弗林蛋白酶切割位点影响冠状病毒细胞入侵的研究进展

2023-09-08

中文摘要弗林蛋白酶是一种宿主丝氨酸蛋白酶，在多种生理功能中发挥重要作用，是人体正常发育所必需的蛋白酶，与多种病毒的细胞入侵、感染性、毒力等密切相关。冠状病毒为单股正链RNA病毒，外膜有蘑菇状刺突蛋白（spike，S），弗林蛋白酶的切割位点广泛存在于冠状病毒S中。弗林蛋白酶对于冠状病毒入侵宿主细胞起着至关重要的作用。此文重点综述弗林蛋白酶切割位点对各种冠状病毒入侵宿主细胞的影响，总结了该酶作为病毒入侵潜在药物靶点的最新进展，为其在病毒感染中的机制研究以及作为靶点的药物研发提供理论支持。正文弗林蛋白酶是真核生物细胞普遍表达的一种丝氨酸蛋白酶，在胚胎发育、促进卵母细胞成熟、维持免疫稳态和外周免疫耐受等多个生理过程中发挥重要作用。真核细胞多种前体蛋白需经弗林蛋白酶切割才能形成具有生物活性的多肽和蛋白。同时，弗林蛋白酶在多种病原体感染宿主细胞的过程中起着重要作用。弗林蛋白酶可裂解HIV-1的糖蛋白gp160为2个功能亚基，介导病毒附着以及膜融合，使其具备感染宿主细胞的能力[1]。弗林蛋白酶对禽流感病毒血凝素和新城疫病毒融合蛋白的切割与病毒毒力高度相关[2]。埃博拉病毒的糖蛋白GP0同样需弗林蛋白酶裂解为GP1/GP2，然后输出到质膜以启动病毒感染[3]。迄今为止，已有包括新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）在内的7种冠状病毒可感染人类并引发疾病。多个研究表明，冠状病毒的刺突蛋白（spike，S）中广泛存在弗林蛋白酶切割位点，其与病毒的细胞入侵、宿主和细胞嗜性以及细胞毒力相关。本文详细综述了弗林蛋白酶生物学特征、切割位点及其对冠状病毒入侵细胞的影响、作为病毒入侵潜在药物靶点的最新进展，以期为弗林蛋白酶在病毒感染中的机制研究以及作为靶点的药物研发提供理论支持。1弗林蛋白酶概述弗林蛋白酶存在于所有脊椎动物与部分无脊椎动物细胞中，为Ⅰ型跨膜蛋白，由794个氨基酸组成，属于枯草杆菌素丝氨酸蛋白酶超家族中的前体蛋白转化酶。弗林蛋白酶定位于高尔基体反面的网状结构，是分泌途径的主要加工酶，可切割多种蛋白，包括病毒包膜糖蛋白、细菌外毒素、受体、激素、生长因子、凝血因子、血清蛋白等的前体。如图1所示，弗林蛋白酶催化结构域中的D153残基对其催化活性有重要影响；N端抑制前肽即使在蛋白水解裂解后，也可阻断弗林蛋白酶的催化活性，需要被降解才能使弗林蛋白酶具有功能活性；P结构域代表可调节前蛋白转换酶结构域；SR683残基则是弗林蛋白酶脱落的蛋白水解位点[4]。弗林蛋白酶对底物的切割具有高度特异性，切割位点为含有成对精氨酸残基的独特多元基序。弗林蛋白酶最小的切割序列是R-X-X-R↓，核心序列的顺序为P6-P5-P3-P4-P3-P2-P1↓P1'P2，可对含有序列基序R-X-[R/X]-R的位点优先识别。其中，P1位和P4位为精氨酸（R），若P4位不是R，则P2及P6位必须为碱性氨基酸才能保证弗林蛋白酶的切割。当P1和P4位均为R时，P2位的碱性氨基酸虽不是必需的，但其会将弗林蛋白酶的切割效率提高10倍左右。若P1'处是疏水或脂肪族氨基酸则会阻碍弗林蛋白酶的切割[5-6]。弗林蛋白酶作用环境的pH以及一些离子的浓度会对弗林蛋白酶的切割效率造成影响。一般pH在6.0~8.5范围时，弗林蛋白酶能保持催化活性。作为Ca2+依赖性蛋白，Ca2+的浓度对弗林蛋白酶的活性也具有一定影响。研究发现，Mg2+可以选择性激活弗林蛋白酶，对于其识别裂解病毒包膜糖蛋白和真核前蛋白具有一定影响，可能会造成病毒包膜糖蛋白的突变。当Mg2+存在时，这种突变增加了细胞对于弗林蛋白酶的易感性，从而使病毒的感染力也相应提高[7]。2弗林蛋白酶对冠状病毒入侵细胞的影响2.1弗林蛋白酶与SARS冠状病毒（SARS coronavirus，SARS-CoV）SARS-CoV的S中不存在弗林蛋白酶切割位点，在插入弗林蛋白酶切割位点后，虽然没有影响SARS-CoV的感染力，但是会提高细胞的融合能力，影响病毒入侵靶细胞的过程[8]。SARS-CoV可以在没有蛋白水解的情况下启动膜融合，并且在S1、S2亚基没有分离的情况下完成构象变化，这可能是由于其缺乏有利的弗林蛋白酶切割位点[9]。Follis等[10]设计了 SARS-CoV的3个突变体，来研究弗林蛋白酶的水解切割是否影响SARS-CoV S介导细胞-细胞融合和病毒感染的能力。通过实验发现，在SARS-CoV S中插入弗林蛋白酶切割位点以后，该突变体产生的糖蛋白增加数倍，插入序列的细胞与细胞的融合能力显著增强。Simmons等[11]进一步证明，在R667和758序列位点引入弗林蛋白酶共有序列时，对细胞融合性的增强更加明显，可见引入弗林蛋白酶切割位点对病毒的影响还与插入的序列位置相关；然而通过萤光素酶基因的表达测定病毒入侵情况时，发现插入了弗林蛋白酶切割位点的病毒与正常病毒的感染力相同，证实插入弗林蛋白酶切割位点对病毒感染力没有影响。弗林蛋白酶对SARS-CoV的影响与插入切割位点的序列位置相关，这也提示了弗林蛋白酶若作为药物靶点，其疗效与其作用的基因序列有关。2.2弗林蛋白酶与中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）研究表明，MERS-CoV具有和SARS-CoV-2相似的弗林蛋白酶切割基序，一些实验证明，弗林蛋白酶切割序列可以增强MERS-CoV的感染力[9]。MERS-CoV的S上有2个弗林蛋白酶的切割位点，均含有RXXR序列。一个位于S2'（RSAR），一个位于S1/S2接口（RSVR），而在MERS-CoV的S1/S2 接口处有类似于SARS-CoV-2的680SPRRAR↓SV687切割基序[12]。Millet和Whittaker[13］的实验发现，用干扰小RNA干扰宿主细胞的弗林蛋白酶，MERS-CoV对宿主细胞的感染力下降。另外，通过引入弗林蛋白酶抑制剂可以减少MERS-CoV S介导的入侵并降低MERS-CoV活病毒与假病毒的感染力。这些研究表明弗林蛋白酶切割识别位点可以提高MERS-CoV对靶细胞的感染力。但也有实验发现，即使MERS-CoV与SARS-CoV-2有着相似的切割基序，弗林蛋白酶对于两者感染力的影响却并不相同[14]。首先，两者的S1/S2位点仍存在不同。SARS-CoV-2的切割位点上游存在精氨酸，而此P3位的精氨酸对于体外切割具有S1/S2位点的底物非常重要。实验发现，如果将精氨酸引入MERS-CoV S1/S2的P3位（RSVR到RRVR），可以显著提高弗林蛋白酶切割速率。同时，MERS-CoV不仅具有弗林蛋白酶的切割位点，它还可被跨膜丝氨酸蛋白酶（transmembrane protease serine，TMPRSS）2识别。TMPRSS2是MERS-CoV感染人体时的靶向分子，且较弗林蛋白酶活性更强。弗林蛋白酶切割S1/S2位点之后，通过TMPRSS2的作用完成S2'的切割。这表明，MERS-CoV的RXXR序列切割位点中可能存在其他影响弗林蛋白酶切割的因素。2.3弗林蛋白酶与SARS-CoV-2SARS-CoV-2具有弗林蛋白酶切割位点，这增强了其对靶细胞的亲和力。SARS-CoV-2的入侵过程与大多数冠状病毒类似，都是通过借助宿主蛋白酶在S上的S1/S2和S2'切割位点进行剪切以激活S。激活后的S有利于S1亚基中的受体结合域（receptor binding domain，RBD）重排以结合宿主细胞的血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）受体，进而转变S2构象来启动膜融合的过程[15]。研究发现，与其他SARS相关冠状病毒不同的是，SARS-CoV-2 S在S1和S2交界处插入了4个氨基酸残基，形成了1个RRAR多碱性弗林蛋白酶切割位点，见图2。这个独特的切割位点使得SARS-CoV-2的RBD与ACE2亲和力发生改变，S1可以改变自身构象来更好地适应宿主受体[16]。SARS-CoV-2进入气道细胞需要弗林蛋白酶裂解，从而实现膜融合[17］。同时，SARS-CoV-2 S RRAR切割位点中最后一个R和S中的R815分别对应SARS-CoV中胰蛋白酶切割位点[18］。这些位点提高了SARS-CoV-2侵染宿主细胞的效率。表面等离子共振实验表明，SARS-CoV-2的RBD与ACE2的解离平衡常数较SARS-CoV小，亲和力更高[19]。另外，Cantuti-Castelvetri等[20]的实验证明，神经磷脂-1与弗林蛋白酶切割位点的底物结合后，能够增强SARS-CoV-2的感染力。这个独特的弗林蛋白酶识别位点可能是导致SARS-CoV-2具有高传染性的重要因素。SARS-CoV-2的S被弗林蛋白酶切割后会产生预激活效应，扩大了病毒的宿主嗜性。这一预激活效应可以与TMPRSS2以及组织蛋白酶B/L切割S1/S2、S2'位点对膜融合的激活效应相累加，降低SARS-CoV-2的膜融合对细胞表面蛋白酶的依赖性，使其在TMPRSS2等蛋白酶表达较低的细胞中也能完成入侵［21］。预激活效应降低了 SARS-CoV-2对于感染靶细胞的选择性。由于弗林蛋白酶在人体的分布范围较TMPRSS2更广，因此SARS-CoV-2的宿主细胞种类更多，这可能是SARS-CoV-2传播能力大于SARS-CoV的原因之一。除高传播性外，弗林蛋白酶可能与SARS-CoV-2致病性密切相关。病理学中，炎症细胞因子在SARS-CoV-2致病过程中发挥了重要作用。研究者纳入SARS-CoV-2感染者和健康对照来探究弗林蛋白酶水平与疾病严重程度和炎症之间的关系，发现弗林蛋白酶会加剧SARS-CoV-2的感染和炎症反应，存在一定的正相关性。弗林蛋白酶可以成为SARS-CoV-2感染者疾病严重程度的预测指标[22］。弗林蛋白酶抑制剂的运用不仅可以直接降低病毒侵染细胞的效率，甚至可以降低病毒合胞体的数量，说明弗林蛋白酶抑制剂具有一定的抗病毒活性[23］。近期研究发现了位于SARS-CoV-2 S的第2个功能性弗林蛋白酶切割位点[24］。当RRAR多碱性弗林蛋白酶切割位点被删除后，弗林蛋白酶仍然增加了 SARS-CoV-2对宿主细胞的感染性。该功能性弗林蛋白酶切割位点的发现为弗林蛋白酶抑制剂的研发提供了新的思路。2.4弗林蛋白酶与其他冠状病毒在冠状病毒家族中，弗林蛋白酶切割位点广泛存在于α和γ属成员上。弗林蛋白酶切割位点为β属冠状病毒S中的重要突变，在大部分β属冠状病毒中并不存在。弗林蛋白酶切割位点的存在可能是SARS-CoV-2的传播能力显著大于SARS-CoV的原因。值得注意的是，在HCoV-NL63这种人冠状病毒中，存在弗林蛋白酶切割位点S2'，而与其蛋白序列同源性达63.8%的HCoV-229E则没有这一位点[25]。弗林蛋白酶对不同冠状病毒的宿主细胞感染力均有一定的影响。在MERS-CoV、鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）等冠状病毒中，弗林蛋白酶切割位点参与扩大宿主与细胞嗜性。在γ属冠状病毒IBV的S2'位点引入弗林蛋白酶切割位点会使其破坏宿主的血脑屏障，增强IBV对于神经元的感染力，引起鸡的脑炎[26]，说明弗林蛋白酶切割S对IBV的致病性有明显的调控作用。同时，鼠肝炎病毒（murine hepatitis virus，MHV）进入靶细胞依赖于溶酶体蛋白酶水解处理的S，而在紧邻融合肽上游的S中插入弗林蛋白酶切割位点后，MHV便不再需要被溶酶体蛋白酶处理即可入侵靶细胞[27]。这说明弗林蛋白酶改变了MHV的入侵途径，影响了其感染力。3弗林蛋白酶作为药物靶点的可能性通过干扰弗林蛋白酶对冠状病毒S的切割过程，可使病毒无法形成S1、S2活性片段，进而阻碍冠状病毒的入侵和膜融合过程。在人体中，弗林蛋白酶的分布范围比TMPRSS2更广，这为弗林蛋白酶抑制剂阻止冠状病毒侵染不同部位宿主细胞提供了可能。在多碱基切割序列的C端和N端的癸酰基上添加1个氯甲基酮基团，通过竞争性抑制可以不可逆地阻断弗林蛋白酶活性。同时细胞实验表明，肽基氯甲基酮可抑制弗林蛋白酶介导的病毒糖蛋白的切割和融合活性，减少病毒产生和细胞病变作用[12]，从而增强宿主细胞抵御病毒的能力，病毒感染率随之下降。肽基氯甲基酮和α-1抗胰蛋白酶抑制剂已被用于体外抑制弗林蛋白酶，而肽基氯甲基酮已被证明可以抑制SARS-CoV-2的加工[28]。纳米颗粒、高效价的弗林蛋白酶抑制剂避免了蛋白质、肽类抑制剂的缺点，是更好的替代品；小分子弗林蛋白酶抑制剂作为治疗药物也拥有广阔前景 [29]。以上对弗林蛋白酶抑制剂的研究为临床治疗应用提供了支撑。4挑战与展望弗林蛋白酶可影响冠状病毒入侵机制，这一发现极大地促进了对冠状病毒复制、致病、免疫应答等机制以及相关药物靶点的研究进展。虽然现有研究已经对弗林蛋白酶切割位点在冠状病毒感染宿主细胞中的作用有了部分明确，但在一些病毒感染的作用机制研究中仍存在争议,需要更进一步的研究。弗林蛋白酶对于SARS-CoV-2入侵宿主细胞有重要影响，其可能是抗SARS-CoV-2治疗的潜在药物靶点。SARS-CoV-2主要感染人体的黏膜细胞，而弗林蛋白酶在人体各种组织和细胞系中广泛存在，如何特异性地抑制SARS-CoV-2的靶细胞中弗林蛋白酶作用，有待进一步研究。弗林蛋白酶的特异性抑制剂仍是今后药物开发的重要研究方向。同时，由于弗林蛋白酶在细胞分泌和内吞途径中负责多种前体蛋白的水解成熟，因此在药物研发过程中要避免某些全身不良反应。以宿主蛋白为靶点进行药物筛选和设计可以有效规避冠状病毒变异快的劣势，弗林蛋白酶具备成为良好的药物靶点的可能，在病毒感染机制和特异性治疗、药物开发等方面有重要的研究价值。作者吕淑娴1 刘可欣1 杨祺凤1 陈昶倚1 黄靖雯1 郑旭2 丁翠玲31海军军医大学基础医学院，上海 200433；2南开大学生命科学学院，天津 300071；3海军军医大学海军医学系生物医学防护教研室，上海 200433通信作者：丁翠玲，Email：cuilingding@163.com；郑旭，Email：764994029@qq.com引用本文：吕淑娴，刘可欣，杨祺凤，等. 弗林蛋白酶切割位点影响冠状病毒细胞入侵的研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(4): 215-219. DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20221031-00075今年是COVID-19大流行趋于稳定后的第一年，人民生活逐渐走向正轨，经济也在缓慢但有力的复苏之中，而各抗体企业也依然在不断奋进、不断突破、不断超越，使抗体领域蓬勃发展，硕果累累。为促进抗体行业的交流与创新，2023年10月14-15日第六届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。会议内容时间：2023年10月14-15日地点：苏州（酒店定向通知）规模：600-800人主办单位：生物制品圈、抗体圈指导单位：康维讯生物、夏尔巴生物会议费用：免费FREE!（仅收取50元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），9月15日报名定金提高到100元，先到先得，报完即止，超过9月20日预登记将收取会议费！报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。日程安排更多嘉宾仍在邀请中。。。。。。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。