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摘要：慢病毒载体在基因修饰细胞疗法的兴起中发挥了关键作用，特别是T细胞疗法。Tisagenlecleucel（Kymriah）、Axicabtagene ciloleucel（Yescarta）以及最近上市的Bexucabtagene autoleucel（Tecartus）是现在商业化分发的T细胞疗法的例子，它们在成功获得EMA和FDA批准用于治疗血液癌症后，已经上市。这三种疗法都依赖于逆转录病毒载体将治疗性嵌合抗原受体（CAR）转导到T淋巴细胞中。尽管这些创新代表了充满希望的新治疗途径，但在使它们成为医疗护理中随时可用的工具方面仍存在重大障碍。本文回顾了慢病毒（LV）载体和T细胞治疗的生物学原理以及生物加工。还讨论了临床和工程的成功、不足和未来的机会。开发符合良好生产规范（GMP）的仪器、技术和协议将在LV工程化T细胞疗法的发展中发挥重要作用。 1.引言 病毒是由蛋白质外壳保护的核酸组成的传染性生物。这些微生物不能自我复制，而是依赖于它们感染的细胞，通过劫持宿主的复制机制来产生更多自己的副本。病毒通常与疾病相关，但遗传工程师重新利用了它们的生物学特性，利用它们自然的能力来修改或补充宿主细胞的遗传密码，生产出一类称为病毒载体的新的基因传递工具。伽马逆转录病毒（GRV）和慢病毒（LV）载体来源于逆转录病毒科的包膜RNA病毒，由于它们能够将遗传物质整合到宿主细胞基因组中并稳定表达外源基因，因此它们在研究和临床中得到了广泛应用，特别适合转导高度复制的细胞，如免疫细胞。嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是迄今为止最成功的免疫疗法类型，也是唯一上市的基于T细胞的疗法。为了生产CAR T细胞，T淋巴细胞被遗传修饰以表达CAR受体，赋予它们识别和摧毁癌细胞的能力。CAR T细胞疗法在治疗血液癌症方面显示出了有希望的结果，特别是CD19阳性B细胞恶性肿瘤，三种产品Tisagenlecleucel（Kymriah）、Axicabtagene ciloleucel（Yescarta）和最近上市的Bexucabtagene Autoleucel（Tecartus）获得了市场授权。这些疗法的载体和细胞元素的生物加工很少同时考虑，也不一定由同一制造商生产。生物技术和制药行业越来越多地参与T细胞工程疗法和赞助临床测试，证明了这一治疗领域的快速发展。在这篇综述中，我们将介绍用于基因修饰T细胞疗法的LV载体的基本生物学原理和生物加工，以及最近的临床和工程进展。 2.慢病毒载体 2.1.生物学原理 逆转录病毒载体的两个主要类别是GRV和LV载体。两者之间的主要区别在于GRV载体只能感染分裂的细胞，而LV载体也可以感染静止的细胞。慢病毒载体已经在多种临床前应用中用于治疗遗传性疾病，如B型血友病和黄斑变性，通过体内传递。慢病毒载体也用于体外转导细胞以用于治疗应用，最先进的临床应用是CAR T细胞疗法。本综述将重点讨论LV载体在T细胞疗法开发和制造中的使用和应用。慢病毒载体来源于逆转录病毒科的病毒，最常见的是人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1），并已用于研究和治疗应用。还开发了使用不同来源病毒的变体LV，如猴免疫缺陷病毒（SIV）、猫免疫缺陷病毒（FIV）或马传染性贫血病毒（EIAV）。LV是通过依赖逆转录病毒将其遗传物质整合到宿主细胞基因组中的自然能力，有效修饰真核细胞的手段。LV可以被修改以携带高达10 kb的基因，并稳定转导感兴趣的基因，通常被称为“表达盒”。LV基因组编码三个结构基因，在野生型病毒和工程载体中发挥相同功能。这三个基因是群特异性抗原（gag）、聚合酶（pol）和包膜（env）。gag基因编码病毒的结构蛋白，包括基质蛋白、衣壳蛋白和核衣壳蛋白。这些蛋白是蛋白质骨架的一部分，作为病毒RNA基因组的保护层。pol序列编码病毒复制周期所必需的酶功能。这包括蛋白酶，它将HIV未成熟蛋白切割成成熟的功能性蛋白；逆转录酶（RT），将病毒基因组单链RNA（ssRNA）逆转录成双链DNA（dsDNA）；整合酶，它切割宿主基因组DNA以整合病毒dsDNA。env序列编码包膜蛋白，负责HIV细胞进入和通过与目标受体的相互作用来确定嗜性。包膜蛋白复合体是由env编码的两种蛋白gp120和gp41形成的异二聚体。Gp120和gp41通过从包膜膜突出的域与它们的靶标受体CD4、CCR5和CXCR4相互作用。此外，HIV基因组编码调节元件Tat和Rev和辅助蛋白Nef、Vpr、Vif和Vpu。虽然调节元件对HIV复制是必需的，但辅助蛋白增强病毒复制，并与体内的致病性相关。最后，HIV基因组编码参与如核输出、包装和基因表达等功能的基本序列。Rev-Response Element（RRE）与Rev相互作用，允许在病毒复制期间未剪接和单剪接HIV RNA的核输出。HIV DNA基因组由两个在病毒RNA逆转录过程中产生的长末端重复（LTR）序列所包围，对病毒基因组整合到宿主细胞DNA和病毒基因组表达至关重要。LV是通过将逆转录病毒基因组的组件组合成重组质粒DNA（pDNA）而开发的。然后可以将pDNA转染到生产细胞系中。为了增加可以包装到载体中的遗传有效载荷，抑制复制，并限制致病性，同时保留功能，对LV基因组进行了修改。第一代LV与野生型病毒基因组最为相似。为了限制创建复制能力慢病毒（RCLs）的风险，病毒基因被装载到三个单独的质粒上。该系统由包含结构gag基因和调节蛋白的包装质粒组成——包含gp160或其他替代病毒包膜的糖蛋白的包膜质粒，以修改嗜性（例如，VSV-G）——以及包含两个HIV LTRs的转移质粒。包装和env质粒不包含LTR序列和ψ包装序列，而是被巨细胞病毒（CMV）启动子所取代，以进一步防止RCLs的形成。第二代LV生产系统从包装质粒中去除了辅助蛋白Nef、Vpr、Vif和Vpu，因为这些与疾病进展、致病性和通过人类社区的传播相关，但对病毒功能如逆转录、整合或成熟不是必需的。第三代也是最新的LV生产系统修改了转移质粒的5' HIV LTR序列，并用强大的病毒启动子（如CMV或Rous肉瘤病毒（RSV）启动子）替换，允许从系统中去除tat，并进一步防止RCLs的形成。最后，Rev元素从包装质粒中移除，并装载到一个新的调节质粒上，形成了一个四质粒系统，增加了对RCL形成的安全性。所有三代LV载体及其相应的质粒系统已在图1中总结。 图1. 三代LV质粒系统。每一代LV载体都展示了其生产所需的质粒构建以及每个质粒所携带的基因。 2.2.LV生物加工 LV载体生物加工可以分为两个主要阶段，即上游加工（USP）和下游加工（DSP）。病毒载体的USP指的是病毒颗粒产生的步骤。这是通过将DNA转移到包装细胞中实现的，这些细胞被用作载体工厂。在工艺开发阶段，这通常是在2D细胞培养中完成的，并扩大到生物反应器生产，用于临床和商业生产。所使用的细胞是永生化细胞系，最受欢迎的是人胚肾细胞系HEK293T。HEK293T是一种贴壁细胞系，这在扩大规模时涉及挑战，因为大多数大规模生物反应器都适用于悬浮细胞培养。一些替代方案，如固定床生物反应器，已被提出作为有效扩大规模的解决方案。或者，为了解决这个问题，也尝试开发HEK293T细胞的悬浮变体。病毒载体生物加工从扩增生产细胞系开始，例如HEK293T细胞。然后，细胞被质粒DNA（pDNA）转染以转移LV颗粒生产所需的基因。随着它们的成熟，LV载体从生产细胞膜上出芽并释放到细胞培养基中。因此，与腺相关病毒（AAV）载体等其他非包膜载体不同，不需要细胞裂解步骤来释放颗粒。生产出的载体的DSP在收获生产细胞培养上清后开始。这种产品高度异质，包含大量的工艺和产品相关杂质。澄清步骤是为了去除聚集体和细胞碎片等大杂质，可以通过过滤或离心实现。为了在后期去除污染的核酸，这一步可能包括核酸酶消化。捕获步骤旨在保留和浓缩LV颗粒，并进一步去除工艺和产品相关杂质。可能添加中间纯化步骤以交换LV缓冲液、浓缩产品或去除特定杂质。然后是抛光步骤，以去除剩余的杂质，这些杂质通常由于与LV载体的物理性质相似而最难从最终产品中分离。捕获和抛光步骤可以通过多种下游加工技术的组合来实现，可能包括超离心、超滤/透析（UF/DF）、切向流过滤（TFF）、液相色谱或无菌过滤。最后一步或填充完成步骤包括LV载体的最终配方，可能包括缓冲液交换、无菌过滤、冷冻保存或添加辅料。大规模LV生物加工的一个例子在图2中展示。 图2. 用于GMP级LV载体生产的端到端上游和下游生物加工示例。这个图描述了Oxford Biomedica（英国牛津）为其GMP级慢病毒载体生产而申请专利的生物加工过程，该过程使用了他们悬浮适应的、无血清的HEK293T生产细胞系。这个过程包括一个依赖于丁酸钠的可诱导质粒系统。每批产品都单独冷冻保存和储存，直到生产出足够的材料，然后合并、过滤和浓缩以进行最终配方。 3.基因修饰T细胞疗法  3.1.生物学原理  T淋巴细胞在免疫中的一个作用是检测和摧毁被有害病原体感染的细胞。在感染期间，T细胞可以在呈递特定传染病原的免疫原部分，称为抗原时，检测到外来病原体。这种激活是通过T细胞受体（TCR）介导的，由CD3受体和CD4或CD8共受体组成。CD4共受体由辅助T细胞在与抗原呈递细胞相互作用时使用，以激活它们的细胞因子释放功能，这促进了其他免疫细胞的招募和激活，而CD8共受体由细胞毒性T细胞用来激活它们的细胞杀伤功能。其他共受体，包括OX40、CD28和4-1BB，增强了细胞功能，如增殖、细胞因子产生和细胞存活。一旦激活，T细胞将开始快速分裂，产生促炎因子并激活其细胞毒性功能以摧毁感染细胞。当感染解决后，由克隆扩展产生的激活T细胞群将变得筋疲力尽、衰老，并最终经历凋亡。这个过程只留下一小部分持久的记忆细胞，能够检测到相同的抗原并经历快速的克隆扩展，随后分化以产生强大和特定的适应性免疫反应。 在胸腺中的成熟过程中，识别自身肽段的T细胞被移除，以防止自身免疫反应。癌症细胞中存在的遗传和表观遗传修饰导致细胞功能如代谢、增殖、DNA修复、凋亡、运动和附着的失调。免疫系统有能力检测到这些因素中的一些，并利用其杀伤功能来根除癌细胞。肿瘤微环境（TME）的修饰也可以是免疫系统的潜在靶标，因为TME的特征与健康周围组织明显不同。被吸引到TME并渗入肿瘤的淋巴细胞被称为肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）。这些免疫细胞的存在与癌症患者的更好预后和缓解机会相关，它们已在临床上用于自体细胞治疗。然而，癌细胞源自受损或突变的健康细胞，因此对免疫系统来说可能很难检测。 嵌合抗原受体或CAR是一种能够结合目标抗原的工程TCR。CAR可以被引入T淋巴细胞中，以产生具有检测特定抗原能力的CAR T细胞。CAR由人类IgG抗体的单链可变片段（scFv）组成。已经开发了三代CAR：第一代是与CD3信号结合的scFv片段，以促进CAR T细胞的细胞毒性活性。第二代还包含一个CD28信号，以促进目标结合后的细胞增殖和细胞因子产生。第三代CAR增加了4-1BB和OX40区域，以促进细胞存活并延长CAR T细胞体内的持久性。最近开发了第四代，并包含特定的细胞因子信号，使CAR T细胞对TME的免疫抑制效应产生抗性，并进一步提高它们体内的寿命。 3.2.T细胞疗法生物加工 两种主要的方法已经从T细胞过继疗法中出现，依赖于两种不同的来源材料。异体方法依赖于来自“通用”来源的细胞，采取一种一刀切的策略。自体方法依赖于直接从患者体内获取的细胞，用于个性化医疗类型的治疗。所有商业上可用的T细胞过继疗法都依赖于自体原则，因为异体方法由于HLA分型和干细胞技术的早期发展而被证明难以开发。 对于大多数商业上可用或在临床开发中的CAR T细胞疗法来说，细胞是通过白细胞分离术或白细胞分离术从患者的外周血单个核细胞(PBMCs)中分离出来的。这种材料包含大量免疫细胞，包括B细胞、巨噬细胞、单核细胞、NK细胞和T细胞。第一个制造步骤是从PBMCs中分离出T细胞亚群，这可以通过磁性珠选择或选择性扩增来完成。磁性选择是指将磁性珠与抗体结合，这些抗体与目标T细胞群体结合，当通过磁性柱时可以分离出来。对于CAR T细胞的开发，可以使用抗CD3或抗CD4和抗CD8抗体的组合来选择T淋巴细胞。选择后，细胞通常在培养基中休息数小时。然后可以使用含有CAR盒的病毒载体转导细胞。这一步允许将CAR基因引入细胞，以产生完全功能的CAR T细胞。病毒转导的替代方法是转染。T细胞可以通过化学转染，使用聚乙烯亚胺(PEI)等转染化学试剂，或通过电穿孔，使用电流在细胞膜上形成孔隙，使pDNA进入细胞来进行转染。这些方法需要大量的pDNA，因为它们是在扩增阶段的末端进行的，涉及更多的细胞数量，因此在治疗应用中使用有限。 在生产用于治疗应用的CAR T细胞时，可以通过四种主要类型的遗传物质转移来实现基因传递：将基因稳定整合到宿主T细胞基因组DNA中；非整合的瞬时转移，转基因DNA作为环状体存在；病毒载体介导的转导；和非病毒转导。为了达到治疗患者所需的细胞治疗剂量，细胞在培养中被保留并允许扩增。为了刺激T细胞扩增，使用与单克隆抗体结合的珠子激活细胞，这些抗体针对CD3和CD28 T细胞受体。激活后的细胞可以在生物反应器中培养，这提供了在封闭系统中扩增细胞的可能性，中等规模，并在整个过程中进行采样和监测，以控制产品质量。 CAR T细胞疗法的开发面临一些挑战，包括细胞扩增不良、体内寿命短以及治疗患者的重大副作用。获得足够的目标T细胞以提供功能性治疗是主要挑战之一。用于临床前药物开发的材料通常来自健康捐赠者，而临床使用的材料来自接受过包括化疗、放疗、免疫疗法或所有这些组合的严酷治疗方案的晚期癌症患者。因此，临床使用的材料质量较差，变异性较高。最后，从处于危急状态的患者中采样免疫细胞将对他们的健康和生存机会产生重大影响。因此，有效的细胞扩增技术对于将CAR T细胞疗法从“实验室到床边”至关重要。 尽管取得了很大成功，但CAR T细胞疗法已被证明存在重大安全挑战。这是因为CAR T细胞可能触发称为细胞因子释放综合征(CRS)或“细胞因子风暴”的免疫反应级联反应。CRS是由T细胞的组成性过度激活引起的，导致大量促炎因子的释放，激活更多免疫细胞进入正反馈循环。CRS症状包括高烧、癫痫发作、器官衰竭、低血压和全身性炎症反应，可能导致死亡。 4.LV载体技术在T细胞工程中的应用  4.1.引言  LV载体是体外研究和开发的成熟技术，最近它们在临床应用中越来越受欢迎。事实上，LV临床应用的安全性和有效性已经为许多临床试验所证明，一些产品已经获得市场授权。图3描述了生产商业上可用的自体疗法所用的制造过程。然而，需要解决CRS、神经毒性和总体成本等挑战，以使T细胞过继疗法成为一种广泛可及的治疗。开发符合良好生产规范(GMP)的仪器、技术和技术对于LV工程化T细胞疗法的开发至关重要。在本节中，我们将介绍LV载体技术在T细胞工程中的一些应用。以下讨论了目前可用的CAR T细胞疗法、旨在将LV应用整合到T细胞工程中的技术、基于LV的T细胞疗法开发研究和开发工具、使用LV修饰的供体T细胞的异体方法以及CAR T细胞疗法的替代品。 图3. 病毒载体和自体CAR T细胞疗法生物加工。 病毒载体生物加工始于生产细胞系的扩增，例如HEK293T细胞。然后，细胞通过质粒DNA (pDNA) 载体进行转染。转染后，从细胞上清中收获产生的病毒颗粒。澄清步骤是为了去除大的杂质，如聚集体和细胞碎片；这一步骤可能包括核酸酶消化步骤。捕获步骤旨在保留慢病毒(LV)颗粒并进一步去除杂质。抛光步骤去除与LV载体物理性质相似的杂质。填充-完成步骤包括LV载体的最终配方。 自体CAR T细胞生物加工从通过白细胞分离术或白细胞分离术从患者中分离外周血单个核细胞(PBMCs)开始。为了从PBMCs中分离T淋巴细胞，可以引入使用抗体偶联磁性珠的富集步骤。使用抗CD3/CD28抗体偶联珠激活T细胞。激活后，使用慢病毒载体转导细胞，CAR治疗基因整合到目标T细胞基因组中，以产生完全功能的CAR T细胞。然后，在培养中扩增激活的T细胞，以达到治疗输注所需的细胞数量。然后收获细胞材料，并在-120°C下进行冷冻保存。然后将材料运回诊所，通过静脉输注给患者。 4.2.商业上可用的基因修饰T细胞疗法 在获得市场授权的三种CAR T细胞疗法中，brexucabtagene autoleucel (Tecartus, Kite Pharma Inc., Los Angeles, CA, USA) 和 axicabtagene ciloleucel (Yescarta, Kite Pharma Inc.) 都使用GRV载体进行转导，而 tisagenlecleucel (Kymriah®, Novartis International AG, Basel Switzerland) 使用慢病毒载体进行转导。Brexucabtagene autoleucel 和 axicabtagene ciloleucel 都使用相同的病毒载体在MSCV启动子的控制下转导转基因有效载荷。Tisagenlecleucel 使用独特的LV载体，并且转基因在EF-1a启动子的控制下。尽管目前正在对其他采用T细胞疗法的基因转移技术进行临床评估，但还没有获得市场授权，这表明逆转录病毒载体作为细胞治疗应用的基因转移工具的重要性。所有EMA和FDA批准的疗法已在表1中列出。当前的自体CAR T细胞疗法协议已建立，并在图3中展示。这种自体方法代表了商业产品的可行选择，但需要进一步改进以满足全球需求。由于成本和生产能力，目前商业上可用的LV工程化T细胞疗法仅被视为对常规化疗、放疗和免疫治疗无反应或复发的患者第二、第三或第四线治疗选择。必须同时考虑改进生产LV载体和T细胞工程所需的生物工艺和技术，以改善患者获取。为解决流程瓶颈、增强功能性和提高LV工程化T细胞疗法的安全性，已提出最近进展。 细胞和基因治疗所涉及的物流包括患者材料的采购、生产、运输、调理和药品的储存，被视为使细胞和基因治疗成为一种可行治疗解决方案的主要瓶颈之一。目前在美国进行的22天生物工艺对包括欧盟在内的其他市场构成了重大挑战，因为在收到治疗之前，患者需要两次跨越大西洋运输他们的细胞，这突显了当前自体T细胞疗法方法所面临的物流问题。为缓解这一问题，诺华公司正在增加在法国和瑞士的生产能力。 欧洲药品管理局(EMA)优先药品计划(PRIME)和美国联邦食品药品监督管理局(FDA)突破性疗法认定已开发出来，以促进在临床前研究中显示出对当前护理标准有显著改进的药品的市场批准。这三种疗法都从这种加速评估中受益，因为这些疗法对B细胞恶性肿瘤显示出高疗效，并满足了未满足的临床需求。 Tisagenlecleucel在2018年获得了FDA和EMA的批准，用于治疗套细胞淋巴瘤(MCL)。T淋巴细胞通过慢病毒载体进行修饰，以转导抗CD19 CAR，然后修饰后的细胞再输回患者体内。第二阶段的临床研究仍在进行中(ELIANA, NCT02435849)，结果已公布，并计划在2022年11月完成。第三阶段(BELINDA, NCT03570892)目前正在进行，但由于成功的加速批准状态，tisagenlecleucel可以在完成之前商业化。来自抗CD19 CAR T细胞方法的令人鼓舞的结果导致增加了努力以标准化实验开发协议并预测临床要求。 4.3.限制、安全性和有效性 尽管CAR T细胞疗法在治疗血液癌症方面取得了初步的临床成功，但安全性问题和提高实体肿瘤的疗效仍然是需要解决的障碍。除了将慢病毒基因分离到单独的质粒DNA构建中以避免RCL生成外，还对慢病毒载体进行了几项修改以提高安全性。一种减轻CAR T细胞输注后不良反应发展的解决方案是包含含有“自杀基因”的转基因。“自杀基因”允许通过添加一种特定化学试剂来选择性杀死CAR T细胞，这种试剂对未修饰的细胞本身无毒。这项技术已进展到临床前和临床阶段。例如，针对多发性骨髓瘤(MM)的抗SLAMF7疗法包含了一个二聚化结构域与caspase-9结构域自杀基因的融合，以减轻非靶向激活的风险，因为SLAMF7在包括NK细胞在内的健康白细胞上表达。作者已在体外和体内显示出疗效，并且通过添加二聚化剂AP1903 (利米杜西)可以消除修饰的细胞。 CAR T细胞制造的另一个相关风险是其他细胞类型与转基因的转导。单个白血病B细胞的转导导致了接受抗CD19 CAR T细胞疗法tisagenlecleucel (Kymriah)治疗的患者中耐药转基因克隆的发展。这导致了在制造过程中由于CAR治疗基因的顺式整合而掩盖了目标CD19表位。尽管这是一个罕见的事件（当时治疗的369名患者中有1名），但使用具有广泛嗜性的整合载体可能代表一个严重的安全问题。用于这种疗法的载体使用了VSV-G包膜蛋白进行假型化，这赋予了载体广泛的嗜性。建议工程化更具体的嵌合包膜蛋白作为一种解决这个问题的方法。基于麻疹包膜的嵌合蛋白能够靶向仅在T细胞上存在的CD3受体。在人源化小鼠模型中的体内数据显示了这种载体的特异性，甚至允许体内基因传递以产生功能性CAR T细胞转导。尽管需要更多的工作，但这种方法可以解决体外转导期间潜在的非靶向转导问题。 已经报道了开发不表达CD19抗原的耐药淋巴瘤B细胞，导致CAR T细胞治疗患者复发的情况。为了解决耐药癌症的发展，提出了转基因工程。已经在体外测试了将两到三个CAR构建体引入每个工程细胞，并正在进行临床研究，以防止对CAR疗法产生耐药性的出现，取得了令人鼓舞的结果。 CAR表达水平被证明影响临床结果。仔细选择和设计驱动CAR基因表达的启动子，可以提高CAR表达。CAR转基因的不同组成部分，如跨膜和铰链结构域，也显示出影响CAR表达。优化嵌合受体内细胞和外细胞结构域设计的努力正在进行中。 尽管在治疗血液癌症方面取得了初步成功，CAR T细胞疗法在治疗实体肿瘤方面遇到了障碍，并且成功率有限。实体肿瘤的物理特性以及肿瘤微环境(TME)限制了CAR T细胞有效接触和杀死癌细胞的能力。经常引用的障碍包括细胞穿透肿瘤床的困难、肿瘤内恶劣的生理条件以及癌细胞产生的免疫抑制调节蛋白。这些障碍在血液癌症中不存在，因为它们不形成实体肿瘤癌症类型中看到的大肿瘤床，从而解释了抗CD19 CAR疗法所遇到的成功。最后，为了解决遇到的局限性和安全问题，已经提出了LV和RV载体的替代品。电穿孔就是这样一种替代品，它包括通过细胞传递电流引入pDNA。电流暂时在细胞中生成孔隙，并将带负电荷的mRNA通过细胞悬浮液并进入细胞。由于这种基因转移技术的非整合性质，可以提高安全性，因为随着mRNA的降解和通过细胞分裂的稀释，转基因的表达将逐渐减少。 尽管这些技术提供了安全优势，但长期疗效仍需要在人类试验中得到证明。 4.4.开发基于LV的CAR T细胞疗法研究工具 除了作为将CAR转基因转移到T细胞中的有效和安全工具外，LV载体还被用于开发体内和体外模型。开发体外和体内模型的一个重要部分是开发表达CAR T细胞疗法靶向的肿瘤相关抗原(TAA)的靶细胞。由于患者材料是稀缺资源，并且在伦理上不能在每个研究和开发研究中使用，因此永生化细胞系已成为测试CAR T细胞在临床前研究中性能的流行癌症模型。LV载体已被用于快速修改永生化细胞系，以获得稳定的靶TAA表达，并使用修饰的细胞开发体外杀伤测定，这对于证明疗法的效力和特异性至关重要。然后可以将相同的靶细胞系重新利用并移植，以在体内产生肿瘤模型，以研究疗法的安全性和有效性。小鼠模型在CAR T细胞疗法的体内测试中发挥了重要作用，并用于测试治疗效果和安全性的不同方面。小鼠模型可以分为四类：同系免疫能力，人类异种移植，免疫能力转基因和人源化转基因。所有这些模型都注入了人类或小鼠癌细胞系，以测试CAR T细胞，并且对于理解肿瘤发展和全身对疗法的免疫反应至关重要。提供证据表明在临床前阶段开发的疗法既安全又有效，也是进入人体临床阶段的先决条件。 4.5.开发整合LV的T细胞生物工艺仪器 自体CAR T细胞疗法已被证明是有效的；然而，仍有许多挑战需要解决。生物反应器制造商一直在设计符合GMP生产要求的平台，包括在封闭系统中进行特定适应性改造，以适应T细胞生物加工，例如德国哥廷根Sartorius的ambr 250，美国马萨诸塞州剑桥Aastrom Biosciences的Replicell™系统，瑞士巴塞尔Lonza的Cocoon，以及美国科罗拉多州Lakewood Terumo BCT的Quantum细胞扩增系统。这些系统中最受欢迎的是德国Bergisch Gladbach Miltenyi的CliniMACS Prodigy生物反应器平台。它是一种一次性、完全封闭且符合GMP的T细胞工程解决方案。这个生物反应器有一个培养室，包括一个用于介质交换和配方的离心机，并且可以在较低级别的洁净室环境中操作。该平台包括病毒载体应用线，允许T细胞疗法制造商将LV转导完全整合到生产过程中。它适合自体方法，因为规模仅适应于每个仪器生产单一剂量。尽管这种解决方案不允许规模化生产，但它代表了有希望的规模化解决方案，并且可以用于分散模型，其中剂量更接近或在临床现场生产。这项技术已在I期临床试验现场使用，研究了一种针对非霍奇金B细胞淋巴瘤的双重抗CD19抗CD20 CAR T细胞疗法。14天的生产过程完全整合了使用LV载体转导抗CD19/CD20 CAR基因。在治疗的8名患者中，所有治疗剂量都通过了释放标准，超过了输注所需的细胞数量，并成功给药。这些技术可以提供提高产品质量和生产灵活性的解决方案，并且还可以降低生产成本、物流复杂性和产品变异性。 4.6.使用LV载体的CAR T细胞异体方法 自体CAR T细胞疗法已被证明是当前治疗应用的有效策略。起始细胞材料直接来自患者，减少了与移植物抗宿主病(GvHD)相关的风险。此外，材料的自体性质不会导致产生抗HLA供体特异性抗体(DSAs)，这可能限制了整个器官移植和异体T细胞的剂量数量和体内持久性。尽管自体T细胞疗法已被证明更容易开发，但主要限制使这种方法难以扩大规模，以减少生产时间和成本。起始材料的变异性加上低细胞扩增潜力使得在自体T细胞扩增期间难以实现治疗剂量。这是由于从接受多条治疗线的患者中获取的材料的性质，这些患者在接受细胞疗法之前已经符合条件。此外，材料的自体性质意味着每个剂量都特定于每个患者，这排除了任何大规模生产选项，只留下了定制的规模化选项。由于所有这些限制，人们越来越关注一种一刀切模型中的异体方法。在这种情况下，材料将来自通用来源，如基因修饰的供体T细胞、脐带血(UCB)、胎盘、永生化细胞系或诱导多能干细胞(iPSC)衍生的T细胞，为大规模生产打开了可能性。目前，只有基因修饰的供体T细胞和永生化细胞系方法已经进展到临床阶段，因为干细胞衍生的方法仍需要进一步的临床前优化。 2015年，在伦敦大奥蒙德街医院对两名儿童进行了首次异体CAR T细胞疗法的概念验证人体测试。该技术结合了使用抗CD52血清疗法的淋巴细胞清除，然后在CAR T细胞输注之前使用UCART19技术。使用慢病毒载体引入抗CD19 CAR治疗基因，并使用转录激活因子样效应核酸酶（TALEN），这是一种基因编辑工具，用于敲除供体T细胞中的CD52和TCR基因，以避免淋巴细胞清除和避免GvHD。该研究结果显示，在异体CAR T细胞输注后，两名患者在输注后28天实现了分子缓解。UCART19由Cellectis独家授权给Servier，Servier赞助了两项I期临床试验，分别于2016年开始，2020年完成。共有7名儿童和14名成人患有B细胞急性淋巴细胞性白血病。两项试验的发表结果显示，最常见的副作用是CRS（91%）和神经毒性（38%），导致两例治疗相关死亡。总体存活率为55%，无进展生存率为27%。在UCART190初步成功的基础上，Cellectis、Allogene和Servier开始研究使用TCR和CD52 KO CAR T细胞以及抗CD52重组抗体治疗复发或难治性大B细胞淋巴瘤或滤泡性淋巴瘤。异体CAR T细胞（ALLO-501）的给药是在患者自己的免疫细胞使用氟达拉滨、环磷酰胺和重组抗CD52抗体（ALLO-647）进行淋巴细胞清除后进行的。这项技术目前正在22名患者（NCT03939026）的I期、单臂、开放标签试验中进行研究。2020年在美国临床肿瘤学会上提出的初步数据显示，ALLO-501和ALLO-647在19名患者中有12名（63%）产生了客观反应率（ORR），其中37%的有反应患者完全反应（CR）。 尽管异体T细胞供体方法显示出有希望的结果，但仍然需要更多的步骤来敲除或抵消可能引起GvHD的免疫原性T细胞生物学特征。将LV载体技术整合到最先进的异体CAR T细胞疗法生物工艺中，进一步证明了这种方法在T细胞工程中基因转移的相关性。如果正在进行的临床试验获得市场批准，对临床级LV载体的需求和全球供应的压力将进一步增加。这突显了改进工艺和技术以增加T细胞工程LV载体的生产和质量的必要性。 4.7.稳定生产慢病毒载体以满足载体需求增长 为了满足全球需求，已投入努力改进当前的LV生物加工协议，并开发技术以增加生产。大型制药公司一直在投资研究和开发旨在解决瓶颈的技术。一个主要限制是使用HEK293T细胞系生产的LV载体的规模。尽管这种HEK293T粘附细胞与质粒DNA LV系统的瞬时转染可以实现高滴度，但这种细胞系的粘附性质代表了传统规模扩大解决方案（如搅拌罐生物反应器生产）的障碍。近年来，人们尝试解决这种生产方法提出的几个瓶颈。已建议使用专用包装细胞系稳定生产LV载体，作为减少瞬时生产模型中需要大量GMP级质粒DNA的成本的潜在解决方案。在稳定包装细胞系（PCL）中，LV生产所需的病毒基因被稳定地转导到PCL基因组中。可以选择高滴度产生克隆进行载体生产。这种方法已经显示出一些令人鼓舞的结果，尽管与瞬时转染相比滴度仍然较低是一个主要障碍。除了稳定的PCL外，还建议开发HEK 293T细胞的悬浮变体作为替代方案。最近，Chen等人（2020年）在他们的细胞系中结合了悬浮和稳定方面，使用单一稳定转染构建体产生与瞬时转染系统相当的LV滴度。这项技术在搅拌罐生物反应器中进行了测试，提供了扩大生产的潜力；CAR T细胞疗法被引用为潜在应用之一。这项技术最初由意大利米兰的Telethon基因治疗研究所（TIGET）和美国旧金山的Cell Genesys开发，并在罕见疾病战略联盟下转让给GlaxoSmithKline，并获得了专利（专利号PCT/EP2016/078336），概述了未来商业化的潜力。 4.8.针对CAR T细胞疗法应用的专用慢病毒技术 除了提高LV载体的全球生产能力外，为CAR T细胞应用开发专用LV颗粒还可以改善疗法生物加工和生物功能。当使用LV载体进行基因传递时，激活T细胞对于实现高效率的转导至关重要。T细胞的激活还利用了免疫细胞在对抗原反应时自然克隆扩增的能力。T淋巴细胞的这种生物学特性被用来从通过白细胞分离术获得的初始样本中产生足够数量的细胞以治疗患者。这个过程通常使用与抗CD3和抗CD28抗体结合的磁性或聚合物珠子进行，如表2所示。LentiSTIM和RetroSTIM技术（专利号PCT/GB2016/050537）已经开发出来，结合了CAR T细胞的转导和激活。在LV载体从生产细胞出芽时，一些细胞蛋白被携带在病毒包膜上[144]。这种LentiSTIM颗粒是在表达抗CD3和抗CD28膜结合有丝分裂原的细胞系中产生的，随后在LV包膜从生产细胞膜出芽时出现在LV包膜上。同样的方法也被用来在LV包膜上表达生物素基团，以改善下游纯化。这项技术通过减少所需的试剂和工艺步骤以及提高载体纯度，简化了CAR T细胞的生产。 4.9.使用慢病毒技术替代CAR T细胞疗法的方法 TCR T细胞疗法是针对恶性肿瘤的CAR转导T细胞的替代品。这种疗法不是依赖于嵌合抗原受体，而是依赖于修改过的T细胞受体。T细胞被设计为表达具有特定亲和力针对目标抗原的TCR，这种疗法的生产过程与CAR T细胞疗法相同。TCR T细胞的主要优势是，工程化受体使用与未修饰T细胞相同的激活和免疫途径，从而降低了CRS和神经毒性的风险。Adaptimmune Therapeutics, PLC是特定肽增强亲和力受体（SPEAR）技术的拥有者，目前正在赞助或授权几项临床试验，用于治疗实体瘤癌症。SPEAR T细胞包含优化的TCR，并使用编码TCR转基因的慢病毒载体进行生产。首个完成的II期试验是由GlaxoSmithKline赞助的“重定向自体T细胞治疗晚期骨髓瘤”试验（NCT01352286），在第42天有20/25名患者（80%）达到客观反应率（ORR），1年后有11/25名患者（44%）。SPEAR T细胞也在Adaptimmune赞助的II期SPEARAD 1（NCT04044768）和2（NCT04408898）试验中进行临床测试，研究ADP-A2M4疗法治疗滑膜肉瘤、黏液性脂肪肉瘤和头颈癌。重新定向用于通用细胞因子介导杀伤或TRUCKs是另一种替代CAR的受体类型。有时被称为第四代CAR T细胞，TRUCKs已经开发出来，通过细胞因子释放改善CAR T细胞在实体瘤中的效力。当CAR与其目标抗原结合时，基因修饰的T细胞会释放特定的细胞因子，从而抵消肿瘤微环境（TME）的免疫抑制作用。TRUCKs目前正在进行临床研究，并可以提供改善实体瘤中CAR活性的答案。例如，针对转移性结直肠癌的抗EGFR-IL12-CART目前正在进行测试（NCT03542799）。已经开发了特定的慢病毒技术，使用单一慢病毒构建体转导所有生产完全功能的TRUCK所需的元素，进一步提高了这类基于T细胞的免疫疗法的吸引力。 除了嵌合抗原受体的替代品外，还考虑了新的T细胞亚群作为新的潜在治疗细胞。在新的候选细胞中，γδ T细胞、自然杀伤T（NKT）和调节性T（Treg）细胞被建议作为细胞过继治疗和慢病毒技术的有前景的替代细胞类型。γδ T细胞占CD3+ T细胞群体的1-10%。它们是一种高度保守的免疫细胞类型，已经显示出对过继T细胞治疗应用的吸引力。这些包括它们强大的移植物抗肿瘤（GVT）活性以及与异体移植的低GVHD潜力。一项追踪108名癌症患者在接受HSCT后长达3个月的免疫剖面的研究显示，高水平的γδ T细胞与显著更高的总生存率和无复发生存率相关。已经发布和开发了使用慢病毒载体培养和转导γδ T细胞的协议和专利，以包括未来生产的适应性，如无血清培养基培养。一些研究已经进展到I期测试，例如IN8BIO Inc.技术NC200临床试验研究使用慢病毒修饰的γδ T细胞靶向成人胶质母细胞瘤（GBM）。不变自然杀伤T细胞或iNKT细胞也被认为是CAR T细胞治疗的有前景的T细胞亚群。与γδ T细胞一样，它们是T细胞的罕见亚群，占循环PBMCs的不到1%。它们在免疫调节中发挥重要作用，并且已经显示出强大的抗肿瘤活性。iNKT的一个显著优势是能够在不引起GVHD的情况下移植它们，使它们成为“现成”应用的强有力候选者。iNKT细胞已在多项临床试验中使用，包括针对神经母细胞瘤等实体瘤的疗法。使用GRV载体将抗GD2 CAR构建体转导到iNKT细胞中，以靶向神经母细胞瘤。临床前数据对显示体内有效性且无显著毒性，这导致了临床阶段的进展。正在进行的I期临床研究调查CAR iNKTs称为GINAKIT细胞（NCT03294954）与抗体疗法联合治疗复发或难治性高危神经母细胞瘤在1至21岁患者中的有效性。iNKTs也在针对血液癌症的测试中，例如，针对复发、难治、高危B细胞肿瘤的抗CD19 CAR-iNKT疗法目前正在I期试验中（NCT04814004）。 调节性T细胞或Tregs是CD4阳性T细胞的一个亚群，其主要作用是控制免疫反应。与执行促炎功能不同，Tregs对其他免疫细胞类型具有抑制作用，控制对外国病原体的免疫反应并预防自身免疫疾病。Tregs已被建议用于新的有前景的治疗应用，并扩展了过继T细胞治疗的范围，超越了肿瘤学。由于它们自然抑制免疫反应的能力，这些细胞特别适合治疗自身免疫疾病和预防移植物受者的GvHD。首个人体Treg临床试验测试Sangamo CAR Treg产品TX200-KT02已获批准进行I/IIa期（2019-001730-34）。Tregs使用慢病毒载体转导，以表达针对受体的HLA A*2的CAR受体，并预防患有终末期肾病（ESRD）患者的免疫介导的同种异体移植排斥反应。 5.结论  慢病毒载体在基因修饰T细胞治疗的发展中发挥了重要作用。这些逆转录病毒载体代表了一种安全有效的基因转移工具，已经应用于CAR-T细胞疗法近期进展到市场所需的许多开发步骤。慢病毒载体不仅直接应用于CAR治疗基因的转移，还用于开发体外和体内测试所需的靶细胞。慢病毒载体在T细胞治疗发展中的重要性不仅体现在它们整合到T细胞治疗协议中，还体现在用于其制造的仪器设计中。疗法通过后期临床试验的进展和监管机构设立的快速通道计划的准入，以及生物技术和制药行业的积极参与，预示着T细胞治疗在肿瘤治疗武器库中的未来重要性。尽管已经提出了基因转移的替代品，但慢病毒和γ-逆转录病毒载体目前是基因修饰T细胞治疗制造最先进的方法。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：病毒载体和病毒样颗粒(VLPs)疫苗是新型疫苗设计平台，用以克服传统疫苗的局限性。病毒载体疫苗高效且能快速激发保护作用。许多基于重组病毒载体的人类疫苗候选株，基于不同病毒科的病毒，如腺病毒科、逆转病毒科、副黏病毒科、弹状病毒科和细小病毒科。此外，首个获批用于人类疫苗接种的病毒载体疫苗是日本脑炎病毒疫苗。此后，已有几种病毒载体获批用于针对拉沙热病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、SARS-CoV-2病毒和疟疾的疫苗接种。VLPs是能模仿病毒颗粒的纳米颗粒，由结构蛋白的自组装形成，针对乙型和戊型肝炎病毒、人乳头瘤病毒以及疟疾的VLPs疫苗已商业化。正如COVID-19疫苗加速生产所证明的，这些新方法对于疫苗学以及针对病原体和新出现大流行威胁的快速响应是重要的工具。 1.引言 疫苗学的时代始于1789年，当时爱德华·詹纳开发了第一种针对天花的疫苗。从那时起，疫苗预防了数百万人死亡，并且在1978年甚至导致了这种疾病的根除。在19世纪，巴斯德开创了基于病原体灭活或减毒的疫苗发展。在20世纪下半叶，使用细胞培养来培养病毒，促进了几个灭活和减毒疫苗的发展。有关疫苗历史的综述， 在20世纪末分子生物学出现之前开发的常规疫苗包括灭活或减毒病原体、类毒素、基于蛋白的疫苗或细菌多糖。因此，它们的使用减少了如脊髓灰质炎、麻疹、破伤风和白喉等疾病的影响。尽管经过数十年的深入研究，针对某些人类病原体的有效疫苗尚未开发出来，例如，那些表现出高度遗传变异性（如人类免疫缺陷病毒[HIV]和丙型肝炎病毒）、导致持续或潜伏感染（如HIV、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、Epstein-Barr病毒）或未能诱导无菌免疫的病原体。此外，传统疫苗存在几个缺点，如安全问题，包括减毒活病毒恢复毒力的风险、与活生物污染的可能性以及对免疫系统减弱人群的风险。同时，疫苗生产成本高昂且耗时，需要更高水平的生物安全和专业实验室。近几十年来，新的有希望的疫苗平台已经出现，这些平台得到了遗传工程、分子和细胞免疫学、结构生物学、生物信息学、计算生物学、纳米技术、合成生物学等领域进展的支持，如重组病毒载体、病毒样颗粒(VLPs)、mRNA、合成DNA和细菌载体疫苗。此外，疫苗设计新技术是疫苗学中的重要工具，用于克服传统技术的限制，并促进对新威胁（如新出现的病原体和大流行爆发）的快速和有效响应。在这篇综述中，我们旨在总结病毒工程的最新进展，这些进展导致了针对当前流行病病原体（如流感、埃博拉、艾滋病和COVID-19）的安全有效疫苗的开发，特别关注病毒载体和基于VLP的疫苗平台。 2.基于病毒载体的疫苗  重组病毒是经过基因改造并设计用作针对传染病和抗癌及基因疗法的疫苗。具体来说，20世纪90年代开始使用病毒载体进行基因疗法。从这一点开始，遗传工程、重组DNA技术以及发展反向遗传技术以恢复重组病毒，促进了基于载体的疫苗平台的发展。病毒载体是通过将外来抗原或转基因（如感兴趣的免疫原）通过重组DNA工程插入病毒遗传物质构建的。此外，病毒载体被特别修改以根除其固有的致病属性。然后使用新构建的病毒载体将抗原基因传递给宿主，在那里它被短暂地高度表达以引发强大的免疫反应。此外，构建了多价或多病原体疫苗，以同时从同一或不同病原体表达各种转基因。而且，在被动免疫中，重组病毒携带抗体转基因。 迄今为止，已经设计了两种主要类型的病毒载体：复制型和复制缺陷型载体。复制型载体扩增转基因并产生感染性后代，而非复制型载体传递单一的转基因副本而不复制，这提高了其安全性。复制型载体通过模仿自然感染产生强烈的免疫反应。复制缺陷型载体在外来启动子的控制下表达免疫原，产生较弱的疫苗反应，可能需要使用佐剂。复制型载体包括腺病毒、逆转录病毒、弹状病毒和副黏病毒载体，而复制缺陷型载体包括腺病毒、逆转录病毒和腺相关病毒载体（表2）。还有单周期病毒载体可用，它们通过一轮复制增加抗原表达并避免病毒后代的形成。已从腺病毒和弹状病毒开发出单周期载体。病毒载体疫苗通常极其有效，并通过诱导强烈的体液和细胞免疫反应（包括干扰素和炎症细胞因子的产生）提供快速保护。通常不需要使用额外的佐剂，这简化了疫苗的组成和配方过程。表1总结了基于病毒载体的疫苗的主要优点和缺点。有关载体疫苗免疫反应的综述。 许多基于病毒载体的疫苗已获准用于兽医用途，如犬瘟热病毒、猫白血病病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒和马立克病。例如，基于NDV的流感疫苗保护鸡免受高致病性禽流感的侵害，并在墨西哥和中国作为兽医疫苗使用。牛痘病毒是第一个作为针对乙型肝炎的疫苗载体开发的。2010年，针对黄病毒属日本脑炎病毒的第一种病毒载体疫苗ChimeriVax-JE(Imojev)获准用于人类。ChimeriVax-JE是一种利用黄热病黄病毒株17D构建的减毒活疫苗，通过用日本脑炎病毒的相应序列替换编码前膜和包膜蛋白的序列。这个载体在澳大利亚和亚洲商业化，单剂量可迅速引发免疫反应，具有良好的安全性。 尽管目前只有少数病毒载体疫苗获准用于人类（表3），但针对SARS-CoV-2的腺病毒载体疫苗的广泛使用已被证明是安全的。因此，目前正在进行许多使用重组病毒载体疫苗的临床试验。有关在欧洲进行的病毒载体疫苗临床试验的综述。 许多基于人类的重组疫苗候选株都是基于腺病毒科、逆转录病毒科、痘病毒科、副黏病毒科、弹状病毒科、黄病毒科、togavirus科和细小病毒科的病毒，其中腺病毒和逆转录病毒是最广泛使用的载体。然而，那些被选为设计疫苗的载体是根据要插入的基因的特性以及与预先存在的免疫力、病毒复制和遗传稳定性相关的安全问题来选择的。下面总结了被选为设计基于病毒的疫苗的五种主要类型的病毒载体（表2）。 3.用于开发疫苗的主要病毒载体  3.1.腺病毒载体 腺病毒（Ad）载体已被广泛用作基因治疗的工具，并且是最常见的疫苗平台之一。腺病毒科由非包膜的双链线性DNA病毒组成，长度范围从26到45 kb。基因组包含五个早期转录基因（E1A、E1B、E2、E3和E4）、四个中间转录单元（IX、IVa2、L4中间和E2晚期）、五个晚期单元（L1-L5）以及两端的两个倒置末端重复（ITR）序列。二十面体衣壳由三种主要蛋白质组成：纤维蛋白、五聚体和六聚体，后者是最丰富的蛋白质，含有主要的中和表位。存在100多种不同的人类腺病毒血清型，分为七个不同的物种（A-G）。最初，Ad5和Ad2是最广泛用于构建载体的血清型，因为它们最容易操作，生产和免疫原性都很高。然而，由于预先存在的免疫力，Ad5已被其他血清流行率较低的血清型所取代，如Ad6、Ad26和Ad35。此外，还开发了针对不同病原体和疾病的猴源腺病毒载体，包括流感、HIV、埃博拉、SARS-CoV-2和疟疾。 使用腺病毒载体的优点包括增加转基因转导能力、广泛的细胞嗜性、能够感染分裂和非分裂细胞以及抗原呈递细胞，以及它们不整合到宿主基因组中（表2）。此外，重组基因组在连续传代中表现出稳定的维持，这有助于快速和大规模生产，并产生高滴度稳定库存。如上所述，腺病毒载体的主要缺点是预先存在的免疫力和载体本身的免疫原性。这是因为腺病毒具有很强的免疫原性，能够引起针对Ad主要衣壳蛋白的高滴度中和抗体。 根据病毒基因组编辑，Ad载体被分类为第一代、第二代或第三代载体（图1a）。然而，第一代载体已从病毒复制基因E1B和E1A中移除。此外，通过同源重组插入外源基因以及E3基因的删除，使得转基因的大小从5增加到8 kb。E3产物的删除促进了免疫原性，因为它对于抑制宿主的免疫反应至关重要。在第二代Ad载体中，E4和E2区域的删除增加了转基因容量并减少了宿主细胞中的毒性。第三代Ad载体，称为无肠道载体或助手依赖载体，除了包装信号Ψ和对病毒包装至关重要的ITR序列外，大部分结构和功能基因都被删除（图1a）。这些载体可以容纳高达35 kb大小的转基因。助手依赖载体在保持免疫反应的同时提高了安全性。 图1. 不同基于病毒的载体示意图：(a) 腺病毒载体。在第一代载体中，腺病毒基因组的E1A、E1B和E3基因被删除；在第二代载体中，额外删除了E2和E4基因；在第三代载体或无肠载体中，除了包装信号Ψ和ITR序列外，大部分病毒基因被删除。(b) 慢病毒载体。包含转移载体质粒（带有慢病毒5'和3' LTRs，修改为自灭活和转基因）的第三代慢病毒载体；包含一个启动子和HIV env或VSG-G的假型慢病毒颗粒的包膜质粒；以及分别编码gag或pol和rev的两个包装质粒。(c) 副黏病毒载体。显示了NDV载体。使用T7启动子系统从克隆的DNA（cDNA）中恢复NDV。NDV，新城疫病毒；T7Pro，T7聚合酶启动子；T7ter，T7末端序列。ITR，反向末端重复；Ψ，包装信号；LTR*，自灭活长末端重复。使用BioRender.com创建。 Ad载体通常是复制缺陷型的。此外，通过删除IIIa衣壳水泥蛋白设计了单周期Ad载体；例如，用于针对埃博拉病毒和SARS-CoV-2的疫苗。使用动物模型进行的几项临床前研究导致了良好的免疫反应，使得单周期Ad载体用于人类疫苗的开发非常有希望。 使用Ad载体技术的疫苗已经为广泛的病原体开发（表3）。一些Ad载体疫苗仍在研究中，而针对埃博拉病毒和SARS-CoV-2的疫苗已经被商业化，正如我们将在以下部分讨论的。 3.2.逆转录病毒载体 在腺病毒之后，慢病毒是病毒载体设计中第二常用的载体。慢病毒，如HIV-1，属于逆转录病毒科，这是一类包膜的单链RNA病毒。进入宿主细胞后，RNA被逆转录成DNA并整合到染色体DNA中。基因组编码三个必需基因（gag、pol和env）以及几个调节和辅助基因，用于小型六蛋白（tat、rev、vif、vpr、vpu和 nef），这些基因对于病毒复制、感染和灭活宿主限制系统至关重要。gag基因编码结构蛋白，pol基因编码蛋白酶、这一组特有的逆转录酶和整合病毒DNA到宿主基因组所需的整合酶。env基因编码包膜（Env）糖蛋白，gp160，它经过蛋白水解裂解产生gp120和gp41跨膜糖蛋白。 慢病毒载体在免疫方面具有巨大潜力，因为它们最佳地转导树突细胞并有效刺激T和B淋巴细胞。临床前研究表明，慢病毒载体能够引发强烈且持久的体液和T细胞反应，为许多传染病提供有效保护。导致慢病毒载体广泛使用的其他优点包括它们增强的能力来携带大型转基因（<8 kb），它们整合到宿主基因组中，确保了高水平和持久的转基因表达，它们在分裂和非分裂细胞中的高转导效率，以及它们的低遗传毒性和免疫原性，包括低抗载体免疫。然而，慢病毒载体的广泛使用可能受到相对较高的生产成本和与大规模制造相关的技术挑战的阻碍。主要缺点源于它们的整合，这可能诱发肿瘤发生（表2），尽管基于慢病毒的基因疗法临床研究表明插入性突变的风险很低。此外，慢病毒的前病毒整合位点不是随机的，而是相对非特异性。对于HIV，位点整合的偏好包括活跃转录的基因，而不是启动子区域。尽管如此，通过突变病毒整合酶已经为疫苗生产了非整合慢病毒载体。 大多数慢病毒载体是从HIV产生的。第一代慢病毒载体是使用三质粒表达系统开发的，该系统包括携带gag和pol基因以及辅助和调节基因的包装质粒；包膜质粒；以及带有被慢病毒长末端重复序列(LTR)包围的转基因盒的转移质粒（图1b）。慢病毒载体的细胞嗜性可以通过伪型化来修改，从而增加病毒的嗜性。在伪型化载体中，病毒受体结合蛋白Env被异源包膜糖蛋白所取代，其中弹状病毒狂犬病病毒(VSV-G)的G蛋白是最常用的。缺乏对伪型化慢病毒载体的预先存在的免疫力，加上它们低促炎特性，使它们成为粘膜疫苗策略的合适候选者。第二代慢病毒载体通过从包装质粒中删除辅助毒力基因vif、vpr、vpu和nef而变得更安全。第三代慢病毒载体目前用于基因传递，也通过疫苗接种诱导强烈的免疫。在第三代载体中，病毒基因组被分离成三个不同的质粒（gag/pol、rev和env或VSV-G）。为了防止整个HIV基因组的转录，转基因被包含在一个额外的含有用于自我失活的慢病毒LTR序列的质粒中（图1b）。 慢病毒载体作为癌症疫苗的使用也在研究中，特别是用于黑色素瘤、淋巴瘤和前列腺癌。正如下一节将讨论的，已经设计了许多针对不同病原体的慢病毒载体，如流感病毒、西尼罗河病毒、HIV-1和SARS-CoV-2。 3.3.腺相关病毒载体 在腺病毒和慢病毒之后，腺相关病毒（AAVs）是第三广泛使用的病毒载体。AAVs是一种属于细小病毒科的非包膜单链DNA病毒。AAVs是依赖性病毒，因为它们需要辅助病毒，如腺病毒或单纯疱疹病毒，才能复制。大多数AAV载体已用于基因治疗。AAV载体可以感染分裂和非分裂细胞，并携带高达5 kb大小的转基因。AAV载体主要作为游离基因组存在，并以较低频率整合到第19号染色体。它们的优点包括缺乏致病性、广泛的嗜性、低免疫原性、易于生产，并能够建立长期的转基因表达。主要缺点是转基因的大小有限（表2）。构建AAV基载体时，病毒复制（rep）和结构（cap）基因被转基因表达盒（转基因以及启动子和调控元件）替换，该表达盒由AAV ITRs包围。几种基于AAV载体的疫苗候选物已被评估，它们编码针对病原体如尼帕病毒、登革热病毒、人乳头瘤病毒（HPV）、HIV、埃博拉病毒（EBOV）、流感病毒和SARS-CoV-2的抗原。此外，还开发了许多基于AAV的载体，用于被动免疫策略，以传递中和抗体的基因。这种策略针对HIV、流感病毒和呼吸道合胞病毒（RSV）等几种病原体产生持续的抗体表达，对于这些病原体，疫苗尚未可用或效果较差。例如，已证明通过鼻腔给药AAV血清型9载体表达重组单克隆抗体palivizumab，可以有效保护小鼠模型免受RSV挑战。 3.4.弹状病毒载体 已开展了许多基于弹状病毒载体的疫苗候选物的临床前和临床研究，包括一些商业化的病毒载体疫苗（表3）。然而，与腺病毒、AAV和慢病毒载体相比，进行的研究数量较少。弹状病毒科由具有典型子弹形状的包膜病毒组成，它们具有非分段的负义单链RNA基因组。基因组编码五种结构蛋白：核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和大聚合酶（L）。反向遗传技术的使用已使负义RNA病毒能够从克隆的DNA中恢复。1994年首次开发该系统，用于从cDNA中恢复狂犬病病毒。其基因组的模块化组织便于通过反向遗传学进行基因修饰，并提供比大多数更复杂的DNA和正义链RNA病毒更大的操控性。 使用弹状病毒载体的优点包括转基因大小（高达6 kb），这允许表达多价弹状病毒疫苗的多种抗原，细胞质复制，这降低了病毒整合到宿主基因组的可能性，低或不存在预先存在的免疫力，以及在组织培养中高滴度复制（表2）。基于弹状病毒的疫苗候选物主要使用狂犬病病毒和VSV。许多基于弹状病毒的载体是减毒的复制型，尽管也设计了单周期载体。此外，在基于VSV的伪型载体中，G蛋白（病毒神经毒性的主要贡献者）被另一种糖蛋白所取代。然而，复制缺陷的弹状病毒载体疫苗的免疫原性较低。 已开发了相当数量的重组狂犬病病毒，用作针对HIV、淋巴细胞性脑膜炎病毒、埃博拉和马尔堡病毒、拉沙热病毒、裂谷热病毒和SARS-CoV-2等多种病原体的疫苗载体。特别是，表达拉沙热病毒糖蛋白复合物的狂犬病病毒载体疫苗，是一种针对拉沙热病毒和狂犬病病毒的灭活双重候选疫苗。这种载体在小鼠和豚鼠模型中诱导了针对拉沙热病毒和狂犬病病毒的持久体液反应，并提供了针对拉沙热病毒的有效保护。 与狂犬病病毒不同，VSV会在牛、马和猪中引起疾病，但不会在人类中引起。编码外源蛋白的重组VSV是针对HIV、EBOV、结核病和SARS-CoV-2等疫苗载体的优秀候选物。使用VSV载体进行的首次成功试验之一是使用基于VSV的载体编码流感病毒血凝素抗原对小鼠进行疫苗接种。还开发了针对致命的新兴副黏病毒亨德拉和尼帕病毒的基于弹状病毒的疫苗候选物。在许多情况下，受体结合G糖蛋白被免疫原所取代。如上所述，VSV的G糖蛋白也可以被纳入伪型慢病毒载体。 至少有两种基于重组VSV的疫苗已获准用于人类，即rVSV-ZEBOV和GamEvac-Combi，后者结合了表达EBOV包膜糖蛋白的重组VSV和Ad5（表3）。 3.5.副黏病毒载体 副黏病毒科由具有负义单链RNA基因组的包膜病毒组成。副黏病毒基因组的组织与弹状病毒相似，编码五种结构蛋白：核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、附着糖蛋白（HN/G）和大聚合酶（L）（图1c）。与弹状病毒类似，副黏病毒的模块化基因组便于通过反向遗传学进行操作。麻疹病毒（MV）于1995年首次恢复，NDV于1999年恢复。许多基于副黏病毒的疫苗载体基于MV、人副流感病毒3型（HPIV3）和NDV。 基于副黏病毒的载体提供了几个优点。它们不整合到目标细胞的基因组中，而是仅在细胞质中复制，没有DNA中间体。它们可以容纳6 kb的插入大小，提供高且稳定的异源基因表达，具有黏膜疫苗接种的潜力，制造简单且成本效益高。在NDV载体疫苗的情况下，它们基于卵清的性质使它们适合大规模生产（表2）。 由于使用减毒活麻疹病毒取得了巨大成功，因此很早就开始将其作为疫苗载体用于病毒载体疫苗学领域。不同的麻疹病毒基载体已在针对HIV、RSV、登革热、SARS-CoV、MERS-CoV、基孔肯雅、埃博拉和寨卡病毒、乙型肝炎、西尼罗河和SARS-CoV-2等广泛病原体和病毒的临床前和临床试验中使用。 天然无致病性的NDV株作为家禽业中活减毒疫苗的广泛使用。NDV载体疫苗也已开发用于兽医用途。此外，由于宿主范围有限且缺乏预先存在的免疫力，NDV基载体在人类中使用是安全的。已设计NDV载体来携带来自EBOV、流感病毒、HIV、SARS-CoV和尼帕病毒等的抗原。还描述了使用编码SARS-CoV-2 S蛋白的NDV载体（表3）。 基于HPIV3的载体疫苗已针对EBOV、RSV和SARS-CoV开发，包括针对儿童COVID-19疫苗的候选疫苗，但并未达到MV和NDV载体疫苗的程度。 4.病毒样颗粒  VLPs是由病毒结构蛋白自组装形成的纳米颗粒，它们模仿病毒颗粒。VLPs不含遗传物质，因此是复制缺陷型和非感染性的。这显著提高了它们的安全性，与减毒活疫苗或重组病毒载体相比，因为不会像病毒载体疫苗那样合成更多的免疫原副本。VLPs可分为两类：非包膜和包膜。非包膜VLPs缺乏外部脂质包膜，而包膜VLPs具有来自宿主细胞的膜包膜，允许糖蛋白抗原被整合到脂质膜中。非包膜和包膜VLPs都可以是单层或多层，并由单个或多个蛋白质组装而成。一个简单的非包膜VLP的例子是HPV VLP疫苗，它由单层组成。流感VLPs是包膜VLPs的一个成熟例子。 病毒样颗粒（VLPs）携带它们自己的特定病毒表位或外来抗原（嵌合VLPs），这些表位安全地刺激体液和细胞免疫反应，并引发强大的免疫原性。VLPs通常表现出与它们起源的病毒的抗原相似性。它们以有组织且高度重复的方式呈现抗原，从而有效激发体液和细胞免疫反应，这归功于具有重复表面的颗粒对B细胞的最佳刺激。此外，VLPs具有激活T辅助细胞的能力，因为它们自然编码激活细胞免疫反应的T辅助细胞表位。通过将特定的病原体相关分子模式（PAMPs）如单链RNA或CpG寡脱氧核苷酸（CpG-ODNs）装入VLPs，可以进一步激活免疫系统。这一特性即使在较低剂量下也增强了VLPs的免疫原性。 来自35个病毒家族的100多种病毒蛋白，包括包膜和非包膜病毒，已被证明能够组装成VLPs。这解释了为什么使用VLPs提供了一个多功能的新兴平台，用于创建提供病毒载体替代方案的疫苗。由于设计的疫苗种类多样以及它们的临床应用，这项技术在近年来经历了显著增长。通常，较低剂量的抗原足以诱导与亚单位疫苗相似的保护反应。病毒蛋白自发组装成VLPs确保了快速高效的生产，允许VLPs经济地大规模生产（表2）。除了用于预防传染病和癌症的疫苗，VLPs还可以用作药物、染料或纳米材料的载体，用于纳米医学。 VLPs是通过将病毒结构基因分子克隆到表达载体中，然后在表达系统中表达这些基因而开发的。大约30%的VLPs是在细菌中生产的，尽管也使用不同的表达系统，如杆状病毒/昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物。大肠杆菌表达系统以其易用性和成本效益而著称。然而，由于缺乏翻译后修饰（PTM）系统，它在生产非包膜VLP方面的效用有限。在酵母中的生产具有低成本的生产和维护成本，但引入PTMs（例如，糖基化、磷酸化）的能力有限。相反，杆状病毒-昆虫细胞和哺乳动物细胞系统具有引发更完整的PTM修饰的优势，有助于生产包括多蛋白VLP组装在内的包膜和非包膜VLPs。此外，植物表达系统已成为降低蛋白质生产成本的多功能和有前途的平台。有关设计、生产和开发基于VLP疫苗的不同方法的综述。 第一种基于VLP的疫苗，Recombivax HB，于1986年获得许可用于人类。这是一种在酵母中生产的乙型肝炎VLP疫苗，最早开发于1982年。从那时起，已有几种基于VLP的疫苗被商业化（表3）。Engerix-B是另一种针对乙型肝炎病毒的疫苗，也是在酵母中生产的。Gardasil和Gardasil9是另外两个在酵母中生产的商业化VLP疫苗，它们携带HPV的L1蛋白。最近的研究已经成功生产了携带Gag和p17以及p24蛋白的基于HIV的VLPs。最近批准的两种疟疾疫苗，RTS, S/AS01（Mosquirix）和R21/Matrix M，利用乙型肝炎表面抗原（HBsAg）VLP作为平台，在酵母中形成的VLP表面展示疟疾表位。 Hecolin是唯一能有效预防戊型肝炎的疫苗。它是第一种在细菌中生产的VLP疫苗，携带戊型肝炎病毒的p239截短衣壳蛋白。III期临床试验已证实Hecolin具有高度的免疫原性和效力，证明了它能够诱导显著的戊型肝炎病毒抗体滴度。此外，利用大肠杆菌表达系统有助于成本效益生产。Hecolin于2011年在中国获得监管批准。最近，它作为第三代乙型肝炎疫苗PreHevBio获得批准，该疫苗在哺乳动物细胞中生产。针对疟疾、流感、HPV和西尼罗河病毒的疫苗是其他在细菌中生产的VLP疫苗候选物。杆状病毒/昆虫细胞系统是VLP生产的优选系统，因为它有助于高表达具有许多PTMs的多蛋白VLPs。Cervarix是一种含有HPV 16和HPV 18的L1衣壳蛋白的HPV疫苗，就是这种情况。 针对SARS-CoV-2、流感A、EBOV、腺病毒-7、HPV、HIV-1、乙型肝炎、SARS-CoV、登革热、狂犬病、轮状病毒、诺如病毒和疟疾的不同基于VLP的疫苗最近已获批准或目前正在临床试验中测试（表3）。 5.针对主要传染病和病原体的病毒载体疫苗  在这一部分，我们将总结一些已获得许可用于预防主要疾病或正在几个临床试验中测试的新型疫苗载体。 5.1.埃博拉病毒疫苗 埃博拉是由丝状病毒EBOV引起的一种新兴疾病，已在西非和中非国家引起多次爆发，导致25%至90%的死亡率。迄今为止，可获得的获批埃博拉疫苗基于编码EBV的GP糖蛋白的病毒载体（表3）。Adv5-EBOV是2017年在中国获批的第一种EBV疫苗，基于Ad5载体。Ervebo或rVSV-ZEBOV疫苗是一种活减毒重组VSV基载体疫苗，其中VSV的G蛋白被EBOV扎伊尔物种的GP蛋白所取代。rVSV-ZEBOV是2019年获得FDA批准的第一种抗EBOV疫苗。临床前研究表明，Ervebo在小鼠和非人灵长类动物中对致命EBOV挑战提供保护，主要由抗GP抗体介导。最初由加拿大公共卫生机构开发的疫苗，作为单剂量1毫升剂量给药，并在2018年至2020年持续爆发期间给药超过200,000人。第三种EBOV疫苗是Zabdeno（Ad26.ZEBOV），一种腺病毒载体（Ad26）和Mvabea（MVA-BN-Filo）的两剂量组合，以及编码不同EBOV物种GP蛋白的改良牛痘病毒安卡拉（MVA）载体。GamEvac-Combi是一种异源载体疫苗，已获得紧急使用许可，结合了重组VSV和Ad5表达EBOV的包膜糖蛋白。 此外，许多埃博拉疫苗候选物正在临床前或临床试验中研究，包括使用副黏病毒载体、VSV和狂犬病病毒载体、巨细胞病毒载体和基于VLP的疫苗。 5.2.流感病毒疫苗 流感是由正黏液病毒科的病毒引起的疾病，影响全球15%的人口，每年导致多达645,000人死亡。感染人类的三个主要属是流感A、B和C。正黏液病毒具有负义、单链、分段的RNA基因组，由于遗传突变和基因组重组，经常导致新变种。这一特性使有效疫苗的生产变得复杂。存在于家禽和野生鸟类中的许多禽流感病毒对人类构成人畜共患威胁。除了病毒的不同季节性变种的出现，流感病毒是导致未来大流行的强有力候选者。流感A是开发重组疫苗的主要目标，病毒包膜的血凝素（HA）是主要的抗原靶点。此外，NA、M1、M2、NP和病毒RNA聚合酶复合物免疫原也可以包括在载体中。 基于不同病毒载体的流感A疫苗主要涉及阿尔法病毒、痘病毒和腺病毒，已进入临床试验阶段。此外，副黏病毒、腺相关病毒和疱疹病毒也被考虑用作疫苗载体。特别是，基于Ad5和Ad4腺病毒的疫苗，以及基于非人腺病毒载体（黑猩猩AdC7、AdC68和ChadOx1；牛BAdV-3；猪PAV-3）的疫苗，正在临床前和临床试验中研究。据报道，基于Ad5的疫苗在单剂量下对流感病毒产生了更强大和更有效的免疫反应。编码流感病毒NP和M1基因的ChAdOX载体已完成两个I期临床试验。VXA-A1.1是一种基于Ad5载体的流感疫苗，编码HA免疫原，并使用双链RNA作为佐剂进行给药。VXA-A1.1疫苗也已完成II期临床试验。 此外，基于MVA载体的几种疫苗已在动物模型和临床试验中进行了研究和测试。例如，表达流感A病毒NP和M1蛋白的MVA-NP + M1疫苗（VTP-100载体）在I/2a期临床试验中进行了测试，但未获成功。此外，委内瑞拉马脑炎病毒作为流感疫苗载体也进行了测试。慢病毒载体也被设计为流感病毒平台疫苗，并在临床前试验中进行了测试。具体来说，使用缺陷整合酶的慢病毒载体传递了流感病毒的HA和NP抗原。使用该载体免疫的小鼠对流感病毒表面蛋白持续产生功能性抗体，并引发能够中和病毒致病性的功能性T细胞反应。 最后，在I、II和III期的多个临床试验中测试了基于VLP的流感疫苗的有效性，包括流感B疫苗。一项III期试验评估了针对流感病毒的四价植物源性VLP疫苗。该疫苗的配方包括来自四种不同毒株的HA蛋白，并使用Nicotiana benthamiana作为生产平台。研究结果突出了这种植物源性VLP流感疫苗的免疫原性和安全性。表达HA和不同NA亚型的VLP衍生疫苗被认为是开发通用流感A疫苗的有前途的平台。 5.3.HIV-1疫苗 HIV在1980年代首次被确认，当时它造成了全球公共卫生威胁。该病毒属于逆转录病毒科，如前所述，包含具有单链RNA基因组的包膜病毒，在病毒生命周期中被逆转录为DNA。两种主要的HIV物种感染人类，即HIV-1和HIV-2。主要的抗原蛋白是病毒包膜糖蛋白，Env或gp160，它被蛋白水解激活成受体结合蛋白gp120和融合蛋白gp41。Env蛋白的两个主要特征赋予了它逃避中和抗体和非中和体液及细胞反应的机制。暴露的表位高度变异，具有高突变率，并且蛋白质具有高度的糖基化，使表位无法接触。因此，尽管进行了深入研究，至今仍未商业化有效的HIV疫苗。 为HIV疫苗接种设计了不同的病毒载体。HIV疫苗旨在刺激针对Env蛋白（刺激产生中和抗体）或Gag、Pol和Nef蛋白（刺激T细胞反应）的保守表位的体液和细胞免疫反应。此外，腺病毒载体已被广泛使用。例如，STEP和Phambili IIb期试验测试了编码HIV-1 B亚型gag、pol和nef基因的Ad5衍生疫苗。由于对这些载体的预先存在的免疫力，结果令人沮丧，导致设计了具有不同Ad血清型的载体，如Ad26、Ad35或黑猩猩腺病毒，这些载体已在几个临床试验中进行了测试。 除了腺病毒载体，还基于其他类型的载体设计了几种HIV疫苗，如慢病毒载体。THV01是一种第三代慢病毒疫苗，它是一个复制缺陷型和自失活载体，编码HIV Gag、Pol和Nef蛋白片段。I/II期临床试验表明，这种载体具有高度免疫原性。基于NDV副黏病毒的载体表达gp160 Env和p55 Gag蛋白已在临床前研究中进行了测试。编码env、gag和pol基因的canarypox ALVAC-HIV载体也在III期RV144试验中进行了测试。在这项研究中，病毒载体与增强剂和重组gp120蛋白疫苗结合使用。这次试验对HIV免疫产生了适度的结果。目前正在进行几项正在进行的有效性试验，以进一步阐明RV144试验的发现，包括对各种佐剂的有效性研究。 5.4.SARS-CoV-2疫苗 SARS-CoV-2是最近COVID-19大流行的病原体，是一种属于冠状病毒科的动物源性呼吸道病毒，具有包膜的正单链RNA。表面刺突S糖蛋白是设计针对SARS-CoV-2疫苗的主要靶标。这种蛋白对于病毒进入目标细胞至关重要，因为它在亚基S1和S2上分别具有受体结合和融合活性。 已迅速且成功地开发了针对SARS-CoV-2的安全有效疫苗。此外，目前正在开发大量使用不同平台的SARS-CoV-2疫苗，包括病毒载体和基于VLP的疫苗。 许多疫苗基于复制缺陷型腺病毒载体，编码不同版本的S蛋白或表位，如受体结合域（RBD）。迄今为止，已有四种腺病毒载体疫苗获得批准（表3）。Janssen（Johnson & Johnson）Ad26.COV2–S SARS-CoV-2疫苗是一种复制缺陷型Ad26载体，编码全长S蛋白的前融合构象，于2021年全球获批使用。Gam-COVID-Vac或Sputnik疫苗由基于Ad26载体的异源方案和Ad5增强剂组成，两者都编码全长S蛋白，于2021年春季在俄罗斯作为紧急疫苗获批。Oxford/AstraZeneca疫苗基于黑猩猩腺病毒载体（ChAdOx1 nCov-19），包含编码蛋白S的转基因。Convidecia疫苗基于Ad5（Ad5-nCov9），由中国的CanSino开发。 此外，目前正在进行大量临床前和临床试验。AdCOVID是一种基于Ad5载体的疫苗，表达S蛋白的RBD区域。这种载体可以在小鼠中有效引发粘膜免疫。第二代Ad载体hAd5-S-Fusion + N-ETDS编码刺突和N蛋白。该载体旨在免疫并保护可能的新出现的变种，目前正在进行I期临床试验。GRAd-COV2是第一代大猩猩腺病毒载体，编码在前融合构象中稳定的S蛋白，已在II期临床试验中进行了测试。 一种携带全长膜锚定的S蛋白的慢病毒载体已被证明，在通过鼻内接种后，能够在临床前动物模型中对SARS-CoV-2提供保护。基于新城疫病毒（NDV）的载体表达S蛋白，也已针对SARS-CoV-2设计并在I、II、III期临床试验中进行了测试。NDV-HXP-S载体含有一种增强免疫原性的S蛋白版本，该版本保持了刺突蛋白在稳定的前融合构象。这种疫苗可以在鸡蛋中以低成本高效生产。NDV-HXP-S既适用于活疫苗，也适用于灭活疫苗。I期临床试验表明，通过肌肉注射或鼻内途径给予NDV-HXP-S载体是安全且高度免疫原性的。在泰国，灭活的NDV-HXP-S疫苗已获得紧急使用授权。使用狂犬病病毒（VSV）作为疫苗载体也已针对SARS-CoV-2进行了使用，利用了为设计埃博拉疫苗而发展起来的成熟平台。这些载体表达S蛋白，无论是在其原始未修饰的非稳定构象中，还是在优化的前融合稳定构象中，以及核衣壳。大量的基于改良型安卡拉病病毒（MVA）的疫苗候选物已针对SARS-CoV-2设计并在临床前和临床试验中进行了测试。此外，来自不同病毒的病毒样颗粒（VLP）平台，如流感、新城疫病毒和莫洛尼鼠白血病病毒等，也被用于SARS-CoV-2疫苗的开发。基于VLP的SARS-CoV-2疫苗目前正在临床前和临床研究中，Novavax的NVX-Cov2373疫苗是唯一商业化的针对SARS-CoV-2的VLP疫苗。最近，加拿大批准了植物制造的SARS-CoV-2 VLP疫苗Covifenz。 6.结论性评论  病毒载体最初用于基因治疗，其中第一种疫苗是20世纪80年代开发的天花病毒载体疫苗。自那以后，许多病毒载体疫苗已被设计用于人类疫苗接种，并已成为解决传统疫苗限制的新平台。腺病毒载体在COVID-19疫苗接种中的广泛使用已证明这项技术既安全又有效。此外，病毒载体促进了对新病毒变种和新出现的病毒的新病毒载体的重新设计，并可用于大规模生产。 腺病毒载体是临床试验和批准疫苗中最常用的载体。由于Ad5血清流行率，其他较少见的人类和猴血清型被用作载体。然而，出于安全考虑，更倾向于使用复制缺陷型载体。此外，通常去除载体的病毒复制必需基因和防止宿主免疫反应的基因。这一领域的大量研究导致了第三代载体的设计，主要是腺病毒和慢病毒载体，从而增加了转基因的大小并提高了安全性。 一些病毒载体疫苗已获得人类疫苗接种的许可，然而，许多使用病毒载体疫苗候选物的临床前和临床试验仍在进行中。病毒载体疫苗已在单一试验中进行了测试，并对HIV免疫接种产生了适度的结果。因此，开发针对没有有效传统疫苗的病原体的疫苗，如HIV、丙型肝炎病毒和埃博拉病毒等，至关重要。 VLP是一种新兴的多功能疫苗平台，近年来已被显著用于生产几种商业化疫苗。从这个意义上说，VLP衍生的疫苗被提出作为对抗新出现的病毒和开发通用流感A疫苗的有希望的解决方案。 利用病毒载体和其他技术，如mRNA和蛋白质亚单位疫苗，迅速开发COVID-19疫苗进行全球疫苗接种，突显了这些技术的成功。这一成功强调了拥有基于先前研究的正确平台的重要性，并验证了病毒载体针对新出现的病毒和大流行爆发的有效性。 7.展望  病毒载体和VLP基础疫苗的巨大潜力推动了新疫苗的持续设计。大量针对重要病原体的疫苗，如流感、HIV、RSV、埃博拉病毒和SARS-CoV-2，目前正在开发中，有些处于临床前或临床试验阶段。然而，尽管在开发病毒载体和VLP基础疫苗方面取得了显著进展，但仍需解决许多挑战。具体来说，进一步的研究对于提高其安全性至关重要，解决与预先存在的免疫、可能整合到宿主细胞基因组以及产生致病表型相关的担忧。此外，开发针对主要人类病原体或疾病（如HIV、Epstein-Barr病毒、丙型肝炎病毒和结核病）的有效疫苗至关重要。努力还应集中在创建通用流感疫苗和发展新的载体以免疫针对新出现的变体上。此外，改进多价疫苗、克服扩大病毒载体在被动免疫中使用的挑战，以及推进病毒载体在预防性或治疗性癌症疫苗中的应用，是未来研究的关键领域。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 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摘要: 为了克服传统疫苗的局限性，出现了新的疫苗设计平台，如基于病毒载体和病毒样颗粒（VLPs）的平台。病毒载体疫苗高效且保护作用迅速。许多人类重组疫苗候选基于属于不同科的病毒，如腺病毒科、逆转录病毒科、副黏病毒科、弹状病毒科和细小病毒科。此外，首个获得许可用于人类疫苗接种的病毒载体疫苗是日本脑炎病毒疫苗。此后，已有几种病毒载体获批用于针对拉沙热、埃博拉、乙型肝炎、戊型肝炎、SARS-CoV-2和疟疾病毒的疫苗接种。VLPs是由结构蛋白自组装形成的纳米颗粒，模拟病毒颗粒，基于VLPs的乙型肝炎和戊型肝炎病毒、人乳头瘤病毒以及疟疾的疫苗已经商业化。正如COVID-19疫苗加速生产所证明的，这些新方法对于疫苗学以及针对病原体和新兴大流行威胁的快速响应是重要的工具。 1.引言  疫苗学时代始于1789年，当时爱德华·詹纳开发了第一种针对天花的疫苗。从那时起，疫苗已经预防了数百万人死亡，并且在1978年甚至导致了这种疾病的根除。在19世纪，巴斯德开创了基于病原体灭活或减毒的疫苗发展。在20世纪下半叶，使用细胞培养病毒促进了几种灭活和减毒疫苗的发展。 在20世纪末分子生物学出现之前开发的常规疫苗包括灭活或减毒病原体、类毒素、基于蛋白质的疫苗或细菌多糖。因此，它们的使用减少了如脊髓灰质炎、麻疹、破伤风和白喉等疾病的影响。然而，尽管进行了数十年的深入研究，针对某些人类病原体的有效疫苗尚未开发出来，例如表现出高度遗传变异（如人类免疫缺陷病毒[HIV]和丙型肝炎病毒）、导致持续或潜伏感染（如HIV、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、Epstein-Barr病毒）的病原体，或未能诱导无菌免疫。此外，传统疫苗存在几个缺点，如安全问题，包括减毒活病毒回复致病力的风险、污染活生物体的可能性，以及对免疫系统弱化人群的风险。同时，疫苗生产成本高且耗时长，需要更高水平的生物安全和专业实验室。 近几十年来，新的有希望的疫苗平台出现了，这些平台得到了遗传工程、分子和细胞免疫学、结构生物学、生物信息学、计算生物学、纳米技术和合成生物学的进步的支持，如重组病毒载体、病毒样颗粒（VLPs）、mRNA、合成DNA和细菌载体疫苗的情况。 此外，疫苗设计新技术是疫苗学中的重要工具，用于克服传统技术的限制，促进对新威胁如新出现病原体和大流行爆发的快速和有效响应。在这篇综述中，我们旨在总结病毒工程的最新进展，这些进展导致了对当前流行病原体如流感、埃博拉、艾滋病和COVID-19的安全有效疫苗的开发，特别关注基于病毒载体和VLP的平台。 2.基于病毒载体的疫苗  重组病毒是基因修饰的，并被设计用作针对传染病代理人的疫苗，以及在抗癌和基因疗法中使用。具体来说，病毒载体在基因疗法中的使用始于1990年代。从这一点开始，在遗传工程、重组DNA技术和开发拯救重组病毒的反向遗传技术方面取得的进展促进了基于载体的疫苗平台的发展。病毒载体是通过将外源性抗原或转基因，如感兴趣的免疫原，通过重组DNA工程插入病毒遗传物质构建的。此外，病毒载体被特别修改以根除其固有的致病属性。然后使用新构建的病毒载体将抗原基因传递给宿主，在那里高水平短暂表达以引发强大的免疫反应。此外，构建了多价或多病原体疫苗，以从相同或不同病原体同时表达各种转基因。而且，在被动免疫中，重组病毒携带抗体转基因。 迄今为止，已设计出两种主要类型的病毒载体：复制型和复制缺陷型载体。复制型载体扩增转基因并产生感染性后代，而非复制型载体传递单一转基因副本而不复制，这提高了其安全性。复制型载体通过模仿自然感染产生强烈的免疫反应。复制缺陷型载体在外来启动子的控制下表达免疫原，产生较弱的疫苗反应，可能需要使用佐剂。复制型载体包括腺病毒、逆转录病毒、弹状病毒和副粘病毒载体，而复制缺陷型载体包括腺病毒、逆转录病毒和腺相关病毒载体（表2）。还有单周期病毒载体可用，它们通过一轮复制增加抗原表达并避免病毒后代的形成。已从腺病毒和弹状病毒开发出单周期载体。病毒载体疫苗通常极其有效，并通过诱导强烈的体液和细胞免疫反应，包括干扰素和炎症细胞因子的产生，提供快速保护。通常不需要使用额外的佐剂，这简化了疫苗的组成和配方过程。表1总结了基于病毒载体的疫苗的主要优点和缺点。 许多基于病毒载体的疫苗已获准用于兽医用途，如犬瘟热病毒、猫白血病病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒（NDV）、传染性法氏囊病病毒和马立克病。例如，基于NDV的流感疫苗保护鸡免受高致病性禽流感的侵害，并在墨西哥和中国用作兽医疫苗。天花病毒是第一个作为疫苗载体针对乙型肝炎开发的。2010年，第一种病毒载体疫苗ChimeriVax-JE（Imojev）针对黄病毒属的日本脑炎病毒获得了用于人类的许可。ChimeriVax-JE是一种使用黄热病病毒17D株构建的减毒活疫苗，通过用日本脑炎病毒的相应序列替换编码前膜和包膜蛋白的序列。这种载体在澳大利亚和亚洲商业化，单剂量可迅速引发免疫反应，并具有良好的安全性。 虽然目前只有少数病毒载体疫苗获批用于人类（表3），但针对SARS-CoV-2的腺病毒载体疫苗的广泛使用已被证明是安全的。因此，目前正在进行许多使用重组病毒载体疫苗的临床试验。 许多人类重组疫苗候选基于属于腺病毒科、逆转录病毒科、痘病毒科、副黏病毒科、弹状病毒科、黄病毒科、披膜病毒科和细小病毒科的病毒，其中腺病毒和逆转录病毒是最广泛使用的载体。然而，选择用于设计疫苗的载体是根据要插入的基因的特性以及与预先存在的免疫力、病毒复制和遗传稳定性相关的安全考虑来决定的。下面总结了五种主要的被选为设计基于病毒的疫苗的病毒载体（表2）。 3.用于疫苗开发的主病毒载体  3.1. 腺病毒载体  腺病毒（Ad）载体已被广泛用作基因治疗的工具，并且是使用最广泛的疫苗平台之一。腺病毒科由非包膜的双链线性DNA病毒组成，长度从26到45 kb不等。基因组包含五个早期转录基因（E1A、E1B、E2、E3和E4）、四个中间转录单元（IX、IVa2、L4中间和E2晚期）、五个晚期单元（L1-L5）以及两端的两个倒置末端重复（ITR）序列。二十面体衣壳由三种主要蛋白质组成：纤维蛋白、五聚体和六聚体，后者是最丰富的蛋白质，含有主要的中和表位。存在100多种不同的人类腺病毒血清型，分为七个不同的物种（A-G）。最初，Ad5和Ad2是最广泛用于构建载体的血清型，因为它们最容易操作，生产和免疫原性高。然而，由于预先存在的免疫力，Ad5已被其他血清流行率较低的血清型所取代，如Ad6、Ad26和Ad35。此外，还开发了针对不同病原体和疾病的源自猿猴的腺病毒载体，包括流感、HIV、埃博拉、SARS-CoV-2和疟疾。使用腺病毒载体的优点包括增加转基因转导能力、广泛的细胞嗜性、能够感染分裂和不分裂的细胞以及抗原呈递细胞，以及它们不整合到宿主基因组中（表2）。此外，重组基因组在连续传代中表现出稳定的维持，这有助于快速和大规模生产，并产生高滴度稳定库存。如上所述，腺病毒载体的主要缺点是预先存在的免疫力和载体本身的免疫原性。这是因为腺病毒具有高度免疫原性，并能引起针对Ad主要衣壳蛋白的高滴度中和抗体。根据病毒基因组编辑，Ad载体被分类为第一代、第二代或第三代载体（图1a）。然而，第一代载体中已去除了负责病毒复制的E1B和E1A基因。此外，通过同源重组插入外源基因以及删除E3基因，使得转基因的大小从5增加到8 kb。同时，删除E3产物促进了免疫，因为它对于抑制宿主的免疫反应至关重要。在第二代Ad载体中，删除E4和E2区域增加了转基因容量并减少了宿主细胞中的毒性。第三代Ad载体，称为无肠载体或助手依赖型载体，除了包装信号Ψ和对病毒包装至关重要的ITR序列外，大部分结构和功能基因都被删除（图1a）。这些载体可以容纳高达35 kb大小的转基因。助手依赖型载体在保持免疫反应的同时提高了安全性。Ad载体通常是复制缺陷型的。此外，通过删除IIIa衣壳水泥蛋白设计了单周期Ad载体；例如，用于针对埃博拉病毒和SARS-CoV-2[129]的疫苗。使用动物模型进行的几项临床前研究导致了良好的免疫反应，使得单周期Ad载体用于人类疫苗开发非常有前景。已经开发了针对多种病原体的Ad载体技术疫苗（表3）。一些Ad载体疫苗仍在研究中，而针对埃博拉病毒和SARS-CoV-2的疫苗已经被商业化，我们将在以下部分讨论。  图1. 不同基于病毒的载体示意图表示：(a) 腺病毒载体。在第一代载体中，腺病毒基因组的E1A、E1B和E3基因被删除；在第二代载体中，额外删除了E2和E4基因；在第三代载体或无肠载体中，除了包装信号Ψ和ITR序列外，大部分病毒基因被删除。(b) 慢病毒载体。含有转移向量质粒的第三代慢病毒载体（带有被修改为自灭活型的慢病毒5'和3' LTRs和转基因）；包含HIV env或VSG-G的包膜质粒，以假型慢病毒颗粒的形式；以及两个分别编码gag或pol和rev的包装质粒。(c) 副黏病毒载体。展示了NDV载体。T7启动子系统用于从克隆DNA（cDNA）中拯救NDV。NDV，新城疫病毒；T7Pro，T7聚合酶启动子；T7ter，T7末端序列。ITR，倒置末端重复；Ψ，包装信号；LTR*，自灭活长末端重复。使用BioRender.com创建。 3.2. 逆转录病毒载体  在腺病毒之后，慢病毒是第二种最常用的病毒载体设计载体。慢病毒，如HIV-1，属于逆转录病毒科，这是一类包膜的单链RNA病毒。进入宿主细胞后，RNA被逆转录成DNA并整合到染色体DNA中。基因组编码三个必需基因（gag、pol和env）以及几个调节和辅助基因，用于小型六蛋白（tat、rev、vif、vpr、vpu和nef），这些基因对于病毒复制、感染和灭活宿主限制系统至关重要。gag基因编码结构蛋白，pol基因编码蛋白酶、这一组特有的逆转录酶和整合病毒DNA到宿主基因组所需的整合酶。env基因编码包膜（Env）糖蛋白，gp160，它经过蛋白水解裂解产生gp120和gp41跨膜糖蛋白。慢病毒载体在免疫方面具有巨大潜力，因为它们最佳地转导树突细胞并有效刺激T和B淋巴细胞。临床前研究表明，慢病毒载体能够引发强烈且持久的体液和T细胞反应，为许多传染病提供有效保护。其他导致慢病毒载体广泛使用的优点包括它们增强的能力来携带大型转基因（<8 kb），它们整合到宿主基因组中，确保高水平和持久的转基因表达，它们在分裂和非分裂细胞中的高转导效率，以及它们的低遗传毒性和免疫原性，包括低抗载体免疫。然而，慢病毒载体的广泛使用可能受到相对较高的生产成本以及与大规模制造相关的技术挑战的限制。主要缺点源于它们的整合，这可能诱发肿瘤发生（表2），尽管基于慢病毒的基因治疗临床研究表明插入性突变的风险很低。此外，慢病毒的前病毒整合位点不是随机的，而是相对非特异性。对于HIV，位点整合的偏好包括活跃转录的基因，而不是启动子区域。尽管如此，通过突变病毒整合酶已经产生了用于疫苗的非整合慢病毒载体。 大多数慢病毒载体是从HIV中产生的。第一代慢病毒载体是利用三质粒表达系统开发的，包括携带gag和pol基因以及辅助和调节基因的包装质粒；包膜质粒；以及带有被慢病毒长末端重复序列(LTR)包围的转基因盒的转移质粒（图1b）。慢病毒载体的细胞嗜性可以通过假型化来修改，从而相应地增加病毒的嗜性。在假型载体中，病毒受体结合蛋白Env被异源包膜糖蛋白所取代，其中弹状病毒水泡性口炎病毒(VSV-G)的G蛋白是最常用的之一。缺乏对假型慢病毒载体的预先存在的免疫力，加上它们低促炎特性，使它们成为粘膜疫苗策略的合适候选。第二代慢病毒载体通过从包装质粒中删除辅助毒力基因vif、vpr、vpu和nef而变得更安全。目前用于基因传递的第三代慢病毒载体也通过疫苗接种诱导强烈的免疫。在第三代载体中，病毒基因组被分离成三个不同的质粒（gag/pol、rev和env或VSV-G）。为了防止整个HIV基因组的转录，转基因被包含在一个额外的含有用于自我灭活的修改后的慢病毒LTR序列的质粒中（图1b）。慢病毒载体作为癌症疫苗的使用也在研究中，特别是用于黑色素瘤、淋巴瘤和前列腺癌。正如下一节将讨论的，已经设计了许多针对不同病原体的慢病毒载体，如流感病毒、西尼罗河病毒、HIV-1和SARS-CoV-2。 3.3. 腺相关病毒载体 在腺病毒和慢病毒之后，腺相关病毒(AAVs)是第三广泛使用的病毒载体。AAVs是属于细小病毒科的非包膜单链DNA病毒。AAVs是依赖性病毒，因为它们需要辅助病毒，如腺病毒或单纯疱疹病毒，才能复制。大多数AAV载体已用于基因治疗。AAV载体可以感染分裂和不分裂的细胞，并携带高达5 kb大小的转基因。AAV载体主要作为附加体存在，并以较低频率整合到第19号染色体。它们的优点是缺乏致病性、广泛的嗜性、低免疫原性、易于生产，以及建立长期转基因表达的能力。主要缺点是转基因的大小小（表2）。对于构建基于AAV的载体，病毒复制(rep)和结构(cap)基因被转基因表达盒(转基因与启动子和调节元件一起)所取代，两侧是AAV ITRs。已经评估了几种基于AAV载体的疫苗候选，编码针对病原体的抗原，如尼帕病毒、登革病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、HIV、埃博拉病毒(EBOV)、流感病毒和SARS-CoV-2。此外，还开发了许多基于AAV的载体，用于传递中和抗体基因的被动免疫策略。这种策略可以持续表达针对几种病原体的抗体，如HIV、流感病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)，对于这些病原体，疫苗尚未可用或效果较差。例如，已经证明通过鼻腔给药AAV血清型9载体表达重组单克隆抗体palivizumab可以有效地保护小鼠模型免受RSV挑战。 3.4. 弹状病毒载体 已经进行了大量基于弹状病毒载体的疫苗候选的临床前和临床研究，包括一些商业化的病毒载体疫苗（表3）。然而，与腺病毒、AAV和慢病毒载体相比，进行的研究较少。弹状病毒科包括具有典型子弹形状的包膜病毒，它们具有非分段的负义单链RNA基因组。基因组编码五种结构蛋白：核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和大聚合酶(L)。反向遗传学的使用已经允许从克隆DNA中拯救负链RNA病毒。该系统最初是为1994年从cDNA中拯救狂犬病病毒开发的。其基因组的模块化组织便于遗传修饰，并提供了与大多数更复杂的DNA和正义链RNA病毒相比更大的操作性。使用弹状病毒载体的优点包括转基因大小（高达6 kb），这允许表达多价弹状病毒疫苗的多种抗原，细胞质复制，这降低了病毒整合到宿主基因组的可能性，低或缺乏预先存在的免疫力，以及在组织培养中高滴度复制（表2）。基于弹状病毒的疫苗候选主要使用狂犬病病毒和VSV。许多基于弹状病毒的载体是减毒的复制能力，尽管也设计了单周期载体。此外，在基于VSV的假型载体中，G蛋白（对病毒神经嗜性的主要贡献者）被另一种糖蛋白所取代。然而，复制缺陷的弹状病毒载体疫苗的免疫原性较低。已经开发了大量的重组狂犬病病毒，用于作为针对多种病原体的疫苗载体，如HIV、淋巴细胞性脑膜炎病毒、埃博拉和马尔堡病毒、拉沙热病毒、裂谷热病毒和SARS-CoV-2。特别是，表达拉沙热病毒糖蛋白复合物的狂犬病病毒载体疫苗，是一种灭活的双重候选疫苗，用于针对拉沙热病毒和狂犬病病毒。这种载体在小鼠和豚鼠模型中诱导了针对拉沙热病毒和狂犬病病毒的持久体液反应，并提供了针对拉沙热病毒的有效保护。与狂犬病不同，VSV会在牛、马和猪中引起疾病，但不会在人类中引起。编码外源蛋白的重组VSV是针对HIV、EBOV、结核病和SARS-CoV-2等的疫苗载体的优秀候选。使用VSV载体进行的首次成功试验之一是使用基于VSV的载体编码流感病毒血凝素抗原对小鼠进行疫苗接种。还开发了针对致命的新兴副黏病毒亨德拉和尼帕病毒的基于弹状病毒的疫苗候选。在许多情况下，受体结合的G糖蛋白被免疫原所取代。如上所述，VSV的G糖蛋白可以被纳入假型慢病毒载体。至少有两种基于重组VSV的疫苗已获准用于人类，即rVSV-ZEBOV和GamEvac-Combi，后者结合了表达EBOV包膜糖蛋白的重组VSV和Ad5（表3）。 3.5. 副黏病毒载体 副黏病毒科由具有负义单链RNA基因组的包膜病毒组成。副黏病毒基因组的组织与弹状病毒相似，编码五种结构蛋白：核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、附着糖蛋白(HN/G)和大型聚合酶(L)（图1c）。与弹状病毒类似，副黏病毒的模块化基因组便于通过反向遗传学进行操作。麻疹病毒(MV)于1995年首次被拯救，新城疫病毒(NDV)于1999年。许多基于副黏病毒的疫苗载体基于MV、人副流感病毒3型(HPIV3)和NDV。基于副黏病毒的载体提供了几个优点。它们不整合到目标细胞的基因组中，而是专门在细胞质中复制，没有DNA中间体。它们可以容纳6 kb的插入大小，提供高且稳定的异源基因表达，具有粘膜疫苗的潜力，制造简便且成本效益高。在NDV载体疫苗的情况下，它们基于鸡蛋的特性使其适合大规模生产（表2）。由于使用减毒活麻疹病毒取得了巨大成功，因此在病毒载体疫苗学领域很早就开始将其作为疫苗载体。不同的基于麻疹病毒的载体已在针对HIV、RSV、登革热、SARS-CoV、MERS-CoV、基孔肯雅、埃博拉和寨卡病毒、乙型肝炎、西尼罗河和SARS-CoV-2等广泛病原体和病毒的临床前和临床试验中使用。自然发生的无毒力NDV株作为活减毒疫苗在禽业中广泛使用。基于NDV的疫苗也已开发用于兽医用途。此外，由于宿主范围有限且缺乏预先存在的免疫力，基于NDV的载体在人类中使用安全。已设计基于NDV的载体携带来自EBOV、流感病毒、HIV、SARS-CoV和尼帕病毒等的抗原。还描述了使用编码SARS-CoV-2 S蛋白的NDV载体（表3）。基于HPIV3的载体疫苗已针对EBOV、RSV和SARS-CoV开发，包括针对儿童COVID-19疫苗的候选疫苗，但并未达到MV和NDV载体疫苗的程度。 4.类病毒颗粒  VLPs是由病毒结构蛋白自组装形成的纳米颗粒，模仿病毒颗粒。VLPs不含遗传物质，因此是复制无能和非感染性的。这显著提高了它们的安全性，与减毒活疫苗或重组病毒载体相比，因为不会像病毒载体疫苗那样合成更多的免疫原副本。VLPs可分为两类：非包膜和包膜。非包膜VLPs缺乏外部脂质包膜，而包膜VLPs具有来自宿主细胞的膜包膜，允许糖蛋白抗原被纳入脂质膜中。非包膜和包膜VLPs都可以是单层或多层的，由单个或多个蛋白质组装而成。一个简单的非包膜VLP的例子是HPV VLP疫苗，它由单层组成。流感VLPs是一个成熟的包膜VLP的例子。VLPs携带自身或外来抗原（嵌合VLPs）的特定病毒表位，安全地刺激体液和细胞免疫反应，并引发强大的免疫原性。VLPs通常表现出与它们起源的病毒的抗原相似性。它们以有组织和高度重复的方式呈现抗原，从而触发有效的体液和细胞免疫反应，这是由于具有重复表面的颗粒对B细胞的最佳刺激。此外，VLPs具有激活T辅助细胞的能力，因为它们自然编码激活细胞免疫反应的T辅助细胞表位。通过将特定的病原体相关分子模式(PAMPs)如单链RNA或CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODNs)装入VLPs，可以进一步激活免疫系统。这一特性即使在较低剂量下也增强了VLPs的免疫原性。来自35个病毒家族的100多种病毒蛋白，包括包膜和非包膜病毒，已被证明能够组装成VLPs。这解释了为什么使用VLPs提供了一个多功能的新兴平台，用于创建提供替代病毒载体使用的疫苗。由于设计和临床使用的种类繁多，这项技术的应用近年来经历了显著增长。通常，较低剂量的抗原足以诱导与亚单位疫苗相似的保护反应。病毒蛋白自发组装成VLPs确保了快速高效的生产，允许VLPs经济地大规模生产（表2）。除了用于传染病和癌症的疫苗接种，VLPs还可以用作药物、染料或纳米材料的载体，用于纳米医学。VLPs是通过将病毒结构基因分子克隆到表达载体中，然后在表达系统中表达这些基因而开发的。大约30%的VLPs是在细菌中生产的，尽管也使用不同的表达系统，如杆状病毒/昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物。大肠杆菌表达系统以其易用性和成本效益而著称。然而，由于缺乏翻译后修饰(PTM)系统，它在生产非包膜VLP方面的效用有限。在酵母中的生产具有低成本的生产和维护成本，但引入PTMs（例如，糖基化、磷酸化）的能力有限。相反，杆状病毒-昆虫细胞和哺乳动物细胞系统具有引发更完整的PTM修饰的优势，有助于生产包括多蛋白VLP组装在内的包膜和非包膜VLPs。此外，植物表达系统已成为降低蛋白质生产成本的多功能和有前途的平台。 第一个基于VLP的疫苗Recombivax HB于1986年获得许可，用于人类。它是一种在酵母中生产的乙型肝炎VLP疫苗，最早开发于1982年。从那时起，已经商业化了几种基于VLP的疫苗（表3）。Engerix-B是另一种针对乙型肝炎病毒的疫苗，也是在酵母中生产的。Gardasil和Gardasil9是商业化的基于VLP的疫苗的额外例子，它们在酵母中携带HPV的L1蛋白。最近的研究成功生产了携带Gag和p17和p24蛋白的基于HIV的VLPs。最近批准的两种疟疾疫苗RTS, S/AS01(Mosquirix)和R21/Matrix M，利用乙型肝炎表面抗原(HBsAg)VLP作为平台，在酵母中形成的VLP表面展示疟疾表位。Hecolin是唯一可以有效预防戊型肝炎的疫苗。它是在细菌中生产的第一种携带戊型肝炎病毒p239截短衣壳蛋白的VLP疫苗。第三阶段临床试验已确认Hecolin具有高免疫原性和效力，证明了其诱导显著滴度的戊型肝炎病毒抗体的能力。此外，利用大肠杆菌表达系统有助于成本效益生产。Hecolin于2011年在中国获得监管批准。最近，它被批准为第三代乙型肝炎疫苗PreHevBio，该疫苗在哺乳动物细胞中生产。针对疟疾、流感、HPV和西尼罗河病毒的疫苗是其他在细菌中生产的VLP疫苗候选的例子。杆状病毒/昆虫细胞系统是VLP生产的首选系统，因为它有助于高表达具有许多PTMs的多蛋白VLPs。这是Cervarix疫苗的情况，它包含HPV 16和HPV 18的L1衣壳蛋白。针对SARS-CoV-2、流感A、EBOV、腺病毒-7、HPV、HIV-1、乙型肝炎、SARS-CoV、登革热、狂犬病、轮状病毒、诺如病毒和疟疾的不同基于VLP的疫苗最近已获批准或目前正在临床试验中进行测试（表3）。 5.针对主要传染病和病原体的病毒载体疫苗  在本节中，我们将总结一些已获得许可用于预防主要疾病或正在多项临床试验中进行测试的新型疫苗载体。 5.1.埃博拉病毒疫苗  埃博拉是一种由丝状病毒EBOV引起的新兴疾病，已在西非和中非国家引起多次爆发，死亡率在25%到90%之间。迄今为止，已获得许可的埃博拉疫苗基于编码EBV的GP糖蛋白的病毒载体（表3）。Adv5-EBOV是2017年在中国获批的首个EBV疫苗，基于Ad5载体。Ervibo或rVSV-ZEBOV疫苗是一种活减毒重组VSV载体疫苗，其中VSV的G蛋白被EBV扎伊尔物种的GP蛋白所取代。rVSV-ZEBOV是2019年获得FDA批准的首个抗EBOV疫苗。临床前研究表明，Ervibo在小鼠和非人灵长类动物中对致命EBOV挑战提供保护，主要由抗GP抗体介导。该疫苗最初由加拿大公共卫生署开发，作为单剂量1毫升给药，并在2018年至2020年的爆发期间已为超过20万人接种。第三种EBOV疫苗是Zabdeno（Ad26.ZEBOV），一种腺病毒载体（Ad26）和Mvabea（MVA-BN-Filo）的两剂量组合，以及编码不同EBOV物种GP蛋白的改良牛痘病毒安卡拉（MVA）载体。GamEvac-Combi是一种异源载体疫苗，已获得紧急使用许可，结合了表达EBOV包膜糖蛋白的重组VSV和Ad5。 此外，许多埃博拉疫苗候选正在进行临床前或临床试验，包括使用副黏病毒载体、VSV和狂犬病病毒载体、巨细胞病毒载体，以及基于VLP的疫苗。 5.2.流感病毒疫苗  流感是由正黏病毒科病毒引起的疾病，影响全球15%的人口，每年导致多达64.5万人死亡。感染人类的三个主要属是流感A、B和C。正黏病毒具有负义、单链、分段的RNA基因组，由于基因突变和基因组重组，经常导致新变种。这一特性使有效疫苗的生产变得复杂。存在于家禽和野生鸟类中的许多禽流感病毒对人类构成人畜共患威胁。除了病毒的不同季节性变种的出现，流感病毒是导致未来大流行的强有力候选者。流感A是重组疫苗开发的主要目标，病毒包膜的血凝素（HA）是主要的抗原靶标。此外，NA、M1、M2、NP和病毒RNA聚合酶复合物免疫原也可以包含在载体中。 基于阿尔法病毒、痘病毒和腺病毒的不同病毒载体流感A疫苗已进入临床试验阶段。此外，已考虑使用副黏病毒、腺相关病毒和疱疹病毒作为疫苗载体。特别是，基于Ad5和Ad4腺病毒以及非人腺病毒载体（黑猩猩AdC7、AdC68和ChadOx1；牛BAdV-3；猪PAV-3）的疫苗正在临床前和临床试验中进行研究。Ad5载体疫苗据报道在单剂量下对流感病毒产生更强、更有效的免疫反应。编码流感病毒NP和M1基因的ChAdOX载体已完成两项I期临床试验。VXA-A1.1是一种基于Ad5载体的流感疫苗，编码HA免疫原，并使用双链RNA作为佐剂进行给药。VXA-A1.1疫苗也已完成II期临床试验。此外，基于MVA载体的几种疫苗已在动物模型和临床试验中进行了研究和测试。例如，表达流感病毒A的NP和M1蛋白的MVA-NP + M1疫苗（VTP-100载体）在I/IIa期临床试验中进行了测试，但未获成功。此外，委内瑞拉马脑炎病毒阿尔法病毒已作为流感疫苗载体进行了测试。慢病毒载体也被设计为流感病毒平台疫苗，并在临床前试验中进行了测试。具体来说，使用无整合酶的慢病毒载体传递了流感病毒的HA和NP抗原。用这种载体免疫的小鼠对流感病毒表面蛋白持续产生功能性抗体，并引发功能性T细胞反应，能够中和病毒的感染性。最后，在I、II和III期的多项临床试验中测试了基于VLP的流感疫苗的有效性，包括流感B疫苗。一项III期试验评估了针对流感病毒的四价植物源性VLP疫苗。该疫苗被配制以包含四种不同毒株的HA蛋白，并使用Nicotiana benthamiana作为生产平台。研究结果突出了这种植物源性VLP流感疫苗的免疫原性和安全性。表达HA和不同NA亚型的VLP衍生疫苗被认为是开发通用流感A疫苗的有前途的平台。 5.3.HIV-1疫苗  HIV是在1980年代首次被确认的，当时它造成了全球公共卫生威胁。该病毒属于逆转录病毒科，如前所述，包含具有单链RNA基因组的包膜病毒，在病毒生命周期中被逆转录为DNA。两种主要的HIV物种感染人类，即HIV-1和HIV-2。主要的抗原蛋白是病毒包膜糖蛋白，Env或gp160，它被蛋白水解激活成受体结合蛋白gp120和融合蛋白gp41。Env蛋白的两个主要特征赋予了它逃避中和抗体和非中和体液和细胞反应的机制。暴露的表位高度变异，具有高突变率，并且蛋白质具有高度的糖基化，使表位无法接触。因此，尽管进行了深入研究，至今仍未商业化有效的HIV疫苗。 已设计了不同的病毒载体用于HIV疫苗。病毒载体HIV疫苗旨在刺激针对Env蛋白（刺激产生中和抗体）或Gag、Pol和Nef蛋白（刺激T细胞反应）的保守表位的体液和细胞免疫反应。此外，腺病毒载体已被广泛使用。例如，STEP和Phambili IIb期试验已测试了编码HIV-1 B亚型gag、pol和nef基因的Ad5衍生疫苗。由于对这些载体的预先存在的免疫力，结果令人沮丧，导致设计了具有不同Ad血清型的载体，如Ad26、Ad35或黑猩猩腺病毒，已在多项临床试验中进行了测试。 除了腺病毒载体外，还设计了几种基于其他类型的载体的HIV疫苗，如慢病毒载体。THV01是一种由第三代慢病毒载体生成的慢病毒疫苗。它是一种复制缺陷型和自灭活载体，编码HIV Gag、Pol和Nef蛋白的片段。I/II期临床试验表明，这种载体具有高度免疫原性。基于NDV副黏病毒载体表达gp160 Env和p55 Gag蛋白已在临床前研究中进行了测试。编码env、gag和pol基因的canarypox ALVAC-HIV载体也在III期RV144试验中进行了测试。在这项研究中，病毒载体与增强剂和重组gp120蛋白疫苗结合使用。这次试验对HIV免疫产生了适度的结果。目前正在进行几项正在进行的有效性试验，以进一步阐明RV144试验的发现，包括对各种佐剂的有效性研究。 5.4.SARS-CoV-2疫苗  SARS-CoV-2是最近COVID-19大流行的病原体，是一种属于冠状病毒科的包膜病毒，具有正义单链RNA。表面刺突S糖蛋白是设计针对SARS-CoV-2疫苗的主要靶标。由于其在亚基S1和S2上的受体结合和融合活性，这种蛋白对病毒进入目标细胞至关重要。 已迅速且成功地开发了针对SARS-CoV-2的安全有效疫苗。此外，目前正在开发大量使用不同平台的SARS-CoV-2疫苗，包括病毒载体和基于VLP的疫苗。 许多疫苗基于复制缺陷型腺病毒载体，编码S蛋白的不同版本或表位，如受体结合域（RBD）。迄今为止，已有四种腺病毒载体疫苗获得批准（表3）。强生公司的Janssen Ad26.COV2–S SARS-CoV-2疫苗是一种复制缺陷型Ad26载体，编码全长S蛋白的预融合构象，该疫苗已于2021年在全球范围内获批使用。Gam-COVID-Vac或Sputnik疫苗由基于Ad26载体的异源方案和Ad5增强剂组成，两者都编码全长S蛋白，该疫苗于2021年春季在俄罗斯作为紧急疫苗获批。牛津/阿斯利康疫苗基于含有编码蛋白S的转基因的黑猩猩腺病毒载体（ChAdOx1 nCov-19）。Convidecia疫苗基于Ad5（Ad5-nCov9），由中国康希诺公司开发。 此外，目前正在进行大量的临床前和临床试验。AdCOVID是一种Ad5载体疫苗，表达S蛋白的RBD区域。这种载体能在小鼠中有效诱导粘膜免疫。第二代Ad载体hAd5-S-Fusion + N-ETDS编码刺突蛋白和N蛋白。该载体旨在免疫并保护可能的新出现的变体，目前正处于I期临床试验。GRAd-COV2是一种第一代大猩猩腺病毒载体，编码稳定在其预融合构象中的S蛋白，已在II期临床试验中进行了测试。 慢病毒载体编码全长、膜锚定形式的刺突S糖蛋白，在临床前动物模型中经鼻内接种后已被证明能对SARS-CoV-2提供保护。基于NDV的载体表达S蛋白，也已针对SARS-CoV-2设计并在I、II、III期临床试验中进行了测试。NDV-HXP-S载体包含一个增强免疫原性的S蛋白版本，维持刺突在稳定的预融合构象。这种疫苗可以高效地以低成本在受精鸡蛋中生产。NDV-HXP-S可作为活疫苗和灭活疫苗使用。I期临床试验表明，通过肌肉注射或鼻内途径给药，NDV-HXP-S载体既安全又具有高度免疫原性。在泰国，灭活的NDV-HXP-S疫苗已获得紧急使用授权。弹状病毒VSV也被用作针对SARS-CoV-2的疫苗载体，利用为设计埃博拉疫苗而发展起来的平台。这些载体表达S蛋白，无论是在其天然的未修饰的非稳定构象还是优化的预融合稳定构象，以及核衣壳蛋白。大量的基于MVA的SARS-CoV-2疫苗候选已设计并在临床前和临床试验中进行了测试。此外，源自不同病毒的VLP平台，如流感、NDV和Moloney鼠白血病病毒等，也被用于SARS-CoV-2疫苗开发。基于VLP的SARS-CoV-2疫苗目前正在临床前和临床研究中，Novavax NVX-Cov2373疫苗是唯一商业化的针对SARS-CoV-2的VLP疫苗。最近，加拿大批准了植物源性SARS-CoV-2 VLP疫苗Covifenz。 6.结论  病毒载体最初用于基因治疗，其中第一种疫苗是在1980年代开发的牛痘病毒载体疫苗。从那时起，已为人类疫苗接种设计了许多病毒载体疫苗，并已成为解决传统疫苗局限性的新平台。腺病毒载体在COVID-19疫苗接种中的广泛使用已证明这项技术既安全又有效。此外，病毒载体有助于重新设计新的病毒载体以应对新变体和新出现的病毒，并可用于大规模生产。 腺病毒载体在临床试验和获批疫苗中是最常用的载体。由于Ad5血清流行率，其他较不常见的人类和猿猴血清型被用作载体。然而，由于安全考虑，更倾向于使用复制缺陷型载体。此外，通常去除载体的病毒复制必要基因和防止宿主免疫反应的基因。这一领域的大量研究导致了第三代载体的设计，主要是腺病毒和慢病毒载体，导致转基因大小增加和安全概况改善。 一些病毒载体疫苗已获得人类疫苗接种的许可，然而，使用病毒载体疫苗候选的许多临床前和临床试验仍在进行中。病毒载体疫苗已在单一试验中进行了测试，并对HIV免疫产生了适度结果。因此，开发针对没有有效传统疫苗的病原体的疫苗，如HIV、丙型肝炎病毒和埃博拉病毒等，至关重要。 VLP是一种新兴的多功能疫苗平台，近年来已显著用于生产几种商业化疫苗。从这个意义上说，VLP衍生疫苗被视为对抗新出现的病毒和开发通用流感A疫苗的有希望的解决方案。 利用病毒载体和其他技术，如mRNA和蛋白质亚单位疫苗，为全球疫苗接种迅速开发COVID-19疫苗，突显了这些技术的成功。这一成功强调了拥有基于先前研究的正确平台的重要性，并验证了病毒载体针对新出现的病毒和大流行爆发的有效性。 7.展望  病毒载体和基于VLP的疫苗的巨大潜力推动了新疫苗的持续设计。目前正在开发大量针对重要病原体的疫苗，如流感、HIV、RSV、埃博拉病毒和SARS-CoV-2，有些处于临床前或临床试验阶段。然而，尽管在开发病毒载体和基于VLP的疫苗方面取得了显著进展，但仍需解决许多挑战。具体来说，进一步研究对于提高其安全概况至关重要，解决与预先存在的免疫、可能整合到宿主细胞基因组以及产生致病表型相关的担忧。此外，开发针对主要人类病原体或疾病（如HIV、Epstein-Barr病毒、丙型肝炎病毒和结核病）的有效疫苗至关重要。努力还应集中在创建通用流感疫苗和开发新载体以免疫可能的新出现的变体上。此外，改进多价疫苗、克服扩大病毒载体使用于被动免疫的挑战，以及推进病毒载体在预防性或治疗性癌症疫苗中的应用，是未来研究的关键领域。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 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