号传导抑制因子(SOCS)也是如此，SOCS是一种负性控制细胞因子信号转导的蛋白质家族，RABV感染狗的大脑中，在受感染神经元附近的非感染细胞中，SOCS-1被上调。更重要的是，RABV上调了非经典MHC分子HLA-G和PD-1(程序性死亡蛋白-1)的配体B7-H1(也称为PD-L1)在神经元中的表达，在PD-L1感染的NS中也是如此。此外，RABV、HLAG和PD-L1分子利用它们的免疫耐受特性(见下文)，现在也被认为提供了限制组织炎症的负反馈。对于PD-L1来说尤其如此，它在病毒性脑炎期间抑制促炎分子(如iNos和tnf-α)的表达并激活T调节细胞(Tregs)，从而限制神经退行性疾病的炎症。而HLA-G通过促进IL-4、IL-3和IL-10的分泌以及下调IFN γ和 TNF- α的产生，从而影响细胞因子向Th2模式的平衡。RABV感染对炎症的限制可能通过以下途径实现:(1)减少单核白细胞、单核细胞和巨噬细胞进入神经系统，(2)维持血脑屏障的不渗透性，(3)最大限度地减少可能损害神经系统功能和宿主生存的神经毒性分子的释放。这些条件不仅可以保持受感染神经网络的完整性，还可以保持宿主的生命，使病毒在受感染宿主过早死亡之前到达脑干和唾液腺。3.RABV的适应性免疫反应即使是在肌肉中接种了能迅速进入神经系统的嗜神经病毒，针对这些微生物的适应性免疫应答也总是发生在外周，而不会发生在缺乏淋巴器官的神经系统。适应性免疫反应的触发发生在淋巴结或脾脏等淋巴器官中，依赖于pDCs和1型IFN的激活，它们在遇到微生物后以TLR7和TLR9依赖的方式产生。外源抗原曾由活化的 DCs经MHC II类外源性递呈途径进行过处置，CD4+ T淋巴细胞可识别这样的抗原。一旦被MHC呈递，被消化的外来抗原的肽被携带适当T细胞受体(TCR)和CD4分子的T细胞识别。通过TCR和CD4分子呈现的信号触发T细胞的激活并分化为两个功能亚群，T辅助1 (Th1)和T辅助2 (Th2)细胞。这两个亚群的区别在小鼠免疫系统中比在人类免疫系统中更明显，这是基于它们分泌的细胞因子:干扰素- γ是Th1细胞的标志性细胞因子，而白细胞介素-4 (IL-4)是Th2细胞的标志性细胞因子。Th1细胞的产生受巨噬细胞和DCs产生的IL-12的控制。Th1细胞通过IFN- γ的产生限制病原体的增殖，并为B淋巴细胞产生抗体提供帮助。与CD4+T细胞不同，CD8+ T细胞能够识别通过内源性途径表达MHC I类分子的细胞处理过的外来抗原。被感染的细胞将嵌入MHC I类分子沟槽中的病原体肽输出到细胞表面。带肽的感染细胞激活表达CD8辅助表面分子和适当的TCR的T细胞。活化的CD8+T淋巴细胞产生IFN-γ，并通过穿孔素（perforin）和颗粒酶（granzyme）释放和/或Fas介导的裂解通过细胞毒性杀死感染的细胞。3.1 RABV在外周的特异性免疫反应可引发脑炎的RABV CVS毒株注射小鼠后肢后，可引起腘窝引流淋巴结和脾脏淋巴结增大。引流淋巴结充满表达活化CD69标记物的活化T细胞。激活也可以在外周血淋巴细胞中观察到。脾脏中有强烈的B细胞反应。当给小鼠注射致病性较低的病毒(PV株)时，在淋巴结和血液中观察到类似的T细胞活化，这表明适应性免疫反应与RABV毒株的毒力无关。事实上，当给小鼠注射一种可引发脑炎的RABV蝙蝠毒株(银毛蝙蝠狂犬病毒，SHBRV)或致病性较低的病毒(CVS- F3，G蛋白的编码有突变的CVS突变株)时，产生的适应性免疫反应(中和抗体、CD4+、CD8+ T细胞反应)并没有什么不同。然而，在不激活DCs的犬RABV毒株实验性感染犬的情况下，免疫反应受损。这表明RABV犬毒株和RABV蝙蝠毒株在外周引起的免疫反应并不相同。免疫反应的激活取决于RABV毒株的性质，这一假说可以解释为什么有些患者在外周没有产生抗体反应的情况下死亡，而另一些患者也死于狂犬病，尽管他们的血液中存在中和抗体，证明在外周已产生了免疫反应。RABV毒株在外周引发的适应性免疫反应可能与RABV的致病性无关，这种反应可能发生在病毒已经进入NS后的后期。然而，不能排除适应性免疫反应可能在感染的最后阶段发挥作用，此时病毒颗粒已在唾液腺中产生。在臭鼬狂犬病实验模型中观察到，环磷酰胺（cyclophosphamide）诱导的免疫抑制可增加唾液腺的感染。  3.2 RABV会杀死迁移的T细胞   大多数NS（神经系统）感染是通过浸润T细胞来控制的。例如，在西尼罗病毒脑感染过程中观察到这一点，被感染NS中炎症细胞产生的趋化因子吸引的CD8+ T细胞是控制感染的关键因素。在狂犬病中，T细胞对感染的杀毒效率低下，并被病毒特异性灭活。对狂犬病尸体解剖病例进行的免疫组织化学研究显示，死亡的细胞是白细胞，而不是神经元。这一观察结果在感染致脑炎RABV CVS株的小鼠中重现。脑和脊髓切片的免疫细胞化学显示，尽管有大量的病毒抗原，但感染的神经元不会死亡。相反，迁移的T细胞(CD3+)发生凋亡。此外，CVS毒株在免疫活性小鼠Balb/c小鼠和Nu/Nu Balb/c小鼠中的致病性相似，表明T细胞不能控制致脑炎狂犬病的结果。与此形成鲜明对比的是，剥夺T细胞可将流产感染转化为类似致脑病CVS毒株感染引起的脑病狂犬病，这表明T细胞是限制流产RABV毒株引起NS感染的关键因素。事实上，在感染RABV PV流产株的免疫小鼠脊髓中分析细胞凋亡时，没有观察到T细胞的杀伤;相反，受感染的神经元会死亡。总之，这些观察结果表明，T细胞在NS中具有控制RABV感染的保护潜力，尽管它们控制RABV感染的能力受到致脑炎RABV毒株的阻碍。以下将描述对致脑炎RABV毒株逃避宿主T细胞应答机制的进一步研究。    3.2.1 RABV感染的NS中淋巴细胞的进入在病理条件下，包括嗜神经病毒感染后，单核白细胞、单核细胞和巨噬细胞被招募到神经系统。一旦被激活，表达表面粘附分子的T细胞、B细胞和巨噬细胞就有能力通过毛细血管后小静脉进入神经系统。这种进入与血脑屏障对渗透的控制无关，因为只须调节溶质而不是细胞的进入。致脑炎RABV毒株感染未能获得T细胞保护，可能与T细胞进入NS受阻有关。而事实也可能并非如此，因为在感染致脑炎RABV毒株后，血液T细胞表达活化标记物(CD69)，并高度阳性表达塌陷反应介质蛋白2 (CRMP2)，这是T细胞极化和迁移的标志物。大脑中富含这种类型的细胞，这表明RABV激活的T细胞具有迁移特性。因此，激活和进入神经系统并不是 T细胞保护功能的限制因素。当比较被流产或致脑病RABV毒株感染的小鼠NS中的T细胞浸润情况时，在两组小鼠中，浸润的T细胞侵入薄壁组织（parenchyma）的情况相似。然而，这种现象在被致脑炎毒株感染几天后被中断，而在PV株感染的NS中CD3+ T细胞的积累是持续的。在CVS株感染的脑内T细胞的消失和NS内凋亡细胞数量增加是伴随事件。这些观察结果强烈表明，致脑炎RABV毒株，而不是流产毒株，可在被感染的NS中引发 T细胞存活的不利条件。中和抗体被认为是预防RABV的关键因素。B细胞进入RABV感染的NS并局部分泌抗体有助于NS清除减毒的RABV。值得注意的是，在致脑炎RABV的感染过程中，大脑中几乎检测不到B细胞，这表明限制进入或特异性破坏迁移B细胞也可能有助于RABV保持毒力。  3.2.2 RABV感染的NS中T细胞的破坏肿瘤通过多种机制逃避免疫监视，包括抑制肿瘤特异性T细胞免疫。为了逃避保护性T细胞的攻击，肿瘤细胞上调某些表面分子如PD-L1、Fas-L和HLA-G的表达，从而触发激活T细胞中的死亡信号，这些T细胞表达相应的配体PD-1 (PD-L1)、Fas (FasL)和CD8(以及其他配体)(HLA-G)。研究评估 RABV感染的神经元是否上调免疫反应性分子以杀死激活的T细胞，遵循类似于肿瘤细胞选择的逃避策略，已经在体内和体外进行了研究。体外实验发现RABV感染可上调人神经元表面HLA-G的表达。在体内，将杀死T细胞的CVS毒株和不杀死T细胞的PV毒株引起的实验性狂犬病小鼠进行比较，发现CVS毒株感染的NS上调FasL的表达，而PV毒株感染的NS则没有上调FasL的表达。在缺乏功能性FasL的小鼠中，NS中的 T细胞凋亡少于对照小鼠。值得注意的是，这些小鼠的RABV发病率和死亡率都降低了。通过Fas/FasL途径破坏T细胞可通过吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)增强，RABV上调其在受感染神经元和大脑中的表达。IDO酶将细胞外色氨酸转化为犬尿氨酸（kynurenine），以而降低其在微环境中的浓度，从而显著提高附近任何T细胞对Fas配体诱导的凋亡的敏感性。此外，RABV感染的大脑上调另一种免疫反应性分子PD-L1的表达。而未感染的NS几乎没有PD-L1表达，RABV感染触发神经的PD-L1表达，随着感染的进展而增加。感染的神经元和未感染的神经细胞，包括星形细胞样细胞，显示PD-L1阳性。PD-L1缺陷小鼠(PD-L1 /小鼠)感染RABV可显著降低临床症状和死亡率。在PD-L1 /小鼠中RABV毒力的降低伴随着移动T细胞中CD8+ T细胞凋亡的减少。总之，这些实验表明，尽管在外周触发了经典的适应性免疫反应，淋巴细胞浸润到受感染的神经系统中，但这种免疫反应可能在神经系统中提供的保护，在很大程度 上受到RABV感染的阻碍。4.RABV感染触发中枢神经系统介导的免疫无反应RABV能触发免疫保护的抑制，其完成的机制是，神经系统在面对过度炎症时会试图恢复体内平衡，因而会触发对免疫的神经元反射控制，从而引起中枢性免疫抑制。RABV某个病原毒株的感染可诱导免疫无反应，其特征是T细胞功能受损，细胞因子模式改变，T细胞增殖受到抑制，免疫细胞被破坏，但淋巴器官中免疫细胞的比例(CD4/CD8比值的恒定性)未改变。这导致RABV感染的哺乳动物的脾脏和胸腺萎缩。已发现TNF- α受体在RABV免疫无反应性中发挥作用，因为与野生型相比，缺乏TNF-αp55受体的免疫细胞的免疫抑制程度较低。最重要的是，对大脑进行感染是必需的，因为流产的RABV毒株仅感染脊髓，在NS感染后不会发生免疫无反应。这表明中枢控制外周免疫反应的神经系统特性可能被触发。神经系统通过两个主要的免疫-神经内分泌通路调节免疫功能:下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴和由交感神经和副交感神经纤维组成的自主神经系统(ANS)。当大脑感知到周围存在过多的炎性细胞因子(如TNF-α、IL-1β或IL-6)时，通过神经元(主要通过迷走神经的局部传入纤维)和体液途径激活稳态反射。位于额叶、下丘脑和脑干的神经中枢处理这些输入。这种由NS控制的普遍免疫无反应性可能有利于RABV的传播，因为HPA（下丘脑-垂体-肾上腺）轴效率较低的小鼠品系对狂犬病的易感性较低。这种中枢免疫抑制可能限制肌肉或唾液腺感染的外周控制(见图11.1)。因此，RABV感染不仅通过上调PD-L1和FasL分子积极抑制NS中的 T细胞反应和炎症，而且还受益于NS触发中枢免疫抑制以维持全身稳态的内在能力。　　5.干扰素对RABV的毒力具有矛盾的作用一系列实验清楚地表明，RABV感染对IFN（干扰素）信号的激活是敏感的，并且P蛋白介导的IFN逃避是有效的。然而，在感染过程中，IFN在整个RABV感染NS中的诱导作用远未被废除。事实上，在后肢注射RABV (CVS株)后，脊髓和脑内的进行性感染伴随着以IFN－1型反应为特征的强大的先天免疫反应。这并不是实验室毒株特有的特性，因为在感染高毒力RABV毒株，DOG-4毒株或中国犬BD06 毒株后，也有类似的观察结果。在感染期间，在神经系统可以产生干扰素，这并不奇怪，因为RABV进化的逃避干扰素反应的机制仅限于受感染的神经元，这是唯一表达P和N蛋白的细胞类型。这些机制不能在神经胶质细胞中起作用，因为它们不表达任何病毒蛋白，神经胶质细胞在体内很少被感染。神经胶质细胞是有效的先天免疫应答者，尤其是IFN的应答者。它们不需要被感染就能产生先天免疫反应，正如用灭活的RABV处置小胶质细胞培养物所显示的那样。事实上，在RABV自然感染的狗或实验感染的小鼠的大脑中，表达细胞因子的细胞不是被感染的神经元，而是未被感染的具有胶质或巨噬细胞形态的邻近细胞，这表明未感染的胶质细胞(如星形胶质细胞)可能是IFN应答者和异源细胞IFN的产生者，异源细胞IFN由邻近细胞产生，而不是由感染细胞产生。在这种情况下，我们可以区分由受感染神经元网络组成的神经系统的感染部分，其中IFN反应受到病毒逃避机制的限制，而由胶质细胞组成的非感染部分则可以抵抗RABV逃避机制，并且可以解决异源细胞IFN反应。人们可能想知道异源细胞IFN的功能是什么。可以推测，异源细胞IFN使非神经元细胞对感染具有抵抗性。RABV嗜神经性(趋向神经元的嗜性)和病毒扩展可以通过这种方式得到促进，正如另一种嗜神经性病毒－脊髓灰质炎病毒所展示的。利用重组形式的IFN- β治疗复发型多发性硬化症的经验教训强调，IFN促进抗炎症分子的产生，并减少炎症细胞通过脑毛细血管内皮的运输。如果在RABV感染的大脑中也显示出类似的功能，那么可以认为IFN可减少炎症细胞的运输，并促进RABV通过上调抗炎分子的产生而引发低炎症环境。除了固有的抗病毒或抗炎特性外，I型IFN还控制大量基因(ISG，干扰素刺激基因)的表达。这些基因包括PD-L1和非经典MHC I类分子HLA-G，这两个基因在RABV感染中以依赖干扰素的方式实现表达的上调。PD-L1已被证明有助于在RABV感染中杀灭游走T细胞。此外，PD-L1和HLA-G具有抗炎功能。 为了解释IFN在RABV感染中的双重作用，可以认定，在RABV感染过程中，NS中产生的异源细胞IFN有助于RABV感染建立的低炎症环境和RABV介导的对游走T细胞的杀伤，而IFN的抗病毒作用发生在被感染的神经元中(图11.1B)。6.结论因此，RABV选择了一系列机制来逃避宿主的免疫监视，这可能解释为什么在没有暴露后治疗(PET)的情况下，狂犬病是死亡率接近100%的极少数人类感染之一。尽管有这些适应良好的病毒策略来逃避免疫反应，但如果在暴露后立即注射疫苗，RABV感染可以得到限制，这表明病毒介导的宿主免疫反应瘫痪需要一些时间，这可以用于暴露后治疗。然而，狂犬病PET的功效依赖于公众教育;需要及时清洗伤口，提供有效的疫苗，并提供狂犬病免疫球蛋白。一半的受害者是儿童，为了改善全球人类健康，应考虑对年轻人进行暴露前疫苗接种。此外，对RABV感染NS的免疫逃避机制的进一步了解可能有助于确定新的治疗靶点，如中枢神经免疫反射或神经炎症。原文来源：大型权威学术专著《RABIES: SCIENTIFIC BASIS OF THE DISEASE AND ITS MANAGEMENT（狂犬病的科学基础和管控）》的第11章，作者是法国巴斯德研究所（Institut Pasteur）的Monique Lafon博士。 该书最新版（第４版）共有22章，732页，由Elsevier Inc.旗下的学术出版社（Academic Press）出版。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。