Trypsin

-01-引言肥大细胞（MC）是存在于我们体内结缔组织中的髓系细胞，含有具有有效炎症介质的粗颗粒，如组胺。长期以来肥大细胞一直被认为与过敏性和自身免疫性疾病的发病机制有关，然而现在人们认识到肥大细胞对肿瘤细胞和肿瘤微环境行为具有决定性的影响，是抗肿瘤免疫的关键协调器、肿瘤基质的调节剂，并且与癌细胞的内在特性有关。然而，它们的作用仍然存在争议，因为MCs可以在不同的肿瘤类型中发挥促肿瘤或抗肿瘤功能，这取决于它们在肿瘤内或肿瘤周围的位置以及它们与肿瘤微环境其他成分的相互作用。因此，肥大细胞是一个未被充分认识但非常有希望的癌症免疫治疗靶点。-02-一、肥大细胞的生物学MCs是来源于骨髓多能干造血细胞的先天免疫细胞，在血液中循环并迁移到外周组织，在组织特异性趋化因子和细胞因子（如干细胞因子和IL-4）、细胞外基质蛋白和粘附分子的作用下发育并分化为成熟肥大细胞。MC分布在身体的不同区域，如上皮细胞、粘膜、胃肠道、产生粘液的腺体以及神经和血管周围区域。在MC表面有多种受体，一旦被它们的配体触发，可以释放各种不同的因子。这些包括预先形成的分子（组胺、类胰蛋白酶、蛋白酶和蛋白多糖）和新合成的脂质介质（白三烯和前列腺素）、细胞因子（IL-4、TNFα、TGF-β、IL-1β）和趋化因子（IL-18、CCL2、CCL4）。预先形成的介质沉淀在MC细胞质中的大颗粒中。每个MC被赋予大约50-200个颗粒，在适当的刺激下，这些颗粒在几秒钟内被输送到细胞外。这个过程被称为MC脱颗粒。肥大细胞存在两种类型的脱颗粒：过敏性脱颗粒，其中整个颗粒内容物迅速释放到细胞外环境；以及分段脱颗粒，颗粒内容物以更有层次，更具体的方式释放。研究最充分的肥大细胞脱颗粒发生机制是暴露于同源抗原后，高亲和力IgE表面受体FcεRI的抗原特异性IgE交联，导致肥大细胞快速脱颗粒。肥大细胞也可以通过其他机制激活，如通过toll样受体、补体蛋白、细胞因子和其他刺激物的损伤相关和病原体相关分子模式。肥大细胞激活、脱颗粒和/或炎症介质分泌的结果包括其他免疫、基质、神经和上皮细胞的激活或吸引，从而导致局部组织微环境的变化，如血管扩张和血管生成，以及全身免疫反应的激活。肥大细胞活化和/或脱颗粒可能以经典的快速方式发生，导致炎症介质的大量释放和剧烈的临床表现，如过敏反应和血管性水肿。然而，随着特定介质的缓慢释放，这些过程也会逐渐发生，导致慢性炎症和局部组织改变。后一种形式的肥大细胞激活在癌症中尤其重要。-03- 二、癌症中的肥大细胞MC在癌症相关领域得到了越来越多的关注。然而，它们的作用具有两面性，在不同的情况下促进或抑制肿瘤的发展。MCs的促肿瘤功能MC可以支持血管生成、炎症和体内平衡，从而支持癌症的发展。MC还释放类胰蛋白酶和糜蛋白酶等蛋白酶，可激活基质金属蛋白酶，降解细胞外基质和肿瘤周围组织，从而促进肿瘤生长、血管生成和转移。此外，MC释放VEGF、PDGF-β和IL-6，促进血管形成、细胞增殖和肿瘤生长。在胰腺癌患者中，MC在肿瘤病灶内的积聚与预后不良相关。在Myc诱导的β细胞胰腺癌小鼠模型中，当MC脱颗粒受到化学抑制时，肿瘤发展和血管生成减少。MCs的抗肿瘤功能肥大细胞在调节肿瘤进展中的一个关键作用是其作为前哨免疫细胞的作用，其释放趋化因子、细胞因子和其他因子，将其他免疫细胞招募到肿瘤微环境中并改变其功能。肥大细胞释放趋化因子，如CXCL10、CLL3和CCL5，它们将CD8+T细胞和CD4+T细胞招募到肿瘤中，它们可以通过TNF-α分泌进一步调节T细胞活性。肥大细胞分泌的组胺有利于特定的辅助性T细胞亚型或T细胞调节反应，这取决于受刺激的受体。活化的肥大细胞也被证明可以上调MHC-II和共刺激分子，作为T细胞的局部抗原呈递细胞发挥作用。总之，肿瘤、基质和免疫微环境中肥大细胞诱导的抗肿瘤和促肿瘤信号的净平衡决定了肿瘤相关肥大细胞如何影响最终肿瘤生长。正确理解这些因素是如何相互作用的，对于研究相关的肥大细胞生物学以及如何将肥大细胞作为改善癌症预后的最佳治疗选择具有重要意义。-04-三、TME中MC与其他免疫细胞的相互作用MCs还可以调节TME中其他免疫细胞的功能，从而影响局部免疫抑制或抗肿瘤免疫。例如，在小鼠肝癌模型中，已经表明活化的MCs可以通过CCL2/CCR2轴促进髓源性抑制细胞（MDSCs）的浸润及其IL-17的产生，从而在肿瘤部位募集Tregs。此外，MC可以通过CD40L/CD40轴的直接相互作用增加MDSCs的抑制活性。MCs上的CD40L也可以促进产生IL-10的调节性B细胞（Breg）的扩增。另一方面，在结直肠癌中，MC可以切换Tregs的功能，Tregs下调IL-10并开始产生IL-17，从而获得促炎症表型。值得注意的是，MC介导的Tregs和效应T细胞向Th17的偏斜依赖于OX40L/OX40轴和IL-6产生之间的串扰。此外，MC衍生的TNF-α对T细胞活化也很重要。MCs产生骨桥蛋白和表达共刺激分子也促进了CD8+T细胞的活化和增殖。MCs可以通过释放白三烯B4影响效应CD8+T细胞向炎症部位的归巢。在小鼠黑色素瘤模型中，还观察到TLR2激活的MC可以通过分泌高剂量的CCL3来募集NK细胞。除CCL3外，MC分泌的其他因子，如IL-4、IL-12和TNF-α，也能够激活NK细胞。上述相互矛盾的结果表明，根据癌症的分期、癌周或癌内定位以及与TME其他细胞的串扰，MC及其介质可能具有不同的作用。-05-四、靶向肥大细胞的肿瘤免疫治疗由于MC可以根据肿瘤类型、定位和从周围微环境接收的信号发挥促肿瘤或抑肿瘤活性，因此治疗策略可以根据环境来消除或促进MC功能。靶向c-Kit信号由于c-Kit对MC的发育、存活和激活至关重要，因此酪氨酸激酶抑制剂，如伊马替尼、尼洛替尼或达沙替尼，可有效用于靶向肥大细胞增多症、关节炎或过敏反应中的MC。然而，到目前为止，这些药物在抑制MC肿瘤促进功能方面的应用有限。需要强调的是，伊马替尼、尼洛替尼或达沙替尼对c-Kit没有特异性，因为它们也靶向其他激酶受体，如PDGFR、Src和Abl激酶，因此可能具有脱靶作用。为了克服这些限制，已经开发了一种靶向c-Kit的单克隆抗体，barzolvolimab，但迄今为止仅在c-Kit阳性胃肠道肿瘤中进行了测试。稳定MC脱颗粒可以抑制MC脱颗粒的药物，如色甘酸或酮替芬，已被广泛用于治疗过敏反应；其也在实体瘤的不同临床前模型中进行了研究。在甲状腺癌的异种移植小鼠模型中，用色甘酸治疗可显著降低肿瘤细胞的增殖和生长。除了稳定和阻止肥大细胞介质的释放，也可以选择肥大细胞的上游信号通路作为靶点。IgE与FcεRI结合导致FcεRI聚集，然后导致受体酪氨酸激活基序的下游磷酸化，最终释放炎性介质。从肥大细胞诱导的炎症有利于诱导抗肿瘤反应的角度出发，提出了抗肿瘤IgE抗体。尤其是在肥大细胞浸润率高的肿瘤中，与IgG抗体相比，FcεRI的高密度和抗体的更长半衰期使其成为一种有吸引力的治疗方法。在体外研究中，通过肿瘤靶向的人源化单克隆抗HER-2/neu IgE和人源化抗CD20 IgE观察到抗肿瘤肥大细胞脱颗粒和肿瘤细胞生长减少。触发其他激活/抑制受体除了c-Kit和FcεRI外，MC还有大量不同的受体可以调节其在TME中的功能；因此，这些受体可能成为MC特异性抗癌治疗的靶点。MCs中TLRs的刺激可导致特异性细胞因子分泌，从而导致免疫细胞的募集和激活，最终抑制肿瘤生长。事实上，目前正在评估TLR激动剂在癌症治疗中的作用。在B16.F10小鼠黑色素瘤模型中，TLR2激动剂Pam3CSK4诱导MCs释放细胞因子，如IL-6和CCL3，这分别介导了对肿瘤细胞的直接抗增殖作用以及NK和T细胞的募集。其他受体也被证明对MC与免疫抑制细胞的相互作用至关重要，例如CD40L和OX40L。MC还可以通过其表面的PD-L1直接抑制CD8+T细胞活化。因此，MCs可能是肿瘤中免疫检查点阻断治疗的另一个靶点。在胃癌模型中，MC相关PD-L1的抑制导致T细胞活化增加和肿瘤生长的抑制。调节MC招募靶向MC治疗一种可能的策略是通过作用于趋化途径来抑制或增加其募集。除了调节MC成熟、增殖和脱颗粒外，SCF/c-Kit和FcεRI信号传导也可以介导MC迁移。因此，c-Kit、BTK、Syk和PI3K的抑制剂也可以抑制肿瘤中的MC运输。此外，由肿瘤细胞或TME细胞产生的许多其他不同分子可以诱导MC趋化性，包括CCL2、CCL5、CCL11、CCL15、CXCL12、VEGF、FGF2、骨桥蛋白和脂质介质。阻断这些趋化引诱剂可能代表一种治疗策略，以阻碍MC的募集，从而阻碍它们对肿瘤的支持。靶向MC调解剂直接调节肥大细胞介质是改变肥大细胞下游活化的有效方法，包括靶向组胺或组胺受体、类胰蛋白酶等蛋白酶和TNF-α。类胰蛋白酶是肥大细胞活化过程中释放的一种肥大细胞介质，促进血管生成和细胞外基质降解，导致癌症生长、细胞侵袭和转移。Tranilast, nafamostat mesylate和gabexatemesylate是三种肥大细胞类胰蛋白酶抑制剂，临床前已证明其作为单一疗法或与其他癌症疗法联合使用在多种实体瘤中具有抗癌活性，大多数研究集中在胰腺癌、结直肠癌和乳腺癌。TNF-α是另一种肥大细胞介质，长期以来一直与炎症性肠病的发病机制有关，TNF-α抑制剂（如infliximab）是主要的治疗手段。在一项结肠炎研究中，infliximab治疗可显著降低结直肠癌的发病率。在晚期黑色素瘤的I期临床试验（NCT03293784）中，正在研究ipilimumab、nivolumab和TNF-α抗体（infliximab或certolizumab）的三重组合的安全性。过继转移MC人们也已经开始研究MC的体内过继转移，利用MC的抗肿瘤特性进行细胞治疗以对抗癌症。这种方法应考虑重新编程MCs，以便仅在与肿瘤细胞接触时释放抗肿瘤介质，以避免非靶向的分子递送、过敏反应或其他副作用。Fereyoduni等人在这方面进行了首次尝试，他们利用HER2/neu特异性IgE预敏化的MC在体外和体内有效杀死乳腺癌症模型中HER2/neu表达的肿瘤细胞。-06-结语一系列关于实体瘤的临床前研究数据强烈表明，肥大细胞是抗肿瘤免疫和癌症预后的关键决定因素。肥大细胞可能是抗肿瘤免疫反应的关键协调器，但也存在抵抗免疫检查点阻断以及其他癌症治疗的机制。随着肥大细胞靶向疗法在过敏性疾病中的应用和研究日益增多，其在癌症免疫治疗中的应用呈现出令人兴奋的前景。参考资料：1.Mast Cells: A New Frontier for CancerImmunotherapy. Cells.2021 Jun; 10(6): 1270.2. Frenemies in the Microenvironment: Harnessing Mast Cells for Cancer Immunotherapy. Pharmaceutics.2023 Jun 9;15(6):1692.公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

这篇文章于2025年发表在Stem Cell Reviews and Reports，全面评估了临床级MSC可扩展生产的自动化制造工艺和平台。摘要：     间充质干细胞/基质细胞（MSC）具有卓越的再生和免疫调节特性，因此在再生医学方面具有巨大的潜力。然而，它们的治疗应用需要在严格的监管标准和良好生产规范（GMP）指南下进行大规模生产，这带来了重大挑战。本综述全面评估了临床级MSC可扩展生产的自动化制造工艺和平台。分析了各种大型培养容器，包括多层培养瓶和生物反应器，它们在MSC扩增中的功效。此外，还回顾和比较了自动化MSCs生产平台，如Quantum®细胞扩增系统、CliniMACSProdigy®、NANT001/XL、CellQualia™、Cocoon®平台和Xuri™细胞扩增系统W25。我们还强调了优化培养基的重要性，特别强调从胎牛血清转向人源化或无血清替代品，以满足GMP标准。此外，还讨论了替代冷冻保存方法和控速冷冻系统的进展，这些方法为MSC保存提供了有希望的改进。总之，推进自动化制造工艺和平台对于实现基于MSC的再生医学的全部潜力和满足对基于细胞的疗法日益增长的需求至关重要。强调涉及行业、学术界和监管机构的合作举措，以加速基于MSC的疗法向临床实践的转化。1.背景介绍     间充质干细胞/基质细胞（MSC）是一种存在于各种组织中的多能成体干细胞，包括骨髓、脂肪组织和脐带。它们具有显着的自我更新和分化能力，使它们能够产生各种细胞类型，如成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞。此外，MSC分泌多种生物活性分子，包括生长因子、细胞因子和细胞外囊泡，有助于组织修复和再生。这些旁分泌因子发挥抗炎、抗凋亡和促血管生成作用，促进各种损伤和疾病的组织愈合。此外，使MSC对治疗应用具有吸引力的关键特征之一是其免疫调节特性。MSC已被证明可以通过抑制各种免疫细胞（包括T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞）的增殖和功能来抑制免疫反应。这种免疫调节作用使MSC成为治疗各种自身免疫性疾病、移植物抗宿主病（GVHD）和炎症综合征的有希望的候选者。因此，MSC为再生医学、组织工程和自身免疫性疾病的治疗提供了一条有前途的途径，因此在解决未满足的医疗需求方面具有巨大潜力。     由于MSC的生产被视为ATMP（先进疗法药品），因此其应用由特定的监管框架控制。MSC生产需要符合当前良好生产规范（GMP）标准的大规模细胞扩增系统。GMP指南是由政府监管机构制定的严格法规，例如美国的食品药品监督管理局（FDA）或欧洲药品管理局（EMA），旨在确保药品（包括基于MSC的产品）的质量、安全性和有效性。考虑到基于MSC的疗法涉及事后无法过滤或灭菌的活细胞的给药，MSC生产的首要GMP先决条件是具有受控无菌和多级无菌保护解决方案的环境。洁净室设施、无菌防护服、层流罩和封闭培养系统共同参与其中，以限制空气中的颗粒数量并避免最终产品受到污染。最后但并非最不重要的一点是，训练有素、组织有序、了解制造过程的员工对于不伤害患者也很重要。      基于MSC的疗法的生产过程包括供体和MSC来源选择、细胞分离和扩增、质量控制以及扩增细胞的进一步移植等步骤。将MSC用于治疗目的的关键挑战之一是能够在保持其特性和功能特性的同时大量扩增它们。一般来说，天然组织和收集的生物材料中MSCs的初始频率非常低——据报道，骨髓中每104-105个单核细胞或脂肪抽吸物中每102-103个细胞中MSC少于或大约1个。传统的MSC体外扩增至临床相关产量（数百万至数亿个细胞）通常非常耗时、劳动密集型，并且需要大量的培养箱空间。因此，它不仅效率低下，而且还可能损害扩增的MSC的质量。重要的是，以前的研究报道了MSC在晚期传代中的增殖和分化能力下降。      MSC制造过程的另一个组成部分是最终产品的质量控制。这包括细胞活力、表型标志物、分化潜能和无微生物污染的检测，以评估制造细胞产品的纯度、特性、效力和安全性。根据国际细胞治疗学会（ISCT）的规定，MSC必须满足以下方面：（I）塑性粘附性，（II）CD105、CD73和CD90等分化簇（CD）分子表达阳性，缺乏CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α和人类白细胞抗原（HLA）-DR的表达，（III）在体外分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞[9].然而，为了确保MSC的安全性和功能性，应进行免疫调节活性和基因组稳定性的额外测试。2.MSC生产平台     大规模生产临床级MSC的生物工艺策略是一个复杂的过程，对封闭和无菌环境有很高的要求。因此，MSC加工必须在符合GMP的专用设施中进行，以最大限度地降低物理屏障和空气过滤污染的风险。为了响应该领域的客户需求，一些制造商正在开发和引入用于自动和密闭细胞培养的新技术，例如量子®细胞扩增系统（TerumoBCT）、CliniMACSProdigy®（MiltenyiBiotec）、NANT001/NANTXL系统（VivaBioCell）、CellQualia™（Sinfonia技术）、Cocoon®平台（Lonza）或Xuri™细胞扩增系统W25（Cytiva）（图1）.生物反应器的利用在扩大基于细胞的疗法的可及性方面具有巨大潜力，特别是对于缺乏现场GMP合规实验室的中心。这些生物反应器为细胞培养和扩增提供了受控的环境，确保了细胞生产过程的一致性、可重复性和质量。通过使用生物反应器，没有GMP设施的中心仍然可以生产临床级细胞，从而将基于细胞的治疗范围扩大到更多患者。图1：大规模生产临床级间充质干细胞/基质细胞（MSC）的生物加工策略的复杂概述。MSC扩增平台（Quantum®细胞扩增系统、CliniMACSProdigy®、NANT001/XL、CellQualia™、Cocoon®平台和Xuri™细胞扩增系统W25）需要以下输入：样品或分离的细胞、培养基、洗涤试剂（磷酸盐缓冲盐水）、解离试剂（胰蛋白酶、TrypLE）和可选添加剂。细胞收获、质量控制（最终产品的纯度、特性、效力和安全性）、冷冻保存和产品配方等下游工艺也是临床级MSC生产的重要组成部分。     Terumo-BCT开发的量子®细胞扩增系统代表了一种利用中空纤维生物反应器的自动和闭式细胞培养的替代策略。此外，该设备以适合细胞培养过程的速率提供连续的培养基更换。生物反应器本身的面积为21,000cm2，相当于120个T-175培养瓶。值得注意的是，在细胞接种前，该生物反应器的中空纤维必须涂有粘合基材，如纤连蛋白、波形蛋白或冷沉淀物（通常来自多个供体的血液）。迄今为止，已有多达25项实验研究测试了Quantum®细胞扩增系统用于成人MSC扩增，使其成为贴壁细胞使用最广泛的生物反应器系统。此外，在比较脂肪组织来源的MSC（AT-MSC）的产量和群体倍增时，Quantum®优于基于培养瓶的手动培养，因此适用于大规模生产。此外，用人血小板裂解物（hPL）取代胎牛血清（FBS）作为生长补充剂，可显著增强AT-MSC在Quantum®内的扩增，同时保持其质量。例如，以20×106的密度加载到Quantum®中，来自骨髓的解冻MSC（BM-MSC）（在第2代）（在第2代）扩增7天，产量为100–276×106。此外，几项研究表明，能够在体外抑制T淋巴细胞活化的量子®扩增BM-MSC可以保持免疫调节功能。此外，Quantum®系统可以直接连接到任何气体及其组合，从而提供常氧或低氧微环境。Hanley等人观察到，与Quantum®和缺氧扩增的BM-MSC相比，培养瓶和常氧培养的BM-MSC的生产率较低。另一方面，加强对乳酸和葡萄糖水平的监测，再加上Quantum®生物反应器内新鲜培养基的持续供应，很可能促进了卓越的存活率和整体生长。通常，与基于培养瓶的增殖相比，Quantum®减少了所需的传代次数（减少到一半）和开放作（从54400个步骤减少到133个步骤）。此外，他们的研究还声称量子®扩增BM-MSCs在缺血性卒中大鼠模型中的治疗效果。另一项研究揭示了源自脐带组织（UC-MSC）的Quantum®制造的MSC和移植到诱导膝关节关节表面缺损小鼠身上的BM-MSC的愈合能力。采用Quantum®生物反应器系统的临床试验探索了GVHD、2型糖尿病、帕金森病、高级别神经胶质瘤、缺血性心脏病、中风和急性呼吸窘迫综合征等疾病的治疗方法。利用各种MSC类型，包括BM-MSC、AT-MSC或神经MSC，这些试验证明了使用Quantum®系统在不同剂量和给药途径下产生的细胞的安全性、耐受性和有效性。  来自MiltenyiBiotec的CliniMACSProdigy®设备利用ACC（贴壁细胞培养）工艺和适当的管路组（TS730），可实现自动MSC分离（通过骨髓样本的密度梯度离心）、接种、培养、培养基更换、繁殖和收获。Godthardt等人展示了该系统的大规模和临床级效率以及特定MSC-BrewGMP培养基的使用。此外，他们声称原代组织分离的BM-MSC以及AT-MSC或UC-MSC的单细胞悬液可以由CliniMACSProdigy®处理。此外，据报道，使用1层CellSTACK®的10天程序能够产生100多个集落，由29至5000万个MSC（第零代–P0）组成，这些集落是从马电针动员的外周血样本中分离出来的。分离的MSC具有特征性的成纤维细胞样形态和MSC表型特征。重要的是，与手动方案相比，Prodigy系统在P0收获的MSC数量显著更高，并且通过随后的手动传代提高了纯度，P3中CD73、CD90和CD105的阳性率达到95%。在制造商研究中，人骨髓单核细胞最初接种在1层CellSTACK®腔室中。然后在CliniMACSProdigy®系统内使用MSC-BrewGMP培养基洗涤、培养和扩增这些细胞，并将其扩增成三个5层CellSTACK®腔室。为了进行比较，使用T175培养瓶进行手动扩增过程。扩增14天后，CliniMACSProdigy®系统产生3.8×10⁸个BM-MSC（第2代），而手动过程在同一传代下产生4.5×10⁸个细胞，表明自动和手动方法之间的细胞数量相似。然而，平台复杂性和高耗材价格使CliniMACSProdigy®成为昂贵的制造选择，尤其是对于小规模MSC增殖。     NANT001或XL系统提供了另一个平台，在XL系统的情况下，包含一个CellSTACK®（636cm2）或两个互连的细胞培养容器（T-175和3180cm2的5层培养瓶）。与CliniMACSProdigy®不同，该系统不需要外部培养箱。另一方面，它的产能较低，但足以满足中小批量的自体生产。此外，它还允许对过程控制信息（例如温度、pH值、汇合度和细胞分离）进行智能和远程监控。NANTCartridge是一个封闭系统，由四个通过无菌连接器易于连接的部分组成[23]。Fitzgerald等人测试了NANT001系统在符合GMP的要求下生产来自健康供体的自体AT-MSC的效率。手动和自动过程同时进行，将加工后的基质血管组分（SVF）的细胞以4,000个细胞/cm2的密度放入一个636cm2的CellSTACK®培养室中。总体积为150mL的培养基由补充有5%hPL和1U/mL肝素的最低必需培养基（α-MEM）的α改良型组成。用150mL磷酸盐缓冲盐水洗涤培养样品，然后在第1天、第3天和50%汇合时更换培养基。在达到90%汇合度24小时后，用50mL重组TrypLE溶液收获扩增的细胞。来自三次验证运行的数据显示，分别持续6-8天和7-9天的手动和自动过程的细胞产量（平均2.7×107）和活力（>90%）相当。此外，两种扩增的AT-MSC都具有MSC表型特征以及与脂肪细胞和骨细胞相似的分化能力。      CellQualia™代表了另一个由Sinfonia技术设计的智能细胞处理系统。该系统使用两个细胞培养单元以及从1层到5层（CellSTACK）®和36层（HYPERStack®）腔室的自动传代，实现MSC的紧密和自动化生产。分析技术的内置过程通过对自动采集的样品进行在线（温度、CO2、形态、pH、葡萄糖和乳酸）和离线分析，确保高水平的质量控制。通过监测乳酸水平随时间的变化，可以间接评估细胞生长和增殖动力学。一旦乳酸水平达到表明最佳细胞密度的某个阈值，系统就会表明需要自动传代。此外，犬尿氨酸的积累和低水平2-氨基己二酸的维持表明细胞在整个过程中保持未分化状态。Hosoya等人证实了CellQualia™连续繁殖的MSC的塑料粘附和表型特征，这些MSC对MSC特异性标志物CD105、CD73和CD90呈阳性。然而，该研究缺乏对MSCs阴性标志物及其分化能力的评估。从2×10开始，该公司表示，在培养2次传代和6天后，MSC产量相当于1×108个细胞。     Lonza推出的Cocoon®平台旨在满足自体（患者规模）细胞疗法的生产要求。该系统使用封闭的一次性盒，为培养锚依赖性或独立细胞提供平面或体积空间。在包埋盒内，热障将温暖和寒冷区域分开，确保细胞培养（37°C）和试剂储存（4°C）的最佳条件。此外，该盒还配备了pH和溶解氧传感器，可在制造过程中实时记录数据。该平台是可定制的，易于使用，并且需要最少的作员干预，但是，目前其广泛的实施尚不清楚。     由Cytiva开发的Xuri™细胞扩增系统W25代表了细胞治疗生物工艺的飞跃。该系统采用单向WAVE™摇摆技术和各种培养体积（从300mL到25L），适用于小规模研究或大规模临床生产。WAVE™技术提供的轻柔摇动运动增强了营养物质的分布和气体交换，这是维持最佳细胞生长和活力的关键因素。专为免疫治疗中不依赖贴壁的细胞（嵌合抗原受体T细胞）的可扩展扩增而设计，但也可以参与微载体上的MSC生产。Silva等人在小体积接种到2L细胞袋的CultiSpher-S微载体上进行了UC-MSC的扩增，并在最初的24小时内保持静止。之后，在600mL培养基中的摇摆培养物中扩增UC-MSC。总体而言，该系统产生的膨胀系数范围为12.3至24.8。重要的是，摇摆培养中采用的动态条件不会对扩增细胞的质量产生负面影响，这通过各种质量控制措施（包括活力、表型保留和分化潜力）得到验证。有趣的是，另一项研究发现，在摇摆生物反应器中自发产生的MSCs聚集体表现出增加的干性、迁移特性和血管生成因子表达，从而提供了更高的治疗潜力。总体而言，Xuri™细胞扩增系统W25是一种多功能且高效的MSC扩增工具，为研究和临床应用提供了可靠的解决方案。3.细胞培养容器的放大    多层培养瓶是大规模MSC生产的重要组成部分，与传统使用的T-25、T-75和T-175培养瓶相比，其表面积更大（表1），从而减少了MSC的广泛传代培养。通常，放大涉及使用更大的生物反应器来提高生产能力，需要进行大量优化以保持更大体积的细胞质量。相比之下，横向扩展通过添加更多相同大小的生物反应器来扩大容量，确保各单元的条件一致，但需要更多的空间和资源。在放大和横向扩展之间进行选择取决于生产目标、预算和保持细胞一致性的能力等因素。如今，多层培养瓶是最有效的大规模策略之一，据报道其扩增率为100倍甚至更高。另一方面，随着细胞培养过程扩大到更大的容器尺寸，在整个生产过程中保持无菌和均一的培养环境变得越来越具有挑战性。表1.Corning和ThermoFisher不同多层培养瓶的生长面积   CellSTACK®多层培养瓶（Corning）和Nunc™CellFactory™系统（ThermoFisher）就是此类容器的示例，它们由堆叠在一起的多层细胞培养表面组成。它们都有5种尺寸，从1到40层不等，每层提供636厘米和632厘米的生长面积2。据报道，对于2室CellSTACK®，在5天的培养过程中，最终细胞产量为2.84×108（WJ-MSCs（沃顿氏果冻-MSCs）和4.69–5.65×107（BM-MSCs）。比较这两项独立研究，初始接种的细胞数量存在显着差异，范围为1000至4000个细胞/cm2，导致计算的扩增率存在195.28倍和9.22-11.10倍的巨大差异。同样，两位独立作者使用4室Nunc™CellFactory™在收获时获得了不同的细胞产量，对应于扩增的BM-MSC×7.8×108和2.5108。最后，在5腔CellSTACK®中培养牙髓来源的MSC（DP-MSC）11天，分别产生3.2×108个细胞在补充FBS和hPL的培养基中培养的108个细胞。总体而言，接种密度、培养基、某些添加剂和培养时间等细胞培养参数会影响给定系统的细胞产量。此外，康宁的CellBIND®表面处理通过增加聚苯乙烯细胞培养容器的亲水性来增强细胞粘附和生长，使其更有利于多种细胞类型。这种处理确保了一致、稳健的细胞培养条件，这对无血清或低血清培养基应用特别有益。  HYPERFlask®和HYPERStack®容器采用独特的细胞-介质环境气体交换技术，通过透气材料消除容器内的内部顶部空间。在补充有15%人AB血清的α-MEM中，以2×103个细胞/cm2的浓度接种10层HYPERFlask®（1720cm2）（共3.44×106个细胞）中，从人脐带基质（UCM-MSCs）衍生的扩增MSC能够在培养11天后产生4.5×107个细胞，相当于12.99的扩增率。HYPERStack®由Stackettes组成–一个单独的细胞培养室，由顶板和透气膜组成。每个Stackette拥有500cm2的生长面积，它们通过两个（液体和空气）歧管互连，形成一个模块，每个Stackette之间有一个露天气管空间。因此，HYPERStack®的12层和36层模块（相当于6000和18000cm2）具有与传统的2层和10层堆叠培养容器相同的体积占地面积。从而最大限度地减少培养空间，同时满足培养细胞的代谢需求。Sherman等人进行的初步数据显示，以3×103个细胞/cm2的密度接种BM-MSCs扩增5天后，可以®产生8.7亿个细胞的平均收获产量（扩增比为16.11）。      康宁®CellCube®系统为贴壁细胞培养提供了一个新颖、稳定且可扩展的平台。其模块化设计由平行的10、25或100个聚苯乙烯板组成，可在紧凑的占地面积中提供8500至85000cm2的大生长表面积。在CellCube®系统内，在每个培养板的两侧接种和培养细胞，使培养空间加倍。接种过程需要优化贴壁时间和系统的多次垂直旋转，以均匀接种细胞。此外，内置蠕动泵和一次性生物反应器可确保高效的连续流体再循环，以实现最佳的气体和营养物质输送。CellCube®系统的这种基于灌注的设计创造了一个与体内条件非常相似的环境，从而提高了细胞生产率。提供的信息概述了HEK293T和Vero细胞培养物在100层CellCube®模块中的成功扩增，展示了对培养条件的严格控制以及使用代谢物分析来确定收获时间。HEK293T和Vero细胞培养物均能有效扩增，分别×10个10个细胞的产量达到1.4和1.1。4.优化MSC生产：利用符合GMP要求的血清和无血清培养基     工艺验证是药物开发中的关键步骤，在此期间，必须仔细评估可能危及产品安全性的培养基、添加剂和材料的使用。例如，使用动物源性添加剂存在病原体传播的风险，需要进行彻底的风险分析并考虑替代添加剂。选择合适的培养基对于MSC的扩增和质量是必不可少的，尤其是在临床目的的大规模生产中。FBS作为富含生长因子和营养物质的天然补充剂，在许多实验室应用中用于细胞体外扩增，有着悠久的历史。然而，使用FBS培养旨在进一步用于治疗应用的MSC会带来重大风险，这主要是由于牛病毒、朊病毒和人畜共患病原体的潜在污染，这些物质可能会引发人类的免疫反应。在GMP级MSC生产中，利用经验证的FBS彻底检查免疫调节剂的存在，对于维持质量标准至关重要。γ辐照处理被认为是防止FBS中病毒污染的最佳方法之一，它与GMP流程一致。然而，采用无异种成分（xeno）的培养基，如富含人源物质的含血清培养基或无血清和无异种成分的培养基（SXFM），是符合GMP要求的MSC生产的最佳选择。将人类成分而不是动物衍生物加入培养基中，可确保符合细胞扩增过程的GMP指南。目前，包括人血清、脐带血血清、富血小板血浆和hPL的人源化补充剂被用作FBS的替代品（表2）。尽管自体人血清是MSC扩增的最佳选择，但获得足以产生临床相关量MSC的血清将具有挑战性。然而，来自多个供体的混合同种异体人血清可能有助于克服这一限制并促进MSC的大规模生产。尽管如此，人源补充剂（例如自体人血清）还有下一个显着的缺点，即从一个批次到另一个批次观察到的显着差异。尽管这些变化可以通过每批生产大型供体库来减轻，但它们同时也增加了可能因人类病毒而引起的感染风险。因此，这些障碍可能对大规模临床试验中MSCs的充分扩增和相关治疗效果构成重大挑战。     为了在不使用任何动物产品的情况下获得安全的人类产品，研究人员使用psoralen或核黄素灭活的hPL作为FBS的替代品，验证了在GMP条件下生产MSC。这种方法保留了MSC的多能和免疫调节能力。Mareschi等人使用hPL而不是FBS从5个骨髓样本中分离MSC。他们研究了一种新的hPL生产方法，该方法涉及用Ca-Gluconate处理血小板池以形成凝胶凝块，然后机械挤压以释放生长因子。将通过冻融循环和添加肝素获得的标准hPL（hPL-E）与新的hPL（hPL-S）没有血小板或纤维蛋白原，但含有相似数量的蛋白质和生长因子。hPL-S需要更少的生产步骤来符合GMP条件，保持干细胞标志物，并显示出显着差异，例如HLA-DR表达较低，使其成为MSC生产的有效替代方案。目前，有几种市售的病毒灭活GMPhPL以及最终的商业产品，如人血小板裂解物（生命科学生产）、血小板裂解物MultiPLi（Macopharma）和PLUS™GMP级（CompassBiomedicalInc）。此外，与hPL相关的污染风险得到有效管理。例如，自2018年以来，法国的所有血小板浓缩物都经过补骨脂素处理，以降低微生物污染的风险。另一种消除潜在病原体的方法是在使用hPL之前对其进行伽马射线照射[57]。然而，与hPL产品生产相关的一个重大限制是必须确保血小板供体的充足供应。管理符合GMP的培养基的补充选择是使用合成的、化学成分明确的培养基，例如BDMosaic™间充质干细胞无血清（BDBiosciences）、MesenCult-XF™（StemCellTechnologies）、MSCNutriStem®XF（生物工业）、无血清成分确定的细胞培养物（TNCBioBV）等。上述培养基的成分仅由已知化合物组成，使其成为FBS的潜在可取替代品。尽管如此，它们特别适用于研究目的，因为它们需要不断开发和改进以维持关键的细胞功能，例如粘附、分化、免疫调节和其他基本过程。用于优化和可重复的MSC生产的下一组培养基是具有高质量成分的无血清、无异种成分配方，例如MSC-BrewGMP培养基（MiltenyiBiotec）和StemProMSCSFMXenoFree™（Invitrogen）等。然而，化学成分明确的培养基的一个关键限制是由于缺乏附着因子，MSC增殖缓慢或有限，以及细胞对底物的粘附不足。因此，使用某些培养基需要在塑料表面预涂特定物质，以确保最佳的细胞附着和生长。另一方面，补充人血浆衍生物的StemProMSCSFM™（LifeTechnologies）等培养基对于无包被的MSC培养来说并不是最佳。MSC-BrewGMP培养基（MiltenyiBiotec）是市场上唯一一种符合GMP要求的SXFM，因为它是袋装的，用于封闭系统培养，不需要表面涂层。最常用的分子，如纤连蛋白、层粘连蛋白和肽，用于表面改性，通过引入正表面电荷来促进细胞生长，从而增强粘附力。表2：用于 GMP 级 MSC 生产的培养基     比较补充动物或人血清的不同培养基类型与无血清培养基（SFM）的效果，可得出对MSC特性的显著结果。Dreher等人证明，与在10%FBS中培养的AT-MSC相比，在补充有10%人血清的培养基中培养的AT-MSC在应用后在非肥胖糖尿病免疫缺陷小鼠肺和肝脏中的存在减少。总之，在人血清存在下培养的AT-MSC在特异性粘附和细胞外基质相关分子的下调方面表现出有趣的变化。他们认为整合素α6（CD49f）表达的降低可能与对层粘连蛋白的粘附减少有关。尽管如此，减少间充质干细胞在肺部的滞留可能会降低肺栓塞的风险。细胞扩增培养基的选择在影响MSC的增殖动力学等特性方面起着关键作用。多项实验研究揭示了各种培养基类型对MSC特性和培养动力学的显着影响。Wuchter等人进行了一项比较分析，研究了三种符合GMP的培养基对MSC扩增的影响：补充有10%混合hPL的基础培养基（Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）-低葡萄糖）、StemPro®MSCSFMCTS（Invitrogen）（用于人离体组织和细胞培养加工应用）和补充有10%FBS的非XFMSCGM™（Lonza）（仅供研究应用）。最显着的差异出现在延长培养（50天）后BM-MSCs的大小和增殖动力学。StemPro®MSCSFMCTS显著促进了生长，与其他MSC相比，产生的MSC具有更小但高度均匀的形态。在hPL培养基中培养的BM-MSCs表现出明显的突起，但与在含有FCS的MSCGM™中培养的BM-MSC相比更小。然而，与在MSCGM™中培养相比，用hPL培养基培养的MSC观察到的生长增加略大。血小板裂解物对MSCs扩增的促进也与其他研究的结果一致。此外，Poloni等人证明，在含有10%混合同种异体人血清的Iscove改良Dulbecco培养基中培养的CD271阳性BM-MSC与在补充动物血清的培养基中培养的培养基相比，表现出相当的分化能力以及表面和基因标志物的表达。此外，未观察到核型改变。他们还证明，使用CD271选择的细胞和混合的同种异体人血清，仅30天内从5mLBM抽吸物中细胞产生显着增加到临床显着水平（10×10^8MSC）[66]。此外，SFM的使用也对MSC的特性产生了显着影响。例如，PRIME-XVSFM（IrvineScientific）已被证明可以增强人BM-MSC中的集落形成能力，提高成骨潜力，并增加群体倍增。因此，它是动物血清的优质替代品。尽管基于FBS的培养基和PRIME-XVSFM的渗透压相似（分别为0.31和0.29Osmol/kg），但SFM更接近人类生理条件，因此被认为对细胞有更好的影响。此外，Aussel等人证明，SXFM，特别是MSC-BrewGMP培养基（MiltenyiBiotec），显著影响MSC的克隆形成效率。具体来说，与传统的AT-MSC和BM-MSChPL培养基相比，SXFM条件下的菌落大小和密度增加。     值得注意的是，用于收获和分离用于临床应用的MSC的其他补充试剂也必须满足所有安全标准。目前，大多数临床研究使用猪来源的胰蛋白酶进行细胞分离制备。然而，为了优化该程序，使用TrypLE（Gibco，ThermoFisherScientific）或TrypZean（Sigma-Aldrich）等重组胰蛋白酶是有利的，因为它们对细胞的影响更温和，并且与猪来源的胰蛋白酶相比不存在异种蛋白。对于GMP条件下的酶组织消化，建议使用GMP级胶原酶而不是I型胶原酶，因为后者可能含有可能携带传染源的成分。出于这些目的，例如，源自溶组织梭菌的胶原酶NB6GMP级（NordmarkBiochemicals）是一种用于分离干细胞的高纯度组织解离酶。它包含具有酶活性的蛋白质，包括I类和II类胶原酶、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶。0.4PZU/mL胶原酶NB6的最佳浓度和3h的消化时间表明，在第0代时，沃顿胶溶胶衍生的MSC产量更高。此外，其他类型的胶原酶也用于组织消化：CLSAFA（Worthington）和LiberaseMTF-SGMPGRADE（Roche）。另一方面，胰蛋白酶和胶原酶的另一种替代替代品是Accutase（Life Technologies），它是蛋白水解酶和胶原水解酶的混合物。然而，离心、过滤或微碎裂等机械作提供了避免与胶原酶使用相关的安全问题的替代方法。根据迄今为止收集的数据，来自骨髓、脂肪组织和脐带的MSC是临床试验中最常用的细胞来源。然而，AT-MSC在大规模生产中具有优势，因为与来自同一供体的BM-MSC相比，AT-MSC在长时间培养过程中具有增强的遗传和形态稳定性，并且增殖更快。此外，AT-MSCs在25次传代后表现出分化潜能降低，而BM-MSCs的免疫抑制作用仅在7次传代后观察到下降。5.临床条件下MSC的冷冻保存     细胞或组织在细胞疗法中的应用导致了治疗获得性或遗传性疾病的新型药物的诞生。这些是已知的ATMP，被定义为主要生物作用由细胞或组织执行的治疗产品。冻存保存仍然是延长细胞（包括MSC）保存时间的唯一技术。它有助于维持细胞功能特性，并允许细胞聚集以达到临床使用所需的数量。与成骨细胞和软骨细胞等特殊细胞的冷冻保存相比，MSC必须考虑更多因素。具体来说，评估MSC冷冻保存后的免疫调节和多系分化能力、细胞活力和表型至关重要。如果这些能力受损，MSC可能无法保持原有的免疫调节和再生特性。冷冻保护剂      冷冻保护剂是能够防止生物物体遭受冰冻损伤并确保其解冻后存活的试剂。冷冻保护剂在冷冻过程中的保护作用基于它们与细胞内外的水分子形成牢固键的能力，这比水分子本身之间的键更强。此外，它们还可以降低盐浓度，最大限度地降低破坏细胞蛋白质结构的风险。低温保护剂还与膜的结构部件粘合，保护它们免受冰晶的损坏（图2）。图2：细胞冻存机制作为基于细胞的疗法生产的关键步骤。在冷冻保存过程中导致细胞损伤的过程涉及特定的机制。为了防止这种伤害，必须在细胞悬液中添加适量的适当冷冻保护剂（CPA）并应用最佳冷却速率。      已经开发了各种技术来冷冻保存MSC，例如慢速冷冻和玻璃化。但是，这些方法有局限性。首先，即使使用冷冻保护剂（CPA），使用这些方法保存的MSC仍然存在冷冻损伤的风险。其次，二甲基亚砜（DMSO）等CPA可能会无意中诱导MSC分化为神经元样细胞。为了解决这些问题，需要优化CPA的使用或开发新的冻存方法。微/纳米技术的最新进展提供了有希望的改进，有可能提高冷冻保存的效率并克服当前方法的局限性。在高度疏水性的纳米粗糙表面上冷冻封装在纳升液滴中的细胞以及创建无毒的纳米级生物启发CPA等创新是该领域特别有前途的进展。     已建立的MSC冻存方案使用DMSO。残留的痕量DMSO，即使在洗涤步骤之后，也会对患者造成重大不良反应的风险。此外，DMSO与异常基因表达和MSC分化有关。因此，开发一种不含DMSO的MSC冻存方法是非常可取的。海藻糖、植物蛋白和防冻蛋白模拟物等物质已与降低浓度的DMSO相结合，以改善MSC冻存。这些组合成功地抑制了冰的再结晶，并保护了细胞膜，类似于天然防冻蛋白。目前有几种市售的冷冻保存选项用于MSC的冷冻保存。     CryoStor®CS2、CS5和CS10是市售的GMP级冻存培养基，设计用于优化细胞和组织在−80°C至−196°C的超低温环境中的保存。这些制剂在冷冻、储存和解冻过程中提供保护环境，增强细胞活力和功能，同时无需血清和高细胞毒性试剂。CryoStor专门处理细胞的分子生物学方面，减少冻存诱导的延迟性细胞死亡，从而提高解冻后活力，特别是对于MSC和肝细胞等敏感细胞类型。该产品线包括CryoStorCS2（2%DMSO）、CS5（5%DMSO）和CS10（10%DMSO）。冻存过程涉及关键步骤。最初，通过机械或酶解离制备细胞，然后离心以产生细胞沉淀。去除上清液，同时尽量减少培养基稀释。然后加入CryoStor冷培养基，使其浓度达到0.5-10×10^6个细胞/ml，在2-8°C下孵育约10分钟。以每分钟-1°C的受控速率将温度降低到-80°C，在此温度下保持15-20分钟，然后在-5°C左右开始冰成核，从而开始成核。或者，样品可以在−20°C下保存2小时，然后在−80°C下保存。冷冻后，它们可以在低于-130°C的液氮中储存，或在-80°C的温度下短期储存。解冻至关重要，应在37°C水浴中迅速解冻。解冻后，细胞-CryoStor混合物需要用培养基在20–37°C下稀释。解冻后活力应在24小时后使用活/死荧光测定或MTT等代谢测定进行评估，以仔细比较与非冷冻对照的准确性。      Ho等人提出了一项研究，其中犬AT-MSC被修饰为过表达治疗性转基因，用CryoStor10冷冻保存长达11个月。结果表明，冻存不会影响转基因表达、细胞活力或迁移能力。值得注意的是，解冻的MSC表现出与新鲜MSC相当的细胞毒性，可有效治疗患有癌症的犬患者，并导致超过20个月的无进展生存期，突出了冻存MSC在临床应用中的可行性。此外，将马MSC冷冻保存在CryoStor®CS10中，并评估其在小马体内的活力。Williams等人的研究涉及在模拟冷藏运输后和解冻后立即通过静脉注射这些MSC，并监测临床和血液学变化。结果显示没有不良反应或血液参数偏差。注射后CD4+和CD8+淋巴细胞群增加，表明可能存在免疫反应。CS10有效地维持了MSCs的活力。有必要进一步研究以探索与不同MSCs供体的免疫相互作用。      最近的一篇论文比较了两种冷冻保护剂：STEM-CELLBANKER™（CB）和10%DMSO，均在无异种成分培养基中，用于AT-MSC和BM-MSC。与非冻存MSC相比，两种冻存保护剂都保持了相似的细胞形态和表面标志物表达。然而，冷冻保存的AT-MSC与CB（90.4%）相比于DMSO（79.9%）具有更好的活力。虽然在CB和非冻存条件下，AT-MSC的群体倍增时间相当，但使用DMSO时略有增加。BM-MSC显示两种冷冻保护剂的倍增时间更长。重要的是，两种MSC类型在冷冻保存后都保留了其分化能力。总之，CB比DMSO更能保持AT-MSC的特性，这可能会影响细胞治疗应用。据制造商称，STEM-CELLBANKER®DMSOFREEGMP级是一种创新的冻存解决方案，旨在保存不含DMSO的各种细胞类型。其配方符合JPN、EU、US和PIC/S的GMP指南生产，不含血清、动物源性成分和DMSO，减轻了对研究至关重要的纯度的担忧。STEM-CELLBANKER®DMSOFree可显著提高细胞活力，同时保留细胞多能性和解冻后有效增殖等关键特性。该解决方案提供了卓越的批次间稳定性，确保了批次间性能的一致性。制造商还声称用户会喜欢它的便利性，因为它不需要准备;细胞可以直接在-80°C下冷冻，从而简化了冻存工作流程。它还在美国FDA药物主文件中注册，允许客户申请监管提交授权书。总体而言，该产品代表了那些寻求无DMSO解决方案的人在低温保存方面的重大进步。      人脐带（UC）是MSC的一个有前途的来源，尽管被归类为实体组织，但UC具有单个供体的多种用途等优势。然而，以前使用动物或同种异体血清的冻存方法导致冻融UC-MSC中的细胞增殖较低。Shimazu的研究团队使用无血清和无异种成分的冷冻保护剂STEM-CELLBANKER建立了一种最佳的冷冻保存技术。经过缓慢的冷冻过程和随后的解冻，保存的UC产生的MSC保持了与新鲜细胞相当的典型表型、免疫抑制能力和分化潜力，证明了临床活力。冻存方法和可用系统      冻存MSC有两种主要方法：慢速冷冻和快速冷冻/玻璃化。缓慢冷冻的速率为1°C/min，因其污染风险低且更易于加工而受到诊所和研究实验室的青睐，允许在一个含有低浓度CPA的小瓶中冷冻大量MSC。尽管存在冻伤风险，但优化CPA的使用对于防止冰晶形成至关重要。玻璃化反应涉及使用液氮将细胞悬液从水相快速转化为玻璃态，需要多摩尔CPA混合物和逐步引入，以尽量减少化学毒性。然而，它有渗透损伤的风险，并且由于需要人工作和高技能，不太适合大体积处理。     开发了一种新的低温保存方案，使用甜菜碱和电穿孔。甜菜碱是一种天然的渗透保护剂，稳定、无毒且高度亲水性，这使其能够竞争性地结合水分子并防止结冰。电穿孔被广泛接受用于将非渗透性分子输送到细胞中，在电刺激下在细胞膜上产生临时的疏水孔，允许分子通过。这种联合方法在各种MSC类型中表现出普遍适用性，并在各种MSC类型中保持较高的解冻后细胞活力，包括人源性UC-MSC、小鼠源性BM-MSC和转基因UC-MSC。     对于同种异体“现成”临床应用，需要大量的冷冻MSC。高细胞浓度的冻存可最大限度地减少DMSO输注量，从而降低输注相关毒性。使用CellSeal®冻存管，将1000万个/mL的细胞用5%DMSO冷冻至-80°C，并储存在液氮中。使用该系统冷冻的AT-MSC在解冻时显示出高功能活力。该系统可轻松进行床旁解冻和给药，残留DMSO极少，无需细胞洗涤。未来的研究将检查解冻后AT-MSC在体内的植入潜力。     在表3中，我们列出了用于MSC冻存的控速冷冻系统的市售选项。这些先进的冷冻系统在确保MSC在冷冻保存过程中的活力和功能方面发挥着至关重要的作用，允许受控的温度曲线，防止冰晶的形成并保持细胞完整性。该表提供了各种型号的详细信息，包括其规格、特点和典型应用，可帮助研究人员和从业人员在为其MSC冻存需求选择合适的设备时做出明智的决定。表3.用于MSC冻存的市售受控冷冻系统概述      关于MSCs悬液的冻存，必须专注于标准化细胞培养质量的评估。特别是，冷冻保存前后评估标准的一致性至关重要。通过比较冷冻前后的相似指标，我们可以准确确定冷冻保存对细胞培养的影响。此外，重要的是要认识到细胞培养物在冷冻保存后必须经过修复或驯化过程。几项研究表明，如果没有这个适应阶段，就无法完全恢复冷冻保存的干细胞的治疗潜力。     重要的是要认识到，各种复杂的基于细胞的产品可能有很大差异，这意味着单一的冻存方案可能并不适合所有产品。因此，为每个产品创建单独的协议会使标准化工作复杂化。因此，基于复杂生物医学细胞的产品的冷冻保存是一个具有挑战性和争议性的问题。然而，研究表明，这个概念是可以实现的，值得进行更深入的调查。阻碍冻存标准化的另一个方面是实验室之间技术设备的显著差异。通常，每个实验室都会根据其特定的技术能力和可用试剂来建立其冻存方案。因此，需要一种综合方法来标准化冷冻保存过程。尽管如此，编制通用指南以增强冷冻保存过程，最大限度地减少对细胞的压力应该是可行的。作者希望这篇综述有助于组织和选择冷冻保存MSCs、含MSCs的组织和相关生物医学细胞产品的方法。6.结论     当前用于生产临床级MSC的大规模扩增平台的一个局限性是不同系统和方法之间的细胞产量和质量的差异。虽然已经开发了各种生物反应器和培养容器来满足放大生产的需求，但在培养条件、细胞处理技术和质量控制措施方面仍然缺乏标准化。这种可变性会导致最终产品不一致，从而影响其治疗效果和安全性。此外，与其中一些平台相关的复杂性和成本可能会限制其广泛采用，尤其是在资源受限的环境中或小规模的生产需求中。     展望未来，应将工作重点放在标准化方案和优化大规模扩增平台上，以确保临床级MSC生产的可重复性、一致性和成本效益。这可能涉及开发更加用户友好的模块化系统，以便无缝集成到现有的制造过程中，以及实施先进的监测和控制技术，以确保对培养条件的精确调节。此外，需要继续研究新型培养基底物、培养基配方和生长因子，这些物质可以增强细胞增殖、维持干性并促进治疗效力。MSC的冷冻保存对于在临床应用中保持其活力和治疗潜力也至关重要。虽然DMSO通常用作冷冻保护剂，但它存在毒性和不必要的分化等风险，这促使开发了替代冷冻保存方法和试剂以及市售的GMP级冷冻保存培养基。此外，受控速率冷冻系统的进步提高了MSC解冻后的活力。涉及工业界、学术界和监管机构的合作倡议对于加速基于MSC的疗法从实验室到临床的转化至关重要。最终，应对这些挑战和提高大规模生产能力对于实现基于MSC的再生医学的全部潜力和满足对基于细胞的疗法日益增长的需求至关重要。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

这是ISPE官方在2023年发布的一份关于大规模干细胞生产设计相关注意事项的参考文章。【NO.1】背景介绍    大规模商业干细胞治疗工艺可以从现有的生物加工行业中借鉴很多东西。本文讨论了大规模干细胞和干细胞衍生产品制造工艺带来的一些独特挑战，以及设计制造设施时应考虑的事项。     非转基因细胞疗法通常分为两大类：自体和同种异体。自体疗法使用患者的细胞作为起始材料，而同种异体疗法使用供体细胞。      该行业强烈希望转向同种异体细胞疗法，因为与自体细胞疗法相比，它们具有多项优势，包括降低患者成本、易于自动化以及能够生产可扩展的“现成”产品。然而，同种异体细胞疗法在达到商业可行性方面面临挑战，例如诱导移植物抗宿主病（GVHD）的可能性以及宿主免疫介导的排斥风险。随着GVHD的这些挑战得到解决，随着行业的成熟，以及随着患者群体规模更大的适应症成为目标，大规模同种异体干细胞生产将变得越来越普遍。      在生产规模方面，目前正在开发和生产的同种异体细胞疗法基于不同的模式，这决定了批次大小。同种异体CAR-T和自然杀伤（NK）细胞通常以10至50L的规模制造，但许多干细胞和干细胞衍生的药物产品都以更大的生产能力为目标。生产规模主要由患者剂量要求和患者群体规模触发。      间充质干细胞（MSC）或多能干细胞（PSC）疗法的细胞剂量要求估计需要高达10^9个细胞/患者，一些适应症的预期市场规模需要数十万剂。预计一些商业同种异体干细胞生产将需要200至2000L的批量大小，单个产品每年生产10^11-10^14个细胞，以达到商业可行性。      设计干细胞或干细胞衍生产品制造设施的关键是解决约束、目标、邻接和成本的多变量问题。该设施的设计和建造必须促进操作人员简化生产、考虑工作流程、实现安全作并简化法规遵从性。必须研究通过工厂的所有制造流程路径，包括产品、人员、原材料、废物和设备。过于关注初级工艺可能导致对支持功能的研究不足，例如培养基制备和交付、配套、质量控制（QC）实验室或仓储。从更广阔的角度看待设施将有助于进行更全面的设计。【NO.2】开放 vs 封闭      在设计任何生物制造设施时，最大的考虑因素之一是工艺是“开放式”、“封闭式”还是两者的混合。开放工艺中的单元暴露在周围环境和作员的环境中。封闭过程的设计使周围环境和作员不会暴露在过程环境中，反之亦然。这是通过使用不锈钢容器和管道、一次性系统和管道组件、隔离器和其他方式实现的。      与封闭工艺相比，开放式工艺本身具有更大的污染风险，并且需要更高等级的环境和更保守的设施设计;因此，为了简化设施设计以及优化作员和产品安全，应尽可能考虑封闭过程。尽管工艺的某些部分（例如用于细胞扩增的一次性生物反应器）可能是封闭的，但在设施设计过程中必须考虑所有加工步骤（例如接种或收获）。模块流程图（见图1）有助于识别每个流程步骤并分配一个开放或封闭的标签。如果处理步骤当前未关闭，则应考虑“关闭”该步骤的方法。     重要的是要了解干细胞产品是无法通过过滤、加热或任何其他当前方法进行灭菌的活细胞。因此，需要从头到尾进行全面的无菌加工。必须注重保持无菌技术，以防止从运营一开始就防止传染病的引入、传播或传播。4由于许多干细胞工艺是在学术界或小型研究实验室开始开发的，因此有一种趋势是使用许多手动开放步骤的工艺来限制初始成本并简化作。随着这些工艺逐渐进入更大规模的临床试验或商业生产，早期工艺开发应侧重于使用封闭工艺和更加自动化的程序，以降低污染风险并提高效率。      在技术转让实施期间，产品开发工作应尽早牢记可扩展性，以简化这一过渡。通过最大限度地减少制造早期阶段所需的开放加工量，有机会大幅节省设备和建筑公用设施的成本和占地面积。有时，由于项目时间表、成本或其他原因，无法关闭流程中的特定步骤。在这种情况下，可能需要一个专用房间和额外的过渡气闸来隔离开放过程。开放式处理至少需要在B级房间背景中具有A级空气供应的生物安全柜（BSC）中工作。【NO.3】风险评估      在制定设施布局之前，应执行一系列初步风险评估。风险评估与组织的业务、质量和安全职能有关，是满足疾病控制和预防中心（CDC）和美国国立卫生研究院（NIH）指南的要求。可以针对产品污染风险、工艺可靠性（产品损失）、产品交叉污染风险（产品间、批次间）以及环境、健康和安全（EHS）风险进行特定的风险评估。分区和过渡图（见图2）是了解不同流程制造作的潜在邻接关系的绝佳工具，可用于促进风险评估。风险评估通常属于以下类别之一。2.1.单一产品设施     与其他类型的设施相比，单一产品设施的风险状况相对较低。评估的重点通常是无菌作、批次分离和工人安全。根据风险评估，这些设施可以设计为双向流，并为所需的材料和人员过渡提供适当的气闸设计。单一产品的设施设计通常允许将多个封闭功能整合到一个房间中。2.2.多产品设施     在多产品设施中，交叉污染的可能性会增加，因此必须同时考虑设施设计要素和运营要素。单件商品必须具有名称和安全的制造顺序。可以利用多种方法来降低风险，包括运动、物理隔离、直流加热、通风和空调 （HVAC） 设计以及仔细消毒。ISPE BaselineGuide 第 7 卷：基于风险的药品生产® 6概述了一种基于风险的科学方法，用于管理多产品设施内的交叉污染风险。2.3.合同制造组织 （CMO）由于业务性质，CMO 通常有特殊的考虑，这涉及将其他组织的制造业务内包。CMO 通常将多个客户、流程和产品放在同一个屋檐下，并且多产品风险被放大。这种增加的风险通常会成为他们客户关心的问题，并经常推动 II 期临床试验生产通过商业规模生产采用分割套件方法。【NO.4】法规遵从性     很多时候，初始布局和概念设计是在未充分考虑相关法规和指南的情况下进行的。首先，必须定义产品将销售的市场。这将推动设施设计必须遵循哪些良好生产规范（GMP）。接下来，必须确定将建造设施的位置。该地点将推动生物安全要求、建筑规范以及环境和废物处理要求等要求。以下是一些限制设施设计的关键法规，并提供了对法规期望的见解。4.1.美国《联邦法规》中的以下 GMP 法规是相关的：《美国联邦法规》第21卷第1271部分 — 人体细胞、组织以及细胞和组织产品《美国联邦法规》第21卷第210部分 — 药品制造、加工、包装或储存方面的现行药品生产质量管理规范;常规《美国联邦法规》第21卷第211部分 — 现行的成品药品生产质量管理规范《美国联邦法规》第21卷第600部分—生物制品：一般条款《美国联邦法规》第21卷第610部分 — 通用生物制品标准《美国联邦法规》第21卷第11部分 — 电子记录;电子签名应考虑美国食品药品监督管理局（FDA）的以下 GMP 指南：“行业指南。现行良好组织规范（CGTP）以及对人体细胞、组织以及细胞和组织产品（HCT/PS）制造商的附加要求。2011年12月12“行业指南。无菌加工生产的无菌药品 - 现行药品生产质量管理规范。2004 年9月13以下安全法规是相关的：《美国联邦法规》第42卷第73章 — 部分试剂和毒素法规OSHA法规29CFR 1910.1030 — 血源性病原体应考虑以下安全准则：CDC/NIH—微生物和生物医学实验室的生物安全（BMBL）第6版。涉及重组或合成核酸分子的研究的NIH指南10升小规模< – 附录G10升大型> – 附录K（包括制造）最后，必须满足以下联邦、州和地方建筑规范以及其他具体准则：国际规范委员会（ICC）国家电气规范（NEC）职业安全与健康管理局（OSHA）国家职业安全与健康研究所（NIOSH）美国国家消防协会（NFPA）美国残疾人法案（ADA）4.2.欧洲以下 GMP 法规是相关的：欧洲议会和理事会2007年11月13日关于先进疗法医药产品以及修订指令 2001/83/EC和法规（EC）no 726/2004的第1394/2007号法规（EC）欧盟委员会。“EudraLex，第4卷：良好生产规范 - 特定于先进疗法药品的良好生产规范指南。”欧盟委员会。“EudraLex，第4卷：欧盟人用和兽用药品 GMP 指南。附件1：无菌药品的制造。以下生物安全法规和准则是相关的：欧洲议会和理事会2009年5月6日关于控制使用转基因微生物的第 2009/41/EC号指令欧盟成员国发布的具体法规和指南对于建筑规范，应遵循欧盟成员国发布的具体法规和指南。4.3.世界其他地区许多国家/地区（如加拿大、巴西、中国和墨西哥）都有特定于国家/地区的法规和指南。建筑规范通常是特定于国家/地区的。以下 GMP 和生物安全法规和指南可能相关：药品稽查公约/药品稽查合作计划（PIC/S）PE-009-16附件2A — 制造人用先进疗法药物世界卫生组织（WHO）通常为未发布自己的法规或指南的国家/地区发布GMP和生物安全指南4.4.其他考虑     尽管并非所有列出的法规都与每个设施相关，但设计设施的工程师和建筑师需要了解哪些方面是关键的。欧盟GMP附录1（2022）的最新更新增加了对工厂制定污染控制策略（CCS）的要求。虽然监管机构一直希望工厂有记录在案的污染控制计划，但现有方法可能并不总是在不同部门（例如，QC、质量保证或制造）之间进行协调，从而导致数据与原始鉴定、验证、过程控制和环境监测脱节。     此外，为应对偏差和趋势分析而采取的纠正和预防措施可能既缺乏与综合战略的整合，也缺乏关键控制点与控制有效性评估（设计、程序、技术和组织）之间的联系。但是，附件1（2022）提出了一个整体观点用于颗粒、微生物和热原污染。关于应该如何开发和记录CCS仍然存在讨论和争论。话虽如此，ECA污染控制策略工作组制定了“如何制定和记录污染控制策略”指南，这应该是一个很好的起点。【NO.5】运营挑战     为了更好地了解大规模干细胞和干细胞衍生产品生产带来的挑战，最简单的方法是查看大多数干细胞工艺和设施中的作（见图3）。考虑因素清单当然不是包罗万象的，但它应该提供对主要挑战的有力概述。干细胞的制造从供体选择开始，但本文重点介绍从接种开始的制造设施。细胞系开发（包括细胞收集、细胞分离、细胞活化或细胞库）被认为不在本文的讨论范围之内。5.1.接种     在大多数应用中，样品瓶的初始制备需要手动和开放式处理，因此需要A级环境。这种环境可以通过多种方式实现，要么使用具有B级背景的BSC，要么在具有C级或D级背景的隔离器中实现，具体取决于监管环境（EMA与FDA）。尽管隔离器提供了最合格的无菌环境，但在这两种方法之间的选择通常会陷入关于成本、进度、作灵活性和与批次损失相关的风险的争论。      最常见的选择是在具有B级背景的BSC中进行接种。BSC具有工艺多功能性的优势，而由于需要定制，隔离器更适合成熟工艺。经常被忽视的事实是，当考虑到建筑饰面、暖通空调、防护服、清洁和周转时间时，B级空间的资本和运营成本可能会变得非常昂贵。一些研究（见表1和图4）表明，虽然隔振器通常具有较高的资本成本，但在考虑设备生命周期内的成本时，其盈亏平衡期相对较短。最终，在设计设施时，应根据具体情况对此进行调查。5.2.细胞扩增     为干细胞扩增选择合适的可扩展平台会极大地影响设施设计。尽管现有生物工艺标准中有一些技术可用于干细胞生产，但在使用现有解决方案之前，应仔细审查和解决干细胞工艺的具体要求。许多干细胞系正在使用传统的贴壁板餐具（如T型培养瓶和多层细胞培养容器）进行开发。虽然一些自体或小规模同种异体工艺可能会使用餐具进行商业生产，但由于设备尺寸增加和复杂自动化的运营挑战，这在大规模上是不可行的。      或者，许多市售的封闭贴壁生物反应器是在考虑基因疗法或其他传统生物产品的情况下开发的，其中产物在细胞外表达，或裂解细胞以回收细胞内产物。由于用作细胞锚定的底物类型，活细胞的收获在许多贴壁平台中构成了重大挑战。有一些市售的贴壁平台的底物旨在实现高产量和活力，同时收获活细胞，但这些平台尚不具备大规模生产所需的容量。话虽如此，这些平台可以作为有用的种子培养设计解决方案，在此过程中尽早结束扩建业务。      鉴于当前的技术，基于悬浮液的贴壁干细胞方法（通常与用于连续培养基交换的灌流技术相结合）已被证明更具可扩展性。目前的两种方法是基于微载流子的悬浮液和细胞聚集体悬浮液。微载体悬浮液使用微孔微珠或其他介质，允许贴壁细胞系悬浮在液体培养基中时高密度附着和生长。       这种方法允许使用市售且经过验证的可扩展悬浮生物反应器，但引入了额外的工艺作。为了收获粘附在微载体上的细胞，必须首先将细胞从微珠上解离。这通常是通过添加解离剂（例如胰蛋白酶）来完成的。解离后，磁珠也需要与细胞分离。这通常是通过某种形式的过滤来完成的。或者，聚集体悬浮液是某些干细胞系可接受的生长方法，其中细胞群形成集落或聚集体以支持悬浮液中的生长。      监测和控制细胞密度和聚集体形成是这些过程中的关键，以最大限度地提高细胞生长和活力。此外，细胞将定期需要在临时生长扩增步骤之间采用解离方法，以允许在新培养基中形成新鲜聚集体或转移到最终产品配方中。      干细胞培养过程和干细胞系开发尚未成熟;因此，支持更多干细胞传代的工艺开发带来了许多挑战。鉴于此，实现大规模生产的选择可能有限。设施设计可能需要考虑纵向扩展和横向扩展以达到生产目标。如果无法为单个大型生产生物反应器开发干细胞工艺，则设施可能需要支持具有多个较小反应器的工艺。来源: 自动细胞洗涤和浓缩的进展doi:10.1016/j.jcyt.2021.04.0035.3.细胞收获和洗涤     干细胞制造与传统生物技术不同的一个关键领域是收获和纯化。传统的生物技术可能使用离心、深层过滤、色谱、切向流过滤（TFF）或其他形式的过滤的组合来去除细胞碎片或靶向特定蛋白质，而干细胞收获通常具有较少的单元操作。干细胞采集的目标是采集单个活细胞。这可以通过一系列作来完成，包括分离（如有必要）、速冷、洗涤、浓缩和收集。      作为细胞产品，每个收获步骤都需要关注关键质量属性，例如细胞浓度、总细胞计数和细胞活力。电池本身必须在整个作过程中保持良好状态，从而限制了清洗和浓缩作的设备选择，因为这些作可能会对电池产品产生高剪切力或其他破坏性影响。为了选择正确的作方法和设备，必须仔细研究需要控制产品体积和成分的每个工艺步骤，以找到最合适的解决方案。      除了收获过程之外，其他作可能需要调整细胞浓度。许多干细胞扩增过程需要定期更换培养基，以补充营养并去除细胞废物副产物。这种培养基更换可以连续进行（灌流），也可以通过离散培养基更换进行，其中生物反应器中的工作体积减少并添加培养基推注。这种类型的培养基更换可以提高细胞密度和整体健康状况。     干细胞衍生产品可能需要单独添加许多不同的专用培养基类型。这种离散的培养基交换对于将细胞分化引导到所需的通路可能是必要的。这些步骤中的每一个都需要去除用过的培养基，并将新培养基引入产品液体中，而不会对产品细胞产生负面影响。选择可实现最大加工速率和体积的技术可以极大地有利于这些电池产品的整体制造。     有几种技术平台用于细胞收获或培养基交换，但并非所有平台都能满足大规模生产的需求（见图5）。一次性设备选项是应对这一设计挑战的领先解决方案，包括离心、声波分离、TFF和交替切向流（ATF）过滤（见图4）。声波分离是一项有趣且有前途的技术，但它并未用于大规模制造的商业化。      尽管TFF或ATF可能适用于连续培养基更换，但这些系统的吞吐量通常太慢，无法进行离散培养基更换或收获作。目前，一次性离心是细胞收获或培养基更换的最有效解决方案。它允许在同一台设备上进行解离、淬灭、洗涤、浓缩、收集和离散介质交换，处理时间相对较短。将流程设计为使用同一台设备进行多个单元作，可以实现更小的设施占地面积、更高的设备利用率和更低的资本成本。【NO.6】配方、罐装和冻存      一些大规模干细胞工艺需要多种类型的填充技术和形式来处理中间产品和最终产品。鉴于大规模细胞扩增和分化的时间很长，通过冷冻保存和储存中间产物来战略性地隔离操作可能是有利的。种子培养和生产生物反应器等隔离操作可以减少批次失败的影响并简化批次调度。      例如，考虑一个在差异化阶段失败的过程。如果该工艺在分化之前直接进行了冷冻保存作，则可以使用冷冻保存的中间体立即开始分化，仅损失一两周的生产率（参见图6）。没有中间冻存步骤的工艺必须从原代细胞库中的小瓶开始，从而损失数周或数月的生产率。      大多数细胞治疗产品的灌装和冷冻保存是一项小规模作。细胞采用冷冻保护剂配制而成，例如10%二甲基亚砜（DMSO），以防止在冷冻过程中形成晶体。然后将配制的产品填充到少量冻存管或冻存袋中。如果长时间保持液态，冷冻保护剂会影响细胞活力，因此配方步骤会启动一个通常为1到2小时的“冷冻窗口”。然后将冻存管或冻存袋运输到台式控速冰箱，在那里使用液氮将冻存管或冻存袋降至目标温度。该操作足以满足大多数现有的细胞治疗生产工艺，但大规模干细胞治疗工艺需要大规模解决方案。      为了改善物流和材料处理，以比传统细胞疗法（即500mL或更大）更大的规格罐装和冷冻中间产品可能是有利的。考虑一个实例，其中分化生物反应器需要4L冻存中间体进行接种。在解冻和接种过程中，作员处理四个1L袋，甚至一个4L袋，比处理20个200mL袋要容易得多。在冷冻过程中也会遇到同样的物流和物料搬运挑战。将少量较大的袋子从灌装作移动到冷冻作比移动大量小袋子要容易得多。     大多数可用于填充200mL至5L尺寸范围内的袋子的自动化技术都是专为静脉（IV）液体设计的隔离式高速装置。这些孤立的高速灌装线设计为最低500-1000袋/小时的灌装速度。对于大多数干细胞治疗产品来说，这种容量是过高的，并且资本成本高，占地面积大。传统高速袋装灌装线的另一种选择是封闭的一次性歧管式灌装机。     越来越多的供应商正在根据细胞治疗工艺定制他们的填充产品，现在有少数供应商提供适合50mL至20L袋子的单独使用歧管式产品。使用较大袋规格的挑战之一是几乎没有关于冷冻后细胞活力的公开数据。在短期内，制造商将不得不生成自己的实验数据，以证明大规模技术能够在没有大量细胞损失的情况下冷冻中间产品。6.1.培养基准备和交付     培养基是所有细胞培养过程的重要组成部分，但为大规模干细胞过程提供培养基可能会带来一些独特的挑战。这些挑战可能来自干细胞过程和培养基本身的组成。该工艺带来的一些主要挑战包括无菌制备、大工艺规模、连续灌流要求、推注培养基添加以及几种类型的生长和分化培养基的制备和递送。     由于最终的细胞产物不能以无菌方式过滤，因此整个过程（包括培养基生产）必须以无菌（即不受生物负荷控制）的方式进行。这意味着与传统的生物制造工艺相比，需要额外的过滤和测试，并且可能会推动对更大或专用QC实验室的需求。小规模细胞治疗工艺可以利用外部供应商在一次性容器中提供预先准备好的无菌液体培养基。     大规模干细胞工艺所需的大量培养基使得购买预制培养基不切实际，因此有必要从粉末培养基库存中进行现场制备。众所周知，干细胞对培养基的需求很大，一些干细胞过程需要持续灌注培养基来维持细胞。连续灌流可能意味着整个反应器体积在工艺中每天都要翻转。细胞扩增和分化过程都可能持续数周，可能需要超过10000L的培养基才能完成单个200L生产反应器原料药批次。      将培养基从制备设备输送到生物反应器可能会带来额外的挑战，因此制定稳健的培养基输送策略至关重要。最大的决定之一是是使用一次性还是不锈钢培养基制备和输送设备，或者是否需要将两者结合起来。可以考虑的一种策略是，对小体积种子培养使用一次性培养基制备和输送设备，同时对较大产品或分化生物反应器使用不锈钢培养基制备和输送设备。      典型的培养基系统包括培养基制备罐或一次性混合器、无菌过滤撬或管道套件、培养基储存罐或单独使用手提袋，以及分配系统或管道套件。对一次性设备与不锈钢设备的资本和运营成本进行分析有助于为培养基策略的制定提供信息。培养基的化学稳定性，尤其是任何生长因子或小分子的化学稳定性，可能会增加冷藏需求或限制制备和过期之间的窗口。在区分培养基类型之间切换时，需要向生物反应器中推注培养基，这可能意味着冷培养基（2°C–8°C）需要先加热至37°C，然后再将其添加到反应器中。     对于使用多个生产或差异化生物反应器的工艺，可能必须制定独特的策略和时间表。以使用四个500L分化生物反应器的工艺为例。每个生物反应器可以有一套专用的培养基设备，或者可以制备、保存更大批次的培养基并将其分配到所有生物反应器。如果需要添加冷藏和推注培养基，则需要添加热交换器作为分配的一部分，以便在输送到生物反应器之前加热培养基。【NO.7】生物废弃物处理     人类细胞系被认为具有潜在传染性，并且在OSHA血源性病原体标准 （BPS） 的范围内，除非特定细胞系已被表征为不含公认的血源性病原体。此外，BMBL建议应使用生物安全2级（BSL-2） 做法和遏制来处理人类细胞。16在处理废物时，这些生物安全影响非常重要，因为废物处理程序必须遵守特定地点风险评估的结果。以下建议是典型的，并假设唯一的生物危害是未经基因改造的人类干细胞产品。7.1.固体废物     生产区域的所有受污染固体废物应根据适用的地方、州和联邦法规进行净化。这种净化可以在现场或场外进行，只要包装正确以便运输即可。7.2.废物流     应考虑为设施布局内的受污染废物使用指定的废物流，以避免任何交叉污染源。作为最佳实践，废物流应该是单向的，并尽可能与其他物料流隔离。如果废物流无法进行物理隔离，则应按时间进行隔离。净化完成后，废物可以移动到中央处理区，在那里可以使用高压釜/破碎机组合装置处理材料，然后作为城市固体废物处理。或者，如果现场提供生物垃圾运输服务，则可以将生物垃圾车移至垃圾储存区进行场外处理。7.3.液体生物废弃物     C级或D级洁净室中产生的大量液体生物废物应通过GMP室中专用的全焊接生物废物排放系统进行收集。如果排水系统位于地下，应考虑使用具有主动泄漏检测功能的双封闭管道。虽然仅作为BSL-3设计的一部分需要，但作为最佳实践，排水系统应使用配备0.2μm或HEPA级过滤器的封闭连接/盖和排水口，以保持封闭边界并防止任何空气传播的生物体释放。然后可以通过合格的净化方法对废物进行处理。这可以通过化学或热法进行。热选项是一种更保守、更灵活的方法，通常有两种系统设计：双批次（使用两个交替的储罐进行批量作）或连续净化。      还应考虑液体废物流的生物需氧量（BOD）对现场废物许可证的影响。对于使用灌流或定期离散培养基交换的大型干细胞生产设施，可以将大量几乎用完的培养基（即高BOD废物）指定为卫生下水道。应分析废物的BOD含量，并与场地许可限值进行比较。如有必要，该设施可能需要一种方法来分离和收集高BOD流，以便由油罐车运输和场外处理。【NO.8】GMP仓库和物料暂存     大型干细胞生产设施需要大量且多样化的存储空间。清洁核心中需要大量的短期存储和放置空间，用于暂存一次性材料。对于GMP仓库，一次性组件和其他耐贮存材料需要常温储存。粉末培养基和其他原材料分别需要在2°C–8°C和–20°C下储存。冷藏室可能需要支持所需的2°C–8°C 储存量，而–20°C的储存可能能够由立式冷冻装置支持。低温（–180°C）干相氮气杜瓦瓶储存用于冷冻保存的中间体材料。表2显示了大型干细胞治疗设施的GMP仓库存储要求示例。【NO.9】质控实验室     大规模干细胞生产设施需要大量的分析支持。大量的工艺无菌测试要求QC实验室空间位于洁净核心可进入的位置，以便于样品输送。QC实验室也面临着与生产区域相同的生物废物处理要求。      虽然一些干细胞药物产品可以冷冻保存，但其他干细胞药品可能需要新鲜（即2°C–8°C）运送到诊所。后一种情况需要非常紧迫的时间，从完成填充到交付到诊所，类似于自体设施和产品供应链。更紧迫的产品交付时间表导致了超快的发布测试，并推动了对增加内部功能的需求。QC区域设计应考虑接收和测试以下样品的能力：产品培养基无菌性/生物负荷原材料设施公用设施监控环境监测无菌工艺模拟重新验证 — 原位清洗（CIP）/原位灭菌（SIP）/洁净室此外，应考虑QC区域中支持以下分析的设备的空间要求：生物负荷和无菌性 – 内毒素（LAL）、支原体（PCR）、BACT/ALERT、革兰氏染色生物指示剂 – 生长标志物/纯度/效价 – 细胞核/细胞质标志物、孵育、ELISA免疫细胞化学、高内涵成像Karyology–G带/细胞遗传学内容 – 血细胞计数器、总数、活力一般 – 外观、电导率、渗透压、pH值总有机碳（TOC） – 冲洗水和棉签环境监测 – 总颗粒物、非活性颗粒物、空气传播活性颗粒物、表面活性颗粒物气体和原材料 – 特性【NO.10】结论      随着一次性工艺设备的不断发展，将存在将现有生物加工行业的原理应用于大规模细胞治疗领域的新机会。设计这些设施是一个复杂的系统，在安全性、成本和效率方面存在挑战，需要利用不断发展的技术。在满足监管机构、制造、QC、设施和业务部门的需求的同时，需要一个具有适当专业知识和经验的团队。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。