HiBiT技术-对靶向蛋白降解分子进行高通量细胞活性分析

2024-02-11

蛋白降解靶向嵌合体基因疗法

本文分享这里Promega 公司发表的HIBIT技术对活细胞中蛋白质降解动力学的定量发光检测，包括用于计算和获得定量降解参数包括：降解速率、Dmax、DC50和Dmax50。摘要靶向蛋白质降解化合物，包括分子胶molecular glue，靶向嵌合体的蛋白水解(PROteolysis TArgeting Chimeras, PROTAC) ，还包括溶酶体靶向嵌合体 (Lysosome-Targeting Chimaera，LYTAC) 和基于抗体的 PROTAC (Antibody-based PROTAC，AbTAC)，是药物发现的新兴治疗方式。此类分子通过通过蛋白酶系统降解靶标蛋白。然而，鉴于实现降解所需的细胞途径的复杂性，以高通量方式分析靶标蛋白降解仍然极具挑战性。在这里，介绍一种基于使用 CRISPR/Cas9 内源标记靶蛋白的方案和筛选策略，其中包含 11 个氨基酸的 HiBiT 标签，该标签与 LgBiT 蛋白（大的互补片段）具有高亲和力，结合后融合成完整蛋白以产生发光蛋白。这些带有内源标签的 CRISPR 靶向细胞系可通过使用基于发光板的酶标仪监测发光信号，用于测量实时动态活细胞或终点裂解模式下诱导的降解。概述了不形式的筛选方案，描述了降解速率、Dmax、DC50、Dmax50等关键降解参数的计算，以及与细胞活力测定的多重检测。这些参数能够快速发现和定量分型早期苗头分子，还能在相关细胞背景中维持靶蛋白的内源表达和调节，从而有效优化先导分子。NanoLuc® Binary Technology (NanoBiT®) 由两个单元位组成，我们称之为大 BiT (LgBiT; 18kDa)，因为它较大，而小 BiT (SmBiT; 1.3kDA) 因为它很小。这两个亚基经过单独优化，具有较低的亲和力，可逆相互作用，当彼此靠近时形成明亮的 NanoBiT® Luciferase。当您标记感兴趣的蛋白质对时，一个使用 SmBiT，另一个使用 LgBiT，蛋白质的亲和力（如果它们相互作用）会驱动两个亚基的相互作用，并且可以使用以下方法在活细胞中监测蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI)，通过一种水性、细胞渗透性的呋喃嗪底物。新的双向 (BiBiT) 载体允许您使用单个载体表达 SmBiT 和 LgBiT 融合，从而更简单地创建稳定细胞系。还有与LgBiT具有高亲和力的微小High BiT（HiBiT；11个氨基酸）亚基，它非常小，可以使用CRISPR/Cas9基因组编辑插入标签来检测内源蛋白水平或将HiBiT稳定地插入到LgBiT中。由于HiBiT高亲和力，这种 BiT 不适合蛋白质相互作用研究；相反，HiBiT 标签可让您定量感兴趣的蛋白质。您可以使用基于板的格式检测活细胞上的细胞外蛋白、分泌到培养基中的蛋白、细胞裂解液中的蛋白，或者使用含有 LgBiT 的 HiBiT 检测试剂在印迹到膜上后快速检测标记的蛋白。您还可以通过在系统中表达 LgBiT 来检测活细胞中的细胞内蛋白质，从而进行定量活细胞动力学测量。1. 背景介绍靶向蛋白质降解已成为药物发现中增长最快的领域之一，这得益于用于癌症治疗的免疫调节分子胶化合物（例如 IMiD）的成功治疗，以及靶向蛋白水解嵌合化合物的有前景的早期临床试验数据。靶向蛋白降解化合物通过使靶蛋白与E3连接酶的接近来发挥作用。该化合物诱导靶蛋白向 E3 连接酶的募集，导致靶蛋白通过泛素蛋白酶体途径 (UPP) 泛素化和降解。历史上，小分子药物发现筛选计划依赖于初始生化测定来评估活性和化合物的量化。然而，这对靶向蛋白质降解剂提出了重大挑战，其最终活性（通过蛋白酶体降解）取决于细胞事件的级联。成功靶标降解所需的蛋白质复合物的多种途径和复杂性需要细胞测定方法来早期筛选和定量分析初始化合物。目前，严重缺乏在细胞环境中以高通量方式监测靶蛋白降解的技术。在这里，将介绍使用 CRISPR/Cas9 内源标记 HiBiT 靶细胞系进行实时动态活细胞或终点裂解降解活性评估的方案。通过发光测量来监测用降解剂化合物处理后靶蛋白的降解。为了成功降解治疗靶点并扩大可药物蛋白质组，已经出现了许多方法和类型的降解剂，它们可以靶向破坏多种蛋白质，包括位于质膜、溶酶体、线粒体膜、细胞质、和核。研究最广泛的两类主要化合物是分子胶和蛋白质靶向嵌合体。分子胶是单价的，因此尺寸通常较小，并且在与E3连接酶组分结合后促进与靶蛋白的新型蛋白质：蛋白质相互作用界面。它们是最常见的与 Cereblon (CRBN) E3 连接酶组分结合的降解剂。最近，利用其他 E3 连接酶机制（例如 DCAF15和 CDK/Cyclin招募至 DDB1 ）的新例子显示了扩展此类化合物的潜力。相反， PROTAC是较大的二价分子，由靶结合配体（最常见的是抑制剂）组成，通过化学接头桥接至E3连接酶配体。因此，这些化合物能够直接结合E3连接酶和靶蛋白。许多蛋白质已被证明可通过这些二价分子降解，并且最常用的 E3 连接酶配体招募 CRBN 或 Von Hippel Lindau (VHL)。然而，在嵌合体靶向蛋白水解设计中，用于 E3 连接酶招募的可用配体数量正在快速增长，扩大了此类化合物的能力，具有降解不同靶标类别以及增强细胞、或组织特异性的潜力。结合靶标蛋白的最低要求，即使亲和力微乎其微，降解化合物有望扩大可成药的蛋白。表征蛋白质降解的细胞动力学、以及治疗后潜在的蛋白质恢复对于了解降解化合物的功能和功效至关重要。虽然可以通过蛋白质印迹抗体测定、或质谱来研究相关细胞系统中的内源蛋白质水平变化，但这些方法难以适应高通量筛选形式，定量能力有限，或者缺乏多时间点测量动力学变化的能力。为了应对这些挑战，这里Promega 公司开发了一种基于板的细胞发光系统，用于监测内源蛋白质水平的变化。该系统利用通过 CRISPR/Cas9 将 11 个氨基酸的标签 HiBiT 插入到任何关键降解靶标基因中。该多肽以其高亲和力与其结合伴侣 LgBiT 互补，在其底物存在的情况下产生明亮的发光，从而使这些标记的内源蛋白在细胞或裂解物中发光。用酶标仪测量的相对光单位（ RLU，relative light units）与标记的目标蛋白水平成正比。根据稳定存在荧光素酶底物，可24-48 小时内的实时动态蛋白质水平测量。这允许确定任何给定化合物浓度下任何给定靶标的完整降解曲线，包括初始降解速率、降解最大值(Dmax)和化合物处理后的恢复水平的定量分析。如果筛选大型降解化合物库，也可以在 384 孔格式中以各种药物浓度和指定时间轻松进行终点分析。本文以靶标蛋白质降解化合物（PROTAC）分子的细胞筛选策略为例子，但HiBiT CRISPR 细胞系与所用方案并不限于蛋白质降解，而是监测任何内源性靶蛋白水平，靶标蛋白机制研究的通用工具，可以在治疗后对其进行调节，以研究化合物甚至耐药机制的影响。这些基于发光的检测方法的先决条件是 CRISPR 内源标记的 HiBiT 靶细胞系，这至关重要，因为它能够实现灵敏的发光检测，同时仍保持内源靶表达和天然启动子调节。在细胞中使用 HiBiT 或其他报告基因融合的外源表达来代替内源标记是可能的，但使用蛋白质过度表达的系统时应格外小心。这些可能会导致理解真正的化合物效力和蛋白质恢复动力学的人为因素，包括目标降解后激活的潜在转录反馈环路。此外，低效力的早期化合物可能会被遗漏，并在筛选中表现为假阴性。由于蛋白质损失可能是由化合物诱导的毒性和细胞死亡引起的，因此此方案包含强烈推荐，但可选的细胞活力发光或荧光测定与降解方案配对。该方案有两个重要部分：裂解终点和活细胞动力学筛选。在每个部分中，都包含以终点或动力学形式进行多重细胞活力测量的选项。监测标记内源蛋白的变化需要与细胞中的 LgBiT 互补。因此，动力学筛选部分参考了引入这一点的重要方案，这可以通过瞬时或稳定表达来实现，并且对于进行活细胞发光测量至关重要。这里介绍的所有方法都允许对化合物活性进行快速排序和活性评估，从而实现早期化合物筛选工作和更快速地识别先导降解剂。来自Promega官网的方案介绍2. HIBIT技术操作流程2.1 使用裂解形式的 HiBiT CRISPR 靶蛋白进行终点降解研究，并可选择细胞活力荧光分析细胞的制备和铺板化合物的制备和添加细胞裂解和测量 *需在细胞裂解液中添加LgBiT蛋白细胞活力测定（可选）蛋白降解和细胞活力的量化在测量的时间点对 DMSO 对照的相对光单位 (RLU) 进行平均。使用该值作为目标的基线蛋白质水平，通过将同一时间点测试的所有其他处理标准化至该值来计算降解分数。例如，如果 DMSO 对照孔在 6 小时时的平均 RLU 为 10,000，化合物处理在 6 小时时的 RLU 为 5,000，则降解比率将计算为 5,000 ÷ 10,000 = 0.5（公式 1）。公式 1：根据 Fractional RLU 确定降解百分比：公式 2：绘制特定时间点的 RLU 分数或降解百分比，对化合物的活性进行排名。或者，通过将所有处理的值与 DMSO 对照进行比较，分析细胞活力测定测量的相对荧光单位 (RFU) 数据。如果观察到任何处理相对于 DMSO 对照的 RFU 显着下降，则可以将降解数据另外标准化为细胞活力测定数据，以确定相对于细胞活力损失的蛋白质水平的变化。2.2. HiBiT CRISPR 靶蛋白的实时动力学降解和可选的细胞活力发光测定*：进行动力学筛选和降解时，需要细胞中的 LgBiT 蛋白共表达。这可通过 LgBiT 载体瞬时转染、使用 BacMam LgBiT 或通过将 HiBiT CRISPR 插入 LgBiT 稳定细胞系来实现。细胞铺板使用表达 LgBiT 的 HiBiT CRISPR 细胞进行动力学降解测定为每个实验定制测量的时间增量，但建议的初始实验是在 24 小时内每 5-15 分钟进行一次发光测量或所需的时间量。细胞活力分析（可选，最终动力学测量后测量）注：推荐 CellTiter-Glo (CTG) KIT测定。动力学降解曲线的量化使用收集的动力学发光测量值，将每个 PROTAC 浓度的原始 RLU 标准化为每个时间点的对照 DMSO 平均值随时间的变化。使用公式 1 计算，比率RLU。公式 1：根据降解曲线，使用公式 2 将单分量指数衰减模型拟合到每条曲线的初始退化部分，直至数据达到稳定平台的水平(plateau)。注：从拟合中排除前几个数据点可能会有所帮助，因为在观察到退化之前可能会有短暂的滞后。公式 2：从公式 2 中，确定参数 ƛ（表示降解速率常数）和 Plateau（表示剩余蛋白质的最低量）。计算 Dmax，它是降解蛋白质的最大分数量，计算方式为 1-Plateau。绘制每个 PROTAC 浓度的 Dmax 以确定与时间无关的降解效力曲线。确定上述绘图的Dmax50。值分析化合物的功效。注：要确定特定时间点的 DC50，请绘制所选时间每个浓度的计算降解百分比。这可以指定为 DC50 t=4 h 或 DC 50t=12 h。2.3. HITBIT技术代表性分析结果为了演示单浓度终点裂解降解分析，使用了几种 CDK 靶蛋白；CDK2、CDK4、CDK7 和 CDK10。在 HEK293 细胞的 C 端用 HiBiT 内源标记，并用 1 µM 浓度的基于 Cereblon 的泛激酶 PROTAC TL12-186处理。在不同时间点测量 CDK 蛋白水平，并确定相对于 DMSO 对照的 RLU 分数。每种 CDK 蛋白在化合物处理和不同时间点下均表现出不同程度的降解（图 1A）。为了了解 CDK 蛋白如何在蛋白质降解方面直接进行比较，将图 1A中的分数 RLU计算为总降解百分比，并针对图 1B中的每个时间点进行绘制。这表明，即使在早期时间点（2 或 4 小时），一些 CDK 家族成员也表现出高水平的降解，并随着时间的推移继续呈上升趋势（图 1B）。图 1：泛激酶 PROTAC，TL12-186 54的 CDK 终点降解和毒性。为了演示动力学降解分析，每个 BET 家族成员蛋白；在稳定表达 LgBiT 蛋白的 HEK293 细胞中，BRD2、BRD3 和 BRD4 在其 N 末端内源性标记有 HiBiT。然后用三种不同浓度的 pan-BET PROTAC 处理；基于 Cereblon 的 dBET6（图 2A）和基于 VHL 的 ARV-771（图 2B）。动力学测量是在 24 小时内收集的，从每个浓度的曲线来看，BET 家族成员反应的差异是显而易见的。BRD2 化合物处理后，在降解后更快启动恢复蛋白（图 2 A，B）。先前已在其他泛BET PROTAC 中观察到，可能是由于与降解过程竞争的转录反馈。图 2：使用 BET 降解剂 dBET6 和 ARV-771分析 BET 家族成员的动力学降解选择性。终点和动力学分析都可以通过化合物的完全反应剂量处理来完成。图3 所示为四种不同分子胶化合物处理稳定表达LgBiT蛋白的Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat细胞的动力学剂量反应降解曲线（时间为横坐标）。来那度胺（图 3A）、伊伯度胺（CC-220）（图 3B）、沙利度胺（图 3C）和泊马度胺（图 3D）。这些降解剂在化合物之间以及整个浓度系列中的降解响应表现出显着差异。图3 ：Ikaros/IKZF1- HiBiT与四种分子胶的活细胞动力学降解剂量响应曲线。为了定量评估图 3中化合物的降解和排序，使用剂量响应曲线来计算关键降解参数（浓度为横坐标），包括降解率（图 4A）、Dmax（图 4B）和 Dmax 50值（图 4B）。这些分析表明，伊伯多胺 (CC-220) 和泊马度胺具有非常相似的快速初始降解率（图 4A），但伊伯多胺 (CC-220) 具有最高的效力，正如之前在研究中所见(图 4B ) 。由于伊伯多胺表现出如此高的效力，并且所有测试浓度均显示出大于 50% 的降解，因此，伊伯多胺获得的 Dmax 50值代表了基于精确拟合数据的限制的估计值。从图3C、D和图4B中的图表来看，在测试的最高浓度下，来那度胺和沙利度胺均未完全降解Ikaros/IKZF1靶标。由于用沙利度胺观察到的降解非常少，降解痕迹无法准确地拟合指数衰减模型，因此，没有量化该处理的降解率。对于最有效的降解剂，伊伯多胺 (CC-220)（图 4B）。细胞活力多重测定显示测试浓度的细胞活力没有损失（图4C）。图 4：计算 Ikaros/IKZF1-HiBiT 的降解率和 Dmax50，以及多重细胞健康检测。图 3 中的动力学降解数据用于计算定量降解参数。3. 结果讨论和HiBit技术注意事项在此提出两种以终点裂解形式或活细胞动力学模式筛选降解化合物活性的方法。这些方法基于相同的发光测量原理，但提供不同级别的细节和理解。任一方法的选择可能取决于筛选目标和化合物库的大小。对于大型化合物筛选平台或初级筛选来观察任何可检测到的降解，终点裂解筛选提供了灵敏且高效的高通量兼容性，而其他终点方法（例如蛋白质印迹或质谱法）可能不切实际或难以适应。这些筛选的起点可以使用有限数量的浓度和时间点进行。1，建议测试的初始浓度在 100 nM-10 µM 范围内，以考虑初始降解剂效力低、渗透性差，或在某些情况下使用高效化合物时，存在钩状效应。2，进一步建议至少应测试两个不同的时间点，以确定 4-6 小时的早期降解和 18-24 小时的潜伏或持续降解。表现出高降解效力和靶向机制的化合物在 4-6 小时内很容易观察到，而仅在稍后时间点观察到的降解或明显的蛋白质损失可能是由于多种机制造成的。3，强烈建议在早期和晚期时间点监测细胞活力，以便将蛋白质损失与细胞死亡造成的损失分开。与任何类型的发光或荧光测定类似，文库中的化合物有可能干扰或抑制信号，因此，使用不相关的融合或监测蛋白质水平的替代方法对先导化合物进行后续正交实验对于评估以下情况非常重要：这些测定中 RLU 的损失与靶蛋白降解直接相关。长时间以活细胞动力学形式进行筛选的能力在很大程度上依赖于背景检测信号 (S:B，signal to background )。影响 S:B 的因素包括目标蛋白本身的表达水平（可以跨越几个数量级）、选择用于肽插入的细胞系中 LgBiT 表达的效率，以及标记靶标在其互补蛋白中的可及性（LgBiT）。制定了一般阈值要求，其中 S:B 为 15，以成功测量 Endurazine 或 Vivazine 在动力学模式下的降解情况。S:B 是通过测量共表达 LgBiT 的 HiBiT 编辑细胞相对于在 Endurazine 或 Vivazine 活细胞底物存在下单独表达 LgBiT 的未编辑亲本细胞的基线信号来确定的。Vivazine 会产生更高的发光信号，但衰减速度比 Endurazine 更快，并且可能会将信号采集限制在 24 小时或更短的时间内。此外，S:B 还可能高度依赖于是否使用 CRISPR 细胞池或克隆。与上面讨论的终点分析一样，初始动力学筛选可以以高通量方式使用 100nM-10μM 范围内的有限浓度进行。在 384 孔格式中，可以在一块板上以一种浓度轻松筛选 100 多种化合物，一式三份。由此产生的降解曲线不仅将提供关于观察到的降解程度的指导，而且还提供关于蛋白质的降解速率、降解持续时间和潜在恢复的指导（图2和图3）。降解曲线的形状也能产生有价值的信息。特异性和有效的降解剂通常表现出目标蛋白最初快速损失，并在几小时内达到稳定水平，而转录反馈或化合物毒性等其他机制通常会随着时间的推移导致蛋白质更线性的损失。终点裂解分析会忽略这些细节和细微差别，并且通过 24-48 小时的实时分析，不必预测在一组新的或未知的化合物中捕获真实 Dmax 的时间。实时动力学还可以进行有效的剂量反应筛选，以更好地了解化合物功效、化合物浓度如何影响初始降解率，并提供基于多个参数对化合物进行排名的可能性。降解效力的经典测量涉及基于表观降解最大值的特定时间点的DC 50计算。相比之下，评估效力的动力学方法包含了每个浓度下的真实降解最大值，无论它何时发生。我们将这种动力学降解效力的测量称为 Dmax 50 。以这种方式进行的分析考虑了在较低浓度下可能更慢地引发降解的化合物，因此需要更长的处理后时间才能达到其 Dmax。根据降解率和 Dmax 对化合物进行排序尤其能提供丰富的信息。对于最有效的降解剂，这将进一步区分缓慢但有效的降解剂与快速且有效的降解剂。总之，利用 HiBiT CRISPR 细胞系进行裂解细胞动力学筛选和活细胞动力学筛选都是强大的方法，可以更全面地了解目标蛋白质降解、化合物功能，并通过增强关键降解参数实现从初始活性评估到下游化学优化的筛选过程。参考文献:https://www-jove-com.libproxy1.nus.edu.sg/cn/t/61787/high-throughput-cellular-profiling-targeted-protein-degradation声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓