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关注并星标CPHI制药在线 近日，中国国家药监局药品审评中心（CDE）官网公示，晶锐医药1类新药JRD-018片获批临床，拟开发治疗晚期恶性肿瘤。 JRD-018是一款可入脑的BET抑制剂，今年4月已经获美国FDA批准开展1期临床研究。晶锐医药拟开启1期临床试验并将针对晚期实体瘤患者进行招募，继而扩展到血液瘤、脑转移或原发性脑瘤，旨在探索JRD-018在患者中的安全性、耐受性、药代动力学以及初步抗肿瘤活性。 体内药效研究结果表明，JRD-018单独使用在脑胶质瘤模型、小细胞肺癌模型、非小细胞肺癌模型、髓性单核细胞白血病模型以及乳腺癌模型中均表现出良好的抗肿瘤活性。在临床前动物模型研究中，JRD-018已显示出良好的对脑转移或原发性脑瘤、恶性脑肿瘤的抑制效果。 表观遗传学靶点之BET 溴结构域和超末端结构域（bromodomain and extra terminal domain，BET）属于溴结构域蛋白家族，BET蛋白家族包含四个异构体BRD2、BRD3、BRD4、BRDT，它们的结构相似，在N端有2个串联的溴结构域（BD1和BD2）以及一个超末端结构域（ET）。BD1和BD2识别并结合乙酰化赖氨酸残基，与染色质重塑和基因转录的调控过程相关；ET结构域与多种转录因子相互作用。BET蛋白家族通过溴结构域与乙酰化的染色质结合，从而实现在表观遗传学水平上对基因表达进行调控。 BET蛋白家族在人体内表达广泛，与多种实体瘤和恶性血液性肿瘤、炎症、肥胖、肺纤维化等多种疾病的发生和发展密切相关。如原癌基因Myc在超过一半的肿瘤中过表达，BET抑制剂通过竞争性结合阻止BRD4与染色质结合，进而抑制Myc的转录，从而实现抑制肿瘤的目的。 BET抑制剂是一类新型抗癌药，这类药物在治疗血液癌症如白血病和淋巴瘤方面具有良好的前景。BET抑制剂能够通过阻断BET蛋白的功能从而抑制肿瘤生长。研发BET蛋白选择性抑制剂是目前的新方向。目前，一系列BET抑制剂正在临床试验中检验它们治疗包括白血病、淋巴瘤、脑瘤和骨髓瘤在内的多种癌症的疗效。 BET抑制剂：诺华高调购入，加思科、正大天晴加速推进 BET被认为是抗肿瘤药物研发潜力靶点。目前，全球药企针对该靶点已开发出多款药物，详见下表。在研BET抑制剂大多为小分子化学药，此外还包括蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）。适应症上，BET抑制剂主要被开发用于实体瘤和血液性肿瘤，其中部分还被开发用于治疗炎症性疾病如白癜风等。全球至今还尚无BET抑制剂获批，进度最快的就是MorphoSys的Pelabresib，是首个三期临床试验取得成功的BET抑制剂。MorphoSys围绕该药物布局了骨髓纤维化、恶性外周神经鞘瘤、多发性骨髓瘤等多项适应症。 Pelabrisib是由MorphoSys AG公司研制的first-in-class BET抑制剂，近期Pelabrisib治疗骨髓纤维化III期达到了主要研究终点SVR35（脾脏缩小超过35%），从214例患者的临床数据来看， Pelabrisib与JAK抑制剂芦可替尼联用24周，有65.9%的患者脾脏缩小超过35%，而对照组（芦可替尼与安慰剂）仅有35.2%的患者达到SVR35，实验组的疗效比对照组高30.4%。今年年初，诺华以29亿美元收购MorphoSys AG从而拥有了pelabresib这款BET抑制剂。诺华将基于III期MANIFEST-2研究的积极数据在今年下半年向FDA和EMA提交pelabresib联合芦可替尼治疗骨髓纤维化的上市申请。 ZEN-3694是一种领先的差异化BET抑制剂，被开发联合免疫检查点抑制剂、PARP抑制剂、MEK抑制剂、CDK4/6抑制剂、HDAC抑制剂治疗多种肿瘤。ZEN-3694可以降低BRCA1/2和RAD51等蛋白的DNA修复活性，以提高肿瘤细胞对PARP抑制的敏感性，当前用以治疗转移性去势抵抗性前列腺癌II期临床正在开展中。2019年8月，Zenith Epigenetics 与恒翼生物就该药签订超7800万美元的许可协议，授权恒翼生物获得ZEN-3694在中国（包括中国香港、中国台湾和中国澳门地区）的权益。 JAB-8263是加科思自主研发、具有全球知识产权的小分子BET抑制剂，临床前研究显示其对多种实体瘤和血液瘤均能发挥抗肿瘤作用。从公开数据来看，JAB-8263是同类临床项目中活性最强的BET抑制剂，有望在极低剂量下有效抑制多种肿瘤生长，和Pelabrisib相比具有巨大的差异化优势。目前，加科思正在中美两地开展JAB-8263的多中心、开放性I/IIa期临床研究，适应症涉及白血病及实体瘤。 TQB3617是正大天晴自主研发的一款具有全新化学结构的BET抑制剂，能够通过抑制BET蛋白功能减少c-Myc、NF-κB、Aurora B和BCL-2等致癌基因的异常表达，进而发挥抗肿瘤作用。临床前研究结果显示，TQB3617对BET家族的BRD2、BRD3、BRD4、BRDT蛋白均具有较强的抑制活性。TQB3617用于晚期恶性肿瘤的I期临床试验显示，2例骨髓纤维化患者在治疗第12周结束时，脾 脏体积较基线分别缩小13%和30%，展现出潜在的抗骨髓纤维化疗效。在28例接受疗效评估的淋巴瘤中，总缓解率（ORR）为39.3%（11/28），其中4例CR，7例PR。 Trotabresib（CC-90010）是一种新型、口服、可逆性、小分子BET抑制剂，可穿透高级别胶质瘤患者的脑肿瘤组织，临床前研究显示其可增强替莫唑胺（TMZ）的抗肿瘤作用。已公布的1b/2期开放标签、剂量探索研究结果显示：在长期随访中，新诊断胶质母细胞瘤（GBM）患者接受Trotabresib+TMZ辅助治疗或Trotabresib+TMZ+RT（放疗）同步治疗耐受性良好，未出现新的不良反应。 结语 整体来看，BET是进展相对较慢的一个表观遗传学药物靶点。BET蛋白家族在人体内表达广泛，与多种实体瘤和恶性血液性肿瘤、炎症、肥胖、肺纤维化等多种疾病的发生和发展密切相关，是非常有潜力的药物靶点，全球首个BET抑制剂pelabresib III期临床试验的成功宣告了该靶点的成效性，目前全球围绕BET靶点研发火热，值得一提的是，随着科学技术的发展，BET抑制剂的研发不再局限于小分子化药，已有多家企业、机构研发出BET靶向PROTACs。目前国内药企也积极布局BET靶点，而布局方式除了自主研发，还从外部企业引进，如恒翼生物。期待在药企的不懈努力下，BET靶点可以早日迎来重大突破。 参考来源 1.Raajit Rampal, Sebastian Grosicki, Dominik Chraniuk et al.Updated safety and efficacy data from the phase 3 MANIFEST-2 study of pelabresib in combination with ruxolitinib for JAK inhibitor treatment-na?ve patients with myelofibrosis.?JCO?42,?6502-6502(2024).DOI:10.1200/JCO.2024.42.16_suppl.6502 2.2024 ASCO. Abstract?#6502: Updated safety and efficacy data from the phase 3 MANIFEST-2 study of pelabresib in combination with ruxolitinib for JAK inhibitor treatment-na?ve patients with myelofibrosis. END 来源：CPHI制药在线 声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。 投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com ▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼ 点击阅读原文，进入智药研习社~

引言 基因的表达依赖于转录激活因子和转录辅助因子的参与，这一过程为通过调控基因表达来治疗疾病提供了有前途的策略。在这些辅助因子中，一种具有bromodomain（BD）与extraterminal （ET）结构域（BET）的家族蛋白质起到了关键作用，包括BRD2、BRD3、BRD4和BRDT。这类蛋白可以通过bromodomain（BD1和BD2）特异性地识别染色质的乙酰化标记从而调控基因表达，因此被视为基因表观调控的重要分子。 BET蛋白的BD结构域在基因调控中发挥着两个重要作用。首先，它们通过与乙酰化组蛋白的结合，帮助将BET蛋白招募到基因的增强子和启动子区域，促进基因的激活。其次，BD结构域还通过一种特殊的组蛋白伴侣活性，促进基因的转录延长过程。此外，BET蛋白的ET结构域，能与多种转录调控因子结合，进而进一步影响基因的表达。在这些蛋白中，BRD4因其支持癌基因MYC的转录表达而备受关注。大家长期认为它通过结合乙酰化组蛋白，招募正性转录延长因子（P-TEFb），促进癌基因的持续表达。 BET抑制剂（BETi）通过与BD结构域竞争性结合，阻断BET蛋白与染色质的相互作用，进而抑制癌基因的转录。这类抑制剂在多种癌症中显示出很强的抗肿瘤活性，尤其是抑制像MYC这样的致癌基因。然而，临床试验表明，对于雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌患者，BET抑制剂并未显示出显著疗效。雌激素受体（ER）通过激活癌基因（如MYC和CCND1）的转录，促进肿瘤生长，因此对ER+乳腺癌患者而言，ER扮演了关键角色。尽管近年医学界在ER+乳腺癌治疗方面取得了一些进展，但治疗耐药性仍然是一个重大挑战，尤其是对于高风险患者，他们往往面临有限的治疗选择和较差的预后。而对于这些患者，BET抑制剂一度被寄予厚望。 2024年9月9日，洛克菲勒大学Robert G. Roeder博士 (Arnold and Mabel Beckman Professor) 和张思聪博士（research associate）在Nature Structural & Molecular Biology上发表了文章Resistance of estrogen receptor function to BET bromodomain inhibition is mediated by transcriptional coactivator cooperativity。该研究揭示了一个重要机制：在ER+乳腺癌中，尽管BET抑制剂能够抑制一些基因的表达，但MYC等关键癌基因的转录却依然活跃。这并非是由于乳腺癌细胞对BET抑制剂的演化适应，而是因为他们有一种与生俱来的转录机制——BRD4可以通过不依赖于BD结构域的机制，与其他转录辅助因子相互作用，继续激活这些癌基因。这一发现解释了BET抑制剂在ER+乳腺癌患者中疗效有限的原因。 研究人员首先仔细比较了使用BET抑制剂与去除BET蛋白后对转录的影响，并发现MYC等基因的转录依赖于BET蛋白而非BD结构域的功能。由于目前对哪一个BET蛋白参与ER介导的转录调控尚有争议，研究人员比较了所有BET蛋白的功能。研究人员发现，只有BRD4可以通过不依赖于BD结构域激活MYC与其他癌基因的转录。将BRD4从细胞中去除后，BET抑制剂的抗癌作用显著增强。通过生化手段，发现BRD4能够与Mediator蛋白复合物结合，这个复合物在基因转录过程中发挥着至关重要的调控作用并与ER直接结合。当利用细胞编辑的手段干扰Mediator的功能时，BRD4在基因增强子上的结合显著下降。由于BRD4与Mediator的结合不依赖于BD，研究人员发现了一种新的BRD4的招募途径。 此外，通过研究人员发明的一种专门分析RNA聚合酶II（Pol II）及其相关因子作用的方法——mass spectrometry with DTME crosslinking (MSDC)，发现了BET蛋白通过促进Pol II与转录延长因子（如SPT5、SPT6，PAF1复合物）相互作用，促进基因的转录延长过程。而且这些延长因子的与BET蛋白的作用也不依赖于BD结构域。不过，BET蛋白并并不参与招募P-TEFb。相反，BET蛋白被去除后，P-TEFb在一些基因区域的结合甚至有所增加。因此，我们阐明了BET蛋白如何在不依赖于BD的情况下促进转录延长。 该研究发现对理解ER驱动的基因调控机制具有重要意义。这不仅有助于揭示BET蛋白在癌症中的复杂作用机制，尤其是其在没有BD结构域参与下的关键功能，也为未来开发新型抗癌疗法提供了新的方向。通过更深入地研究这些机制，我们有望克服现有内分泌疗法的抗药性，改善包括乳腺癌在内的多种癌症的治疗效果。 参考文献 https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41594-024-01384-6 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

感谢关注转发，欢迎学术交流 回复药渡Cyber，领取文献原文 请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程 快看版 CBP/p300是关键的表观遗传调节因子，也是治疗去势抵抗性前列腺癌和其他类型的癌症有潜力的靶点。本文报道了一种CBPD-268的发现和表征，是一种极其有效且可以口服的CBP/p300蛋白PROTAC降解剂。CBPD-268在三种雄激素受体阳性前列腺癌细胞中诱导CBP/p300降解，DC50≤0.03nM，Dmax>95%，导致癌细胞生长抑制。CBPD-268在小鼠和大叔中具有优异的口服生物利用度。口服0.3-3mg/kg的CBPD-268会导致肿瘤组织中CBP/p300持续降解，并在小鼠VCaP和22Rv1异种移植肿瘤模型中实现强抗肿瘤活性，包括VCaP肿瘤模型中的肿瘤消退。CBPD-268在小鼠和大鼠中具有良好的耐受性，并且显示治疗指数>10。综合这些结果，CBPD-268是一种有效的CBP/p300降解剂，可作为潜在的新癌症疗法。 药渡CyberSAR系统提供对CBP/p300靶点分子的深入解析，系统通过聚类结构视图和原始结构视图，展示了与靶点相关的活性分子，并以研发阶段时光轴的形式呈现了潜力Hit。此外，CyberSAR还提供了适应症和试验设计的可视化分析，帮助研发人员快速获取靶向结构信息，开拓研究思路。尽管CyberSAR在分子的初步开发中未被使用，但其在解析和优化药物分子方面显示出巨大的应用潜力。 图1.CBPD-268发现和分子优化过程 正文版 前列腺癌仍然是全球男性癌症相关死亡的主要原因。雄激素受体（AR）的激活会驱动前列腺癌发生和生长。阻断雄激素合成的阿比特龙和第二代AR拮抗剂（如恩杂鲁胺和达罗他胺）用于治疗前列腺癌，包括转移性趋势抵抗性前列腺癌（mCRPC）。虽然这些疗法可有效治疗mCRPC并提高患者生存率，但患者通常会在18个月内产生耐药性。对AR靶向治疗产生耐药性的患者，AR信号传导继续在其发展和耐药过程中发挥重要作用。mCRPC的进展主要是由于AR信号传导的改变，包括AR基因扩增、AR配体结合域（LBD）突变以及AR-V7和其他AR剪接变体（AR-SV）的表达是一些主要的耐药机制。由于目前批准的AR靶向治疗无法有效解决这些耐药机制，因此需要开发新的前列腺癌的治疗方法，特别是mCRPC。 组蛋白乙酰转移酶结合蛋白（CBP）及其密切相关的同源蛋白E1A结合蛋白（p300），通常称为CBP/p300，是AR和其他转录因子的关键转录共激活因子。CBP/p300蛋白表达增加已被证实与前列腺癌的不良治疗结果和生存期短密切相关。被认为是针对当前批准的AR靶向治疗的另一种重要的耐药机制。通过siRNA或shRNA敲低CBP/p300可有效抑制AR和AR-SV的信号传导。使用强效、选择性、可口服的CBP/p300溴结构域抑制剂CCS1477、已证明抑制CBP/p300可有效降低AR-、AR-SV-、c-Myc及其调节基因的表达，阻断AR+前列腺癌的细胞增殖细胞系，并在表达AR-SV的22Rv1肿瘤模型中实现强大的体内抗肿瘤活性。CCS1477目前正处于前列腺癌的临床II期试验中。针对CBP/p300代表了治疗前列腺癌（尤其是mCRPC）的一种新治疗策略。 CBP/p300是由多个功能结构域组成的大分子蛋白。除了溴结构域（BRD）外，CBP/p300还包括组蛋白乙酰转移酶（HAT）结构域、植物同源结构域（PHD）指结构域、核受体相互作用结构域（RID）、激酶诱导的CREB相互作用结构域（KIX）、半胱氨酸/组氨酸区域（TAZ1/CH1和TAZ2/CH3）以及干扰素反应结合结构域（IBiD）。目前已经发现了多种CBP/p300抑制剂，如溴结构域抑制剂CBP30、ICBP112、GNE-049及其类似物GNE-781、CCS147717和Y08284，以及HAT结构域抑制剂C464、A-485、B026、DS-9300和CPI-1612（如图1所示）。溴结构域抑制剂和HAT结构域抑制剂的组合可以协同抑制前列腺癌细胞的生长。此外，据报道，在溴结构域抑制剂CCS1477治疗后，去势抵抗性前列腺癌细胞系中的CBP/p300 mRNA水平在用溴结构域抑制剂治疗后显著上调。可能会影响CBP/p300溴结构域抑制剂治疗前列腺癌的疗效。因此，作者假设直接降解CBP/p300蛋白可能会导致比抑制溴结构域或HAT结构域更完全抑制其生物学活性功能，从而对前列腺癌和其他癌症更强的治疗功效。 近年来，利用蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）技术诱导蛋白质降解已成为一种非常具有吸引力的策略，用于开发治疗癌症的全新疗法。目前，已经由20多种PROTAC降解剂进入临床研究，并且具有广阔的临床应用前景，如ARV-110（一种雄激素受体PROTAC降解剂）和ARV-471（一种雌激素受体PROTAC降解剂）。而CBP/p300的有效PROTAC降解剂如dCBP-1、JQAD1和JET-209（图1）之前已报道过，它们都没有口服生物活性。由于PROTAC降解剂由两个小分子配体组成，通过连接子连接，因此分子量通常再800-1200，远高于传统的口服小分子。因此，设计口服活性PROTAC降解剂一直是主要的药化重点，而口服生物可利用的PROTAC降解剂近报道了非常有限数量靶标，包括AR、ER、BTK和IRAK4，出于临床开发目的，非常需要开发有效的可口服的CBP/p300 PROTAC降解剂。 本文主要报道了基于CBP/p300溴结构域抑制剂GNE-049和作者所在实验室开发的新的CRBN配体TX-16的一系列新型CBP/p300 PROTAC降解剂的设计、合成和生物学评价，发现了CBPD-286是一种异常有效且口服有效的CBP/p300降解剂。CBPD-268能够在细胞内以皮摩尔浓度诱导 CBP/p300 蛋白深度降解，并有效抑制三种AR+晚期前列腺癌细胞系的细胞生长。在小鼠和大鼠中取得了优异的口服生物利用度并表现出良好的整体药代动力学（PK）特征。口服CBPD-268可有效消除小鼠肿瘤组织中的CBP/p300蛋白，并在耐受剂量方案的前列腺癌异种移植小鼠模型中实现强大的抗肿瘤功效。 设计有效且可口服的CBP/p300降解剂 虽然许多PROTAC降解剂已被报道可用于不同的蛋白质靶标，但口服活性PROTAC降解剂仅针对少数靶标实现，包括ER、AR、BRD9、IRAK4和 BTK。要获得有效且口服有效的CBP/p300 PROTAC降解剂，需要选择合适的E3连接酶配体CBP/p300配体至关重要。 由于cereblon（CRBN）配体已成功用于口服活性PROTAC降解剂的开发，因此重点设计使用cereblon配体的口服活性PROTAC CBP/p300降解剂。在之前的研究中，开发了一种优化的cereblon配体，即TX-16，与托沙利度胺和来那度胺相比，它对cereblon具有相似的结合亲和力，并表现出良好的细胞通透性和优异的PK特性。使用TX-16，成功开发了强效且口服有效的ER和AR PROTAC降解剂，它们在不同物种之间具有理想的PK特性。因此，在本研究中采用CRBN配体TX-16来设计口服生物可利用的CBP/p300 PROTAC降解剂。 作者选择溴结构域配体GNE-049作为CBP/p300配体，用于设计有效的口服活性CBP/p300降解剂，出于以下几个考虑：（1）GNE-049是一种高效的CBP/p300 溴结构域抑制剂，对两种蛋白的IC50=1.1-1.3nM；(2) GNE-049表现出优于其他溴结构域蛋白的优异结合选择性，包括BRD4蛋白，其选择性超过3,000倍；(3) GNE-049具有优异的细胞渗透性和PK特性，包括高口服生物利用度。 设计并合成了第一组潜在的CBP/p300 PROTAC降解剂，以确定最佳接头长度（表1）。基于与CBP溴结构域和GNE049的共晶结构，四氢-2H-吡喃环中的氧暴露于溶剂中，并在合适的位置与CRBN配体TX-16通过连接子结合。为了促进潜在的CBP/p300 PROTAC降解剂的合成，用氮取代了吡喃氧，并使用所得的CBP/p300配体合成了一系列潜在的PROTAC降解剂（表1）。 为了定量测定设计的CBP/p300 PROTAC降解剂的降解效力（DC50）和效率（Dmax），作者对U2OS细胞系中的CBP和p300蛋白采用HiBiT降解测定，其中CBP或p300蛋白通过CRISPR/Cas9进行基因修饰，将HiBiT标签融合到其羧基末端，在HiBiT检测中对CBP和p300蛋白进行24小时处理，评估了所有合成化合物的降解效力和效率，如表1所示。 连接子中仅含有羰基的化合物15具有非常弱的CBP/p300降解效力 (DC50>1000nM) 和效率 (Dmax=20-44%)。然而，仅在化合物15的接头中插入一个亚甲基，得到化合物16，即可显著提高降解效力（CBP和p300的DC50分别为20nM和7.9nM）和效率（CBP和p300的Dmax=94%和87%）。将化合物16中的羰基从连接基左侧反转到连接基右侧生成了化合物17，其比16弱得多。将额外的1-4个亚甲基插入化合物16的连接基中得到了化合物18-21，其对CBP和p300的降解作用都比化合物16弱。 GNE-049与CBP复合的共晶结构表明GNE-049中的N-甲基吡唑基团位于CBP的浅疏水表面口袋上。作者设计、合成并评估了一系列N-甲基吡唑基团被各种疏水基团取代的降解剂，如表2所示。 用氢原子取代化合物16中的N-甲基吡唑基团生成化合物22，其对CBP和p300 的降解作用比16弱得多且效果较差。用溴原子取代N-甲基吡唑得到了化合物23，它是针对CBP和p300的相当有效的降解剂（针对CBP和p300，DC50分别=64nM和17nM，Dmax=84-86%）。将化合物23中的溴原子改为甲基或乙基产生化合物24和25，与化合物23相比，它们对CBP和p300的效力与化合物23相似，但基于它们的Dmax值比23更有效。用更大的烷基或其他（杂）芳基取代基进一步取代N-甲基吡唑基团得到化合物26-31，其显示DC50值为23-57nM，Dmax值为85-95%。然而，与化合物16相比，所有这些修饰均未实现降解效力的改进。 在表2中的所有这些降解剂中，化合物16仍然表现出最好的降解效力和效率。接下来，评估了化合物16在大鼠中的PK曲线，如表3所示。令人失望的是，化合物16显示出非常差的口服血浆暴露和非常高的清除率（Cl=100.4mL/min/kg）。由于化合物22在表2中的所有化合物中具有最低的分子量，因此还评估了其在大鼠中的PK，如表3所示。然而，化合物22仍然表现出非常差的口服血浆暴露和非常高的清除率（Cl=194.0mL/min/kg）。 口服暴露后，在人、大鼠和小鼠肝微粒体中测试了化合物16和22的代谢稳定性。如表3所示，化合物16和22在大鼠肝微粒体中均具有良好的代谢稳定性（T1/2>60min），这表明两个化合物的口服生物利用度较差并不是由于它们的微粒体不稳定导致的。 为了提高化合物16的降解效力以及提高口服生物利用度，接下来对连接子部分进行了进一步的修饰。已经证明PROTAC分子连接体中的酰胺基团导致细胞通透性低和ADME性质差。因此，认为从化合物16的连接子中去除酰胺基团可以显著提高其降解效力和口服生物利用度。因此，设计、合成并评估了一系列连接子中缺少酰胺基团的化合物，如表4所示。 将化合物16中的酰胺基团转化为CHCH2基团的化合物32显示CBP降解效力提高3倍(DC50＝7.1nM vs 20nM)，但CBP降解效率略有下降(Dmax＝94％ vs 85％)。与化合物16相比，化合物32在p300降解效力 (DC50=6.2nM vs 7.9 nM) 和效率 (Dmax=91% vs 87%) 方面相似。从化合物32的接头上除去一个亚甲基，得到化合物33（CBPD-268，反式构型），以及化合物34（CBPD-266，顺式构型）。虽然化合物34在降低CBP和p300蛋白水平方面不如化合物32强效和有效，但化合物33（CBPD-268）比化合物32更强效和有效。具体地，CBPD-268针对CBP实现了DC50为0.5nM的和p300的DC50为0.8nM。在HiBit测定中，针对p300的浓度为8nM，针对两种蛋白质的Dmax为100%。因此，CBPD-268是CBP和p300蛋白的高效降解剂。 通过一个更多的亚甲基延长CBPD-268中的连接子，得到化合物35，它是CBP和p300的非常弱且无效的降解剂。将CBPD-268连接子中的亚甲基从环己基右侧移至左侧生成化合物36，其在还原CBP和p300蛋白方面比CBPD-268弱得多且效果较差。最后，从CBPD-268连接子上去除亚甲基生成化合物37，其对CBP和p300蛋白的降解作用也比CBPD-268更弱且效果较差。总而言之，表4中的SAR数据表明，连接子在设计的CBP/p300 PROTAC降解剂的降解效力和效率中起着至关重要的作用。 接下来测试了CBPD-268和所有其他化合物对CBP/p300和CRBN蛋白的结合亲和力，如表4所示。CBPD-268对CBP和p300都表现出很强的结合亲和力，IC50值为11和9.5nM。虽然CBPD-268的效力比化合物35和36与CBP/p300的结合强4-5倍，显示出与化合物16、32、34和37相似的CBP/p300结合亲和力。此外，CBPD-268与所有其他化合物具有相似的CRBN结合亲和力（IC50=1.8μM）（IC50=0.9-2.8μM）。这些数据表明，CBPD-268诱导的CBP/p300降解优于其他化合物，这可能归因于CBPD-268形成了比其他化合物更稳定和更高效的三元复合物。 CBPD-268在AR+前列腺癌细胞系中的进一步评估。CBPD-268（化合物33）是HiBit降解测定中评估的所有CBP/p300降解剂中最有效的化合物。接下来，通过传统的蛋白质印迹分析评估了其降低AR+前列腺癌细胞系中CBP/p300蛋白水平的能力。 22Rv1细胞系高表达AR-V7剪接变体，对当前的AR靶向治疗具有耐药性，并已广泛用作CRPC模型。CCS1477是一种CBP/p300溴结构域抑制剂，被证明可有效抑制体内肿瘤生长。因此，首先用图2 和表5中总结的数据来表征CBPD-268在22Rv1细胞系中诱导CBP/p300蛋白降解的能力。 用CBPD-268处理22Rv1细胞4小时，获得了针对CBP的DC50=0.01nM和针对p300的DC50=0.03nM的卓越效力，以及针对CBP和p300蛋白的高降解效率，Dmax=98%。治疗24小时后，CBPD-268针对CBP/p300蛋白实现了<0.1nM的 DC50和90-95%的Dmax。CBPD-268在24小时的处理时间内也能高效降低C-Myc蛋白，能够在低至0.03nM的浓度下将C-Myc蛋白降低>95%。 接下来，评估了CBPD-268降低LNCaP和VCaP AR+前列腺癌细胞系中CBP/p300蛋白水平的能力。如上所述，LNCaP细胞系在AR配体结合结构域中具有T878A突变，并且VCaP细胞系具有AR基因扩增并因此具有非常高水平的AR蛋白。这三种AR+前列腺癌细胞系共同代表了由AR变化引起的对当前AR靶向治疗的三种主要且不同的耐药机制。CBPD-268在这三种细胞系中4小时内诱导的CBP/p300降解数据如表5所示。 与22Rv1细胞系中的结果类似，CBPD-268在LNCaP和VCaP细胞系中对CBP/p300蛋白的消耗也非常有效。在LNCaP细胞系中，对于CBP/p300蛋白，CBPD-268的DC50值为0.01-0.03nM，Dmax值为98%。在VCaP细胞系中，CBP和p300的DC50分别为0.02和<0.01nM，CBP和p300蛋白的Dmax为99％。 接下来，进行了阻断实验来研究CBPD-268诱导的CBP/p300降解机制，如图3所示。加入CBP/p300抑制剂GNE-049（10μM）或CRBN抑制剂TX-16（10μM）完全消除了CBP/p300降解。由CBPD-268诱导，表明需要CBP/p300和CRBN蛋白才能实现CBP/p300降解。 评估CBPD-268对三种AR+前列腺癌细胞系的细胞生长抑制作用 接下来，使用两种CBP/p300溴结构域抑制剂（GNE-049和CCS1477）、一种 AR PROTAC降解剂（ARV-110）和一种AR拮抗剂评估了CBPD-268在AR+ 22Rv1、LNCaP和VCaP前列腺癌细胞系中抑制细胞生长的能力（恩杂鲁胺）作为对照。数据如图4所示。 CBPD-268有效抑制所有这三种细胞系的细胞生长，在22Rv1、LNCaP和VCaP细胞系中的IC50值分别为3.7nM、10.3nM和4.6nM。相比之下，GNE-049在22Rv1、LNCaP和VCaP细胞系中的IC50值分别>1μM、7μM和>1μM，分别比CBPD-268弱>250、>650和>215倍。虽然CCS1477比GNE-049更有效，但仍比CBPD-268低40-50倍。此外，在22Rv1、LNCaP和VCaP细胞系中，CBPD-268的效力分别比ARV-110强85、12和27倍，比恩杂鲁胺强>250、750和>215倍。 在蛋白质印迹分析中，CBPD-268非常有效地诱导22Rv1细胞系中CBP/p300蛋白几乎完全耗尽，仅用4小时的处理时间，这两种蛋白的DC50为0.01-0.03nM，DC90值为<1nM（图2）。细胞生长抑制测定表明，CBPD-268在4天的处理时间内仅显示出IC50为3.7nM。为了阐明CBP/p300降解和细胞生长抑制测定中效力之间的差异，评估了22Rv1细胞生长抑制测定中使用的细胞培养基中CBPD-268的稳定性。数据表明CBPD-268在细胞培养基中不稳定；3小时后残留<50%的CBPD-268，7小时后检测到<10%的CBPD-268（表S1）。CBPD-268的细胞培养不稳定也许并不令人惊讶，因为cereblon配体部分中的戊二酰亚胺部分已被证明在细胞培养基中不稳定，这导致降解剂失活。因此，在4天的细胞生长抑制测定中，CBPD-268在这三种AR+细胞系中的细胞生长抑制效力（IC50）和效率（Imax）基本上是在其存在于细胞培养基中的几个小时内实现的。 CBPD-268的整体蛋白质组分析 CBPD-268在整体水平上的降解选择性，在VCap细胞系中对CBPD-268进行了蛋白质组分析。由于在蛋白质印迹分析中，CBPD-268在4寸VCap细胞系内以1nM浓度非常有效地几乎完全耗尽CBP/p300蛋白（图 S1），因此用1nM CBPD-268处理VCap细胞4小时进行蛋白质组分析，如图5所示。 整体蛋白质组学分析表明，CBPD-268显示出CBP/p300蛋白的深度和显著消耗，CBP和p300蛋白水平分别降低了75%和69%。其他几种蛋白质，包括NKX3-1、ZFYVE19、BUB1B、OXLD1、USHBP1和BRD2，也有适度减少。NKX3-1是AR靶基因，其表达受CBP/p300共同调控。其他蛋白减少的意义有待进一步研究。此外，GSPT1（之前报道的基于CRBN的PROTAC降解剂的新底物之一）在蛋白质组学研究中并未被CBPD-268还原，这得到了蛋白质印迹分析的进一步证实（图S1）。因此，CBPD-268仅降低了几种蛋白质的水平，其中CBP/p300蛋白质是分析的总共6535种蛋白质中降低最多的。 CBPD-268的药代动力学研究 评估了CBPD-268在大鼠和小鼠中的药代动力学（PK），如表6所示。 在大鼠中，CBPD-268静脉注射和口服给药的半衰期分别为1.9和1.3小时，稳态分布体积良好（Vss=4.9L/kg），中等清除率（Cl=34.6mL/min/kg），在3mg/kg高剂量下，口服血浆暴露的Cmax和AUC分别为220.6ng/mL和936.9h*ng/mL，并且具有优异的总体口服生物利用度 (F=67%)。 在小鼠中，CBPD-268还表现出理想的PK特性，静脉注射 (T1/2=3.4h) 和口服给药 (T1/2=3.1h) 均具有良好的半衰期，稳态分布容积适中 (Vss=1.6L/kg），清除率低（Cl=6.0mL/min/kg），3mg/kg剂量时具有良好的口服血浆暴露（Cmax=724.7ng/mL，AUC=4190.4h*ng/mL），以及口服生物利用度（F=60%）。 CBPD-268的体外DMPK和安全性分析 评估了CBPD-268在肝微粒体中的代谢稳定性、血浆稳定性、血浆蛋白结合以及对人ether-a-go-go相关基因 (hERG) 离子通道和细胞色素P450酶（CYP）的抑制，如表7所示。 CBPD-268在小鼠肝微粒体（>120min）中表现出优异的代谢稳定性，在人（T1/2=48min）、猴（T1/2=30min）、犬（T1/2=49min）和大鼠中表现出合理的代谢稳定性。T1/2=65min)肝微粒体。在人（T1/2=71min）、猴（T1/2>120min）、犬（T1/2=78min）和小鼠（T1/2>120min）血浆中具有良好的稳定性，但在大鼠血浆（T1/2=48min）中具有中等稳定性。CBPD-268在人、犬、猴和小鼠中具有高血浆蛋白结合，游离药物浓度为0.6-1.6%，这对于口服生物可利用的PROTAC分子很常见。CBPD-268在高达30μM的浓度下对hERG离子通道没有表现出任何显著的抑制作用，并且在高达10μM的浓度下，对所有评估的CYP亚型（3A4、1A2、2B6、2C9、2C19和2D6）没有显著抑制作用。 CBPD-268在VCaP和22Rv1异种移植小鼠模型中的药代动力学/药效学评估 评估了CBPD-268降低VCaP异种移植肿瘤体内CBP/p300蛋白水平的能力，如图6所示。 CBPD-268以剂量依赖性方式非常有效地诱导VCaP肿瘤组织中CBP和p300蛋白的消耗。单次口服0.3 mg/kg CBPD-268，在1、6 和 24小时时间点分别使CBP 蛋白水平降低 40%、92%和84%，并使p300蛋白减少83%、100% 和1、6 和 24小时时间点分别为99%。单次口服1mg/kg CBPD-268能够在1、6和24小时时间点分别降低CBP蛋白水90%、100%和87%，在1、6小时和24小时时间点使p300蛋白水平降低≥98%。进一步增加剂量至3、10或30mg/kg，单次口服CBPD-268可在1、6和24小时时间点分别有效降低CBP和p300蛋白水平>95%。 由于单次口服3mg/kg CBPD-268在至少24小时内可高度有效降低CBP和p300 蛋白水平，因此进一步评估了CBPD-268在延长时间点（48、72和96小时时间点）对CBP和p300蛋白的影响。数据显示，在48-96小时的时间点，单次口服3mg/kg剂量的CBPD-268，CBP和p300蛋白的水平降低60-70%，证明了其体内的长期效果。 测定不同剂量和时间点VCaP荷瘤小鼠血浆、肿瘤、肝脏和脾组织中CBPD-268的浓度，如表8所示。单次口服给予CBPD-268 0.3-3mg/kg在血浆、肿瘤、肝和脾组织中表现出剂量和时间依赖性的暴露方式。有趣的是，虽然在24小时给药0.3-3mg/kg CBPD-268的时间点肿瘤组织中的药物浓度较低，但CBP和p300蛋白在至少24小时内仍然有效耗尽，表明肿瘤组织中CBPD-268的短暂暴露足以有效降低CBP和p300蛋白的水平至少24小时。 接下来，使用图7中总结的数据评估了CBPD-268消除小鼠22Rv1异种移植肿瘤组织中CBP/p300蛋白的能力。血浆和肿瘤组织中CBPD-268的浓度也在每个时间点确定，图7中也对此进行了总结。 CBPD-268可有效降低22Rv1肿瘤组织中CBP和p300蛋白的水平 单次口服剂量1mg/kg的CBPD-268在1、6和24小时时间点分别使CBP蛋白水平降低18%、93%和86%，并使p300蛋白水平降低56%、86%和53%分别在1、6和24小时。有趣的是，1mg/kg剂量的CBPD-268在22Rv1肿瘤组织中1、6和24h时间点达到的药物浓度远低于在VCap肿瘤组织中以相同剂量获得的结果。相比之下，1mg/kg的CBPD-268在22Rv1肿瘤中的PD效应（图7）弱于在VCaP肿瘤中的PD效应（图5），这与22Rv1肿瘤组织（图7）中的药物暴露低于VCaP肿瘤组织中的药物暴露（表8）一致。。 由于CBPD-268在体外蛋白质组学研究中显示出对BRD2蛋白水平的适度降低（图5），因此评估了其对小鼠22Rv1异种移植肿瘤组织中BRD2-4蛋白的体内影响。数据（图8）显示，口服给予1和3mg/kg的CBPD-268并没有降低所检查的6和24小时时间点的22Rv1肿瘤组织中BRD2、BRD3和BRD4蛋白的水平。因此，PD数据表明，CBPD-268对CBP/p300蛋白表现出优于BRD2/3/4蛋白的体内降解选择性。 CBPD-268在VCap和22Rv1异种移植小鼠模型中的抗肿瘤功效 根据PD数据，首先评估了CBPD-268在VCaP异种移植肿瘤模型中的抗肿瘤活性，以1mg/kg和3mg/kg PO剂量在不同的方案下进行，如图9所示。 CBPD-268以每周两次1mg/kg或每周3mg/kg口服给药，在4周治疗结束时（第48天）抑制肿瘤生长81%或57%（图9A）。CBPD-268以1或3mg/kg口服给药，每周3次，在治疗结束时（第48天）分别导致31%和67%的肿瘤消退（图 9A）。由于VCaP肿瘤具有很强的侵袭性，因此之前报道的任何针对AR或AR信号传导的药物（包括AR降解剂）都无法实现肿瘤消退。因此，CBPD268在VCaP肿瘤模型中能够高度有效地抑制肿瘤生长，并且能够实现肿瘤消退。重要的，小鼠对CBPD-268治疗的耐受性良好，并且在整个实验期间，所有给药组的体重减轻了不到7%（图9B）。 进一步在VCaP异种移植肿瘤模型中评估了较低剂量（0.3mg/kg），但每天、一周五次的CBPD-268的抗肿瘤活性，如图10所示。口服0.3mg/kgCBPD-268，每周五次，持续4周，在治疗结束时抑制肿瘤生长84%（图10A）。重要的是CBPD-268具有良好的耐受性，在整个实验过程中小鼠体重减轻不超过最大体重减轻的8%（图10B）。 受CBPD-268在VCaP肿瘤模型中强大的抗肿瘤活性的启发，进一步确定了其在22Rv1异种移植肿瘤模型中的抗肿瘤活性，该模型具有非常高水平的AR-V7变异表达并且对其他AR靶向药物具有耐药性，如图11所示。 治疗结束时，每周3次口服CBPD-268 1mg/kg和3mg/kg，持续3周，分别抑制22Rv1肿瘤生长54%和83%。治疗结束时，口服CBPD-268 0.3mg/kg和1mg/kg，每周5次，持续3周，分别抑制肿瘤生长56%和75%。重要的是，在整个实验期间，与载体对照组相比，CBPD-268治疗组没有引起任何显著的体重减轻（图11B）。 CBPD-268对具有免疫能力的雄性和雌性BALB/c小鼠的毒性研究 进一步评估了CBPD-268在免疫能力正常的雄性和雌性BALB/c小鼠中的潜在毒性，如图12所示。由于CBPD-268每周两次给药可高效抑制肿瘤生长，因此以3-30mg/kg每周两次测试CBPD-268，持续5-6周。 CBDP-268在3和10mg/kg剂量水平下均未在雄性和雌性小鼠中诱导体重减轻或其他毒性迹象（图12）。用30mg/kg CBPD-268治疗的雄性和雌性小鼠在实验期间经历了适度（<5%）的体重减轻。因此，在免疫功能正常的雄性和雌性BABL/c小鼠中，CBPD-268在比其高效剂量高10倍的剂量下具有良好的耐受性。 CBPD-268在免疫活性SD大鼠中的组织分布和毒性研究 PK数据显示，CBPD-268在大鼠中表现出优异的PK特性和高口服生物利用度（表6）。根据3mg/kg和10mg/kg剂量评估了其在大鼠血浆、肾、肝、脾和心脏中的组织分布，如表9所示。 CBPD-268在血浆和其他组织中表现出剂量依赖性暴露，并且在肾脏、肝脏、脾脏和心脏中的暴露量比在血浆中高得多，表明CBPD-268在大鼠中具有良好的组织分布特征。 研究了CBPD-268是否能够有效减少大鼠细胞中的CBP和p300蛋白。数据表明，CBPD-268在诱导CBP和p300蛋白降解方面非常有效，DC50值分别为0.1nM和0.3nM（图S3）。 评估了CBPD-268在免疫活性SD大鼠中的潜在毒性，口服剂量为1-10mg/kg，每周两次，持续5周，如图13所示。 CBPD-268在整个实验过程中没有导致动物体重减轻。相反，1-10mg/kg治疗组的体重在所有治疗组中均继续增加，与载体对照组相似。在大鼠毒性研究治疗结束时，从每只大鼠收集了血液样本进行全血细胞计数（CBC）和血液化学分析，所得数据总结于图S4和S5中。 CBPD-268以1-10mg/kg口服剂量，每周两次，持续5周，并没有引起血小板、白细胞、红细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和血小板的CBC计数的任何显著变化。嗜酸性粒细胞，并且肌酐、总蛋白、钙、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、血尿素氮、总胆红素和白蛋白的水平也没有显著改变，除了葡萄糖水平在10mg/kg治疗组中显著降低（P=0.014）。总而言之，CBPD-268在SD大鼠中具有良好的耐受性，口服剂量为1-10mg/kg，每周两次，持续5周，并且在整个实验期间没有诱导任何毒性迹象。 总结 在本研究中，试图开发一种特别有效且口服有效的CBP/p300降解剂。从强效选择性CBP/p300溴结构域抑制剂GNE-049和具有优化ADME和PK特性的新型cereblon配体TX-16开始，设计、合成并评估了一系列具有不同接头的潜在CBP/p300 PROTAC降解剂。SAR研究表明，连接子在降解效力和口服生物利用度方面起着至关重要的作用。发现了CBPD-268作为一种异常有效、有效且口服有效的CBP/p300降解剂。CBPD-268在小鼠和大鼠中表现出优异的口服生物利用度。此外，CBPD-268具有良好的血浆和微粒体稳定性以及对CYP和hERG 抑制的耐受性。CBPD-268单次口服0.3-3mg/kg即可非常有效地诱导肿瘤组织中CBP和p300蛋白的消耗。口服CBPD-268在VCaP和22Rv1前列腺癌异种移植模型中均具有很强的抗肿瘤活性，并且能够在VCaP肿瘤模型中实现肿瘤消退。CBPD-268被发现在小鼠和大鼠中具有良好的耐受性，并且显示出>10的治疗指数。综上所述，CBPD-268是一种非常有前途且口服有效的CBP/p300降解剂，值得作为治疗AR阳性人类前列腺癌和其他癌症（包括血液恶性肿瘤和其他实体瘤）的新型治疗剂进行广泛研究。 文献来源 https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1021/acs.jmedchem.3c02124 请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程 1.药渡CyberSAR结合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性的结构，通过CyberSAR以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就CREB-binding protein/Histone acetyltransferase p300（Homo sapiens）举例如下： 2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于CBP/p300相关实验测试活性的分子以“母核结构聚类”的形式展示。其中绿色字体高亮的为文献报道的体外酶、细胞活性测试实验中IC50<1000nM的活性分子结构、具体实验、实验结果及实验来源。 3.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“原始结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献具有关于CBP/p300相关实验测试活性的分子以“研发阶段时光轴”的形式展示。其中绿色字体高亮的“数据挖掘”即为潜力Hit。 登录方式 CyberSAR在电脑浏览器端登录网址： https://cyber.pharmacodia.com/，欢迎猛烈试用。 请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程 如需进一步沟通，请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。