METAP2

引言 蛋白质的亚细胞定位对蛋白质的功能至关重要，因为它们在不同的细胞区域执行特定的生物学功能。例如，某些蛋白质在细胞核内调控基因表达，而另一些则在细胞质中参与信号传导或物质代谢。这种精确的亚细胞定位是通过复杂的蛋白质转运机制实现的，包括核输入和输出、以及细胞器间的蛋白质运输。蛋白质的异常运输和定位往往与多种疾病的发生发展有关，包括癌症、神经退行性疾病和遗传性疾病等【1,2】。尽管针对性地调控蛋白质的亚细胞定位为治疗这些疾病提供了新的思路，但如何在不干扰细胞其他正常活动的前提下，高效、特异性地控制蛋白质的精确位置，以及如何将这种调控转化为疾病治疗的有效手段，都是该领域所面临的重大科学问题。 通过将目标蛋白与细胞内的穿梭蛋白或锚蛋白耦合来调节其位置，为可编程分子控制提供了另一种途径。为了推进定位控制的理念，以解决导致疾病的蛋白质问题，需要了解使定位被劫持的细胞特征，以及扩展可行的目标蛋白、分子和调控机制的原理。而对定位重编程能力的定量分析也将极大地促进小分子介导的蛋白质重新定位向治疗疾病的应用的扩展。 近日，来自美国斯坦福大学的Steven M. Banik团队在Nature上发表题为Targeted protein relocalization via protein transport coupling的文章，利用一种创新的化学生物学工具——靶向重定位激活分子（TRAM），通过结合穿梭蛋白的转运来控制目标蛋白的亚细胞定位。筛选了一系列具有强效配体的穿梭蛋白，并将其成功用于多种内源蛋白的重新定位。开发了一个定制的成像分析流程，展示了通过分子偶联到含有足够强定位序列的穿梭蛋白，可以调节蛋白质的稳态定位。由此提出了一种通过蛋白质转运重构细胞互作网络的靶向治疗方法，为治疗疾病提供了新的思路。 核定位序列（NLS）和核输出序列（NES）可被karyopherin蛋白家族识别，以调节货物在细胞核和细胞质之间的双向运输。要通过蛋白质运输耦合的方式来克服蛋白质的固有定位，将需要满足2点：（1）在穿梭蛋白上有一个足够强的相反定位序列；（2）穿梭蛋白的必要化学计量比。为此，本文研究人员首先选择了烟酰胺核苷酸腺苷基转移酶1（NMNAT1）作为模型蛋白进行重新定位研究，因为NMNAT1只有一个预测的NLS且没有已知的直接DNA结合域，所以可能容易受到小分子介导的重新定位的影响。为了研究缺乏已知小分子结合位点的蛋白质，研究人员合成了双功能分子TRAM 1，其能够与大肠杆菌二氢叶酸还原酶结构域（EcDHFR）和FKBP12F36V结构域结合，这些结构域因其与大多数哺乳动物蛋白的紧密的结合亲和力和正交性而被广泛使用。然后生成了mCherry融合EcDHFR和来自HIV-1 REV蛋白的NES作为穿梭蛋白，并在HeLa细胞中稳定地整合了mCherry-EcDHFR-NES和FKBP12F36V-GFP-NMNAT1。实验证实在TRAM 1的介导下形成了复合物，而且NMNAT1表现出剂量依赖性地向细胞质的转移，且这种效应在更高浓度下被废除（图1）。 图1:a.通过TRAM的蛋白质转运偶联实现亚细胞核质靶向定位控制示意图。b. TRAM 1的结构。c.用于产生稳定细胞系以研究NMNAT1定位控制的病毒构建体。d. TRAM 1介导形成复合物。e.由TRAM 1驱动的NMNAT1重定位（Credit: Nature） 当同时研究两种蛋白质时，核质转运的量化传统上通过一组代表性图像的共定位度量来完成。而一个开源的计算成像分析流程，能够独立地在细胞核和细胞质中对两种不同蛋白质进行单细胞级别的分析，将是衡量蛋白质运输和比较不同目标蛋白与穿梭蛋白的最准确方法。为此，研究人员建立了这样一个定制的计算成像分析流程，展示了蛋白质稳态定位可以通过分子偶联到含有足够强定位序列并在必要丰度中表达的穿梭蛋白来调节。这种方法适用于不同的细胞类型和密度，将定量分析用于检测剂量、穿梭蛋白和化学计量依赖的再定位，实验结果再次证实NES可以通过小分子介导的偶联主动驱动的NMNAT1再分布。与此同时，研究人员发现，必须存在足够水平的锚或穿梭蛋白才能加强TRAM诱导的靶蛋白的再定位。原则上，只要提供合适的定位强度、表达水平和有效的分子偶联，任何蛋白质的运输都可以重新定位另一个蛋白质。核激素受体如雌激素受体 (ERα) 和糖皮质激素受体 (GR) 表现出从细胞质到细胞核的配体依赖性易位，从而发挥下游转录激活作用。研究人员合成了TRAM 4-7，通过实验证实了这些受体作为核穿梭蛋白的潜力。 为了有效地重新定位靶蛋白，TRAM必须与能够克服靶蛋白内在定位的穿梭蛋白充分结合，蛋白质相对再定位能力的量化将有助于合理选择穿梭-靶组合。为了开发一个定量方法来评估通过TRAM介导的蛋白质重新定位的潜力，研究人员建立了含有一系列遗传构建的多克隆细胞系，这些构建将核激素受体（GR和ERα）与已知的NES序列配对，以及将HIV-1 REV NES与不同的NLS序列配对。随后，研究人员使用不同浓度的相关TRAM处理这些细胞系，然后评估NES标记的蛋白以及核激素受体的重新定位情况。研究结果表明，目标蛋白的重新定位程度依赖于穿梭蛋白（ERα或GR）的特性和目标蛋白的NES序列。此外，研究人员还观察到，不同的NLS构建对HIV-1 REV NES的重新定位能力呈现出梯度变化。通过这些数据，研究人员能够区分不同穿梭蛋白和目标蛋白之间的相对可重新定位性，并为蛋白质对的选择提供了一个定量的评估标准，这对于实现程序化的蛋白质重新定位至关重要。 错位的转录调控蛋白和RNA结合蛋白是多种癌症和神经退行性疾病的特征，将这些蛋白质返回细胞核的靶向方法可能有助于改善疾病驱动表型。本文研究人员利用上述方法，使用核激素受体作为穿梭蛋白，检测了三种已知在疾病中表现出异常定位的突变蛋白——SMARCB1Q318X（一种SMARCB1蛋白的突变型C末端截短，存在于非典型畸胎样和横纹肌样肿瘤，定位与细胞质）、TDP43ΔNLS（缺失了核定位信号的TDP43突变形式，导致它不能正确地定位到细胞核，而是异常地积累在细胞质中，形成病理性的聚集体）和FUSR495X（与ALS相关的FUS蛋白的一种突变形式，通常在细胞质中形成应激颗粒，与疾病的发生发展密切相关）——的重新定位能力。研究结果显示，不同的突变蛋白根据其固有特性，对ERα介导的重新定位的敏感性不同。TDP43ΔNLS和FUSR495X比SMARCB1Q318X更容易被ERα重新定位。此外，研究还发现，FUSR495X在应激颗粒中的定位可以通过TRAM的处理而转移到细胞核，并且这种重新定位与应激颗粒数量的减少相关。这些发现表明，通过靶向蛋白质重新定位的方法，有可能改善疾病相关的蛋白错位现象。 与此同时，研究人员探索了利用TRAM实现内源性蛋白质重新定位的能力。他们采用了CRISPR-Cas9基因编辑技术，将结合域和荧光蛋白标签插入到内源性蛋白PRMT9、SOS1和FKBP12上，使用METAP2和PARP1作为内源性细胞质和核的穿梭蛋白，并合成了能够与它们结合的TRAM 11-13。实验结果证明即使在内源性蛋白表达水平下，通过TRAM介导的内源性蛋白重新定位也是可行的，并且整个细胞群体均显示出均匀的重定位效果，这与外源性表达模型通常只在细胞群体的子集中观察到重定位的现象不同。这表明在内源系统中，可以在整个群体中达到穿梭蛋白与靶蛋白的最低相对比例要求。 最后，研究人员使用TRAM 1处理转导了携带mNMNAT1和EcDHFR标签的腺相关病毒（AAV）的大鼠胚胎的背根神经节（DRG）神经元，发现TRAM 1可以促进NMNAT1从细胞核向轴突的重新定位，NMNAT1在轴突中的表达得到了维持，即使在轴突损伤后也能观察到轴突的健康状况和轴突末端的保护，这表明通过TRAM介导的NMNAT1重新定位确实能够在体外模型中减缓轴突退化的过程。 综上所述，本研究开发了一种定量的单细胞分析方法来检查通过TRAM介导的目标蛋白与穿梭蛋白的耦合潜力，展示了两种蛋白质伙伴的相对表达水平是推动目标蛋白重新定位能力的主要参数，证明通过与内源性穿梭蛋白的耦合可以改变内源性目标蛋白的定位。由此提供了一种新的策略来调控蛋白质的亚细胞定位，为治疗蛋白质定位异常相关疾病提供了新的可能性。通过精确控制蛋白质的定位，不仅可以纠正因蛋白质错位导致的疾病表型，还可以通过蛋白质重新定位赋予有益的功能，更细致地调节细胞功能，从而扩大治疗选择的范围，为开发新的治疗方法提供了理论基础和实验策略。 参考文献 1. Kau, T. R., Way, J. C. & Silver, P. A. Nuclear transport and cancer: from mechanism to intervention. Nat. Rev. Cancer 4, 106–117 (2004). 2. Hung, M.-C. & Link, W. Protein localization in disease and therapy. J. Cell Sci. 124, 3381–3392 (2011). https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41586-024-07950-8 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

细胞内的生物调节网络将不同的蛋白质引导到适当的细胞区室。蛋白质定位失调是包括癌症、神经系统疾病在内的多种疾病的基础。 9月18日，来自斯坦福大学的一个科学家团队在Nature杂志报道了一种被称为TRAM的小分子，这种新技术能够通过促进与“穿梭”蛋白的相互作用来重新定位错位的蛋白质。 传统的小分子药物通过与靶蛋白相互作用以改变其活性。然而，许多与治疗相关的蛋白质的活性无法用与其简单结合的小分子来调节。过去几年，许多研究人员专注于研究能够让这类靶蛋白与另一种生物分子“靠近”的小分子药物。先前报道的PROTAC、DUBTAC、RIPTAC技术均属于这类小分子。 在这项新研究中，科学家们开发了一种被称为靶向重定位激活分子(targeted relocalization activating molecules, TRAMs)的化合物，它们能够改变靶蛋白的亚细胞定位。TRAM是双功能分子，其中一个配体与靶蛋白相互作用，另一个与穿梭蛋白相互作用。 双功能分子促进蛋白质的再定位。Christine S. C. Ng等科学家开发了一种小分子，一端结合一种叫做FKBP12F36V的蛋白，另一端与细胞质或细胞核中天然的或工程改造的穿梭蛋白结合。当FKBP12F36V与一种靶蛋白融合时，双功能小分子同时与穿梭蛋白和FKBP12F36V标记的靶蛋白结合。然后，穿梭蛋白带领靶蛋白在细胞区室移动。研究者们认为，这种方法适用于一系列穿梭蛋白和靶点，可用于重新定位细胞中错位的蛋白质。 具体来说，Christine S. C. Ng及其同事的研究起点是一种双功能分子，该分子先前用于将两种蛋白质(ecDHFR和FKBP12F36V)靠近。为了将该分子用于开发靶向重定位激活分子(TRAM)，科学家们通过连接一段核输出序列(NES，一个短的氨基酸序列，可以使蛋白质从细胞核输出到细胞质中)将ecDHFR转化为穿梭蛋白，并添加荧光标记进行检测。TRAM的靶蛋白是NMNAT1，这是一种含有单个核定位序列(一种标记蛋白质输入细胞核的氨基酸序列)的蛋白质。研究人员将NMNAT1与FKBP12F36V融合，使产生的蛋白能够被TRAM识别，并附加不同的荧光标记进行检测。 a.TRAM调节重定位；b.结合EcDHFR和FKBP12F36V的双功能分子 然后，研究人员使用双功能小分子将两种工程蛋白靠近，并监测由此产生的穿梭蛋白-靶蛋白复合物（shuttle–target complex）进出单个细胞细胞核的情况。他们用显微镜观察荧光标志物，以量化每种蛋白质在细胞核和细胞质中的含量。实验表明，携带单个NES的穿梭蛋白足以将靶蛋白从细胞核输出到细胞质。这表明可以通过使用双功能小分子和穿梭蛋白来克服靶蛋白的定位信号。 由于ecDHFR是一种细菌蛋白，科学家们接下来研究了哺乳动物穿梭蛋白是否可以用于重新定位靶蛋白。他们选择研究两种哺乳动物核蛋白（激素受体）作为潜在的“穿梭体”，因为这两种蛋白的小分子配体已经被鉴定出来，且能够导致这些受体从细胞质进入细胞核。 研究显示，当科学家们将这些小分子配体（与其中任一种激素受体结合）应用到TRAM中时，他们观察到以FKBP12F36V标记的各种靶蛋白可以不同程度地导入细胞核。有趣的是，蛋白质的定位可能是双向的——从细胞质到细胞核，或者相反——这取决于穿梭蛋白和靶蛋白的配对。输出和输入的数量也取决于细胞内穿梭蛋白和靶蛋白的相对水平。 靶向重定位可以将突变蛋白移动到细胞核中 接着，科学家们开始研究以突变FUS蛋白作为靶点的情况。FUS突变体与神经退行性疾病运动神经元病（ALS）密切相关，并且已知从细胞核错定位到细胞质。令人兴奋的是，研究者们发现，他们的TRAM在体外人类细胞中将带有FKBP12F36V标记的突变FUS从细胞质转移到了细胞核。这导致细胞中应激颗粒（ALS细胞质结构特征）数量减少，表明突变FUS重定位可能具有治疗作用。 尽管研究结果表明核激素受体可以是有效的穿梭蛋白，但这些受体在非工程改造的细胞中低表达可能会阻碍它们的广泛应用。为了解决这个问题，Ng等人鉴定出了两种可以作为“穿梭体”的高表达蛋白：核输出蛋白METAP2、核输入蛋白PARP1。利用先前报道的METAP2和PARP1的小分子配体，研究人员开发了TRAM，结合这两种蛋白中的一种和FKBP12F36V。然后，他们利用基因编辑技术构建了表达靶蛋白-FKBP12F36V融合体的细胞，并证明，TRAM可与穿梭蛋白结合以改变被标记的靶蛋白的定位。 NMNAT1的靶向重新定位可以防止轴突损伤。 最后，研究证明，TRAM可以在体外使用，将一种工程改造的神经保护蛋白从小鼠神经元的细胞核输出到神经元的轴突突起。这增加了蛋白质的保护特性，促进了损伤后轴突的恢复。 总结来说，该研究鉴定出了一系列具有强效配体的穿梭蛋白（shuttle protein），这些配体被用于开发TRAM技术后能够重新定位内源性蛋白。这一突破有望为癌症、神经退行性疾病等疾病带来全新的治疗策略。 挑战方面，未来的研究需要调查，能否找到位于细胞其他部位（如细胞膜、线粒体等细胞器）穿梭蛋白的配体。此外，也需要开发结合FKBP12F36V以外的靶蛋白配体，以证明TRAM能够重定位广泛的靶点。另一个问题是，TRAM比典型的小分子疗法更大，这意味着它们的物理和化学性质对于药理活性来说往往不是最佳的。不过，这可能不是一个“大问题”，因为类似的双功能分子正在临床中推进。 参考资料： [1]https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41586-024-07950-8 [2]https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/d41586-024-02802-x#ref-CR5 [3]https://chemistry-stanford-edu.libproxy1.nus.edu.sg/news/bringing-lost-proteins-back-home Copyright © 2024 PHARMCUBE. All Rights Reserved. 欢迎转发分享及合理引用，引用时请在显要位置标明文章来源；如需转载，请给微信公众号后台留言或发送消息，并注明公众号名称及ID。 免责申明：本微信文章中的信息仅供一般参考之用，不可直接作为决策内容，医药魔方不对任何主体因使用本文内容而导致的任何损失承担责任。

近年来，蛋白质靶向降解技术，尤其是通过蛋白质降解靶向嵌合体（PROTACs，Proteolysis Targeting Chimeras）实现的靶向蛋白降解，展现出了巨大的治疗潜力。PROTAC是一种能够诱导目标蛋白降解的双功能分子，它们由三个基本模块组成：一个靶向特定蛋白质的配体、一个与E3连接酶结合的配体，以及一个连接这两者的“连接子”（linker）。通过这些组成部分，PROTAC可以诱导靶蛋白和E3连接酶形成三元复合物，从而引发目标蛋白的泛素化（ubiquitination），并最终导致蛋白质通过26S蛋白酶体降解。 这篇综述文章聚焦于E3连接酶配体化学的发展，特别是小分子E3配体的设计与合成。通过对这些配体的详细介绍，文章为PROTAC领域的研究人员提供了设计与开发新型蛋白质降解剂的化学基础。 E3连接酶的作用与潜力 E3连接酶是泛素-蛋白酶体系统（UPS，Ubiquitin-Proteasome System）中的关键酶类，在靶向蛋白的选择性降解中起着决定性作用。UPS系统是细胞中主要的蛋白质降解机制，其核心作用是通过E1激活酶、E2连接酶和E3连接酶的协调作用，将泛素分子连接到目标蛋白上，标记其进行蛋白酶体降解。E3连接酶负责识别特定的底物蛋白，并将泛素转移到蛋白质的赖氨酸残基上。这种特异性使得E3连接酶在靶向蛋白降解领域中占据了重要地位。 在人类基因组中，已经鉴定出600多种E3连接酶，它们通过特异性识别不同的底物来调控多种细胞过程。然而，尽管E3连接酶的种类繁多，但当前用于PROTAC技术的大部分研究集中在少数几种连接酶上，特别是cereblon（CRBN）、von Hippel–Lindau（VHL）和抑制性凋亡蛋白（IAP）等。这些E3连接酶具有较强的小分子结合能力，且其配体合成相对成熟，因而成为当前PROTAC设计的主要目标。 图1.本综述涵盖的不同E3配体和主题 然而，未开发的E3连接酶仍然拥有巨大的潜力。随着越来越多的小分子E3配体被发现，研究者们正试图将PROTAC技术扩展到更多类型的E3连接酶，以覆盖更广泛的靶蛋白。文章中提到，探索新型E3连接酶配体将有助于扩展PROTAC技术的应用范围，并且通过更广泛的配体库，研究者们可以开发出更加精准和特异的蛋白质降解剂。 PROTAC技术的发展历程 PROTAC技术的概念最早于2001年由Sakamoto等人提出，当时他们使用了一个与Skp1-cullin 1-F-box E3连接酶复合体相结合的磷酸肽配体，成功实现了靶标蛋白甲硫氨酸氨肽酶-2（MetAP-2）的降解。尽管这一概念证明了靶向蛋白降解的可行性，但早期的PROTACs大多是肽类分子，其穿膜性较差，代谢稳定性低，因而未能进入更广泛的应用领域。 2008年，首个基于小分子的PROTAC问世，通过nutlin-3a衍生物成功劫持了MDM2 E3连接酶。这是PROTAC技术发展的一个里程碑，因为小分子E3配体相较于肽类分子具有更好的药物代谢性质，且合成更加简单。这一突破激发了人们对小分子E3连接酶配体的广泛兴趣。 在随后的十多年中，随着越来越多的非肽类E3配体的发现，PROTAC技术逐渐成熟。尤其是针对VHL和CRBN的配体的开发，使这两种E3连接酶成为当前研究的焦点。基于PROTAC的蛋白降解技术不仅能够靶向“不可成药”的蛋白质，还能够通过选择不同的E3连接酶实现组织或细胞类型的特异性靶向。 图2.新型CRBN结合支架的合成及其与示例性PROTAC 的结合 CRBN配体的化学设计 Cereblon（CRBN）最早因沙利度胺（thalidomide）而被人们关注。沙利度胺是一种曾经广泛用于镇静的药物，后因其致畸性被市场禁用。然而，到了20世纪90年代，研究者们发现沙利度胺及其类似物具有抗肿瘤和免疫调节的作用。其后来的研究表明，沙利度胺及其衍生物通过结合CRBN并招募其为E3连接酶发挥药理作用。这个发现揭示了IMiD类药物（Immunomodulatory imide Drugs）的潜在应用，包括来那度胺（lenalidomide）和泊马度胺（pomalidomide）。 在PROTAC设计中，IMiD类配体被广泛用于劫持CRBN连接酶以实现靶标蛋白的降解。研究者们通过一系列有机合成方法对这些配体进行了结构修饰，以提高其稳定性和结合特异性。文章中详细介绍了几种关键的CRBN配体合成方法： 核亲取代反应（SNAr）：这种反应可以通过在IMiD分子上引入不同的取代基，调控其与目标蛋白和CRBN的结合亲和力。常见的取代位点包括4位和5位的氟化衍生物。 烷基化反应：通过烷基化修饰，研究者能够提高CRBN配体的细胞膜穿透性，并优化其与目标蛋白的相互作用。 Mitsunobu反应：这种反应允许在分子末端引入特定的基团，使其能够更好地结合目标蛋白。 这些化学修饰极大地拓展了CRBN配体在PROTAC设计中的应用，使得PROTACs不仅能够靶向多种肿瘤相关蛋白，还能够应用于自身免疫性疾病的治疗。特别值得一提的是，CRBN配体的进一步优化正在推动多种PROTAC药物进入临床开发阶段，如ARV-110和ARV-471，分别用于治疗前列腺癌和乳腺癌。 其他E3连接酶配体的化学策略 尽管CRBN和VHL是当前研究中最常见的E3连接酶，但其他E3连接酶的配体设计也同样具有重要意义。文章详细讨论了针对其他E3连接酶的配体合成策略，包括： 金属催化反应：如Heck反应和Sonogashira偶联反应等，允许在E3配体上引入更复杂的结构修饰，从而提高其与目标蛋白的结合亲和力。 氨基酸衍生化：通过使用天然或非天然氨基酸作为起始材料，研究者可以合成出具有不同功能基团的E3连接酶配体，从而实现特异性调控。 此外，文章还讨论了羧胺衍生物和羧基化合物在PROTACs设计中的应用。这些化合物的引入有助于提高配体与靶标蛋白的结合稳定性，尤其是在涉及到长链连接子的情况下，这些化学修饰显得尤为重要。通过结合不同的合成路径，研究者能够灵活调整PROTAC的物理化学性质，从而实现更广泛的应用。 PROTACs的应用前景 PROTAC技术的应用前景十分广阔，尤其是在治疗难以靶向的蛋白质方面。例如，许多肿瘤相关蛋白由于结构复杂等原因难以被触达，PROTAC技术很显然给了我们一个新的解法。 参考文献：Chem Soc Rev. 2022 May 10;51(9):3487-3534. doi: 10.1039/d2cs00148a. 版权信息 本文系AIDD Pro接受的外部投稿，文中所述观点仅代表作者本人观点，不代表AIDD Pro平台，如您发现发布内容有任何版权侵扰或者其他信息错误解读，请及时联系AIDD Pro (请添加微信号sixiali_fox59)进行删改处理。 本文为原创内容，未经授权禁止转载，授权后转载亦需注明出处。有问题可发邮件至sixiali@stonewise.cn 关注我，更多资讯早知道↓↓↓