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当新能源汽车一炮而红，给市场带来强劲增长动力之时，超越燃油车成为汽车行业的未来趋势；当《黑悟空》原创游戏火出海外，斩获“年度最佳动作游戏”和“玩家之声”两项大奖，引起国内一众游戏厂商的深思。 身处医药圈的投资人、企业家们，或也早已开始思考医药行业的“超车机会”在哪里？ 或是前段时间爆火的“顶流”GLP-1药物，或是近期BD出海交易频繁的双抗产品，甚至是起于罕见病、未来将发力于慢性病，实现对症治疗向病因治疗的小核酸药物。 但笔者认为，若在新药领域选出一个“风口”，经历20年沉淀，被誉为小分子药物希望的PROTAC药物，或许该有一席之地。 PROTAC的诞生与爆火 纵观历史，PROTAC的发展历程横跨20年，关键阶段可以分为四个： 图片来源：公开数据整理 概念提出阶段（2001年—2004年） 2001年，Crews教授和Deshaies教授首次在论文中提出了“PROTAC”的概念，但彼时，细胞渗透性和细胞活性并不理想，这也成了PROTAC发展的主要限制。 2003年，PROTAC被应用于靶向降解ER和AR受体，使得PROTAC能够有效降解Erα和AR。 技术进步阶段（2004年—2019年） 2004年，鉴于以肽为基础的PROTAC虽有生物相容性高、体内毒性低的优点，但却也有细胞通透性和合成等问题，随着E3连接酶小分子配体的发展，PROTAC快速进入小分子化阶段。 2010年，CRBNE3复合物的研究取得了重大突破，HIF1α肽的小分子模拟物被发现，为基于小分子结构的完全PROTAC的设计开启了新的可能性。 2015年，第一种基于VHL与CRBN的PROTAC出现，这一年发现了首个基于这两种E3泛素连接酶的PROTAC，其降解活性达到了纳摩尔级别。这一突破性的研究为PROTAC技术的发展奠定了重要基础，并标志着PROTAC作为药物开发的新途径得到了学术界和制药工业的广泛关注。 临床转化阶段（2015年—2019年） 2015年，PROTAC技术先驱公司Arvinas分别与默沙东、基因泰克达成合作，利用Arvinas的PROTAC技术平台开发新的治疗药物。 2015年，C4Therapeutics成立，聚焦蛋白质降解剂研发领域，专注于利用人体对蛋白质水平的自然调节过程来开发新的治疗候选药物，用于治疗癌症、神经退行性疾病以及其他疾病。 2019年，ARv-110成为首个进入临床试验的PROTAC药物，通过将雄激素受体招募到CRL4-CRBN连接酶复合物中来靶向雄激素受体。自此，PROTAC进入了临床转化时代，设计用于降解致病蛋白质的多个分子进入临床，这一领域变得非常热门。 全球合作阶段（2019—2024年） 2019年，拜耳与Arvinas、百健与C4T、罗氏与C4T、吉利德与Nuri分别达成合作协议，共同开发PROTAC蛋白质降解药物。 2020年，赛诺菲与KymeraTherapeutics达成合作协议，共同开发蛋白降解管线KT-474。 2021年，辉瑞与Arvinas公司达成了一项战略合作，以24亿美元的价格共同推进ARV-471的开发和商业化。 2024年4月，诺华与Arvinas达成全球开发和商业化ARV-766的协议，同时Arvinas的临床前项目AR-V7出售给诺华。 很明显，PROTAC的四个发展阶段有着明显的里程碑意义，企业方面诞生了以Nurix、Arvinas、Kymera、C4T四大技术龙头为首的系列Biotech，也是这个阶段，Biotech企业间的差异化优势开始逐步出现。 数据来源：截至2025.01.10，公开数据整理（点击大图查看详情） 疗法方面也从ARV-110不断发展出ARV-471、NX2127、KT474等众多备受期待的疗法；合作方面，拜耳、罗氏、赛诺菲、辉瑞、诺华等大型企业纷纷入局，既推动了该领域的技术发展和应用，也将PROTAC从成药性验证阶段带向了商业化验证阶段。 那么问题来了，PROTAC究竟是怎样一个时代产品，能拥有如此魅力？ PROTAC的魅力所在 所谓PROTAC，即靶向蛋白水解的嵌合体，是一种创新的靶向蛋白降解技术。 图片来源：TargetMol小分子化合物专家 该技术通过一种小分子嵌合体，同时结合我们希望降解的目标蛋白（POI，ProteinofInterest）和E3泛素连接酶。这种结合促使目标蛋白被标记（泛素化），随后被细胞内的蛋白酶体降解。 与传统的小分子抑制剂不同，PROTAC实现了“催化性降解”，而不是简单的“一对一”抑制目标蛋白的活性。这种方法为调控细胞内蛋白质水平提供了新的策略。 结构上，PROTAC由三部分组成：一个与E3连接酶结合的配体，用于引导蛋白降解；一个与靶蛋白结合的配体，用于引导小分子的靶向定位；以及一个负责嵌合两个配体的连接子。 机制上，以泛素-蛋白酶体系统降解蛋白质为基础的PROTAC，与传统的抑制剂的作用机制大不相同，它往往不需要与靶蛋白特异性结合，只需要捕获靶蛋白形成E3连接酶-PROTAC-靶蛋白三元复合物就可以进行靶蛋白降解。因此理论上，PROTAC可以具备很多其他疗法不具备的优势。 靶向“不可成药”蛋白潜力：作为PROTAC最吸引人的特点，理论上PROTAC能够靶向几乎所有细胞内的蛋白以及跨膜蛋白进行降解，历史上被认为难以药物靶向的癌蛋白如原癌基因蛋白Myc和信号转导及转录激活蛋白3（STAT3）等。 克服耐药性：PROTAC通过摧毁整个靶标蛋白，PROTAC彻底消除了靶蛋白的全部功能，因此不易受到靶蛋白表达增加和突变的影响，可以克服靶蛋白突变/过表达引起的耐药性。 低毒性：PROTAC由传统“占位驱动”向“事件驱动”的模式转变，导致其具备强大的催化作用能力，使其在远低于小分子抑制剂的浓度下即可实现显著疗效，间接导致疗法的毒性作用降低。 可逆化：此外，与CRISPR和RNAi等其他蛋白降解技术相比，PROTAC具有与靶标可逆结合的优势，存在循环使用的可能，能够通过控制药物浓度或作用时间来精确调节蛋白水平，减少预期的脱靶效应或副作用。 目前，在愈发多样化的治疗策略之下，由传统小分子抑制剂，向单抗、RNA、ADC等创新疗法迅速演变的趋势已足够明显，而各种疗法的弊端与劣势之下，PROTAC的独特优势也是其作为潜力疗法的根本。 就现阶段而言，小分子抑制剂目前存在的最大挑战在于耐药性和脱靶效应，而单抗虽有较高靶向亲和力，但却也存在细胞渗透性差、口服不可用以及成本高等缺点，RNA疗法也同样面临脱靶效应、口服生物利用度差和组织渗透性不理想等挑战。 作为一种有前途的治疗范例，PROTACs比小分子抑制剂、单克隆抗体和其他治疗策略具有独特的优势。 当然，PROTAC技术并非毫无瑕疵，其显著挑战仍需引起高度重视。作为一种双靶点药物，PROTAC分子在分子量、分子刚性及水溶性方面均存在显著的局限性，这些不足直接削弱了其口服吸收效率和过膜性能。此外，与其他药物相比，PROTAC的化学合成过程也呈现出更为复杂与困难的特性。 目前，PROTAC已被广泛用于肿瘤、自身免疫疾病、神经退行性疾病、脱发、痤疮、哮喘、细菌感染以及部分传染性疾病的治疗。 PROTAC的开发现状 整体上看，目前的PROTAC药物开发已处于成药性验证阶段的最后阶段，或将在近两年正式跨入商业化阶段。 从首款PROTAC药物ARV-110诞生以来，目前全球范围内已有超过200余款新药，进入临床阶段的产品共有33款，占比16.3%。 数据来源：药智数据（数据截止2025年1月10日的临床活跃管线，临床前管线均考虑为活跃管线） 其中，临床III期的产品目前仅有ARV-471一款，预计有望在2026年上市；进入临床II期的产品则共有8款，分别是Cullgen的CG-001419、Kymera与赛诺菲的KT-474、Arvinas的ARV-110、C4T的CFT-8634、海创药业的HP-518、百济神州的BGB-16673、开拓药业的GT-20029、Arvinas与诺华的ASP-3082。 靶点方向 针对全球在研PROTAC药物的靶点情况来看，几乎所有管线针对的靶点均已得到验证。其中，BRD4为最常见靶点，共有16个管线涉及，其次是AR、BTK，分别涉及14与12个管线。 数据来源：截至2025.01.10，药智数据 而针对临床阶段的PROTAC靶点分布情况来看，最集中的领域不再是BRD4，反而是BTK靶点的管线数量最多，共有四款新药，其次是AR与IRAK4，分别涉及4款与3款新药。 数据来源：截至2025.01.10，药智数据 对比之下，很明显的一点是，临床前阶段的靶点选择与临床阶段的靶点选择正处于不同的方向，比如全球在研靶点首位的BRD4，16个管线却均为临床前阶段，某种程度这也意味着PROTAC领域正在向着差异化竞争的趋势发展。 当然，无论是临床前，还是临床后，领域内的靶点选择也确实存在部分常青树，比如AR、BTK两者。 对于BTK靶点，其主要作用为促进B细胞生长、成熟、迁移和凋亡，因此肿瘤、自免疾病等多个领域的失调都可能是BTK通路失调所致，而作为现阶段研究较成熟靶点，全球已有6款BTK抑制剂获批上市，但同时，BTK抑制剂耐药性与脱靶效应的问题也严重阻碍了领域发展。 靶向BTK的PROTAC顺势而生，其不再如小分子靶向药一般抑制蛋白酶活性，转而降解整个蛋白，使其可以完美避免耐药性等问题，因此很多药企将其作为BTK抑制剂的进阶产品。 部分靶向BTK的PROTAC 临床阶段 药品名称 原研企业 最高阶段适应症 临床Ⅱ期 BGB-16673 百济神州 B细胞恶性肿瘤; B细胞淋巴瘤 临床Ⅰ期 HSK-29116 海思科 B细胞恶性肿瘤 NX-5948 Nurix Therapeutics B细胞恶性肿瘤 NX-2127 Nurix Therapeutics B细胞恶性肿瘤 临床前 MZ-001 美志医药 自身免疫性疾病; 非霍奇金淋巴瘤 NW-7-295 麓鹏制药 血液肿瘤 HSK26784 海思科 B细胞白血病 数据来源：截至2025.01.10，药智数据 目前，全球已有超过10款靶向BTK的PROTACs药物在研，横跨临床前与临床后两大阶段，其中百济神州的BGB-16673临床阶段最为靠前，其次是思科的HSK29116与NurixTherapeutics的NX-2127和NX-5948。 对于AR靶点，其作为类固醇激素核受体家族中的一员，其是一种依赖配体的转录因子，能够调控下游特定基因的表达，在维持肌肉骨骼、男性性相关功能以及前列腺癌的进展中起关键作用。 目前，AR靶向疗法已被开发用于治疗相关的人类疾病，AR拮抗剂也已被开发用于治疗前列腺癌，包括转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）。然而，当今AR拮抗剂主要是通过抑制AR功能来发挥治疗作用，但这些小分子抑制剂一方面对具有AR基因扩增、突变和交替剪接的晚期前列腺癌无效，另一方面也在临床使用过程中也出现了耐药，因此开发一种新型有效的AR靶向疗法显得至关重要。 靶向AR的PROTAC拥有AR基因扩增表达，且能完美克服AR拮抗剂的耐药特性，目前正在持续吸引众多研究的注意，迄今为止全球已有20余款ARPROTAC降解剂在研，6款ARPROTAC降解剂进入临床。 部分靶向AR的PROTAC 临床阶段 药品名称 原研企业 最高阶段适应症 临床Ⅱ期 HP-518 海创药业 转移性去势抵抗性前列腺癌 GT-20029 开拓药业 寻常痤疮雄激素性脱发 ARV-110 Arvinas Inc 转移性去势抵抗性前列腺癌 ARV-766 Arvinas Inc诺华制药 转移性前列腺癌 临床Ⅰ期 DG-01 德亘生物 前列腺癌 NX-2127 Nurix Therapeutics B细胞恶性肿瘤 临床前 AR-V7 Arvinas Inc诺华制药 前列腺癌 SK-575 四川大学 癌症 ARD-61 密西根大学 去势抵抗性前列腺癌 数据来源：截至2025.01.10，药智数据 其中Arvinas的ARV-110、海创药业的HP-518、开拓药业的GT-20029、Arvinas与诺华合作的ARV-766进展最快，均已进入临床II期；德亘生物的DG-01与NurixTherapeutics的NX-2127则位于临床I期阶段。 适应症方向 根据有关统计数据显示，虽然PROTAC在多种疾病治疗中展现出广阔的应用前景，但在所有在研PROTAC管线适应症选择上，肿瘤仍是其最主要的应用方向。 全球在研的202个PROTAC药物中，有163个管线针对肿瘤性疾病，占比达到80.69%。其中实体瘤项目68个，占比33.66%，血液肿瘤项目25个，占比12.37%；而肿瘤之外，自免、神经退行性疾病、感染、代谢等领域也有较少布局。 数据来源：截至2025.01.10，药智数据 整体上看，肿瘤、自免、神经退行性疾病与病毒感染类疾病是目前PROTAC领域最主要的适应症方向。 对于肿瘤适应症而言，PROTAC分子可以特异性结合并降解致癌蛋白，进而抑制肿瘤细胞的生长、增殖以及转移，而由于PROTAC技术较传统靶向抑制剂，在耐药性、低毒性、可逆化与靶点空间上的优势，其也顺势成为癌症患者小分子疗法领域的全新治疗选择。 对于自免疾病而言，由于其病理机制的复杂性以及临床的异质性，靶向治疗可谓是自免疾病治疗的最佳选择，但是目前靶向治疗（小分子抑制剂与单抗等）所治疗的适应症分布较为集中，只能覆盖整个人体中20-25%的药物靶点，大量适应症仍缺少靶向药物，而就算是现有靶向治疗，在有效性、安全性方面也存在不少作用。而PROTAC药物无论是分子结构，还是作用机制上都成为治疗自免的不二之选。 目前，全球在研PROTAC药物中已有多款选择针对自免相关疾病，其中KymeraTherapeutics的KT-474已进入临床II期，适应症覆盖特应性皮炎、化脓性汗腺炎；百济神州的BGB-45035、Kymera的KT-621、Nurix的NX-5948则已进入临床I期，适应症分布针对特应性皮炎、慢阻肺等。 对于神经退行性疾病而言，原则上，PROTAC技术也能够靶向这些异常聚集的蛋白质，精准地调控这些致病蛋白的水平，促使其降解，从而缓解疾病症状，延缓疾病的进展。目前临床研究靠前的是Arvinas的ARV-102，适应症方向为帕金森病与进行性核上性麻痹。 对于病毒感染性疾病而言，部分病毒在感染细胞后会借助宿主细胞的蛋白质进行复制和生存。PROTAC技术能够针对这些与病毒相关的蛋白质进行降解，从而抑制病毒的感染和传播，这为开发新型抗病毒药物提供了崭新的思路和策略。 目前来看，虽然早期PROTAC多集中于肿瘤领域，但随着技术进步，现今其在越来越多疾病中展现的广阔的应用潜力，尤其是自免、神经退行性疾病等方面。 企业方向 就全球范围而言，自Arvinas成立之后，C4Therapeutics、KymeraTherapeutics等新贵公司相继成立，组成了如今技术领域的龙头企业。 以PROTAC技术的先驱者Arvinas为例，其目前共有六个处于临床阶段的在研项目，ARV-471已进入临床III期，大概率将成为全球首款获批上市的PROTAC疗法。之后则还有ARV-110与ARV-766两款位于临床II期的产品，适应症均指向前列腺癌；ARV-102、ARV-393与ARV-471三款处于临床I期的产品，适应症分别集中于神经退行性疾病、非霍奇金淋巴瘤等方向。 Arvinas在研PROTAC管线 药品名称 中国上市 原研单位 靶点 适应症 ARV-471 Arvinas Inc; 辉瑞公司 临床Ⅲ期 Estrogen receptor 乳腺癌; 转移性乳腺癌 ARV-110 Arvinas Inc 临床Ⅱ期 AR 转移性去势抵抗性前列腺癌 ARV-766 Arvinas Inc; 诺华制药 临床Ⅱ期 AR 转移性前列腺癌; 转移性去势抵抗性前列腺癌 [phenyl-14C] ARV-471 Arvinas Inc; 辉瑞公司 临床Ⅰ期 Estrogen receptor _ ARV-393 Arvinas Inc 临床Ⅰ期 BCL-6 复发性/难治性非霍奇金淋巴瘤 ARV-102 Arvinas Inc 临床Ⅰ期 LRRK2 帕金森病; 神经退行性疾病; 进行性核上性麻痹 A1874 Arvinas Inc 临床前 BRD4 癌症 ARV-825 Arvinas Inc 临床前 BRD4 癌症 AR-V7 Arvinas Inc; 诺华制药 临床前 AR 前列腺癌 ARVN-71228 Arvinas Inc 临床前 BCL-6 弥漫性大B细胞淋巴瘤 ARV-771 Arvinas Inc 临床前 BRD2; BRD3; BRD4 去势抵抗性前列腺癌 数据来源：截至2025.01.10，药智数据 至于国内范围，以百济神州、开拓药业与海创药业为首的一系列国产Biotech，目前在PROTAC领域已拥有一定的行业地位，勉强可以挤进第一梯队，与四大龙头争雄。 当然，当PROTAC从技术阶段转向商业化阶段的关键时期，MNC怎可能放弃如此大好机会，礼来、诺华、安进等大药企也纷纷入场，试图拔得头筹。 小结 对于PROTAC领域而言，历经20年沉淀，PROTAC成药前景正在越来越明朗。 一者，随着时间推移，越来越多的PROTAC项目在近两年陆续读出关键临床研究数据，甚至领域内即将迎来首款上市产品，为靶向蛋白降解这一前沿技术的成药潜力提供更多有力证明。 二者，不同于早期靶点集中趋势，当下PROTAC领域一方面重点发力经典靶点的新老药物迭代，另一方面越来越多新靶点PROTAC正在持续出现。 三者，随着领域内玩家数量上涨，肿瘤虽仍是现阶段的主攻方向，但部分Biotech已经将目光放到了自免、神经退行性疾病等领域，百家争鸣有望。 而对于PROTAC市场格局，海外四大技术龙头的临床进展顺利，目前以Arvinas最为靠前，其ARV-471的III期临床数据即将读出，未来3-5年，或将成为全球首款上市的PROTAC新药。至于国内方面，百济神州、海创药业、开拓药业等国产Biotech企业的管线进展迅速，目前已与海外技术龙头处于同一研发阶段（临床II期），俨然具备了全球竞艺的资格。 总体来看，在此PROTAC赛道由“成药性验证阶段”向“商业化阶段”转化的关键时期，或许PROTAC真的有望成为继ADC、核药之后的下一个风口，我们拭目以待。 友情推荐：医药行业深度技术内容，点击“博药”查看详情~ 来源 | 博药（药智网获取授权转载） 撰稿 | 博药内容中心 责任编辑 | 八角 声明：本文系药智网转载内容，图片、文字版权归原作者所有，转载目的在于传递更多信息，并不代表本平台观点。如涉及作品内容、版权和其它问题，请在本平台留言，我们将在第一时间删除。 合作、投稿 | 马老师 18323856316（同微信）  阅读原文，是受欢迎的文章哦

2024 年 CNS（《Cell》《Nature》《Science》）期刊发表的新型蛋白降解技术展现出了生物医学研究领域的前沿进展，这些技术为深入理解蛋白质功能和疾病治疗提供了强有力的工具，下面让小编带大家回顾下2024年发表在CNS上的新型蛋白质降解技术。   01   转铁蛋白受体靶向嵌合体（TransTACs） 细胞膜蛋白的调控对细胞生理功能和疾病治疗意义重大，但传统调控方法存在局限。2024年9月25日，Dana-Farber癌症研究中心/哈佛大学医学院周昕团队在Nature期刊上发表了题为“Transferrin receptor targeting chimeras for membrane protein degradation”的研究论文（图1）。该研究旨在开发一种新的膜蛋白降解策略，以更有效地调控膜蛋白水平和活性。 图1.论文截图 在该研究中，研究人员发现转铁蛋白受体1（TfR1）在癌细胞中过表达且内吞作用迅速，适合用于靶向膜蛋白降解。然后，研究人员设计了TF受体靶向嵌合体（TransTACs），其可驱动靶蛋白与TfR1共内化进入溶酶体降解途径（图2）。研究表明，TransTACs能有效降解多种膜蛋白，如表皮生长因子受体、程序性细胞死亡1配体1等，降解效率在不同细胞系统中均超过80%。TransTACs还可用于控制嵌合抗原受体（CAR）-T细胞活性，从而增强其抗肿瘤活性；能靶向肺癌中耐药的EGFR突变细胞，为癌症治疗提供新策略。 图2.TransTAC平台 TransTAC平台为膜蛋白降解提供了新途径，有望在癌症治疗等领域发挥重要作用，为开发治疗多种疾病的新方法提供了理论基础和实验依据。 02  基于trim21的分子胶和PROTAC降解剂（TrimTACs） 靶向蛋白质降解是治疗疾病的重要策略，但现有方法依赖少数组成型活性的E3泛素连接酶，存在选择性和药代动力学等问题。2024年11月1日，北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院韩霆实验室与黄牛实验室合作在 Cell 期刊上发表了题为“Selective degradation of multimeric proteins by TRIM21-based molecular glue and PROTAC degraders ”的研究论文（图3），该研究通过寻找新的降解途径，以提高对多聚体蛋白的降解选择性和效率。 图3.论文截图 研究人员发现抗精神病药物阿立哌唑的代谢物（S）- ACE - OH可作为分子胶，诱导E3泛素连接酶TRIM21与核孔蛋白NUP98相互作用，导致核孔蛋白降解和核质运输障碍。基于此，研究人员设计了TRIM21 - based PROTACs（TrimTACs），可选择性降解生物分子凝聚物中的多聚体蛋白，而不影响单体蛋白。研究还通过晶体结构分析和生物物理测量，揭示了分子胶的作用机制和TRIM21与配体的结合模式。 图4.TrimTAC平台 TrimTACs平台为治疗蛋白质异常聚集相关疾病提供了新策略，有助于深入理解蛋白质降解机制，为开发针对多聚体蛋白相关疾病的治疗药物提供了新的思路和方法。 03   基于EndoTags的溶酶体靶向降解嵌合体（pLYTAC） 内吞作用和溶酶体运输是细胞表面受体调控的重要机制，传统靶向降解方法存在局限性。2024年9月25日，蛋白质设计先驱 David Baker教授团队与2022年诺贝尔化学奖得主Carolyn Bertozzi教授团队合作在 Nature期刊上发表了题为“Designed endocytosis-inducing proteins degrade targets and amplify signals”的研究论文（图5），该研究设计了新的内吞触发结合蛋白（EndoTags），以克服传统方法的不足，从而实现更有效的蛋白质降解和信号调节。 图5.论文截图 在该研究中，研究人员针对胰岛素样生长因子2受体、去唾液酸糖蛋白受体等受体设计了EndoTags，其与靶蛋白结合剂融合后可诱导受体构象变化或聚集，触发内吞作用，促进靶蛋白的降解（图6）。同时，研究人员在此基础上构建了基于人工设计蛋白的溶酶体靶向降解嵌合体——pLYTAC，pLYTAC能够在活细胞中靶向降解大量疾病相关分子靶点，实现对靶蛋白的溶酶体运输和靶向降解。由于这些受体蛋白具有不同的组织分布，因此，不同的EndoTag可以实现对不同组织的靶向降解。EndoTag的基因可编码性，使其可通过治疗性mRNA或基因疗法递送。在小鼠肿瘤模型中，EndoTag - 抗PD - L1融合蛋白能显著增强抗体的抗肿瘤活性。此外，EndoTags还可增强细胞内信号传导，如通过促进Notch - 衍生的合成信号系统的信号激活，实现信号的近100倍增强；之后，研究人员通过将多个EndoTag与蛋白质开关LOCKR技术结合，创建了逻辑门控pLYTAC，实现更高特异性的蛋白质靶向降解。 图6.内吞触发EndoTags的设计策略 EndoTags为蛋白质降解和信号调节提供了创新的方法和策略，拓展了细胞内蛋白质调控的手段，为开发新型治疗药物和治疗多种疾病提供了新的途径和方法。 04   基于噬菌体辅助的连续进化（PACE）平台的锌指（ZF）降解子 小分子诱导的降解子在基础研究和临床应用中具有重要意义，但现有降解子存在一些问题，如大小不适宜、对靶标蛋白的特异性和亲和力不足等。2024年3月15日，麻省理工学院和哈佛大学Broad研究所的刘如谦（David Liu）团队在 Science 期刊上发表了题为“Continuous evolution of compact protein degradation tags regulated by selective molecular glues”的研究论文。该研究基于噬菌体辅助连续进化（PACE）平台开发了一种新型靶向蛋白质降解系统，以进化出更高效、特异性更强的降解子。 图7.论文截图 在该研究中，研究人员首先构建了噬菌体辅助的连续进化（PACE）平台，用于筛选和进化与分子胶复合物相互作用的蛋白质。利用该系统，从锌指（ZF）蛋白和分子胶组成的复合物中筛选出了能够与CRBN结合的ZF降解子，并对其进行了优化，得到了SD40等高效降解子（图8）。SD40仅36个氨基酸，可通过prime editing高效插入基因组位点，对其靶蛋白具有高效、快速和选择性的降解能力。研究还解析了SD40与CRBN结合的复合物结构，揭示了其作用机制和特异性。此外，针对小鼠CRBN中存在的突变，进化出了SD56等能在小鼠细胞中发挥作用的降解子。 图8.新型锌指结构域指导其标记的内源性蛋白的特异性降解 总之，该研究开发的PACE系统为快速进化分子胶复合物提供了有力工具，进化得到的ZF降解子为蛋白质降解和靶向治疗领域提供了新的思路和方法，有助于推动相关领域的研究和应用。 05   分子内二价胶水（IBGs） 靶向蛋白质降解是一种重要的治疗策略，但目前的方法如PROTACs和分子胶等存在一些局限性，如需要与靶标蛋白和E3泛素连接酶分别结合、对靶标蛋白的选择性和降解效率有待提高等。2024年2月21日，英国邓迪大学生命科学学院靶向蛋白降解研究中心与奥地利科学院CeMM分子医学研究中心合作在Nature期刊上发表了题为“Targeted protein degradation via intramolecular bivalent glues”的研究论文，该研究揭示了一类全新的靶向蛋白降解分子—分子内二价胶（intramolecular bivalent glues，IBG），这类分子的降解模式结合了PROTAC和分子胶的特性，能够实现低皮摩尔效力的降解，有望开启新一代的TPD治疗模式。 图9.论文截图 在该研究中，研究人员发现了一种新型的双功能降解剂—分子内二价胶（IBGs），它能够同时与靶标蛋白的两个相邻结构域结合，诱导靶标蛋白的降解。以IBG1为例，它能有效降解BRD2和BRD4，但不降解BRD3，其作用依赖于CRL4 - DCAF16复合物。研究人员通过多种实验技术研究了IBG1的作用机制，发现IBG1能增强DCAF16与BRD4的亲和力，使两者形成稳定的三元复合物，促进BRD4的泛素化和降解。基于机制和结构的理解，研究人员对IBG1进行优化，得到了IBG3等更高效的降解剂，其降解效率可达皮摩尔浓度。 图10.IBG1同时参与BRD4的两个溴结构域，并将BRD4粘合到DCAF16上 研究发现的IBGs为靶向蛋白质降解提供了一种新的策略，具有高效、选择性强等优点，为治疗癌症等疾病提供了新的治疗手段，也为进一步理解蛋白质-蛋白质相互作用和靶向蛋白质降解机制提供了重要的理论依据。 06   结语 这些新型蛋白降解技术为疾病治疗提供了新的思路和方法。例如，IBGs 和 TransTACs 等技术可用于靶向降解与疾病相关的蛋白质，如癌症细胞中的特定蛋白靶点，为癌症治疗提供了更有效的治疗手段。同时，新型蛋白降解技术的发展也为药物研发带来了启示。通过设计和优化降解子，可以提高药物的特异性和疗效，减少药物的副作用。此外，这些技术还可以用于发现新的药物靶点和治疗药物，为药物研发领域的创新发展提供了重要的支持。 Ref. [1] Zhang, Dingpeng et al. “Transferrin receptor targeting chimeras for membrane protein degradation.” Nature, 10.1038/s41586-024-07947-3. [2] Lu, Panrui et al. “Selective degradation of multimeric proteins by TRIM21-based molecular glue and PROTAC degraders.” Cell vol. 187,25 (2024): 7126-7142.e20. [3] Huang, Buwei et al. “Designed endocytosis-inducing proteins degrade targets and amplify signals.” Nature, 10.1038/s41586-024-07948-2. [4] Mercer, Jaron A M et al. “Continuous evolution of compact protein degradation tags regulated by selective molecular glues.” Science (New York, N.Y.) vol. 383,6688 (2024): eadk4422. [5] Hsia, Oliver et al. “Targeted protein degradation via intramolecular bivalent glues.” Nature vol. 627,8002 (2024): 204-211. 推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。 原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。 有问题可发邮件至yong_wang@pku.edu.cn获取更多信息。 ©2021 医药速览 保留所有权利 往期链接 “小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点  人人学懂免疫学 | 人人学懂免疫学（语音版）    综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普 | 医药前沿笔记 PROTAC技术 | 抗体药物 | 抗体药物偶联-ADC 核酸疫苗 | CAR技术 | 化学生物学 温馨提示 医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群加作者微信（yiyaoxueshu666）或者扫描公众号二维码添加作者，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。 简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送 ①点击标题下方“医药速览”   ②至右上角“...”  ③点击“设为星标

早研 早聊 2024. Dec.7 on-Line bioRxiv Early R&D Talking 学以致用 侃侃而言 :环肽PROTACs  DOI: 10.1101/2024.12.07.627262 大环肽再一次吸引众多的研发热情，除了其本身兼顾小分子和生物大分子的某些特性以外，其治疗应用扩展也是一方面很重要的关键因素，就比如在大环靶向蛋白降解嵌合体、大环分子胶降解剂等方面的应用。 近日，预刊bioRxiv上刊载了一篇CUL3KLHL20驱动的基于大环肽设计的BRD蛋白降解剂。接下来了解一下其设计和表征详情 原刊开源，文末“阅读原文”可直达原址。 01 新型E3连接酶：CUL3KLHL20 靶向蛋白降解（TPD）作为一种新型的治疗策略，近些年来获得了足够的关注，也由此产生了众多蛋白质降解剂，靶向各种蛋白质。然而，大多数降解剂分子都参与招募CRBN和VHL的E3连接酶。一方面，过度的使用CRBN、VHL配体，将产生可能的耐药性，这也是当前困扰PROTACs治疗的一大难题；另一方面，为了增加PROTACs等降解剂的治疗应用范围，扩大TPD的应用潜力，需要扩大E3连接酶的范围。 因此，发现和开发新型E3连接酶，并发现其配体具有非常重要的价值和意义。 KLHL20是CUL3超级家族60多个BTB-Kelch家族衔接蛋白之一，也是一种癌蛋白，在许多癌细胞中广泛表达；因此，它可以作为癌症治疗中TPD招募的理想E3连接酶。 02 基于KLHL20大环肽配体的PROTACs    2.1、KLHL20高特异性环肽配体 目前，泛素-蛋白酶体系统（UPS）是已知的CUL3KLHL20驱动的蛋白降解的的唯一途径。本文研究人员早先针对KLHL20的功能验证中，设计了一系列小型环肽，发现了环肽配体BTR2000，与KLHL20的Kelch结构域的降解决定子结合口袋结合。 尽管仅有三个氨基酸残基（P-D-L）与KLHL20结合，BTR2000在蛋白质组分析中却表现出了高特异性。因此，BTR2000可以作为选择性KLHL20招募配体，类似于基于沙利度胺类似物之于VHL、VH032类似物之于CRBN等的PROTACs的设计。    2.1、环肽靶向蛋白降解嵌合体 如下表，研究人员利用环肽BTR2000作为KLHL20 E3连接酶配体，JQ1作为BET家族BRD蛋白家族溴结构域抑制剂，通过多种连接子，设计BRD蛋白降解剂。最终确定了BTR2004作为BRD2、BRD3、BRD4的强效降解剂。 BTR2004是一种新型的大环肽-小分子连接异源双功能PROTAC，为了更好的了解这种新型PROTAC的生物活性特性，接下来研究人员利用BTR2004进一步表征KLHL20驱动的靶向降解。比如，这种新型PROTAC引入细胞的动力学、三元复合物形成在亚细胞的定位、降解的速度、有效时间等。    2.2、BTR2004降解动力学 在作者之前的研究报道中，针对BET家族三种BRD蛋白，BTR2004针对BRD2具有更高的活性，因此，接下来的表征主要围绕BRD2进行展开。 如上图A，降解剂浓度≥2μM，以确保BRD2最大降解。 上图B，总体看，4μM的BTR2004在2小时内有效地清除BRD2蛋白，然而，直到化合物引入约40分钟后才出现可观察到的降解。 为了了解降解动力学，研究人员采用两种不同浓度的降解剂，检测了在不同孵育时间下的BRD2蛋白水平。 如图C，靶蛋白降解曲线呈S型，并且两条曲线都可以用S曲线方程拟合。 蛋白质降解速率和化合物浓度相关，高浓度的降解速率更快，并且比低浓度更快到达最大降解。需要注意的是，不管是高浓度还是低浓度，降解剂发挥降解作用的起始时间几乎相同，并且达到的最大降解值相似。 如图D，通过拟合S曲线方程，可以直接比较不同浓度下的动力学行为。常数"m"是最小值，等于最大降解时剩余的蛋白质比例；常数"k"是发生拐点的时间，此时降解率最大，达到最大降解的一半；常数"n"与斜率成正比。    2.3、BTR2004降解持久性、生物活性半衰期 降解剂在平衡状态下持续存在，来维持其降解蛋白的效率。因此，评估蛋白降解剂的另一个重要因素是它在细胞中的持久性。为了测试降解剂在细胞中的持久性，研究人员对降解剂进行了一种“冲洗”试验。 “冲洗试验”：使用U2OS T-REx细胞，在含有4μM BTR2004的培养基中孵育2小时，以达到BRD2最大降解；然后将细胞洗涤两次，并补充不含有BTR2004的培养基，继续进行培养，分别采用多个不同的时间段，如上图A。 在这个试验中，只有在最初的2小时孵育时进入细胞的降解剂才能进行持续的BRD2降解。降解剂在细胞内生物活性的持久性可以根据BRD2持续降解的时间来确定。在BTR2004冲洗后，BRD2蛋白在2小时内保持最大降解。 如上图B，在冲洗后，蛋白质水平逐渐升高，并在BTR2004冲洗后6~8小时完全恢复。如上图C，相比之下，在4μM BTR2004培养基中，BRD2蛋白水平在至少25小时内保持最大降解。 结果表明，BTR2004在细胞中的活性可以持续2小时以上，在不继续补充化合物的情况下，2~8小时细胞活性逐渐减弱。    2.4、BTR2004细胞渗透性 在以上降解剂在细胞中的动力学研究中，可以看出化合物发挥降解的起始时间有一个1~60分钟滞后期。这个滞后可能归因于降解剂进入细胞、形成三元复合物、靶标BRD2泛素化、和蛋白酶体降解等所需要的时间。其中，降解剂BTR2004进入细胞的时间可能是降解时间滞后的主要限制步骤。 基于降解剂在~2小时达到最大的BRD2降解，细胞内生物活性可以持续至少2小时，研究人员采用一种修改后的“冲洗”试验，如上图A，在BTR2004达到足以催化BRD2降解的包内浓度的时间点，进行冲洗。让细胞在4μM降解剂中孵育不同时间，孵育时间少于2小时，然后冲洗降解剂，让细胞在化合物培养基中继续孵育剩余的时间。 如上图B，在总培养时间135分钟的情况下，即使65分钟的降解剂暴露也可以达到与降解剂暴露整个过程相当的降解水平。 这表明，只要细胞过程不过早停止，65分钟的暴露时间足以在无外源化合物培养条件下驱动自主TPD过程。尽管BRD2的初始降解直到化合物处理后约60分钟后才发生，但该化合物在更早的时间点（＜20分钟）就进入细胞并开始了积累；然后，在大约40~60分钟，积累的降解剂细胞内浓度足够BRD2最大水平的降解。 这也说明第一个小时的滞后期，对于BTR2004的充分细胞积累至关重要。    2.5、三元复合物形成的亚细胞定位 接下来，研究人员探究了BTR2004在细胞内的促进蛋白质形成三元复合物的位置。众所周知，BET家族蛋白的亚细胞定位是严格定位于细胞核，然而，研究发现绝大多数KLHL20定位于细胞质中，如下图A。 上图B的对比，两种细胞表现出一致的细胞质定位，表明表位标签对KLHL20亚细胞定位的人为影响很小。然而，在图C-D中，BTR2004的引入并未影响KLHL20或BRD2的亚细胞定位。这为研究人员带来了一个疑问：当BTR2004与KLHL20-BRD结合时，KLHL20-BTR2004-BRD蛋白三元复合物在哪里形成？ 如上图E，大多数邻近连接试验（PLA）信号是在细胞核中。研究人员使用3D图像分析软件对信号强度和定位进行量化，如图F。降解剂处理不影响KLHL20或BRD4的细胞-核分布。这表明，预先存在的核KLHL20池是参与三元复合物形成的主要来源。尽管丰都较低，但这个预先存在的核KLHL20库足以根除核靶蛋白。上图G中的对照组对BRD蛋白的降解没有影响。 因此，不仅三元复合物主要在细胞核中形成，而且蛋白酶体降解主要发生在细胞核中。 03 总结 & 展望 TPD策略策略的特定是以催化的方式清除靶蛋白，其中PROTACs的优势可以弥补传统抑制剂现有的缺陷。然而，几乎所有的临床阶段的PROTACs都是基于CUL4CRBN E3连接酶的，因此，开发新的E3连接酶治疗TPD的研究就显得意义非凡。 在PROTACs的设计策略中，需要考虑多种因素，其中就包括连接酶的选择。并非所有的E3连接酶都是相同的，酶活性和亚细胞定位将显著影响靶标降解的动力学和持久性。除了固有的生化和亚细胞性质外，PROTACs分子本身的物化特性在药代动力学和药效学中起着至关重要的作用。 关于E3-新底物复合物形成的亚细胞位置，直观的假设是E3连接酶靶蛋白的共定位是必要的。对多种蛋白质对不同类型的异源功能分子进行系统的表征，可以增强对化合物调动蛋白易位的生物学规律的认识。 往期相关精彩回顾 JMC：针对SARS-CoV-2主蛋白酶的非共价细胞穿透性双环大环肽抑制剂的发现 2024-12-03 站在靶向蛋白降解临床获批的风口，耶鲁大学Craig M. Crews教授最新展望 2024-11-09 靶向嵌合体（TACs）的兴起：谁是下一个弄潮儿？ 2024-10-21 分子胶靶向蛋白降解剂的“化学空间”和“设计规则” 2024-10-17 基于共价弹头的可调性BRD4分子胶降解剂设计 2024-10-02 环肽药物新纪元 2024-07-17 基于结构的设计、大环拟肽发威、癌症克星——“分子胶”式抑制剂促进三元复合物形成、抑制激活态KRAS突变体 2024-04-25 JACS|耶鲁大学Crews教授报道肿瘤组织特异性靶向降解剂在PROTACs耐药性问题中的应用 2024-08-29 iScience| 北京师范大学报道分子胶介导靶向蛋白降解：小分子药物开发新策略 2024-08-24 往期链接 “小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点  人人学懂免疫学 | 人人学懂免疫学（语音版）    综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普 | 医药前沿笔记 PROTAC技术 | 抗体药物 | 抗体药物偶联-ADC 核酸疫苗 | CAR技术 | 化学生物学 温馨提示 医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群加作者微信（yiyaoxueshu666）或者扫描公众号二维码添加作者，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。 简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送 ①点击标题下方“医药速览”   ②至右上角“...”  ③点击“设为星标