mRNA递送系统开发：筛选靶向性聚合物纳米颗粒以触发高效免疫反应

2024-03-01

信使RNA疫苗siRNA

导读：经典脂质纳米颗粒（LNP）由4种类型的脂质分子构成：可电离阳离子脂质（Ionizable lipid）、辅助性磷脂(helper lipid)、胆固醇(Cholesterol)和聚乙二醇偶联脂质(PEGylated lipid)。利用微流控芯片将溶解在酸性水相中的mRNA分子与溶解在乙醇相中的各种脂质分子按照一定比例快速混合便可制备成mRNA-LNP制剂。可电离脂质在酸性环境中被质子化携带正电荷，与带负电荷的mRNA分子结合，从而实现对mRNA的包封。最后，用中性磷酸盐缓冲液透析，将体系改变为中性环境，促使可电离脂质转变为不带电状态，此时，LNP表明一般呈现微弱负电状态。当mRNA-LNP进入胞内体，可电离脂质重新带上正电荷，并与负电性的生物膜发生融合，促使mRNA释放到细胞质中。可电离脂质的这一特性使得LNP递送系统成为安全、高效递送mRNA的工具。目前，通用的LNP递送系统，有着非常明显的肝富集性。尽管耦合乙酰半乳糖胺 (GalNAc) 的siRNA-脂质体，可靶向肝细胞上的脱唾液酸糖蛋白受体，并且已被 FDA 开发并批准用于治疗肝脏疾病，但是，仍然缺乏有效的纳米载体来选择性地将mRNA疫苗递送至抗原呈递细胞（APCs）。2023年11月，台湾中央研究院基因体研究中心翁启惠院士团队在bioRxiv发表预印本文章：《Synthesis of Dendritic Cell-Targeted Polymeric Nanoparticles for Selective Delivery of mRNA Vaccines to Elicit Enhanced Immune Responses》，他们合成了一种可生物降解的聚合物纳米颗粒 (PNP)，采用胍和两性离子基团修饰，偶联芳基三甘露糖苷，用于封装和选择性递送 mRNA 至树突状细胞 (DC)。与非靶向性PNP或者LNP相比，树突细胞靶向性的spike mRNA-PNP新冠疫苗在小鼠体内可触发更强烈的保护性免疫反应。一、含二硫键和胍的聚合物近年来，具有二硫键的聚合物已成为广泛应用的功能性材料。由于其动态和可逆特性，这些聚合物被用于各种物质的胞内递送。具有二硫键的聚合物不仅在细胞内环境中可生物降解，而且能够通过硫醇介导的摄取（thiol-mediated uptake ），有效地将蛋白质、siRNA和mRNA递送至胞质。硫醇介导的摄取是一种细胞摄取机制，它涉及到细胞表面的巯基（thiol）与底物上的二硫键（disulfide）发生动态共价交换（dynamic covalent exchange）。这种交换使得底物与细胞表面形成共价键，然后通过不同的方式进入细胞，如融合、内吞或直接跨膜转运。硫醇-二硫化物交换已被证实在某些病毒和毒素进入细胞中发挥重要作用。事实上，白喉毒素和艾滋病毒是最先被发现通过硫醇介导的摄取进入细胞的毒素。二硫键聚合物作为一种高效通用载体来递送不同形式（DNA、mRNA和RNP）的CRISPR-Cas9机器包含嵌段阳离子聚合物的聚离子复合物胶束 (PIC)是有前景的 mRNA 载体。嵌段共聚物的聚阳离子片段中的胍部分与mRNA中的磷酸基团之间的多价相互作用是稳定mRNA/胶束以提高mRNA递送效率的关键因素。聚乙二醇-聚缩水甘油基甲基胍(PEG-PGMG)和PEG-聚缩水甘油基甲胺(PEG-PGMA)两种不同的嵌段共聚物二、筛选高转染效率的mRNA-PNP聚合物纳米颗粒首先，研究人员设计了一系列合成聚合物的传播剂（propagator），探索它们递送GFP mRNA和Spike mRNA的效率。P1携带一个胍基团。传播剂P2携带三个胍基团。P1和P2聚合物被设计为通过胍基团和mRNA的磷酸基团之间形成强盐桥来促进mRNA的封装。传播剂P3在胍基团附近含有两个胍基团，被设计为有分支的聚合物。含有二亚乙基三胺基团的传播剂 P4 被设计为促进被捕获的分子从降解中逃脱，其末端胺残基用于功能化。传播剂P5含有两性离子基团，旨在减少血清蛋白吸附并增强膜融合，并使mRNA从纳米载体递送至免疫细胞。两性离子旨在增强细胞膜融合以促进吸收。一旦聚合物封装的mRNA到达细胞质，二硫键就会被细胞内谷胱甘肽降解，释放出mRNA，以避免高分子量聚合物在细胞内积累而引起细胞毒性。用于聚合反应的引发剂（initiators）和传播剂（propagators）为了确定有效的细胞内递送 GFP-mRNA 的最佳聚合物，通过不同传播剂的共聚反应合成了同聚物和异聚物，并评估了它们在 HEK293T 细胞中的包封能力和转染效率。具有三价胍基团的P2/P3、P2/P4和P2/P5共聚物表现出更高的包封mRNA的能力，并且与传统转染剂聚乙烯亚胺(PEI)的结果相当。P1聚合物不利于细胞内递送，而异质聚合物P1/P4、P2/P4、P1/P5或P2/P5能够转染HEK293T细胞并释放mRNA。特别是，含有两性离子基团的聚合物非常有效。然而，支化聚合物 P1/P3 和 P2/P3 并未表现出令人满意的 mRNA 递送效率。这些结果表明，传播剂是影响转染效效率的重要成分，P1/P5和P2/P5产生的共聚物表现出最高的转染效率，并且在mRNA-Polymer=1:3的比例下，它们没有表现出任何明显的细胞毒性。P1 聚合物与 mRNA 混合，形成接近球形的电子致密纳米颗粒，但由于血清不稳定，这种颗粒通常效果较差。相比之下，P1/P5 共聚物与 mRNA 的复合物被发现是脂质体样的。聚合物可能形成带正电荷的层，可以封装 mRNA，并通过两性离子的结合促进随后的细胞摄取。不同类型的mRNA聚合物纳米颗粒转染HEK293T细胞的效率、尺寸大小及电位将Spike mRNA与P1/P5 共聚物按照不同的N/P比例混合，结果表明，P1/P5共聚物在N/P比为1时便可表现出良好的捕获spike mRNA的能力，所得mRNA-P1/P5共聚物复合物的平均粒径约为50μm。在 10 mM GSH 存在的情况下，mRNA 的释放以时间依赖的方式放生，这表明GSH 介导的聚合物降解导致mRNA释放。mRNA-P1/P5 复合物 (3 µg) 转染到 HEK293T 细胞，转染后 48 小时后，WB胶图上可明细观察到250 kDa 处的Spike蛋白。这些数据说明P1/P5共聚物是体外mRNA转染的有效纳米载体。为了可视化 mRNA-PNP 在细胞中的位置，从 P1/P4/P5 合成了 FITC 标记的聚合物，其中 FITC 通过 P4 上的胺基与聚合物缀合。共聚焦荧光成像表明mRNA-PNP (I1-P1/P4/P5)在2小时内便表现出溶酶体逃逸；然而，mRNA-PNP (I1-P1/P4) 即使在内化后 4 小时内也没有从溶酶体中逃逸出来。溶酶体与mRNA-PNP（I1-P1/P4/P5）的共定位比例低于mRNA-PNP（I1-P1/P4），表明烷基化两性离子残基可以显着改善膜融合和溶酶体逃逸。溶酶体和mRNA-PNP聚合物颗粒共聚焦荧光成像三、树突细胞靶向性的mRNA-PNP聚合物纳米颗粒为了选择性地将mRNA疫苗递送至抗原呈递细胞（APC），尤其是树突状细胞，研究人员设计了携带可被凝集素受体识别的不同聚糖头的引发剂。凝集素受体DC-SIGN 可识别高甘露糖聚糖，引发强大的免疫反应，尤其是 CD4+和 CD8 +T 细胞反应，使其成为选择性 mRNA 疫苗递送的有吸引力的受体。研究人员首先合成有芳基甘露糖苷的引发剂 I5 用于 mRNA-PNP 制备，因为它显示优先结合 DC-SIGN。通过流式细胞术在不同时间点评估 DC-SIGN 介导的 APC 细胞摄取。结果显示，在BMDCs中，携带芳基甘露糖头部基团的mRNA-PNP (I5-P1/P4-FITC/P5) 要比不携带的mRNA-PNP (I1-P1/P4-FITC/P5) 高出约34%。另一方面，当用 mRNA-PNP (I1-P1/P4-FITC/P5) 处理时，DC-SIGN 表达不显著的 B 细胞和 T 细胞仅显示荧光信号轻微增加。这些数据表明树突状细胞可以通过 DC-SIGN 受体有效内化和选择性摄取 mRNA-PNP (I5-P1/P4-FITC/P5) 。树突状细胞通过 DC-SIGN 受体可选择性摄取携带携带芳基甘露糖头部基团的mRNA-PNP聚合物颗粒基于上述结果，研究人员合成了具有不同甘露糖苷化合价和间隔的I6、I7、I8、I9和I10，并制备了相应的mRNA-PNP用于研究。线性三甘露糖配体（linear trimannose ligand）对甘露糖受体（MR）更具特异性，而芳基三触角甘露糖（aryl tri-antennary mannose ）更容易与DC-SIGN结合。此外，抗原内化和信号转导依赖于 DC-SIGN 在细胞表面和内体中的参与以及每个环境中的不同PH。由I5-P1/P5、I8-P1/P5、I9-P1/P5 和 I10-P1/P5 形成的mRNA-PNP 在 pH 7.4 和 5.0 下与 DC-SIGN 胞外结构域 (ECD) 结合具有几乎相同的亲和力，然而，由I6-P1/P5 和 I7-P1/P5 形成的mRNA-PNP 在较低 pH 值下失去了与 DC-SIGN 的结合亲和力，可能是因为在低 pH 值下与钙离子的配位减少。该说明芳基三甘露糖苷可以同酸性内体区室中的 DC-SIGN 相互作用。这种结合稳定性将增强 DC-SIGN 介导的信号传导及其与内体驻留 Toll 样受体（如 TLR7）的协同作用。此外，对于受体靶向递送，配体通常与载体连接，并且载体和配体之间的距离通过间隔的存在来调节。携带较长配体的 mRNA-PNP（带有 Man-Ar-PEG12 的 I6-P1/P5 和带有 Man-PEG12 的 I7-P1/P5）对 DC-SIGN 显示出稍高的亲和力。总体而言，具有芳基三甘露糖苷的 mRNA-PNP (I9-P1/P5) 对 DC-SIGN 表现出最高的亲和力。增加的亲和力可能是由于聚合物中配体的聚集效应和空间排列，并且芳基部分可以促进其疏水相互作用。ELISA测定在PH 7.4和PH5.0条件下，不同mRNA-PNP与DC-SING 之间的解离常数研究人员还进一步发现 C2C12 肌肉细胞（不表达甘露糖受体）对 mRNA-PNP (I9-P1/P5) 不具有靶向性的优先摄取。与直链型芳基三甘露糖苷 I10 相比，支链型芳基三甘露糖苷 I9 对 DC-SIGN 表现出更好的偏好。此外，I10 与 DC-SIGN、MMR、Dectin-2 或 langerin 强烈结合，没有显着的选择性。然而，I9 对 DCSIGN 呈现出更具选择性的结合。这些数据支持 DC 对 mRNA-I9-P1/P5 的有效摄取更有可能是由 DC-SIGN 介导的。四、Spike mRNA-PNP疫苗免疫效果BALB/c 小鼠在第 0 天使用疫苗进行免疫，并在第 14 天接受加强免疫。与采用LNP作为递送系统的疫苗或者不具携带芳基甘露糖头部基团的mRNA-PNP(I1-P1/P5)疫苗相比，加强免疫后，携带芳基甘露糖头部基团的mRNA-PNP(I9-P1/P5)疫苗触发的血清IgG抗体滴度要高出3倍。mRNA-PNP (I1-P1/P5) 的中和抗体水平与 mRNA-LNP 组相似，但在 mRNA-PNP (I9-P1/P5) 组会出更加显著的中和抗体水平。mRNA-PNP(I1-P1/P5)疫苗、mRNA-PNP (I9-P1/P5) 及mRNA-LNP免疫小鼠后的抗体反应五、小结研究人员设计合成了一系列用于合成递送mRNA的聚合物传播剂，并证明含有胍和两性离子基团的共聚合物（P1/P5）在体外和体内对于 mRNA 疫苗递送都表现出很高的效率。此外，由带有芳基三甘露糖苷头的引发剂 I9 和传播剂 P1/P5 产生的聚合物是选择性地将 mRNA 疫苗递送至树突状细胞进行翻译、加工、呈递和触发有效免疫应答的有效载体。总的来说，这项研究开发了一种靶向DC细胞的、触发强烈免疫反应的、可简单制备的新型共聚物mRNA递送系统，未来还需要对起触发的免疫机制做出更加详尽的研究。参考文献[1] Chen-Yo Fan, Szu-Wen Wang, Cinya Chung, et al. Synthesis of Dendritic Cell-Targeted Polymeric Nanoparticles for Selective Delivery of mRNA Vaccines to Elicit Enhanced Immune Responses. doi: 10.1101/2023.11.13.566827.[2] Yuan P, Zhang H, Qian L, Mao X, Du S, Yu C, Peng B, Yao SQ. Intracellular Delivery of Functional Native Antibodies under Hypoxic Conditions by Using a Biodegradable Silica Nanoquencher. Angew Chem Int Ed Engl. 2017 Oct 2;56(41):12481-12485. doi: 10.1002/anie.201705578.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。