宿主细胞蛋白：确保患者安全

2022-12-27

疫苗免疫疗法

工艺相关杂质，如宿主细胞蛋白（HCP），可能会引起对生物药功效、质量和安全性的担忧，具体取决于其性质和水平。这里，我们将回顾有关HCP与患者安全性的相关文献，包括有关HCP相关免疫反应和不良临床事件的信息。HCP 对患者安全的影响至少5种HCP诱导的因素可以影响治疗性蛋白质的安全特性：免疫原性 - 在注射部位激活先天性或诱导适应性免疫反应，形成结合和/或中和抗体（分别为IgM和IgG），释放促炎细胞因子（例如肿瘤坏死因子α，TNFα）致敏性 - 与 IgE 诱导相关的早期过敏反应（例如过敏反应）和 IgE 非依赖性反应（例如，与细胞毒性 T 细胞 CD8+ 诱导相关的晚期反应），以及组织损伤的后果与治疗性蛋白质（折叠/未折叠/聚集）相互作用或结合的可能性，诱导与佐剂作用相关的结合和中和抗药物抗体（ADA）与重复模式相关的聚集潜力，可激活边缘区 B 细胞（MZB）激活生物活性潜力 - 例如，单核细胞化学吸引蛋白 1（MCP-1）和转化生长因子 β1（TGFβ-1）。HCP诱导的免疫反应HCP本身可以产生极端的免疫反应。特别值得关注的是细菌HCP，如鞭毛蛋白和肽聚糖。来自E.Coli的HCP可以引起直接免疫反应，因为该物种是我们微生物群的一部分，并且广泛存在于人类周围的环境中。强烈且持续的免疫反应：要了解HCP如何诱导免疫反应，请考虑旨在诱导持续且强烈免疫反应的生物制剂：佐剂疫苗。没有佐剂，纯化的抗原（Ag）不会导致有效、持久的免疫。纯化的Ag通常与氢氧化物或磷酸铝、角鲨烯、CpG B类非甲基化DNA或脂质A单磷酸（MPL）混合，以诱导预期的反应。也有其它佐剂正在研究当中。氢氧化铝Al(OH)3是证明佐剂如何诱导免疫反应的一个很好的例子。它表现为微米级颗粒的聚集。巨噬细胞将这些微粒与针状细菌（2-10μm）混淆并吞噬它们。当疫苗皮下注射时，巨噬细胞迁移到注射部位并吞噬铝-Ag颗粒，然后在注射部位持续数月。研究还表明，巨噬细胞在疫苗注射后在其溶酶体中保留铝沉积物。含铝的骨髓细胞系和抗原呈递细胞（APC）分化成具有典型形态的成熟CD83 +树突状细胞（DC）。该过程是由白细胞介素（IL）4和12的自分泌以及调节性T（Treg）细胞的旁分泌诱导的。铝通过引起细胞坏死，激活溶酶体中的组织蛋白酶B，进而诱导炎性小体组装来激活巨噬细胞。炎性小体招募酶源-1，其寡聚并经历自蛋白水解。形成的半胱天冬酶-1消化pro-IL-1b和pro-IL-18。然后激活的IL促进基于2型辅助性T（Th2）细胞的炎症和适应性免疫反应。这一系列事件将更多的T细胞、DC、嗜碱性粒细胞和肥大细胞招募到创伤部位。嗜碱性粒细胞和肥大细胞脱颗粒可增加细胞通透性、血球渗出和血管活性胺的分泌。通过自身，APC分泌IL，如前列腺素E2（PGE2），其诱导淋巴细胞T CD4 +分化和DC活化。一些T细胞成为记忆细胞，针对一些Ag提供持久的免疫。其它疫苗含有用变性剂（如甲醛）处理的活的和/或减毒的病毒或细菌成分。减毒疫苗可含有来自靶病毒的单链或双链 RNA、非甲基化 CpG DNA 或来自细菌的鞭毛蛋白、皮林蛋白、肽聚糖、外膜孔蛋白（Omp）C、OmpF 和脂多糖（LPS）。这些分子是免疫反应的强诱导剂。病原体相关分子模式（PAMP）在被 APC 吞噬后（通过角质形成细胞、成纤维细胞或 APC）在注射部位诱导应激信号。在通过模式识别受体（PRR）检测后，APC分泌干扰素（IF），并通过趋化性将更多的免疫细胞招募到该位点。与先天免疫应答相关的 PRR 包括C型凝集素受体核苷酸结合和寡聚结构域样受体（NODL）gxv视黄酸诱导基因I样受体Toll样受体（TLR）后一受体可以迅速触发强烈的免疫反应。例如，TLR4识别细菌LPS，触发转导信号，这些信号进入免疫细胞内的炎性小体机制组装，而在小鼠中TLR11可以检测鞭毛蛋白和profilin样蛋白。总之，为了引发免疫反应，APC必须吞噬HCP，然后在组织蛋白酶B、尿酸释放或其它免疫反应介质促进的应激后，处理并向主要组织相容性复合物II类（MHC II）分子（或人白细胞抗原（HLA）系统）递呈其Ag。减毒活疫苗药物产品不是用佐剂分子（例如铝）或其它增强免疫反应的物质制造的。美国药典-国家处方集第34章<1132>关于“生物制药中残留宿主细胞蛋白的测量”指出，对具有人源化HCP的动物的免疫必须使用适当的佐剂进行，可以是不完整或完整的弗氏佐剂，以引起足够的免疫反应。此外，强反应的剂量必须在每剂量5μg - 50μg之间，并存在佐剂。浓度低于该范围可导致无效，其中反应性T细胞耗尽，诱导耐受性。在此过程中，由于没有危险相关分子模式（DAMP）或自然发生的感染，克隆扩增受到抑制。不在药物配方中添加佐剂时，一些Ag不能在7.5μg的剂量下引起持续的免疫反应（因此炎症和/或过敏反应）。Ag被认为抗原性不足。也许 - 这是一种观点 - PAMP和DAMP的缺乏是一些药物产品仅显示结合抗体存在的原因。这也可以解释为什么一些产品产生T细胞依赖性反应（主要是IgG反应）或T细胞依赖性（IgM）反应，但没有中和抗体。HCP可以作为诱导剂吗？这似乎取决于它们的性质。值得一提的是，HCP相关免疫反应的所有报告都来自使用传统纯化工艺制备的E.Coli衍生产品。该表达系统产生所有上述分子信号，可以引发强烈的免疫反应。研究表明，E.Coli HCP 可通过 TLR 诱导免疫应答（例如，对 CpG DNA、甲酰基甲硫酰蛋白、LPS、肽聚糖和鞭毛蛋白）。此外，由于过表达的蛋白质形成包涵体，因此来自这些颗粒的杂质在纯化后很容易残留在药物底物/产品中。事实上，纯化过程不能完全去除HCP。与小蛋白质相关的免疫原性：现有数据与Janeway的理论相矛盾，即纯蛋白质在没有佐剂的情况下不会诱导免疫反应。如果重组治疗性蛋白质与天然蛋白质不一致，则它们可能具有免疫原性。在免疫治疗的早期，鼠单克隆抗体（mAb）被设计用于肿瘤治疗。美国食品和药物管理局（FDA）于1986年批准了第一个这样的产品，Orthoclone OKT3（Muromonab-CD3，Janssen- Cilag）CD3，Janssen- Cilag），用于治疗急性同种异体移植排斥反应。MAb与ADA发展相关的不良超敏反应有关。构建体的小鼠起源引起免疫反应。因此，使用常规杂交瘤技术开发了抗CD3小鼠抗体（Ab）的人源化版本。新结构12F6被证明比其原始结构的免疫原性要小。随后，研究人员过渡到开发嵌合、人源化和完全人化的mAb。一些产物保留了其免疫原性特征，即使它们是完全人源化的mAb。但并非所有的治疗方法都遇到过这样的困难。Amgen的Enbrel（依那西普）是TNF受体2（TNFR2）及其Fc结构域的融合蛋白，不会诱导免疫原性。对这一结果的解释是，这两个结构域都是100%人源的。虽然后来的例子提供了相互矛盾的数据，但mAb的免疫原性似乎与Ab的互补性决定区（CDR）有关，CDR诱导抗特异型抗体或具有非天然表位的蛋白质。这些例子引起了对治疗性mAb的严重关注。然而，对外来蛋白（例如，来自E.Coli、酵母或非人类哺乳动物细胞）的免疫原性似乎不是问题，除非它引起极端炎症或 IgE 反应。此外，免疫原性的研究表明，聚体对于诱导这种反应是必要的，并且诱导剂或“超级抗原”（如LPS）的存在可能是高度免疫原性的。世界各地的研发（R&D）部门都在努力克服这些问题。目前的纯化工艺可以将关键杂质降低到非常低的水平。然而，问题仍然存在：HCP-治疗性蛋白质复合物的形成能否加速免疫原性反应？与注射PAMP、DAMP和蛋白质-杂质混合的强烈免疫反应能否引发交叉反应？这些问题的答案一直难以捉摸。与IgE诱导和过敏反应相关的不良反应：预计会出现全身性过敏反应。HCP和治疗性蛋白质不是内源性的，因此可以诱发高血压、水肿、疲劳、虚弱、呼吸困难、头痛、恶心、呕吐、胸痛、皮肤反应、癫痫发作和其它过敏反应。一些针对Epoetin（epoetin alfa，Amgen）的临床研究表明，安慰剂诱导的注射部位过敏反应（12%，皮下注射）比参考产品（7%）更高。值得一提的是，其中一些反应与治疗性蛋白质本身有关，而不是与药物产品中存在的杂质有关。然而，生物制品可引起过敏反应等不良事件，在美国每年造成500 -1,000人死亡，在英国估计，每年每百万人有0.33人，在澳大利亚为每年每百万人约0.66人。过敏反应的主要原因包括药物（44%）、食物（31%）和昆虫叮蛰（23%）。因此，检测生物制药产品中的HCP水平至关重要。Ag必须具有特定的特征才能被视为过敏原。它们必须：稳定的蛋白质具有酶活性（例如蛋白酶活性）在低剂量下诱导反应（例如，IL-4感应器）具有高溶解度分子量低与 MHC II/HLA 系统有效交互必须吸入许多过敏原才能引起反应；然而，食物中的某些蛋白酶会在肠道中变得过敏。房屋尘螨粪便颗粒中的蛋白酶可以诱导具有相关过敏反应的IgE特异性信号。在小鼠中，注射活性蛋白酶，如木瓜蛋白酶，可以触发IgE反应。过敏原可能成为食品行业员工的职业危害，他们使用含有菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的肉类嫩化剂。过敏根据其免疫反应途径可分为4种类型：1 型 - 由肥大细胞的 IgE 激活介导2型 - 由针对细胞表面和基质的IgG抗体介导3 型 - 由 Ag–Ab 复合物介导4型 - 由T细胞介导过敏反应是加重的 1 型反应。Ag以低浓度通过某些途径（例如，在食品和小分子药物的情况下，口服或通过粘膜）传播，并被APC消化。然后，它们通过MHC II呈递给Treg细胞，诱导Th2表型的表达以及激活后IL-4，IL-13和CD154的分泌。在B细胞中，初始刺激触发从IgG到IgE产生的转换。浆细胞（分化的B细胞）释放的 Ab 与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的高亲和力 IgE 受体（FcεRI）结合，然后根据受影响的器官分泌负责典型哮喘和过敏样特征的介质，并具有相应的血管舒张或支气管收缩。在“经典过敏途径”中，IL-13和IL-33也由2型先天淋巴细胞（ILC2s）分泌。这些分泌的介质 - 即组胺（主要介质）、IL-4（由嗜碱性粒细胞分泌）、白三烯、前列腺素、β胰蛋白酶、血小板激活因子、细胞因子和趋化因子 - 是IgE免疫反应的主要介质。与过敏反应相关的不良反应包括细胞通透性，即间质液向细胞外区室移动。这种运动可诱发低血容量性休克，伴有呼吸困难、瘙痒、低血压、腹痛、晕厥、支气管痉挛，甚至最终的心力衰竭和死亡FDA报告了与小分子药物相关的过敏反应，如葡萄糖酸氯己定和马来酸阿塞那平。该机构还发布了有关小蛋白质的警告，例如重组人生长激素（rhGH）：据报道，使用生长激素产品会出现严重的全身性超敏反应，包括过敏反应和血管性水肿。关于Fiasp（速效胰岛素门冬胰岛素，Novo Nordisk），该机构指出任何胰岛素（包括 Fiasp）都可能发生严重、危及生命的全身性过敏，包括过敏反应、全身性皮肤反应、血管性水肿、支气管痉挛、低血压和休克，并可能危及生命。在临床计划中，在用Fiasp治疗的成年患者中报告了全身性超敏反应（表现为全身性皮疹和面部水肿）。1.7%的成年患者在使用Fiasp后报告有过敏性皮肤表现，包括湿疹、皮疹、瘙痒、荨麻疹和皮炎。英夫利昔单抗给药可产生 IgE 和 IgM ADA。在一项研究中，不良反应很少见，在71名受试者中只有3名发生。这种反应源于产品的嵌合源性。然而，在另一项研究中，61%的受试者对该产品产生了免疫原性。Xue等人在没有已知接触过生物制剂的受试者中，检测到了抗英夫利昔单抗中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系HCP的Ab。在这些Ab中，IgG1和IgG2亚类占主导地位，分别出现在67%和60%的研究参与者中。此外，40%的受试者对IgM亚类Ab有反应，但没有显示出显著的IgE活性。3名患者报告了由于抗英夫利昔单抗IgE和皮肤反应引起的严重反应。Ingerslev等人的一项研究表明，在用重组人血因子VIII（rhFVIII）治疗之前和之后，血友病患者中存在针对CHO HCP的Ab，尽管这种Ab没有被认为应对报告的不良事件负责。然而，抗rhfVIII Ab可以中和治疗，成为一个严重的质量问题。到目前为止，所有关于HCP相关过敏反应的报道都涉及聚集蛋白。HCP与治疗性蛋白质的相互作用可以诱导ADA的产生吗？另一个重要的危险因素是产生ADA的潜力，ADA可以结合或中和Ab。当HCP表现出相似的物理化学性质（例如，相似的等电点，pI）时，HCP可以与治疗性蛋白质一起洗脱。HCP可以与药物表面的疏水性区域建立范德华相互作用。该过程可以诱导反应性（免疫原性）表位的暴露治疗性蛋白质复合物可以指导针对HCP的交叉反应性抗体。这种交叉反应可以介导自身免疫过程，其中内源性蛋白质的水平可以被耗尽。例如，促红细胞生成素消耗可导致一种称为纯红细胞再生障碍（PRCA）的严重疾病，这是一种自身免疫性疾病，其特征为严重贫血、骨骼中红细胞前体缺失、促红细胞生成素无反应性，以及ADA的形成，这些ADA也中和了内源性促红细胞生成素1998年至2002年间，发生了12例严重的Ab介导的PRCA病例，其中11例涉及皮下注射Eprex（epoetin alfa，Johnson & Johnson），这是一种无血清白蛋白的促红细胞生成素制剂。这些病例与预装注射器中未涂覆橡胶柱塞的析出物有关。析出物产生乳浊液，形成促红细胞生成素聚集体，皮下注射诱发自身免疫性疾病。在塞子涂覆聚四氟乙烯后，PRCA的发生率降低了约90%。这个例子表明，涉及析出物、乳液和聚集体的相互作用可以诱发自身免疫性疾病。2017年的一项研究在128名接受重组人促红细胞生成素（rhEPO）治疗的患者中检测了ADA。只有3名受试者显示出贫血与ADA之间的相关性。现有数据显示一些可触发抗 rhEPO ADA的因素，包括胶束形成、析出物释放、制剂中存在甘氨酸和皮下注射，这与接受促红细胞生成素治疗的患者的 PRCA 事件有关。在疫苗中诱导免疫反应的实验表明，为了诱导对蛋白质的强烈反应，制剂必须包括LPS；其解毒对应物，单磷酸脂质A（MPL）；或至少一种合适的佐剂。自20世纪80年代以来，许多生物技术产品已经开始销售，从那时起的几年里提供了大量数据。可以随时使用监管机构的网站进行查询。在分发治疗产品后，严格的药物警戒方案有助于早期发现不良反应，例如由于生物治疗药物批次间的差异、特殊的患者反应以及患者亚群之间的差异（例如，临床试验中未评估的种族和其它因素）。在临床设施中，“过敏反应性测试”可以防止最严重的IgE介导和过敏样反应。从业者可以使用皮下穿刺进行此类测试，以获得快速的IgE反应或由于抗原阈值增加而导致的缓慢T细胞（CD8 +）反应性。早期过敏样追踪可以帮助确定对治疗性蛋白质的反应性，并追踪药物产品中存在的HCP、DNA或RNA。值得注意的是，目前还缺乏关于细菌蛋白（或来自其它表达系统的蛋白质）是否可以触发ADA以响应与治疗性蛋白质直接相互作用的研究。然而，研究人员已经开始将ADA与HCP和治疗性蛋白质络合引起的药物产品功效损失联系起来。生物活性：Beatson等人的一项研究表明，TGFβ-1在CHO-K1细胞中的组成性表达。该蛋白在低浓度下显示出生物活性。在这项研究中，它还与融合到粘蛋白1（MUC1）外胚层的小鼠IgG2 Fc区域组成的融合蛋白共洗脱，表明2种蛋白质具有相似的pI（~5.5）。TGFβ-1以每毫克治疗蛋白19.4ng的比例存在。研究小组还发现，MUC1的免疫调节作用至少部分归因于样品中发现的细胞因子杂质，并且可以使用抗TGFβ-1中和Ab来抑制这种作用。这样的活性对于HCP来说是意想不到的。对培养基进行TGFβ-1检测，酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒返回阴性结果。使用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），研究小组在表达系统中发现了细胞因子基因。他们最终确定TGFβ-1来源于宿主细胞，并且它作为213-275 kD的大型潜伏复合物（LTBPx-LAP-TGFβ-1）的一部分存在于上清液中，如超滤（100 kD）。特别令人感兴趣的是，尽管细胞因子起源于仓鼠，但细胞因子在人体细胞中具有生物活性，这是由使用水貂肺上皮细胞（Mink-PAI-1-Luc）的纤溶酶抑制剂1启动子-荧光素酶测定的。尽管Beatson等人报告说，仅在80°C下孵育10分钟后，鉴定的细胞因子才具有活性，但另一项研究发现接受静脉注射免疫球蛋白的患者血液中的TGFβ-1水平升高。随后的研究确定了几种激活机制，例如轻度机械搅拌、蛋白酶裂解或体内pH应激。值得一提的是，几乎所有的mAb和糖基化治疗蛋白目前都使用CHO细胞进行表达。因此，必须跟踪所有用此类产品治疗的患者的HCP-TGFβ-1活性，直到有问题的基因可以从CHO细胞表达系统中删除，或者直到纯化工艺可以将杂质去除到非常低的水平。该分子发挥重要的生物学功能，如G1细胞阻滞。在另一项研究中，Haggerty等人描述了宿主细胞源性趋化因子MCP-1的存在。杂质可诱导嗜碱性粒细胞释放组胺。在2a期临床试验中，患者在接受Orencia（abatacept，BMS）治疗后出现与组胺释放有关的严重不良事件。使用全血体外分析，研究人员检测到了释放的组胺的存在。通过反相液相色谱与串联质谱（RP-LC-MS / MS）进行杂质鉴定。HCP显示出与人类MCP-1的高度同源性。确保药物产品的安全性本文中的例子指出，必须进行严格的理化分析、杂质定量、生物分析、临床试验和药物警戒，以确保药物产品在商业化过程中的短期和长期安全性。新的信息和对体外分析的改进可以阐明并增强对现在无法检测到的安全问题的检测。原文：V.P.M.Martinez, C.E.E.la Garza, N.O.Perez, Opportunities in the Field of Host Cell Proteins: Part 2: Ensuring Patient Safety. Bioprocess International, 2022.相关阅读：19位行业专家，4场知识盛宴，抗体药物大规模高效生产系列网络研讨会盛大开启！