ADC连接子设计与ADC赋能

2022-09-27

抗体药物偶联物抗体免疫疗法

在开发ADC药物的早期阶段，连接子的设计经常被低估，原因是人们起初认为只需将细胞毒素添加到抗体上就足以进行ADC药物开发。然而，随着ADC的开发迭代，以及临床上成功和失败经验的积累，目前已经至少从两个方面清楚地证明了连接子是整个ADC设计的关键元素：第一，连接子可以进行架构修饰以优化治疗指数（TI）；第二，连接子必须确保将正确数量的细胞毒素递送到正确的细胞(图1)。图1. 影响ADC性能的ADC连接子设计为了开发成功的ADC，必须找到抗体、连接子和有效载荷的合适组合，不同的癌症治疗靶点需要不同ADC连接子结构设计。连接子的不同结构元素，包括连接位点、释放部分、增溶部分的存在，以及这些不同单元的适当设计，可以调节ADC的功能、安全性和可制造性，并建立适合的靶标产品轮廓(TPP)(表1)。本文就连接子的设计影响ADC性能的一些方面做一些简单介绍，以希望对我们未来ADC的开发做一个参考。表1. ADC靶标产品轮廓的概述连接子设计与ADC药效由于抗原表达水平的降低限制了ADC和有效载荷向靶细胞的递送，因此有效载荷效力是ADC效力的主要驱动因素。不同的有效载荷类别往往具有不同的细胞毒性，受其特定的MOA的影响；例如，DNA交联剂，如PBD二聚体、环丙苯并吲哚二聚体(CBI)或吲哚苯并二氮杂二聚体(IGNs)是最有效的有效载荷，在体外细胞杀伤实验中通常为PM或亚PM范围内的IC50。在异种小鼠模型中，具有这些有效载荷的ADC可以在一次注射低至100ug/kg后诱导治愈。干扰微管蛋白聚合的抗肿瘤药物，如奥瑞他汀类衍生物auristatins 和美登素类衍生物maytansinoids，通常表现为亚nM IC50值，并可以在异种小鼠模型中以mpk内的单剂量注射诱导治愈。拓扑异构酶抑制剂，如喜树碱衍生物，位于ADC有效载荷中的最低端， IC50值在nM范围内。在异种小鼠模型中，需要单剂量在10mpk范围内实现治愈。然而，对于给定的有效载荷，可以通过修改连接子来影响ADC的活性。其中影响ADC效力的一个关键参数是其释放的有效载荷或活性代谢物对邻近细胞的细胞毒作用的能力。在抗原阳性和抗原阴性细胞共同培养的体外试验中，连接子对这种所谓的旁观者活性的影响可以很好地得到证明。例如，在含有抗原阴性的Namalwa细胞和抗原阳性的Colo 205细胞的体外共培养中，研究了针对肿瘤抗原CanAg的ADC的旁观者活性，该ADC通过二硫键可切割接头或不可切割接头连接不同的maytansinoids有效载荷。用不同的ADC以固定浓度处理细胞，以可以杀死所有抗原阳性细胞，而不杀死抗原阴性细胞。对于含有二硫键可切割连接子的ADC，随着共培养中Colo 205的增加，对Namalwa细胞的杀伤作用增加，这表明可切割连接子ADC产生的maytansinoids代谢物能够扩散并杀死邻近细胞。使用非切割的MCC-DM1 ADC，尽管有效地杀死了Colo 205 细胞, 但无论共培养中Colo 205细胞的水平如何，Namalwa细胞都没有受到影响，这表明带电的Lys-MCC-DM1代谢物对邻近细胞缺乏效力。对于这些基于二硫键的可还原连接子，还可以通过改变二硫键周围的空间位阻程度来调节切割效率。利用CanAg靶向的huC242抗体，产生了一系列基于maytansinoids ADC，其二硫键上的空间位阻水平不同。所有这些 ADC 均由 SPP 连接子通过赖氨酸偶联制备。随着二硫键附近碳上甲基取代基数量的增加(DM1为0，DM3为1，DM4为2)，各种maytansinoid有效载荷被连接到SPP连接子上。当在Colo 205异种移植小鼠模型中进行评估时，尽管不利的PK导致肿瘤暴露水平低得多，但受阻最少的ADC huC242-SPP-DM1药效依然优于其他可切割连接子形式，并在一些动物中观察到完全缓解。在这个特定的模型中，二硫键的裂解能力被证明是ADC药效的决定因素。作为FR-a靶向ADC mirvetuximab soravtansine临床前开发的一部分，研究人员比较了不同连接子形式的基于maytansinoids的ADC，包括含有二硫键的三个可切割连接子，即SPP-DM1、SPDB-DM4和Sulfo-SPDB-DM4，以及一个不可切割连接子MCC-DM1。研究发现在高表达的KB细胞中，IC50约为0.1 nM。而在低表达的Igrov-1和JEG-3细胞系中，非切割连接子的活性下降了1-2 log10，相比之下，具有可切割连接子的ADC的效力几乎保持不变。进行体内评估时，带有二硫键可切割连接子的ADC也保持了更高的效率。旁观者活性不仅有助于提高对不同抗原表达水平的肿瘤的疗效，而且可能更有利于实肿瘤的治疗。另一个通过调节连接子稳定性来调整ADC效率的启发性例子来自于Immunomedics对使用拓扑异构酶I抑制剂SN-38功能化的ADC的开发。与具有更稳定的、可酶切割的连接子的ADC相比，具有易水解性连接子的SN-38 ADC的体内药效更好，因为具有旁观者效应的有效载荷在TME中的释放水平更高。FDA批准的ADC Trodelvy便使用了这种可水解性连接子形式。通常，在体外观察到ADC药效与DAR值正相关。然而，其他因素也可以影响ADC在体内的效果，从而有利于较低的DAR。因此，一旦建立了抗体、有效载荷和释放机制的适当组合，DAR优化是ADC开发过程中不可或缺的一部分。对于大多数监管批准的ADC，在临床前开发期间已经进行了最佳DAR的研究。例如，根据在活体小鼠异种移植有效性和耐受性研究中的综合结果，对于MC-Val-Cit-PABC-MMAE连接子，与DAR2和DAR8 ADC相比，DAR为4的Brentuximab (本妥昔单抗) ADC呈现最佳的TI。临床前研究也比较了deruxtecan的DAR为3.4和8的研究。鉴于DAR8 ADC在低HER2表达的细胞系中的疗效高于DAR3.4 ADC，DAR 8 ADC DS-8201a被选为临床candidates。而另一种靶向trop-2并用linker的DS-1062 DS-1062 ADC使用了DAR4正在临床试验评估，这也适用于靶向B7-H3的DS-7300a DS-7300a，这表明最佳的药物载量也可能取决于抗原表达水平和表达谱的情况。FDA批准的两种Calicheamicin ADC，Mylotarg和Besponsa，虽然都针对血液肿瘤中的抗原CD33和CD22，但也有不同的DAR。Besponsasa DAR为5-7，Mylotarg DAR为2-3，进一步强调了药物载量作为ADC的关键设计参数以及在ADC candidate选择过程中DAR优化的重要性。高DAR ADC的体外效力和体内效力之间的一些差异与有效载荷和一些连接子元件的疏水特性有关，如常用的Val-Cit-PABC。肿瘤中ADC的暴露是ADC药效的重要决定因素。由于高DAR 的Val-Cit-PABC增加了它们的疏水性从而被更快的清除，因而高DAR ADC的更高效力可以被它们的更快清除所抵消。降低linker paylaod疏水性的一种方法是引入具有亲水性的基团，这已被证明是改善某些ADC的PK谱的有效方法。例如，在含有二硫键的maytansinoid ADC的连接子中引入磺酸基，增加了它们的亲水性。与SPDB-DM4 相比，含有磺酸盐基团的 sulfo-SPDB-DM4 linker-payload在体内对低 FR-a 表达的癌细胞系更有效。在连接子中引入简单的极性部分也可以对ADC的药效产生显著影响。这在Synaffix基于HydraSpace技术ADC中得到体现。通过在各种接头有效载荷中加入极性磺胺间隔基单元来然后定点地连接到抗体的重塑的糖链上。与使用相同元素但缺乏极性磺胺间隔物的ADC相比，加入极性磺胺间隔物的ADC降低了聚集倾向，改善了PK，并显著提高了ADC的体内药效。碳水化合物作为高度亲水的部分，也被用于改善ADC的溶解性和PK。特别是，这部分可以作为ADC连接子释放单元的一部分，被溶酶体中特有的酶切割，如β-葡萄糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶。在Karpas-299异种移植模型中，具有β-葡萄糖醛酸酶释放单元的单剂量0.5 mpk Brentuximab MMAE DAR 8 ADC在所有动物中都实现了完全缓解，而在另一项研究中，不含β-葡萄糖醛酸酶释放单元的MC-Val-Cit-PABC-MMAE DAR8 ADC在单次1 mpk剂量时仅使大多数动物完全缓解。在连接子中引入亲水和增溶部分并不是降低ADC整体疏水性的唯一方法。Linker-payload疏水性掩蔽是改善ADC PK的另一种有效方式。抗体本身可以与linker-payload相互作用以减弱疏水性。例如，没有特别亲水的短连接子(例如MC或MCC连接子) 的ADC仍然具有可接受的PK的原因可能是受益于抗体提供的屏蔽效应。另一种屏蔽疏水linker-payload的方式是两亲性聚合物，例如聚乙二醇(PEG)、聚肌氨酸(PSAR)、或亲水性大环聚合物。这些两亲性聚合物用作linker-payload和溶剂掩蔽linker-payload疏水性之间的适当界面。这种方法已被证明可以改善ADC PK，从而导致更好的体内功效。研究发现，将这些增溶元件定位在linker-payload的侧链，而不是线性间隔物，可以最大限度地发挥保护效果。长的线性间隔物反而增加了linker-payload对溶剂的暴露，对ADC的疏水性有不利影响。为了最大限度地提高这些连接子设计的有效性，还需要优化两亲性聚合物侧链的长度，因为短链可能不能提供足够的屏蔽，而较长的链可能会影响有效载荷的释放。根据聚合物的性质、有效载荷和释放单元的不同，最佳侧链长度可能有所不同。由于P-糖蛋白(P-gp)外排机制在MDR表型中起关键作用，对疏水底物具有广泛的特异性。细胞毒有效载荷通常具有疏水性，容易被P-gp摄取。因而将亲水性连接子添加到这些细胞毒性有效载荷上已被证明是一种可行的策略，可以减少P-gp的摄取并恢复MDR细胞系的细胞毒活性。在一项研究中，ImmunoGen已经证明了亲水性不可切割连接子在MDR癌细胞系中的益处，在该研究中， DM1与具有三种不同连接子的EPCAM抗体偶联。一种用疏水性MCC连接子制备，另外两种连接子用具有更高溶解度的亲水性连接子制备，一个含有带电的磺酸基，另一个含有PEG4单元。在相似的载药量下，在Colo 205结肠癌细胞系中观察到这三种ADC的体外药效相当。然而，在自然高表达P-gp的HCT-15细胞系和工程化高表达P-gp转运体的Colo 205细胞系中，带有PEG4和3-磺酸非裂解连接子的ADC的效力是含有MCC连接子的ADC的四倍。这些结果在Colo 205 MDR小鼠异种移植模型中也得到了证实。在该模型中，PEG4 ADC在10 mpk一次注射后抑制肿瘤生长20天。而MCC ADC仅减缓肿瘤生长速度。这些结果归因于与Lys-MCC-DM1底物相比，亲水性不可切割连接子产生的DM1代谢物与P-gp外排泵的亲和力较低。ADC连接子与分解代谢的稳定性连接子的设计可以影响有效载荷对分解代谢的稳定性，这在一系列PNU-159682基于蒽环素的THIOMAB ADCs中得到了证明。细胞毒素PNU-159682具有对其活性至关重要的葡聚糖，其去糖基化被用来探索通过偶联产生的ADCs对工程半胱氨酸的连接子子稳定作用的影响。研究发现，二硫键可裂解单元附近的空间位阻在区分脱糖作用方面起不到什么作用；然而，连接子长度对有效载荷代谢的影响明显更大。与具有 6-8 Å 连接子的ADC相比，具有 16 Å 连接子ADC的有效载荷的代谢在食蟹猴中增加约三倍，在小鼠全血中增加两倍。美登素类化合物细胞毒素在ADC中的应用为描述分解代谢的驱动因素提供了一个特别有用的案例研究，以评估MTD。使用可切割氧化还原二硫化物释放或不可切割连接子而开发的含有硫醇功能化的美登素的ADC，进行详细比较二硫化物周围甲基的空间屏蔽效果和不可切割连接体的分解代谢驱动因素。研究发现， MCC-DM1连接子可以抵抗逆迈克尔反应，这可能是由于硫醇供体的pKa值比抗体上的半胱氨酸残基更高。相比之下，SPP-DM1和SPDB-DM4连接子依赖于细胞内硫醇的还原释放DM1或DM4，然后通过细胞甲基转移酶进行甲基化。在肝脏中，这种甲基化的美登素通过氧化进一步代谢成甲基亚砜和甲基砜。糖蛋白CanAg是粘蛋白1(MUC1)的一种新型糖体，高度糖基化，富含岩藻糖和唾液酸，表达于人结肠癌、胰腺癌细胞和胃癌细胞表面。对一系列抗CanAg美登素ADC的血浆稳定性进行了评价，结果表明，无空间阻碍的huC242-SPP-DM1 ADC的半衰期为2天，而空间位阻较大的huC242-SPDB-DM4 ADC的半衰期为4.6天。与不可切割的MCC-DM1连接子相比，这两个可切割连接子ADC的血浆稳定性均降低。在临床试验中，不稳定的ADC的DLT具有free有效载荷的特征，而稳定连接子的ADC的DLT可能是抗体(ADC)分布和分解代谢的结果。然而发现临床试验的前10个美登素ADC的耐受性与连接子的化学稳定性之间存在负相关。这一点得到了以下证明：ADC的MTD使用SPP-DM1连接子在6到8 mpk之间，使用SPDB-DM4连接子在3.5到7 mpk之间，以及ADC的MCC-DM1连接子的MTD为3.6 mpk。这个结果强调，更稳定的连接子不一定会在临床上导致更高的MTD，释放的代谢物的化学性质与连接子的血浆稳定性一样重要。ADC连接子设计与PK、疏水性和安全性考量ADC的PK谱在其吸收、分布、代谢和排泄(ADME)属性方面是相当复杂的。ADC有几个关键特征，包括连接子稳定性、结合部位、DAR、细胞毒素和总体疏水性都可以影响其PK谱 (表2)。表2. ADC PK 与各个组分的关联使用MC-Val-Cit-PABC-MMAE连接子开发抗CD30 ADC的早期工作表明，将DAR从2个增加到4个和8个的会导致血浆PK的减少。这项开创性的工作在ADC领域具有很大的影响力，为ADC设定了一个强大的范例，即ADC的最佳载药量不超过4。直到最近DAR8 ADC Enhertu和 Trodelvy的成功才突破了这一界限。这些ADC采用了一种改进TI的策略，该策略侧重于结合更低效力和更高DAR的有效载荷。Enhertu和Trodelvy的开发分别利用了喜树碱DXd和SN-38，这两种药物都在nM活性范围内具有细胞毒性。Trodelvy通过引入一种聚乙二醇型聚合物，而Enhertus中通过引入疏水性较弱的酶切割单元GGFG来减少整体ADC疏水性。如前所述，减少ADC的疏水性可以通过在连接子中加入极性单元来实现，如磺酸酯、磺酰胺、半乳糖和磷酸酯，在二磷酸溶剂化和释放单元的情况下，还可以阻止细胞内裂解。然而，季铵盐连接子的开发是在减少疏水性方面的另一个进步。这种连接子通过二甲基缬氨酸N端进行四取代化（季铵盐化），与PAB氨基甲酸酯和MMAE相连，得到DAR为8的ADC。与vedotin的MMAE的三级胺的氨基甲酯相比，这种ADC具有更好的PK特性。此外，在这些季铵盐连接子的开发过程中，加入一个葡萄糖醛酸酶可裂解的释放单元可以带来好处，并赋予ADC额外的亲水性。这种葡萄糖醛酸连接子的进一步发展，证明了基于MMAE的ADC在PK和TI方面的改进。Seagen围绕葡萄糖醛酸脂释放机制的连接子优化做了许多开创性工作，其是结合不同长度的聚乙二醇组分(n=2-24)进行评估的。这些DAR8 MMAE ADC随后在PK和耐受性研究中进行了评估，结果表明聚乙二醇的含量与耐受性存在明显的相关性，然而PEG 数量从8到24达到了平台期。这表明8个单位足以屏蔽疏水性MMAE，从而减少细胞的非特异性摄取，这意味着PEG长度有一个最佳值。肝脏毒性是ADC安全性的重要驱动因素，ADC的疏水性和肝脏介导的清除之间的关系是由高负载ADC species的疏水性增加所驱动的，其可被肝脏中的Kupffer细胞快速清除。因此，通过适当的连接子设计也可以调节与ADC疏水性相关的安全风险。小编小结最近ADC批准的数量的激增突出了ADC连接设计对ADC性能的重要影响。人们已经摆脱了仅仅将细胞毒性有效载荷附着到抗体上就能开发一款成功ADC药物的想法，多年的研究更证实ADC连接子设计对ADC药物的有效性、稳定性、疏水性、和安全性都至关重要。下一代ADC开发的核心更是连接子设计的根本创新及其对ADC性能的影响。这将推动ADC领域朝着向患者提供精准药物的最终目标迈进。扫描下方二维码，助力佰傲谷洞见生物医药，把握行业脉搏（20份神秘好礼先到先得）参考文献1. Chemical Linkers in Antibody–Drug Conjugates (ADCs).2. Factors Affecting the Pharmacology of Antibody–Drug Conjugates.3. Preclinical Pharmacokinetic Considerations for the Development of Antibody Drug Conjugates.