疫苗开发的新“平台”——使用酵母生产病毒样颗粒

2024-05-08

疫苗信使RNA

病毒样颗粒（VLP）是一种空的纳米级结构，形态上类似于真正的病毒。它们具有内腔、非传染性和颗粒性质，并且拥有高密度的重复表位，使其成为疫苗开发和药物输送的理想平台。商业上使用的Gardasil-9和Cervarix疫苗证明了VLP在疫苗制剂中的有效性。此外，嵌合VLP还可以增强针对不同免疫原的免疫反应，从而有助于减少医疗或临床废物的产生。然而，VLP的经济可行性对于它们的使用、应用和可用性有显著影响。因此，讨论利用不同酵母作为发酵宿主生产VLP的方法具有重要意义。近日，来自南非约翰内斯堡的维特沃特斯兰德大学的、美国纳斯勒理工学院和夏洛特·马克西约翰内斯堡学术医院的Vartika Srivastava、Kripa N. Nand、Aijaz Ahmad和Ravinder Kumar发表了题为：Yeast-Based Virus-like Particles as an Emerging Platform for Vaccine Development and Delivery的文章，探讨了与其他可用系统相比，使用酵母生成VLP作为疫苗开发和传递的新兴平台的潜力和优势及存在的问题和局限性。疫苗是一种生物制剂，源于拉丁语词汇"Vacca"，意为奶牛。它是由弱化或杀死病原体（有时与目标病原体密切相关的物种）制成的，在注射后通过模仿感染的方式帮助个体预防目标疾病的侵害。除了治疗性的狂犬病疫苗外，疫苗通常是预防性的。最初，疫苗制剂包括整个微生物病原体以及其他成分，如防腐剂、稳定剂、佐剂或免疫增强剂。然而，传统的疫苗开发策略并不适用于与相关病原体无法在商业规模上培养的疾病，例如麻风分枝杆菌和疟原虫。亚单位疫苗只包含病原体的少数成分，克服了与传统疫苗开发相关的一些问题。除细菌、原生动物和病毒的表面蛋白外，亚单位疫苗还可能包括病原体特异性毒素和多糖。基于核酸的疫苗（包括DNA和mRNA）是疫苗制剂中的最新和最显著发展。这些疫苗克服了传统疫苗和亚单位疫苗开发过程中的一些问题，例如目标蛋白的表达和纯化。因此，基于核酸的疫苗为医疗保健机构的治疗方案提供了新的视角（图1展示了不同的抗病毒疫苗制备方法）。例如，基于mRNA的COVID-19疫苗（由Moderna和辉瑞公司生产）是传统传染病疫苗开发的一项进展。图1：抗病毒疫苗开发的不同策略示意图。该图显示了传统(减毒和灭活病毒)和较新的疫苗开发方法(包括亚基、核酸和基于vlp的疫苗)因此，疫苗的开发和提供方法和策略不断改进。随着疫苗设计和开发新方法的出现，有必要重新定义疫苗。如今，疫苗可以被重新定义为含有减毒或灭活病原体或其他成分（如多肽、蛋白质、DNA、mRNA或多糖）的生物制剂，在注射后有助于预防个体未来可能的感染。尽管基于亚单位和核酸的疫苗相比传统疫苗开发方法具有许多优势，但它们仍然存在一些问题，例如需要冷链或深度冷藏以及保质期较短等。最初，疫苗主要用于预防传染性疾病，包括病毒和细菌引起的疾病。然而，现在人们认识到疫苗也是对抗某些类型的癌症最有希望的手段。例如，Gardasil-9是一种针对人乳头瘤病毒（HPV）的疫苗，它通过从酵母中表达和纯化HPV的L1蛋白来预防HPV感染，从而预防宫颈癌。因此，在现代世界中，疫苗不仅是预防传染病的工具，还被用于预防与病毒感染相关的某些类型的癌症。除了乳头状瘤疫苗外，还有其他几种抗癌疫苗正在不同的临床试验阶段。本研究重点介绍一种新兴的疫苗开发平台，即酵母源VLP。讨论作为疫苗开发和药物递送手段的可适用性，特别关注源自酵母的VLP。还探讨了VLP因能更好地触发宿主免疫反应而相对于纯化蛋白具备的优势。本综述还将讨论为何选择酵母作为表达和纯化VLP的理想模型，并介绍与该概念相关的关注点和成功案例。VLP（病毒样颗粒）、幽灵病毒或没有遗传物质的虚拟病毒是在1968年首次在肝炎患者的血清样本中被观察到的纳米结构。VLP可以在自然环境中存在（在感染病毒的宿主中），也可以在实验室中生成。VLP的大小可以从20纳米到200纳米甚至更大。VLP的大小取决于用于制造这些颗粒的病毒物种和病毒蛋白。VLP可以使用壳体、包膜或核心病毒蛋白来形成。这些颗粒通常是在适当的条件下（包括最适pH值、盐浓度、温度等）通过将病毒蛋白正确折叠而自然形成。当单体蛋白折叠成五聚体形式（也称为壳聚体）时，VLP就会形成。VLP可以是非包膜的，例如人乳头瘤病毒（HPV）VLP。也可以是包膜的，例如SARS冠状病毒VLP。VLP的形状也可以从二十面体变为棒状。这些颗粒可以由单个蛋白质组成，也可以是两种不同蛋白质的融合（嵌合VLP）。VLP在疫苗开发中的重要特点是其高密度的表位、颗粒性质以及缺乏限制其复制并使其对宿主安全的遗传物质。除了在疫苗开发中的应用，VLP还被广泛研究用于在宿主系统内传递药物和其他小分子。这个特性归因于VLP内部的空腔。一些研究还显示了在光成像中使用VLP的可行性（图2）。图2：VLP的不同应用原理图。一些研究已经证明了疫苗、药物输送和照片成像等应用的概念。本研究建议可以使用VLP来研究病毒与宿主的相互作用或内化VLP的高表位密度和颗粒性质使它们成为引发免疫反应的理想系统，已证实VLP能够引发细胞免疫和体液免疫反应。相比纯化蛋白质，VLP似乎是疫苗传递的更好选择。目前已从原核系统（例如大肠杆菌）以及真核系统中表达和纯化出了VLP，包括酵母菌（例如酿酒酵母）、昆虫细胞系、哺乳动物细胞系和植物中表达和纯化VLP（图3）。图3:不同系统被用作表达和纯化VLP的宿主示意图。注:酿酒酵母和毕赤酵母（红色字体）仍然是最常用的酵母种类。在体外生产VLP的情况下，可以使用细菌(原核生物)或酵母(真核生物)的蛋白质翻译机制。除了整个细胞外，几项研究表明VLP可以通过体外蛋白质翻译系统产生。其他人已经讨论了基于体外蛋白质翻译的VLP生成的优缺点。在表1中，对用于表达和纯化VLP的不同系统的优缺点进行了比较（表1）。表1：生产VLP的宿主不同模型系统的比较过去，已经成功地利用几种酵母菌表达和纯化与临床相关的蛋白质。酵母物种酿酒酵母（S. cerevisiae）和毕赤酵母（K. phaffii），属于“通常被认为安全”（GARS），这是使用基于酵母的系统开发VLP的另一个重要优势。与细菌系统不同，基于酵母的系统不会遇到内毒素问题，表达的蛋白质的溶解性和折叠在酵母中比细菌要好得多。此外，利用哺乳动物和昆虫细胞进行VLP生产成本高昂，主要是由于培养基的高成本和可扩展性差。相比之下，酵母可以在简单的培养基上迅速生长。酿酒酵母这一酵母物种可以在商业规模上高密度生长，而动物细胞无法实现。另一个问题是不同器官或组织中的表达水平变化大，而且批次之间的差异也较大。其他问题包括可能逃逸到自然环境中的可能性。季节变化可能严重影响植物生长，因此对感兴趣蛋白质的表达仍是一个重要的考虑因素。由于具有多个优势，酵母已被广泛用于表达和纯化VLP，尤其是酿酒酵母（表2）和毕赤酵母（表3）。除了酿酒酵母和K. phaffii外，其他几种酵母也进行了表达和纯化VLPs的测试。(表4、表5)表2：利用酿酒酵母制备VLP的研究表3：利用毕赤酵母制备VLP的研究表4：利用多态酵母产生VLP的研究表5：利用酵母菌种(表2-4中的酵母菌种除外)产生VLP的研究在前面的部分中，我们讨论了一些使酵母成为商业化生产VLP的合适宿主的显著特点。事实上，许多商业上可用的疫苗都是使用酵母生产的。尽管如此，有几个问题限制了酵母基于系统在商业上表达和纯化VLP的应用。首先是使用酵母细胞来生产蛋白质（将用作疫苗）的一个关键问题是酵母细胞无法像人类那样进行蛋白质糖基化。此外，与动物细胞（包括人类细胞）相比，酵母细胞中的蛋白质通常更多地发生糖基化。同时，人类和酵母的糖基化模式不同，这可能对蛋白质的抗原性、溶解性和稳定性产生重要影响，尤其是当注射到体内时。限制酵母用于生产VLP的另一个问题是许多病毒具有包膜。迄今为止，只有一项研究显示使用酵母作为宿主可以生产包膜VLP（eVLP）的可能性。在工业规模上成功生产使用酵母基于系统的eVLP的问题仍有待确定。的确，在这方面，动物细胞比酵母基于系统具有优势；然而，未来的研究可以帮助操纵细胞膜，并可能为酵母中eVLP的分泌打开道路。将完全组装的VLP分泌到培养基中是可取的，因为它能够经济高效地从宿主系统中纯化VLP。到目前为止，已知昆虫和哺乳动物细胞能够将完全组装的VLP分泌到培养基中。这一特点在处理eVLP时尤为重要。然而，动物细胞系的培养基成本高以及规模化的可行性仍然是显著的问题。酿酒酵母和毕赤酵母被认为可以在廉价培养基上生长，并且可以在大型工业容器中良好生长（尤其是毕赤酵母）；然而，在一些情况下，完全组装的VLP可以分泌到培养基中。甚至在分泌之前，重要的是要观察VLP是否能够在酵母细胞的细胞质内组装。过去的几项研究已经显示VLP在体内组装，然后进行分泌。这再次展示了酵母相对于细菌系统的优势。根据已发表的研究，一些VLP会被分泌到培养基中，而其他一些则不会。VLP的分泌取决于用于VLP生成的蛋白质和VLP的大小。因此，对于每种病毒和蛋白质，都必须检查VLP分泌的可能性。使用上述不同宿主在商业规模上生产VLP现在已经成为常见做法。许多从事疫苗或药物生产的公司正在商业化生产VLP。几乎所有VLP的生产都存在一个共同问题，即在低盐浓度和2-8摄氏度下储存时VLP会发生聚集。动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）可以检测到VLP的聚集，这些方法通常用于VLP的表。此外，洗脱或储存过程中的浑浊度也可以提示可能的VLP聚集情况。VLP聚集的主要问题是它会影响其免疫原性和免疫反应水平。VLP的聚集降低了它们在商业化纯化过程中使用的POROS树脂的回收率。观察到聚集VLP引起的免疫反应低于非聚集VLP引起的免疫反应。此外，聚集还会影响剂量配方。为了获得高度均一的VLP，制造商会进行超速离心或分子排除，以分离干净的和聚集的VLP。然而，这导致了大量的VLP浪费，并降低了有用VLP的回收率。为了预防或最小化VLP的聚集，过去采用了不同的方法。例如，添加L-精氨酸和甘氨酸可以改善VLP的回收率。糖类如山梨醇和海藻糖也被证明可以溶解和改善VLP的回收率，以防止其聚集并溶解蛋白质单体。聚乙二醇（PEG）或甘油的使用也可以改善VLP的溶解性。此外，使用表面活性剂或乳化剂如Tween-80也有助于防止VLP的聚集并提高其回收率。在几个已发表的研究中，作者在VLP的纯化过程中的某个步骤中添加了这些化合物。有时，改变缓冲液的pH值和缓冲液组成也有助于防止VLP的聚集。此外，为了获得均一大小的VLP，建议先进行体外解离，然后再重新组装。因此，需要大量的工作来找到改善VLP回收率同时预防其聚集的适宜条件。目前已经有一些成功应用VLP作为疫苗或药物传递系统的案例。第一个上市的基于VLP的疫苗是Gardasil，随后是Gardasil9；这两个产品都由默沙东公司品牌推出，用于预防HPV引起的癌症。葛兰素史克（GlaxoSmithKline）推出了另一种基于VLP的HPV疫苗（Cervarix）。值得注意的是，Cervarix对HPV16和HPV18病毒株都有效。Cervarix在2016年从市场（美国）撤下，而Gardasil和Gardasil9仍可供公众使用。值得注意的是，Gardasil和Gardasil9是由酵母生产的，而Cervarix是由昆虫天蛾病毒表达系统生产的，使用的是源自昆虫中烟草蠋（Trichoplusia ni）的High Five Rix4446细胞。除了提到的两种（由酵母生产的）疫苗，另一种针对疟疾病原体恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）的疫苗Mosquirix已经获得商业批准。除了上述目前公众使用的基于VLP的疫苗，还有几种基于VLP的疫苗正在临床试验中。例如，一种针对HIV的疫苗正在临床试验中。除了酵母源的VLP，还有几种来自非酵母宿主的基于VLP的疫苗也正在公众使用或临床试验中。除了酵母衍生的VLP外，几种非酵母宿主衍生的基于VLP的疫苗也在公共使用或临床试验中。表6列出了目前使用酵母生产的VLPs和处于临床试验不同阶段的VLP清单。表6：被FDA批准用于商业用途或正在进行临床试验的基于VLP在酵母中表达的疫苗。目前的几个可用于VLP生产的宿主都有一些优于其他宿主的优点。虽然酵母作为VLP商业生产的宿主有一些显著的好处。然而，酵母菌无法分泌重要病毒的VLP仍然是一个尚未突破的瓶颈。因此，需要在菌种工程方面做更多的工作，以充分挖掘酵母生产VLP的潜力。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。