干货+新年福利|单克隆抗体纯化及其商业规模发展

2023-01-25

摘要：随着上游技术的进步，单克隆抗体（mAb）的生产能力已从几毫克转变为每升克。这些titer会对下游流程（DSP）造成巨大压力，需要对其进行重新加工以实现更高的效率和对可用资源的更好利用。在设计用于商业规模的设施时，必须考虑各种参数，例如层析柱的大小，多聚体的去除，过滤和体积处理。如果在设施设计阶段未定义这些关键参数中的任何一个，则可能导致过程崩溃，进而导致商业损失并延迟产品进入市场。因此，在设施设计阶段，必须在商业规模实施之前适当评估过程要求，空间利用率，过程效率和先进的制造系统。抗体纯化书籍读书交流获取方式关注抗体圈微信公众号，回复关键字“抗体纯化”即可获取报名链接，一周后统一发送具体参加要求，符合规定要求即可参加以上书籍的读书交流，邮件地址请务必填写正确，建议优先网易邮箱（其他邮箱可能被拦截），有效期一周！1背景在过去的几十年中，单克隆抗体已被批准用于治疗用途，并被证实对人类受试者有效。单克隆抗体的改善的生物利用度和结合特异性导致其在各种疾病的治疗中的使用增加。高度纯化的单克隆抗体对于解决各种疾病至关重要。上游和下游工艺平台在制造业中已建立完善，可满足抗体生产要求。商业mAb生产利用细胞系统进行上游细胞培养，然后去除细胞并纯化蛋白质。在纯化过程中采用了各种色谱系统以获得所需质量的产物。需要将与过程和产品相关的杂质减少到所需的水平。单克隆抗体价格昂贵，并且治疗患者所需的剂量数量很高。例如，各种抗癌单克隆抗体需要以克为单位的治疗剂量。因此，需要大量生产单克隆抗体以满足世界人口的需求。在放大过程中，很可能会出现有关工艺参数的各种困难。所有这些相关问题都需要在规定的时间范围内进行调查和解决。因此，始终建议检查各种过程参数以识别关键过程参数并加以实施。一旦了解了所有参数的影响，就可以将转换为更高规模的风险最小化。在大多数情况下，抗体分子是稳定的，并且可以耐受苛刻的pH条件和加工过程中的剪切力。在纯化过程中，一些制造商试图用其他纯化技术替代Protein A亲和配体，但未能获得与Protein A蛋白亲和色谱相同的质量结果。在捕获的第一阶段使用Protein A的优势在于，与抗体分子的特异性结合使杂质清除和回收过程比其他纯化方式更有效。研究人员已使用高性能的纯化技术来改进行业中当前流行的工艺模板。通过模板过程产生了大量的单克隆抗体。资本投资和运营成本太高，无法在上游和下游加工期间进行规模扩大和转移。为了应对这一挑战，已经提出了一种集成且连续的处理方法作为替代方案。综合和连续的加工方法需要更短的加工时间，并借助小型设备提高了生产效率。单程，切向流过滤；在线稀释；多柱捕获; 和直接色谱柱上样和直接色谱柱装载是实施集成连续过程策略所需的单个单元操作的一部分。各种色谱技术已广泛用于生物制药行业中，以分离和纯化分子。蛋白A色谱介质用于纯化单克隆抗体以获得高纯度以及高密度灌注细胞培养，并在生物工艺放大过程中直接与连续捕获色层析耦合。在纯化和精纯过程中已经使用了疏水作用色谱，羟基磷灰石色谱，混合模式色谱以及阳离子和阴离子交换色谱，它们有助于去除不需要的产物，污染物和聚集体。在生物处理过程中连接各种色谱技术可形成流通系统，从而省去了多个中间池，并在商业上可行。1.1 任何治疗性分子的一般流程生产单克隆抗体的商业生产过程遵循图1中描述的路径。从主细胞库到最终的批量药物分子，涉及几个步骤。Fig.1. The generalized process flow for therapeutic molecule production is outlined, starting with cell bank expansion, followed by seeding, production, purification, polishing, filtration and formulation, resulting in the final drug product2单克隆抗体的下游纯化工艺近来，用于纯化单克隆抗体的方法已得到很大发展，导致总步骤和每个步骤的目的同步。广义上讲，每个步骤的目标都是实现从澄清的收获物中去除特定杂质。特定色谱步骤的包括取决于所关注抗体的物理化学性质（表1）。值得一提的是，由于抗体性质的差异，适用于特定mAb的特定色谱方法可能不适用于不同mAb。图1显示了用于生产大多数mAb的基本纯化模型。纯化方案是根据分子的性质设计的，它还指示了在纯化的各个阶段要实施的色谱类型。Table1. Various columns involved in purification2.1捕获层析亲和色谱法目前是处理大量上游细胞培养物收获的首选。使用Protein A亲和色谱的主要优点是其对mAb的高度选择性，第一步产生的纯度> 90％，其高选择性来自抗体分子的Fc区与固定的Protein-A的相互作用。还已经显示，与分子的Fab部分相比，IgG的Fc部分在结构上对低pH条件敏感，这在从Protein A树脂洗脱中可能起重要作用。配体和抗体之间的结合是可逆的，并且在酸性条件下会被破坏。通常，可以在低pH值（最好在pH 3和pH 4之间）下洗脱与Protein A亲和柱结合的抗体。已经表明，在IgG的Protein A结合区中心的高度保守的组氨酸残基面对Protein A中的互补组氨酸残基。这些残基在低pH下会带正电荷，从而相互排斥并削弱蛋白质-IgG的疏水缔合，并导致IgG从亲和柱上洗脱。除蛋白质A外，其他蛋白质（例如蛋白质G和蛋白质L）也用于抗体纯化。每种抗体结合蛋白结合不同亚型和种类的抗体的能力各不相同。所有这些抗体结合蛋白都是细菌蛋白，并且具有良好的特性。这些已经重组产生，并用于从多种物种中亲和纯化抗体类型。蛋白A和G与抗体Fc区的重链结合，而蛋白L与两个Fab区的轻链特异性结合（表2）。Table2. Properties of various affinity proteins used in antibody purification.2.2 低pH灭活通常，在酸性条件下，使用低pH的缓冲液洗脱与Protein A亲和柱结合的抗体。在酸性条件下，抗体从蛋白A基质中解离，并在溶液中提取。A蛋白亲和洗脱液可保持在低pH值以进行病毒灭活，这是ICH Q5A的要求之一[30]。抗体纯化需要两个正交步骤才能去除或灭活病毒。保持低pH值后，洗脱液用碱溶液中和，用于下一步中间色谱步骤。中和后，可以将获得的抗体溶液保存一段时间，然后再进行进一步处理。2.3 中间品纯化从澄清的收获物中捕获抗体溶液后，所得溶液的纯度几乎> 90％，但仍含有少量杂质。需要使用各种色谱技术，例如阳离子交换，阴离子交换或疏水相互作用，从抗体中去除这些与过程和产物相关的杂质。2.4 离子交换所有单克隆抗体均具有7.3–8.9的基本等电点。抗体的等电点决定了其在离子交换色谱中的洗脱。如果pH值保持在抗体pI以下，则抗体会带净正电荷。当pH值保持在抗体的pI以上时，抗体会产生净负电荷。阳离子交换或阴离子交换色谱可以在纯化方案中根据要除去的目标杂质进行。阳离子交换主要用于与产物相关的杂质，例如宿主细胞蛋白，聚集体，而阴离子交换则用于去除宿主细胞DNA和宿主细胞蛋白。阴离子交换色谱在证明纯化过程中的病毒清除率方面也起着重要的作用。阴离子交换通过流通模式实现，在该模式中，所有带负电荷的杂质均与色谱柱结合，而带正电荷的抗体则在流通中被洗脱。2.5 精纯在此阶段中，将在中间精纯过程中未除去的杂质除去，以获得符合要求规格的产品。在此阶段，根据分子及其性质，使用离子交换，GFC（凝胶过滤色谱）或HIC（疏水相互作用色谱）。2.6 纯化的单克隆抗体原料药经过各种纯化过程获得的原料药必须符合要求和期望的规格 (表3)。最终规格将有助于设计纯化过程。在不同的纯化阶段绘制各种杂质的图谱将有助于制造商识别关键的工艺参数和阶段，进而有助于确定最终工艺。3 参数放大当前，随着制造规模的增加，输入产品，中间产品和成品的处理已成为关注的问题。除产品外，如此规模所需的缓冲液量也是在准备和处理大量样品时引起实际问题的根本原因。在开发过程中使用的小规模色谱柱洗脱液量非常小，并且操作舒适。但是，一旦规模扩大过程达到了商业阶段，就必须在数量处理方面保持谨慎。即使改变1-2的柱体积也会对过程产生很大的压力，因为容器可能不足以保持该体积。因此，在开发规模期间，需要针对色谱柱体积详细研究洗脱体积。 Table3.Specification of a monoclonal antibody drug substance3.1 缓冲液量缓冲液是决定下游加工过程中工艺稳定性，产品产量和质量的最基本和必不可少的成分。在大多数情况下，许多制造商在设施设计过程中忽略了这一方面，而将精力更多地集中在处理方面，即色谱系统，色谱柱和树脂。由于储罐安装的空间要求，缓冲液会消耗设备占地面积的很大一部分。此外，这些大型储罐的运营成本非常高，因为必须按照GMP要求对其进行清洁和消毒。表4可以作为实验室规模，中试规模和商业规模的体积处理示例。在不同的操作规模下所需的缓冲液量在实验室规模，中试规模和商业水平之间变化。Table 4. Handling of buffer volume at various scales in different stages varies widely from lab to commercial process缓冲溶液是水性的，由弱酸及其共轭碱组成，并添加盐以保持离子强度。缓冲液的关键特性是当添加少量强酸或强碱时维持溶液的稳定pH值。因此，在多种生物处理应用中，缓冲溶液被用作将pH保持在几乎恒定值的手段。任何缓冲剂的缓冲能力定义为计算出的每单位体积溶液中一个pH单位发生变化的强酸或强碱的摩尔数。低缓冲容量的缓冲液会影响生产过程的稳定性，并且由于溶液pH值和规格的偏差而导致产量下降。特定系统的缓冲能力取决于两个主要因素：缓冲物质的pKa值和缓冲剂浓度。实验室规模的过程所需的缓冲区数量很少，但是在商业规模上，所需的缓冲区数量呈指数增长。传统上，商业规模所需的缓冲液是根据特定配方以所需体积手动制备的。由于使用的量很大，因此在生产规模中，缓冲区管理可能会成为瓶颈。为了克服这个问题，可以研究和评估以下两个概念：1.在线稀释（ILD）（见图2a）2.在线调节（ILC）（见图2b）ILD：采用这种方法，先制备浓缩缓冲液，然后在处理过程中使用注射用水（WFI；用于生物疗法的商业化生产）或蒸馏水在线稀释，然后使用单独的泵分别浓缩缓冲液和WFI。使用ILD制备的缓冲液在稀释后必须保持其pH和电导率。在某些情况下，稀释过程中pH值可能会漂移（参见图2）。ILC：在此过程中，使用储备溶液和注射用水（WFI）制备在线缓冲液（表5）。Table5. Comparison of the properties of In-Line dilution (ILD) and In-Line conditioning (ILC)Fig.2.(a) In-Line dilution (ILD); (b) In-Line conditioning (ILC) and (c) Flow diagram depicting the purification steps involved during In-Line conditioning (ILC)4放大过程中的色谱柱装填和评估柱填料是任何纯化过程的一个重要方面，有助于确定特定步骤的性能。如果列没有适当地装填，则可能导致通道化，从而影响步骤性能。为了避免这些问题，必须在启动实际运行之前对层析柱进行装填和评估。在任何层析阶段，有两个参数是恒定的：树脂床高度和线性流速。通过保持这两个参数不变，柱直径增加，在所有操作范围内维持保留时间不变。小柱子的装填是无麻烦的，因为它们可以在需要时拆开装填，重新装柱对于直径较大的柱子是非常关键的，因此，必须避免频繁拆柱和装填。填料中所含的色谱树脂也起到了高效填料的作用。高达30厘米的柱可以很容易地手动装填。另一方面，对于装填较大直径的层析柱，可能需要一个自动装填站来确保紧凑性。一旦填料被装填好，它需要评估装填效率，色谱柱不对称性是确定色谱柱有效的参数之一。在图3中显示出了使用小型和大型填料柱获得的色谱图。在商业规模生产过程中，必须在每次运行前对色谱柱进行测试，如果规定的不对称性或HETP（高度相当于理论板）有任何偏差，则必须使用标准协议重新装填色谱柱，并重新评估，直到达到目标值。Fig3. (a) Small scale column evaluation and (b) Large scale column evaluation5 连续流层析最近，连续处理概念已经成为最聪明和最有效的概念之一，以满足快速增长的市场需求。它有助于以较低的成本和可再生的产品质量满足日益增长的市场需求。在单克隆抗体纯化过程中，蛋白A树脂的成本使产品价格昂贵。树脂载量利用率是连续色谱与间歇色谱相比的主要优点。5.1填料载量利用在批处理模式下，目标产品不受层析柱的最大载量的限制；考虑到柱的老化，始终保持安全系数以避免产品损失。另一方面，在连续工艺的情况下，使用了95%以上的树脂载量。在连续处理中，两个相同的柱串联在一起，这样第一柱的任何流穿都可以在第二柱上捕获。两个柱都保持在荷载区（见图4），允许通过第一个柱进行荷载，而无需考虑DBC和突破的安全问题。各柱分别洗涤和洗脱，然后再生和CIP。整个过程以连续模式运行。Fig. 4. Column continuous chromatography flow有效使用树脂可导致：•没有上样安全系数（载量利用率比批量提高25%）•过载超过流穿（上样增加30%-50%）•缩短上样时间以提高柱的寿命（更多周期/时间）。与间歇模式色谱相比，周期逆流色谱（pcc）的载量利用率可能会显著提高。连续加工降低了每克目标产品的树脂和缓冲成本。缓冲液的使用与层析柱有关，而与结合的产品无关。随着载量利用率的提高，每克产品的缓冲成本降低了相同的百分比。只要合理地优化了批处理模式，就可以进行pcc的比较和与批处理模式的替换。在实施大规模商业产品之前，需要对过程的PCC进行彻底评估。6上样和周转周期的并行执行在批处理模式下，过程的每个阶段都是串联操作的，这涉及到大量的空闲时间。换句话说，首先，即使柱的上层已经完全饱和，也必须完成上样。上样后进行多次洗wash，然后洗脱产物，再生色谱柱；进行CIP并重新平衡，以使色谱柱在下一个加载循环中恢复其原始状态。在连续层析的情况下，在不等待其他阶段（如wash、洗脱和CIP）的情况下连续进行加载。一旦上样与层析柱进程的其余部分分离，就可以在上样周期和层析柱周转周期上执行并行操作。与批处理模式相比，根据所选择的条件，可以在给定的时间内完成更多的循环。快速上样和更有效地操作整个循环的选择提供了一个在短时间内使用柱中树脂寿命的机会，并降低了每克产品的树脂成本。中和蛋白A洗脱液的稳定性：由于树脂成本高，可以用蛋白A进行多次操作，因此，多次操作后，下一阶段的色谱可以在一次操作中汇集在一起。抗体分子在低pH下的稳定性是一个值得关注的问题，因此，溶液随后被碱溶液中和。大多数抗体溶液在中和后都是稳定的。根据研究计划，不同的时间间隔收集两个月的数据，如表6所示。根据结果，证实抗体分子在2到8℃之间稳定2个月（见图5）。Table6. Concentration and purity of neutralized Protein-A EluteFig5. Stability of neutralized Protein-A eluate.7病毒去除过滤病毒去除过滤器是纯化任何CHO衍生产品的组成部分（见表7）。这些小孔径过滤器是专门为清除病毒而设计的。这些过滤器是非常昂贵的，需要进行评估，以达到最大载量而不损害过滤器的完整性。表7显示了制造商的列表及其病毒去除过滤器的可用性。Table7. List of nanofilter manufacturers在实施大规模商业流程之前，需要对这些过滤器进行测试。建议使用缩小模型进行过滤器尺寸研究。图6和表8显示了纳滤器的v-max数据。这些缩小规模的实验有助于制造商设计一个病毒挑战性研究的生产工艺。基于这些数据，考虑到安全系数在1.2-2.5之间，可以提议大规模纳米过滤器的表面积。Fig.6. V-max graph of time/volume versus time for a nanofilterTable8 Results of V-Max study of a nanofilter8缓冲液和产品的过滤大多数纯化操作不被认为是无菌操作。在不同的操作阶段，使用0.2μm的过滤器将生物负荷降低到一个较低的水平，因为操作是在环境温度下进行的。最好使用色谱法中过滤所用的缓冲溶液。抗体过滤的主要问题出现在低pH值后产物的中和过程中。当产物的pH值由酸性升高到中性时，可以清楚地观察到杂质（HCP和DNA）的沉淀，这种沉淀使溶液浑浊。要评估商业规模所需的过滤器尺寸，应分析两个方面：一是实施缩小模型所需的最小体积，二是杂质分布从小规模到商业规模的变化。小比例尺和大比例尺的浊度有可能不同。因此，在对过滤器进行评估时，最好保留一定的安全裕度。此外，如果浊度太高，目标过滤器可以有0.8/0.45-μm的孔，而不是0.2-μm的孔，以实现高通量。如果浊度太高，也可以在此阶段对深层过滤器进行评级。与普通滤器相比，这些滤器具有更高的载量。8.1.深层滤器评估三种不同的深层过滤器已评估为过程中过滤使用缩小模型。图7（a、b、c）示出了三种不同深层滤器的尺寸。面积要求为商业规模。从图7d可以清楚地看出，就过滤中间产物所需的表面积而言，深层过滤器2比过滤器1和3更有效。Fig.7. Evaluation and comparison of three different depth filters (a) Filter 1 (b) Filter 2 (c) Filter 3 and (d) comparison of depth filters9最终的成品规格和成本对于所有生物治疗蛋白质，包括单克隆抗体，成品必须符合所需的规格。所有与工艺和产品有关的杂质必须在规定的限度内。以下主要因素决定了制造过程是否涉及两个、三个或四个步骤：1）产品纯度和回收率：产品纯度和回收率是决定一个制造过程是否有两个、三个或四个步骤的决定因素。总杂质水平必须在规定限值内。所涉及的步骤数是根据产品的纯度水平确定的。一旦纯度水平得到优化，就必须考虑回收率，因为这将对产品的总体成本产生影响。2）树脂成本：树脂成本在最终确定整个制造过程中也起着重要作用（表9）。3）操作简便：在制造过程中，每个分子的行为都不同。一种蛋白质开发的过程可能对另一种蛋白质不起作用。值得一提的是，在设计制造过程时，必须从可扩展性的角度考虑其易操作性。可行的小规模制造工艺可也许不可能实现商业规模。表9显示了纯化过程中制造成本的主要来源。Table9. Process requirements and cost involved in the purification process10生物制品批准管理导则大多数监管机构正在努力优化和精简生物产品的审批要求。欧洲药品管理局（EMA）、美国食品药品管理局（USFDA）和世界卫生组织（WHO）为单克隆抗体的研发和批准提供了必要的监管指南。一些新兴市场的许多机构仍在制定监管准则。大多数国家都采用了美国食品药品监督管理局（USFDA）或欧洲药品管理局（EMA）制定的指导方针。欧洲药品管理局（EMA）还发布了关于类似生物医药产品的指导方针，对所有生物技术/生物产品，包括单克隆抗体，都有明确的监管要求。CPMP/BWP/328/99号文件解释了生物技术和生物制品的药剂学发展。本文件还对药品开发研究所需的营销授权数据提供了指导。此外，本文件还着重于通过生物或生物技术手段生产的活性物质的适当剂型开发过程中涉及的配方和预成型研究。世界卫生组织（世卫组织）发布了技术报告系列（TRS）1003：药物制剂规格专家委员会。TRS为药品（包括放射性药品）在产品生命周期的所有阶段提供质量保证的技术指导。如果材料是动物源性的，传播性海绵状脑病（TSE）指南是必不可少的。世卫组织还提供在开发和鉴定生物仿制药或类似生物制品（SBP）过程中发挥关键作用的参考标准/试剂。这些标准由世卫组织生物标准化专家委员会制定。商业制造商可以使用这些世卫组织标准校准其二级标准。由于使用了单一的一级标准，全世界分析结果的可比性是可能的。国际人类用药药品注册技术要求协调会议（ICH）发布了具体的指导方针。ICHQ5A（R1）涉及从人类或动物细胞系衍生的生物技术产品的病毒安全性评估。ICHQ5B讨论了生物技术产品的质量：用于生产R-DNA衍生蛋白质产品的细胞中表达结构的分析。ICHQ5C提供了生物制品质量指南：生物技术/生物制品的稳定性试验。ICHQ5D阐述了用于生产生物技术/生物制品的细胞基质的衍生和特性，ICHQ5E讨论了生物技术/生物制品在其制造过程中的变化的可比性。超过五十个单克隆抗体已被批准，约200在临床发展的各个阶段。从实验室规模发展到商业规模的单克隆抗体是相当耗时和繁琐的。在进入下一阶段之前，分子在每一步都要经过各种检查。在开发生物制品之前，考虑了几个参数和因素。几步纯化后，使用CHO细胞株产生的一些已批准的抗体如下表10所示。所有这些产品均采用与上述章节中讨论的步骤类似的步骤进行纯化。Table10. Few of the approved antibodies from CHO cell lines临床前和临床研究中，纯化的单克隆抗体的药代动力学、药效学、药理学和毒理学也很重要，这将是另一篇文章的主题。这些研究类似于推荐用于小分子药物、天然产物和纳米药物的研究，以评估分离和纯化的单克隆抗体的剂量和效力。治疗蛋白总是有可能导致不想要的免疫原性，这可能是由于各种产品相关的因素。在临床评估和任何分子的注册后，必须产生足够的数据以将免疫原性相关风险降至最低。在临床试验期间，必须正确评估和评估不需要的免疫原性。因此，纯化的单克隆抗体可以有效地用于治疗疾病和治疗人类疾病。意外和不可预测的不想要的免疫原性的发展是影响治疗蛋白的一个重要问题，包括后续的生物制剂。抗治疗性生物抗体的发展可引起过敏或过敏反应，降低疗效，在某些情况下，严重的不良反应。诱导免疫应答的风险在很大程度上取决于受者以及许多与产品相关的因素（例如，生产过程、配方和治疗过程中服用的剂量）应考虑从临床前开发到临床试验到注册后评估后续生物制剂的不想要的免疫原性，以尽量减少治疗产品接受者的免疫原性相关风险。在I/II期临床试验期间，需要使用一系列经过仔细验证的程序进行适当计划的免疫原性研究，以评估治疗产品不需要的免疫原性。10.1临床前和免疫原性评估美国对生物制品的监管取决于生物制品在时间上的发展方式，而在欧盟，生物制品按其活性物质和制造方法进行分类。尽管存在这种差异，但美国和欧盟都认为，由于生物制品具有独特的特性，例如其复杂的结构和在制造过程中的变化，有必要更多地关注生物制品。单克隆抗体（mabs）因其免疫功能和生物来源而被认为是生物制剂或生物仿制药。生物制剂必须进行临床前实验室和动物研究，以了解它们的药理和毒理效应。生物制剂需要以科学为基础的个案研究方法来解决人类临床试验之前的问题。ICH指南已经公布了选择合适的动物种类和进行临床前免疫原性试验的重要性。必须进行体外和体内研究，以确定生物制剂的药理意义。需要有效地利用体外结合试验和功能试验来鉴定最适合体内研究的物种。例如，在单克隆抗体的情况下，体外研究将提出药理学作用并将其与特定受体的表位或表达联系起来。一般来说，建议使用两种相关的物种来测试生物制剂的活性，但在某些情况下，确定适当的动物物种可能是不可行的。在这种情况下，表达人类受体或同源蛋白的动物模型和转基因动物被认为是测试生物制品的替代方法。了解生物制剂的免疫原性对理解临床前研究结果至关重要。生物制剂和免疫反应是相互关联的，通常对疫苗是必不可少的，但并不总是如此。生物活性的持续，免疫复合物的形成，以及与内源性物质的反应被认为是可能的不希望的影响。因此，足够数量的抗体样品是必不可少的了解其药代动力学，药效学和毒代动力学。通常，单剂量和多剂量的药代动力学和毒理动力学研究，以确定吸收，分布，暴露和清除，从而预测人类生物制品的安全性。动物免疫反应可以或不可以预测人类免疫原性。生物制剂的致癌性评估是可行的，可以在恶性和正常人细胞的帮助下进行检测。遗传毒性研究不推荐用于生物制品，因为转化为肽和氨基酸。10.2生物制剂临床研究食品和药物管理局（FDA）批准的试验性新药申请（IND）对临床试验至关重要IND应反映治疗性生物技术产品的临床前研究、生产和化学细节临床前研究必须对其吸收、分布、代谢和排泄途径进行总结。化学和制造细节对于确定未知杂质成分的存在与否非常重要。临床前试验的数据有助于fda确定临床试验是否安全，对患者没有不合理的风险。生物制剂的临床试验包括三个阶段在L阶段，生物制品在不断增加的剂量下的药理学和安全性是通过给少数患者而不是经常给健康志愿者用药来确定的。第1阶段研究的目的是评估生物制品的最大耐受剂量、药代动力学和生物活性，以确定生物剂量。生物制剂的免疫原性是通过药代动力学和药效学监测抗体给药后约28天来确定的。第2阶段的研究是为了了解几百名患者的短期不良事件。药代动力学、药效学和免疫原性结果用于探索暴露反应相关性，并随后协助完善第3阶段研究的程序。第3阶段的研究依赖于患者群体，并侧重于患者的风险效益评估根据替代疗法的有效性，第3阶段的研究是盲目的，对照的，随机的，在几个中心进行。对目标人群的临床益处的证明被认为是生物制剂第3阶段临床试验的有效结果。10.3生物制品的生产工艺与发展生物制剂对可能影响生物制品质量的工艺变化非常敏感。在生产过程中不应影响其特性、纯度、效力和安全性。FDA需要来自体外和体内生物测定、分析测试、动物临床前测试和人类临床研究的数据。来自各种分析的数据有助于FDA确定生产变化。在生产过程中，配方变化会影响产品的药代动力学、药效学和药理学。同样，必须使用敏感仪器进行分析测试，以确定有意义的差异和结果。因此，生产数据和临床前数据对于FDA确定生产过程中的变化程度、产品外形、产品特征技术和产品稳定性等因素至关重要。FDA的建议需要包含在IND（研究新药申请）或BLA（生物许可申请）中。在临床试验之前和期间，定期与FDA会面对于生物制品许可证的申请至关重要。生物制品许可证申请应包含有关生物制品纯度、安全性、制造方法、稳定性、有效期、标签和生产生物制品的设施地址及其他附件的简要数据。食品药品监督管理局根据纯度、安全性、效价、生产工艺、涉及的加工步骤、包装细节和其他良好的生产规范，审查并批准生物许可证申请。任何新产品在开发过程中都需要遵循图8所示的监管路径。Figure8. Common regulatory path of a molecule11单克隆抗体研制专利为任何生物技术产品申请专利与药品所需的工艺完全不同。任何生物技术产品都需要一个以上的专利才能完全覆盖治疗实体，而药品则可以由一个或两个专利覆盖。在早期，任何一种单克隆抗体分子都可以申请专利，而对实际分子的披露很少，但目前需要提供大量数据，才能通过专利获得对该分子的广泛保护。如果没有向专利当局提供必要的真实数据，申请有可能被驳回。因此，以实验证据支持专利请求权具有重要意义。单克隆抗体的可专利性在很大程度上取决于其与抗原表面给定表位结合的能力。研究人员必须关注抗原和抗体之间的这种特殊相互作用。一旦证实这种相互作用产生了新的技术效果，所述抗体可被视为专利。最近，一些商业组织申请了包括发酵和纯化在内的完整制造工艺的专利。生物反应器的设计以及在商业规模上用于培养和繁殖哺乳动物细胞以达到最大产量和细胞计数的系统获得专利。由于各种各样的管理障碍，一些组织正在广泛地研究可丢弃的概念，因为它避免了与清洁和重用有关的许多问题。单一用途的概念仍处于初级阶段，有些组织自始至终都在使用同一个系统，而另一些组织则根据过程的适宜性和易用性使用系统。由于世界贸易组织（WTO）TRIPS协议（与贸易有关的知识产权协议），全球大多数专利法都是统一的。大多数国家对一项专利从申请日起给予20年的期限。在欧美一些发达国家，也考虑了排他性时期。单克隆抗体（mAbs）用于治疗各种疾病，如癌症、自身免疫性疾病和免疫性疾病。抗体可以作为药物靶向和传递系统，并触发或抑制免疫系统。抗体的应用包括蛋白质纯化、诊断和法医学。获得一项新开发的单克隆抗体专利对研究人员来说是一项艰巨的任务。专利过程中的关键方面是产品的功能特性、产品的结构、选择干预和治疗性单克隆抗体的应用。抗体与抗原表面表位结合的能力是决定产品专利性的关键因素。抗体与抗原相互作用的特异性以及靶点的描述和特性是获得生物制品专利的其他重要要求。抗体产生方法、抗体的选择、抗体效力和治疗作用的实验证据是将抗体视为可专利治疗产品的独特参数。抗体也被定义为用于治疗性免疫防御的免疫球蛋白或蛋白质。所有的单克隆抗体都被认为是蛋白质产物，而所有的蛋白质产物都不是抗体。新颖性、创造性和书面描述是抗体获得专利的保证。新颖性的标准主要基于抗体与新表位或靶点的结合。单克隆抗体（mAb）的发明性或非显而易见性越来越难以证明。人源化和嵌合抗体的产生、用于产生人抗体的转基因小鼠、抗体药物结合和用于疗效的抗体工程常数区被认为是明显的。为了应对这一挑战，我们必须显示可比较的结果，即可比较的、结构特征、新的表位识别、更好的效能、显著的半衰期、对靶的亲和性、抑制生物靶点和减少毒性。以及支持发明或非显而易见权利要求的体内数据和临床结果。长期未满足的需求和商业上的成功也被认为是支持新颖性和非显而易见性的主张。对于新抗原，书面规范应包括有关抗原的完整特征数据。除了功能性声明，如表位结合和竞争性结合，结构特征，如带有VH、Vl或CDR残基的序列，可以包括在抗体声明中。因此，表位的表征、结合亲和力、药理意义、靶点特异性以及抗体的结构和功能对于拓宽专利权的范围是必要的和有用的。11.1轰动一时的生物制品和最新专利到2016，全球销售的前五种生物药物是（1）用AbbVie治疗类风湿性关节炎和Crohn病；（2）Enbrel（依那西普），用于治疗类风湿性关节炎、银屑病性关节炎和强直性关节炎，由AMGEN和辉瑞公司治疗；（3）RemiCAD（英夫利昔单抗）治疗溃疡性结肠炎，Crohn病和类风湿关节炎由约翰逊和约翰逊和默克；（4）利妥昔单抗（利妥昔单抗）用于治疗非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病以及罗氏化疗药物；以及（5）阿维斯丁（贝伐单抗）靶向不同类型的癌症或罗氏药物（见表11）。2017年，十大畅销生物制剂包括上述5种，此外还有（6）赛诺菲-安万特治疗糖尿病的镧（甘精胰岛素）；（7）诺和诺德治疗糖尿病患者控制高血糖的诺和洛普（天冬胰岛素）；（8）用于治疗辅助性乳腺癌的赫赛汀（曲妥珠单抗），Roche/Genetech的转移性乳腺癌和胃癌）；（9）Privigen（免疫球蛋白基）用于CSL Behring治疗原发性体液免疫功能丧失、慢性免疫性血小板减少性紫癜和慢性免疫性血小板减少性紫癜；和（10）Humalog（lispro胰岛素）用于Eli Lilly治疗1型和2型糖尿病。这些生物制剂中的大多数已经上市一段时间了，它们的专利最近在美国和欧洲都已经过期或即将过期。Table11. Biotechnology products with patent validity由于世界贸易组织（WTO）TRIPS协议（与贸易有关的知识产权协议），全球大多数专利法都是统一的。大多数国家对一项专利从申请日起给予20年的期限。在欧美一些发达国家，也考虑了排他性时期。这为其他制造商开发生物仿制药铺平了道路，但制造商阿博维已经在HouiRa上获得了大约一百项专利，以保护它。同样，强生公司的生物产品Remicade也拥有100多项专利。自2017年以来，生物认证的数量迅速增加。2017年批准18种生物药物，2018年批准19种生物制剂。从2019年1月至今，共批准了11项生物许可申请。这说明了生物制品的重要性和专利的重要性。最近批准的所有生物制品都获得了制造商的专利。2018年和2019年批准的生物制剂如下表12所示，显示了专利趋势。Table12 Recent patent trends of Biologicals12结论近年来，随着细胞培养技术的不断进步，在每一批细胞中获得最高纯度的单克隆抗体已成为生产的迫切要求。大多数制造商目前采用色谱和过滤技术来满足这一要求。只要对过程和参数进行充分评估，任何过程都可以放大以产生大量抗体。需要考虑和测试色谱树脂的性能、色谱柱的尺寸和缓冲要求等参数，以避免在商业规模的生产过程中出现令人惊讶的结果。系统和柱在小范围内的处理并不复杂，而在大范围内，需要处理大量的缓冲液、树脂和产品，同时保持产品分子的稳定性。工艺参数需要优化，使产品的最终规格在规定的范围内。运行参数的任何变化都可能导致产品不合格。连续色谱的一个主要瓶颈是通过病毒spiking在缩小模型中进行病毒验证，因为采用连续色谱在商业规模上执行的相同条件将非常麻烦。原文来源：Chahar DS, Ravindran S, Pisal SS.Monoclonal antibody purification and its progression to commercial scale.Biologicals. 2019 Sep 23. pii: S1045-1056(19)30105-8. 在抗体圈微信公众号回复“JPM23”可下载60 家药企PPT合集。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。