EXOSC10

今天分享来自Symeres与X-Chem合作的一篇利用DEL筛选及构效研究大环苗头分子，可见DEL筛选大环化合物的优势。逃避细胞凋亡对于肿瘤的发生和生长至关重要。促生存蛋白骨髓细胞白血病 1 (Mcl-1) 是 Bcl-2 家族的抗凋亡成员，与肿瘤侵袭性、生存不良和耐药性相关。Mcl-1 抑制剂的开发意味着阻断蛋白质-蛋白质相互作用，通常需要对大而复杂的分子进行漫长的优化过程。在此，描述了使用 DNA 编码的化学文库合成和筛选来直接生成复杂但构象优先的大环化合物，作为 Mcl-1抑制剂。通过应用构象分析和基于结构的设计的概念组合，并结合允许快速模拟的强大合成平台，将先导系列的体外效力优化为低纳摩尔状态。此外，证明了大环化合物的物理化学性质的微调，从而鉴定出具有平衡特征的主要候选物57/ 59。1. 药物开发背景细胞凋亡是一种高度保守的程序性细胞死亡形式，是消除可有可无和潜在危险细胞的必要过程。内在凋亡途径主要由Bcl-2蛋白家族控制，该家族包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bcl-w）和促凋亡成员（如BAK、BAX、BIM、BID）。这两个亚家族之间的动态相互作用对于维持细胞的凋亡平衡至关重要，促凋亡蛋白的α-螺旋硼烷结构域与抗凋亡蛋白表面的螺旋状凹槽结合。具体来说，细胞应激导致仅BH3的促凋亡Bcl-2蛋白（如BIM、BID）的上调，该蛋白与抗凋亡家族成员相关，阻止促凋亡效应因子（如BAK、BAX）失活，从而驱动细胞凋亡。避免细胞凋亡被认为是肿瘤发展的关键因素，并进一步影响多种抗癌治疗的耐药性。为此，癌细胞高度表达Bcl-2家族的促生存基因，并且这些基因的表达已被证明是必不可少的，使它们成为癌症治疗的有希望的靶点。这类蛋白质的药物，和直接凋亡激活的潜力作为治疗方法，证明了具有里程碑意义的批准选择性Bcl-2抑制剂Venetoclax慢性淋巴细胞白血病（CLL）。在2016年，在其他抗凋亡家族成员，髓细胞白血病分化蛋白1（Mcl-1）是作为主监管各种细胞凋亡。Mcl-1的过表达已在血液癌和实体肿瘤中被广泛观察到，包括非小细胞肺癌（NSCLC）和乳腺癌。此外，有证据表明，Mcl-1的表达与癌症复发和由Bcl-2抑制剂Venetoclax引起的癌症复发和耐药性有关。图1.来自不同结构类别的代表性Mcl-1抑制剂的结构。在过去的5−10年中，在（专利）文献中披露了各种有效的、选择性的Mcl-1抑制剂，一些化合物达到临床开发，尽管结果混合和某些毒性担忧。认识到抑制Mcl-1功能需要阻断蛋白−蛋白相互作用的事实，大多数开发的抑制剂都是相当大的分子，许多特性如Log P、PSA和MW位于“non-Lipinski”超过五规则（bRo5）区域。图1显示了这些复杂分子的化学空间，显示了过去十年中报道的具有代表性的抑制剂选择。在药物相关分子的发展之前，有来自Fesik实验室的开创性工作，包括基于片段的药物发现，更具体地说是片段连接。初步的研究发现了一种有效的吲哚羧酸衍生物（“化合物53”，图1），其共晶结构为研究Mcl-1蛋白的药物口袋提供了重要的见解。对同一组分子进行进一步优化，进行片段筛选，同时将蛋白的主要结合位点与原化合物饱和结合。由此产生的命中，从而结合到目标蛋白的其他亚袋，通过片段连接的方法保持原来的indole支架。这导致了更复杂的结构（例如，“化合物-60”，图1），与Bcl-2家族的其他成员相比，具有更强的效力和选择性。2016年，报道了一种基于硫代嘧啶骨架的化合物类（例如，S63845，图1）。这些分子最初是通过片段筛选发现的，并通过几轮SBDD进一步优化。化合物S63845（图1）在静脉给药后的一系列临床前肿瘤模型中被证明有效的。随后工作得到化合物S64315，进入I/II期临床试验。自2017/2018年以来，基于几种不同核心骨架的几种大环抑制剂相继出现。安进公司提出了一类基于已知噻吩嘧啶支架的大环，先导化合物ABBV-467将于2019年进入临床试验。阿斯利康发表了AZD5991(图1)，它是通过后续的大环化，根据已知的开链吲哚羧酸骨架合理设计的。大约在同一时间，安进报告了一类含有螺环四氢萘部分的新型大环(例如AMG397，图1)。这些化合物来自基于片段的命中生存方法，之后在后期进行大环化。2020/2021年，Gilead和Prelude Therapeutics公司均发现了类似的含有大环抑制剂的四氢萘，但其骨架结构和修饰模式均存在明显差异。最后，2017年，阿斯利康和X-Chem已经描述了基于线性DNA编码化学文库(DEL)的筛选命中，这些命中随后被大环化。最近，Janssen发表了基于之前描述的吲哚羧酸和螺环四氢dronaphthalene核心(图1 中的JNJ-4355和“化合物28”)开展的关于两个大环抑制剂系列的广泛研究。图 1 中的大分子化合物、主要是大环的化合物与寻找命中和优化命中面临许多明显挑战。所有化合物最终都是从较小的非环分子开发出来的，这需要大量的优化过程，即是典型的大环合成过程。另一方面，从筛选中直接识别大的大环命中分子需要特别大和多样化的文库，通常只有DNA编码的化学文库(DEL)提供。考虑到优化DEL化合物的命中方面的经验，再加上X-Chem的大环DEL可用性，决定采用这种方法筛选命中。期望通过直接产生大环命中，同时建立一个稳健的合成平台，以高效制备大量的大环分子，从而缩短此类复杂候选药物的开发时间。本文描述了从命中发现，到开发具有更高效能和理化性质的先导分子的过程，包括对精确的大环分子三维结构进行大量的构象分析。2. 分子开发结果2.1 DNA编码化学文库筛选图2a 描绘了该筛选的一般工作流程。21种不同的DNA编码化学文库的混合物被组合到单一的文库平台中，用于筛选Mcl-1。每个库都是用不同的化学方案单独合成的，并由此定义了一组砌块。950亿种化合物中的每一种都与一种独特的DNA序列共价连接，并被其编码，这一序列记录了其分裂和聚合的合成历史，并允许其被识别。在这个文库中包括的亚型中有一个四循环肽的大环文库，其合成是通过将受保护的三功能构建块2-氨基-3-(4 ' -氨基苯基)-丙酸酰化到一个5 ' -胺端连接体寡核苷酸缀合物开始的。然后，通过连续组装三组N-Fmoc-氨基酸(每组数量超过300)，将2-氨基作为化学多样化的一个点，随后组装甲酰酸的第四个化学循环。随后，使用还原胺化化学进行了大环化步骤，从而产生了15亿个四环大环化合物库。图2. 用于发现单个DNA编码化学文库命中的选择输出数据:(a)工作流程表示，I: DNA编码文库的设计和合成，II:通过亲和筛选富集选择性结合物，III:使用DNA标签深度测序表征选择输出，IV:通过统计分析鉴定富集的文库化合物，V:合成无标记的代表性化合物，VI:分析化合物和鉴定导联; (b, c)对16.6 μM Mcl-1(172 - 327)进行4循环大环库富集的单个构建块对的富集数据。蓝色的簇代表包含命中的化合物家族;(d)“SAR”数据，如在四个化学周期中的每一个周期中，对包含命中的化合物家族的选择输出所显示的共富集变量组成部分的流行率;(e)用于建立此系列的无标记命中化合物;在Mcl-1-BAK时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)测定中确定的IC50值;b在NCI-H929细胞活力测定中确定的IC50值;c IC50值在Bcl-xl-BAK TR-FRET测定中测定。首先是捕获60 μL体积的16.6 μM Mcl-1（172−327）到5 μL体积的IMAC亲和树脂His-Select (Sigma-Aldrich, MO)上，将该树脂夹在两个Phytip (Phynexus, CA)之间。除去未捕获的蛋白，然后加入1纳摩的文库溶解在缓冲液中，与捕获的目标孵育30 min。然后洗涤树脂8次，然后以95°C洗脱。洗脱后的文库用新鲜蛋白进行第二轮筛选，以进一步增加Mcl-1结合物的富集。同时进行了一系列额外的选择，包括含有80 μM BIM肽的Mcl-1（172−327）、Mcl-1（33−327）、Bcl-xl和无目标对照（仅His-Select树脂）。第二轮筛选的结果经PCR扩增并提交Illumina测序。在所有21个库和所有选择条件下，总共产生了1.2亿次单端读取，平均每个选择条件下每个库读取114万次。将单个测序片段转换回相应的砌块和文库方案，并计算每个文库在所有选择条件下的所有构砌块组合的统计概率数据。在筛选的所有文库中都观察到许多强富集的砌块组合，这些组合被识别，聚成复合家族，并在所有选择条件下进行分析。所有这些化合物都富集了全长Mcl-1和截短Mcl-1，并且都被认为是与BIM肽竞争性的；只有当在Mcl-1的选择中包含一个饱和浓度的BIM肽时没有富集。大多数富集的化合物也针对脱靶的Bcl-xl富集，从而证实了寻找对Mcl-1具有选择性的化合物比Bcl-xl更困难。选择输出中化合物的相对富集水平如 图2b,c所示。这些立方图沿着x轴和y轴显示了两个化学循环中的每个组成部分，并且沿着z轴绘制了这些组成部分对的富集情况。2.2 大环化合物组合阵列的方法如图2e所示，DEL筛选的大环命中已经显示出明显的结合亲和力（50−130nM），没有检测到针对Bcl-xl的脱靶活性，因此为进一步优化提供了良好的起点。尽管其半肽特性，该化合物具有足够的代谢稳定性来进一步发展。在H929骨髓瘤细胞的细胞活力试验中，3个命中的2个仅为中等（分别为7.2、3.5和>10μM），所有化合物在pH为7.4时的水溶度为<2 μM。这些结果清楚地表明，改进点的重点是效力和理化性质。由于这些化合物与Mcl-1蛋白的结合模式尚不清楚，还不清楚我们需要关注大环分子的哪个区域进行改进。从结构上单独研究所有区域需要多个冗长的设计-测试-分析（DMTA）周期，以获得足够有用的SAR信息。因此，作者决定继续应用组合方法，同时研究分子的所有部分。因此，大环结构需要以一种允许强大的合成耦合程序的方式被分解成片段。因此，我们鉴定出了4个片段，同时利用了酰胺键连接，这与在合成DEL时使用的连接相同。图3突出显示了片段A−D，将代表对活性明确重要的独立区域。使用化合物3作为参考结构，将所选择的策略限制在单替换和双替换，假设这将提供最基本的SAR信息，同时保持一个可管理的数组大小。这种限制理论上可以从图3中所示的砌块中产生733个目标分子。其中，有444个化合物被成功合成，使整个组合阵列的总体成功率为61%。所有组合阵列化合物均以单一浓度测试，用于Mcl-1-BAK TR-FRET结合试验，其结果如图4a。对在10 μM浓度下显示>50%抑制的49种新化合物进行了剂量−反应测量，所得到的半抑制浓度值如图4b所示。半抑制浓度值与抑制百分比合理一致，只有5种化合物被归类为假阳性（半抑制浓度> 10 μM）。尽管观察到陡峭的SAR，但多种化合物在母体化合物3的范围内表现出活性。所有半抑制浓度值低于300 nM的化合物见表1。从表1中所示的化合物中可以推断出几种早期的SAR趋势。显然，a片段中的乙氧基部分并不是特别重要，因为甲氧基(5)和氯（6/12）也是可以耐受的。相反，未取代的含a2的变化显示出活性降低，这表明在该位置至少需要一些空间体。可能，影响邻位醚乙酰胺连接剂的取向对稳定生物活性构象很重要。在B和C区域可以容忍更多的变化，特别是在外周取代基中。这表明，精确的主干构象在大循环的这一部分中更为重要，而侧链之间的相互作用则不那么重要。图3. 在组合阵列合成过程中用于所有四个组件的构建块。图4. Mcl-1/BAKTR-FRET检测结果：442种新组合阵列化合物在10 μM时的(a)抑制率百分比；49种最活跃的化合物在μM的(b)半抑制浓度值与10μM（纵轴）的抑制百分比。2.3 特定的/有针对性的SAR研究表1. 与半抑制浓度< 300 nM的组合阵列化合物a.用Mcl-1-BAK TR-FRET法测定的半抑制浓度值。表2. 聚焦的苯基甘氨酸修饰a. 用Mcl-1-BAK TR-FRET法测定的半抑制浓度值；ND =未测定。表3. B/C区域主干结构修改 a. 用Mcl-1-BAK TR-FRET法测定的半抑制浓度值。b.  4：1苯基甘氨酸外构异构体的混合物。2.4 结构研究为了深入了解合成的化合物的SAR，我们使用各种核磁共振技术，包括二维核磁共振（如NOESY）、变温（VT）核磁共振和H/D交换实验，研究了游离大环配体在溶液中的构象特征。图5. 重要的光谱数据和化合物3在溶液中（CDCl3）的主要构象的阐明。最可能的分子内氢键用蓝色虚线表示。图6. 为溶液中3 (a)和18 (b)的肽链片段的氢键网络。显示了NH酰胺基团的温度系数（Δδ/ΔT）和H/D交换速率（t1/2）。 图7. 化合物2的单分子晶体结构；黄色虚线表示轴向NH与苯氧氧之间的2.1 A分子内氢键。图8. 蛋白质−配体晶体结构（绿色）的配体1覆盖3（洋红色），去除3的侧链和取代基；用薛定谔的MacroModel模型生成构象。 图9. 化合物1（绿色）与Mcl-1蛋白（PDB：8QSO）复合物的X射线晶体结构，突出显示不同的口袋：P1（小麦色）、P2（浅蓝色）、P3（粉红色）和P4（淡绿色）；氢键用黄色虚线表示。图10. 化合物1与图1（PDB 5FDR）中的“化合物60”的X射线晶体结构叠加；(a)比较诱导P1口袋的封闭形式（8QSO，青色）和开放形式(PDB：5FDR，浅粉色）；(b)（绿色）覆盖5FDR蛋白的“Cmpd60”（橙色），显示诱导口袋的表面。2.5 先导优化表4. P1‘-口袋取代基的优化a.用Mcl-1-BAK TR-FRET法测定的半抑制浓度值。b. NCI-H929细胞活力测定测定的半抑制浓度值。c.用NCI-H929细胞Caspase 3/7检测方法确定的半抑制浓度值；ND =未测定表5. 平衡活性和理化性质a.一个d-苯丙氨酸片段被d-苯丙氨酸取代。b. 用PAMPA测量的被动渗透率。c. 用Mcl-1-BAK TRFRET法测定的半抑制浓度值。d. 用NCI-H929细胞Caspase 3/7检测方法确定的半抑制浓度值；ND =未测定。参考文献:https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1021/acs.jmedchem.3c02206声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

导读：经典脂质纳米颗粒（LNP）由4种类型的脂质分子构成：可电离阳离子脂质（Ionizable lipid）、辅助性磷脂(helper lipid)、胆固醇(Cholesterol)和聚乙二醇偶联脂质(PEGylated lipid)。利用微流控芯片将溶解在酸性水相中的mRNA分子与溶解在乙醇相中的各种脂质分子按照一定比例快速混合便可制备成mRNA-LNP制剂。可电离脂质在酸性环境中被质子化携带正电荷，与带负电荷的mRNA分子结合，从而实现对mRNA的包封。最后，用中性磷酸盐缓冲液透析，将体系改变为中性环境，促使可电离脂质转变为不带电状态，此时，LNP表明一般呈现微弱负电状态。当mRNA-LNP进入胞内体，可电离脂质重新带上正电荷，并与负电性的生物膜发生融合，促使mRNA释放到细胞质中。可电离脂质的这一特性使得LNP递送系统成为安全、高效递送mRNA的工具。目前，通用的LNP递送系统，有着非常明显的肝富集性。尽管耦合乙酰半乳糖胺 (GalNAc) 的siRNA-脂质体，可靶向肝细胞上的脱唾液酸糖蛋白受体，并且已被 FDA 开发并批准用于治疗肝脏疾病，但是，仍然缺乏有效的纳米载体来选择性地将mRNA疫苗递送至抗原呈递细胞（APCs）。2023年11月，台湾中央研究院基因体研究中心翁启惠院士团队在bioRxiv发表预印本文章：《Synthesis of Dendritic Cell-Targeted Polymeric Nanoparticles for Selective Delivery of mRNA Vaccines to Elicit Enhanced Immune Responses》，他们合成了一种可生物降解的聚合物纳米颗粒 (PNP)，采用胍和两性离子基团修饰，偶联芳基三甘露糖苷，用于封装和选择性递送 mRNA 至树突状细胞 (DC)。与非靶向性PNP或者LNP相比，树突细胞靶向性的spike mRNA-PNP新冠疫苗在小鼠体内可触发更强烈的保护性免疫反应。一、含二硫键和胍的聚合物近年来，具有二硫键的聚合物已成为广泛应用的功能性材料。由于其动态和可逆特性，这些聚合物被用于各种物质的胞内递送。具有二硫键的聚合物不仅在细胞内环境中可生物降解，而且能够通过硫醇介导的摄取（thiol-mediated uptake ），有效地将蛋白质、siRNA和mRNA递送至胞质。硫醇介导的摄取是一种细胞摄取机制，它涉及到细胞表面的巯基（thiol）与底物上的二硫键（disulfide）发生动态共价交换（dynamic covalent exchange）。这种交换使得底物与细胞表面形成共价键，然后通过不同的方式进入细胞，如融合、内吞或直接跨膜转运。硫醇-二硫化物交换已被证实在某些病毒和毒素进入细胞中发挥重要作用。事实上，白喉毒素和艾滋病毒是最先被发现通过硫醇介导的摄取进入细胞的毒素。二硫键聚合物作为一种高效通用载体来递送不同形式（DNA、mRNA和RNP）的CRISPR-Cas9机器包含嵌段阳离子聚合物的聚离子复合物胶束 (PIC)是有前景的 mRNA 载体。嵌段共聚物的聚阳离子片段中的胍部分与mRNA中的磷酸基团之间的多价相互作用是稳定mRNA/胶束以提高mRNA递送效率的关键因素。聚乙二醇-聚缩水甘油基甲基胍(PEG-PGMG)和PEG-聚缩水甘油基甲胺(PEG-PGMA)两种不同的嵌段共聚物二、筛选高转染效率的mRNA-PNP聚合物纳米颗粒首先，研究人员设计了一系列合成聚合物的传播剂（propagator），探索它们递送GFP mRNA和Spike mRNA的效率。P1携带一个胍基团。传播剂P2携带三个胍基团。P1和P2聚合物被设计为通过胍基团和mRNA的磷酸基团之间形成强盐桥来促进mRNA的封装。传播剂P3在胍基团附近含有两个胍基团，被设计为有分支的聚合物。含有二亚乙基三胺基团的传播剂 P4 被设计为促进被捕获的分子从降解中逃脱，其末端胺残基用于功能化。传播剂P5含有两性离子基团，旨在减少血清蛋白吸附并增强膜融合，并使mRNA从纳米载体递送至免疫细胞。两性离子旨在增强细胞膜融合以促进吸收。一旦聚合物封装的mRNA到达细胞质，二硫键就会被细胞内谷胱甘肽降解，释放出mRNA，以避免高分子量聚合物在细胞内积累而引起细胞毒性。用于聚合反应的引发剂（initiators）和传播剂（propagators）为了确定有效的细胞内递送 GFP-mRNA 的最佳聚合物，通过不同传播剂的共聚反应合成了同聚物和异聚物，并评估了它们在 HEK293T 细胞中的包封能力和转染效率。具有三价胍基团的P2/P3、P2/P4和P2/P5共聚物表现出更高的包封mRNA的能力，并且与传统转染剂聚乙烯亚胺(PEI)的结果相当。P1聚合物不利于细胞内递送，而异质聚合物P1/P4、P2/P4、P1/P5或P2/P5能够转染HEK293T细胞并释放mRNA。特别是，含有两性离子基团的聚合物非常有效。然而，支化聚合物 P1/P3 和 P2/P3 并未表现出令人满意的 mRNA 递送效率。这些结果表明，传播剂是影响转染效效率的重要成分，P1/P5和P2/P5产生的共聚物表现出最高的转染效率，并且在mRNA-Polymer=1:3的比例下，它们没有表现出任何明显的细胞毒性。P1 聚合物与 mRNA 混合，形成接近球形的电子致密纳米颗粒，但由于血清不稳定，这种颗粒通常效果较差。相比之下，P1/P5 共聚物与 mRNA 的复合物被发现是脂质体样的。聚合物可能形成带正电荷的层，可以封装 mRNA，并通过两性离子的结合促进随后的细胞摄取。不同类型的mRNA聚合物纳米颗粒转染HEK293T细胞的效率、尺寸大小及电位将Spike mRNA与P1/P5 共聚物按照不同的N/P比例混合，结果表明，P1/P5共聚物在N/P比为1时便可表现出良好的捕获spike mRNA的能力，所得mRNA-P1/P5共聚物复合物的平均粒径约为50μm。在 10 mM GSH 存在的情况下，mRNA 的释放以时间依赖的方式放生，这表明GSH 介导的聚合物降解导致mRNA释放。mRNA-P1/P5 复合物 (3 µg) 转染到 HEK293T 细胞，转染后 48 小时后，WB胶图上可明细观察到250 kDa 处的Spike蛋白。这些数据说明P1/P5共聚物是体外mRNA转染的有效纳米载体。为了可视化 mRNA-PNP 在细胞中的位置，从 P1/P4/P5 合成了 FITC 标记的聚合物，其中 FITC 通过 P4 上的胺基与聚合物缀合。共聚焦荧光成像表明mRNA-PNP (I1-P1/P4/P5)在2小时内便表现出溶酶体逃逸；然而，mRNA-PNP (I1-P1/P4) 即使在内化后 4 小时内也没有从溶酶体中逃逸出来。溶酶体与mRNA-PNP（I1-P1/P4/P5）的共定位比例低于mRNA-PNP（I1-P1/P4），表明烷基化两性离子残基可以显着改善膜融合和溶酶体逃逸。溶酶体和mRNA-PNP聚合物颗粒共聚焦荧光成像三、树突细胞靶向性的mRNA-PNP聚合物纳米颗粒为了选择性地将mRNA疫苗递送至抗原呈递细胞（APC），尤其是树突状细胞，研究人员设计了携带可被凝集素受体识别的不同聚糖头的引发剂。凝集素受体DC-SIGN 可识别高甘露糖聚糖，引发强大的免疫反应，尤其是 CD4+和 CD8 +T 细胞反应，使其成为选择性 mRNA 疫苗递送的有吸引力的受体。研究人员首先合成有芳基甘露糖苷的引发剂 I5 用于 mRNA-PNP 制备，因为它显示优先结合 DC-SIGN。通过流式细胞术在不同时间点评估 DC-SIGN 介导的 APC 细胞摄取。结果显示，在BMDCs中，携带芳基甘露糖头部基团的mRNA-PNP (I5-P1/P4-FITC/P5) 要比不携带的mRNA-PNP (I1-P1/P4-FITC/P5) 高出约34%。另一方面，当用 mRNA-PNP (I1-P1/P4-FITC/P5) 处理时，DC-SIGN 表达不显著的 B 细胞和 T 细胞仅显示荧光信号轻微增加。这些数据表明树突状细胞可以通过 DC-SIGN 受体有效内化和选择性摄取 mRNA-PNP (I5-P1/P4-FITC/P5) 。树突状细胞通过 DC-SIGN 受体可选择性摄取携带携带芳基甘露糖头部基团的mRNA-PNP聚合物颗粒基于上述结果，研究人员合成了具有不同甘露糖苷化合价和间隔的I6、I7、I8、I9和I10，并制备了相应的mRNA-PNP用于研究。线性三甘露糖配体（linear trimannose ligand）对甘露糖受体（MR） 更具特异性，而芳基三触角甘露糖（aryl tri-antennary mannose ）更容易与DC-SIGN结合。此外，抗原内化和信号转导依赖于 DC-SIGN 在细胞表面和内体中的参与以及每个环境中的不同PH。由I5-P1/P5、I8-P1/P5、I9-P1/P5 和 I10-P1/P5 形成的mRNA-PNP 在 pH 7.4 和 5.0 下与 DC-SIGN 胞外结构域 (ECD) 结合具有几乎相同的亲和力 ，然而，由I6-P1/P5 和 I7-P1/P5 形成的mRNA-PNP 在较低 pH 值下失去了与 DC-SIGN 的结合亲和力，可能是因为在低 pH 值下与钙离子的配位减少。该说明芳基三甘露糖苷可以同酸性内体区室中的 DC-SIGN 相互作用。这种结合稳定性将增强 DC-SIGN 介导的信号传导及其与内体驻留 Toll 样受体（如 TLR7）的协同作用。此外，对于受体靶向递送，配体通常与载体连接，并且载体和配体之间的距离通过间隔的存在来调节。携带较长配体的 mRNA-PNP（带有 Man-Ar-PEG12 的 I6-P1/P5 和带有 Man-PEG12 的 I7-P1/P5）对 DC-SIGN 显示出稍高的亲和力。总体而言，具有芳基三甘露糖苷的 mRNA-PNP (I9-P1/P5) 对 DC-SIGN 表现出最高的亲和力。增加的亲和力可能是由于聚合物中配体的聚集效应和空间排列，并且芳基部分可以促进其疏水相互作用。ELISA测定在PH 7.4和PH5.0条件下，不同mRNA-PNP与DC-SING 之间的解离常数研究人员还进一步发现 C2C12 肌肉细胞（不表达甘露糖受体）对 mRNA-PNP (I9-P1/P5) 不具有靶向性的优先摄取。与直链型芳基三甘露糖苷 I10 相比，支链型芳基三甘露糖苷 I9 对 DC-SIGN 表现出更好的偏好。此外，I10 与 DC-SIGN、MMR、Dectin-2 或 langerin 强烈结合，没有显着的选择性。然而，I9 对 DCSIGN 呈现出更具选择性的结合。这些数据支持 DC 对 mRNA-I9-P1/P5 的有效摄取更有可能是由 DC-SIGN 介导的。四、Spike mRNA-PNP疫苗免疫效果BALB/c 小鼠在第 0 天使用疫苗进行免疫，并在第 14 天接受加强免疫。与采用LNP作为递送系统的疫苗或者不具携带芳基甘露糖头部基团的mRNA-PNP(I1-P1/P5)疫苗相比，加强免疫后，携带芳基甘露糖头部基团的mRNA-PNP(I9-P1/P5)疫苗触发的血清IgG抗体滴度要高出3倍。mRNA-PNP (I1-P1/P5) 的中和抗体水平与 mRNA-LNP 组相似，但在 mRNA-PNP (I9-P1/P5) 组会出更加显著的中和抗体水平。mRNA-PNP(I1-P1/P5)疫苗、mRNA-PNP (I9-P1/P5) 及mRNA-LNP免疫小鼠后的抗体反应五、小结研究人员设计合成了一系列用于合成递送mRNA的聚合物传播剂，并证明含有胍和两性离子基团的共聚合物（P1/P5）在体外和体内对于 mRNA 疫苗递送都表现出很高的效率。此外，由带有芳基三甘露糖苷头的引发剂 I9 和传播剂 P1/P5 产生的聚合物是选择性地将 mRNA 疫苗递送至树突状细胞进行翻译、加工、呈递和触发有效免疫应答的有效载体。总的来说，这项研究开发了一种靶向DC细胞的、触发强烈免疫反应的、可简单制备的新型共聚物mRNA递送系统，未来还需要对起触发的免疫机制做出更加详尽的研究。参考文献[1] Chen-Yo Fan, Szu-Wen Wang, Cinya Chung, et al. Synthesis of Dendritic Cell-Targeted Polymeric Nanoparticles for Selective Delivery of mRNA Vaccines to Elicit Enhanced Immune Responses. doi: 10.1101/2023.11.13.566827.[2] Yuan P, Zhang H, Qian L, Mao X, Du S, Yu C, Peng B, Yao SQ. Intracellular Delivery of Functional Native Antibodies under Hypoxic Conditions by Using a Biodegradable Silica Nanoquencher. Angew Chem Int Ed Engl. 2017 Oct 2;56(41):12481-12485. doi: 10.1002/anie.201705578.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

感谢关注转发，欢迎学术交流请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程阿尔茨海默病(AD)的病理特征之一是由磷酸化的Tau片段组成神经原纤维缠结（NFT）形成。天冬酰胺内肽酶（AEP）是一种关键的Tau蛋白切割酶，可产生易于聚集的Tau蛋白片段。抑制AEP以降低毒性Tau片段形成水平可能是一种很有前途的治疗策略。这篇文章报道了第一种具有不可逆结合模式的选择性、口服生物可利用性和脑渗透抑制剂，从可逆分子开始概述了该系列的发展，并在体外和体内证明了AEP抑制与Tau N368片段减少之间的联系。阿尔茨海默病（AD）是最常见的痴呆症形式，2020年全球有5500多万人受到影响。阿尔茨海默病大脑的两个主要组织病理学病变是淀粉样斑块，包括聚集的Aβ肽和神经原纤维缠结（NFTs）。缠结的主要成分是Tau蛋白，通常是一种与微管相关并稳定微管的高可溶性蛋白质。在AD和其他Tau病变中，Tau蛋白经历结构变化导致其聚集。总之，Tau聚集在Tau病变中起着重要的作用。特别地，AD患者认知能力与Tau聚集负荷呈负相关。此外，AD患者的多模态成像显示Tau聚集沉积与区域性脑萎缩和功能障碍相关。因此，减轻Tau聚集的策略是一种很有前途的方法来调节AD。Tau含有几个（3-4）串联重复序列，存在31或32个残基，每个都有一个特征的PGGG基序。重复区是分子的关键部分，使原纤维组装成核。结构研究表明，位于中心的重复区域通常被N端和C端区域覆盖，从而排除了溶液中Tau-Tau相互作用。翻译后修饰，如磷酸化和蛋白水解，诱导Tau蛋白的构象变化，暴露重复区域，促进聚集。溶酶体半胱氨酸蛋白酶天冬酰胺内肽酶（AEP）已被证明可以在重复区域的两侧切割Tau蛋白，从而暴露重复区域并促进聚集。AEP水平和活性在AD中上调，导致产生更多的Tau N368片段。AD患者脑脊液中Tau N368/total-Tau比值显著降低，且与18F-GTP1 Tau PET信号呈强负相关。这一观察结果与Tau N368片段容易聚集的假设相一致。除了切割Tau外，AEP还通过促进Tau磷酸化影响Tau聚集，因为AEP间接抑制蛋白磷酸酶2A（调节Tau去磷酸化的关键酶），AEP可能在促进Tau聚集之外参与AD的发病机制。AEP切割片段Tau N368最近被证明可以通过与BACE1转录因子STAT1结合来增加BACE1的表达和Aβ的产生。这意味着AEP抑制可能通过直接减少Tau N368片段或间接抑制BACE1途径对AD患者提供治疗益处。除Tau蛋白外，AEP被报道具有广泛的底物范围包括与神经退行性疾病相关的其他蛋白，如α-synuclein15和TDP-43。AEP在人体组织中普遍产生，与大脑相比，肾脏和淋巴器官中的AEP水平相对较高。AEP KO小鼠表现出肾近端小管上皮细胞（PTEC）增生和增生的进行性肾脏病理，并表现为免疫系统过度刺激的噬血细胞综合征。因此，该项目的第一个目标是通过使用目标化合物进行药理学抑制并降低潜在的外周毒理学影响的风险。第二个目标是使用脑渗透目标化合物证明AEP在阿尔茨海默氏症或其他Tau病变中的参与机制。先前寻找AEP抑制剂的努力是由Bogyo（化合物1）和Williams（化合物2和3）组推动的。此外，Ye组报道化合物4和5可能通过一种变构抑制机制在体内表现出促进认知的作用。图1.已报道的AEP抑制剂不幸的是，这些抑制剂由于高极性和部分低代谢稳定性以及高蛋白质结合而导致渗透性差。它们不适合测试疾病假说或降低体内外周毒性。在体内可以获得AEP-配体复合物的X射线晶体结构，揭示了催化位点的分子识别（图2）。其与天冬酰胺和天冬氨酸（低pH）残基C端蛋白质底物的特异性切割一致，S1口袋相对较小且极性很强。与Arg-44（2.8和3.0Å）和Asp-231（2.6Å）的侧链形成氢键。肽型氯甲基酮抑制剂AcYVAD-CMK通过与Ser-216和Ala-218附加的主氢键进入子口袋S2−S4。此外，还检测到与Cys-189的共价键（图2）。图2.AEP与Ac-YVAD-CMK共晶（PDB代码: 4aw9）。图中标注了结合口袋S1~S4，以及关键蛋白-配体氢键（红线）和与Cys-189的共价键（蓝线）。化合物设计与SAR研究受益于氰基与Cys-189共价结合，丙酰胺取代基与P1 Asn残基相似，二级酰胺NH和三级酰胺C=O分别与Ser-216和α-218的主链相互作用（图3），选择以通式6的腈（表1）为起点，并重点优化了指向S3和S4袋的R1-R3取代基。最初的SAR研究（表1）表明，芳基乙酰胺具有最好的效价，通过在α位置安装环丙基或环丁基等取代基，可以进一步提高5-20倍（比较化合物6e和6f与6a）。这可以用模型中通过S3口袋中的范德华相互作用来合理化解释。此外，芳基环对位的亲脂取代基对效价和渗透性都有有益的影响。图3.覆盖晶体结构（PDB ID：4aw9）的支架6（黄色）模型表1.P3和P4残基的初始优化a至少2次测定的几何平均值±SEM。bpH值为7.4时测得的log D。cPAMPA有效渗透率（10−6cm/s）。d小鼠肝微粒体CLint（μL/min/mg）。在亲脂性、高通透性和低清除率之间取得平衡对于获得具有良好体内药代动力学（PK）特征的化合物至关重要。在此基础上，将化合物6o确定为第一个进一步分析的化合物（见下表4）。化合物6o在小鼠中表现出良好的PK谱，生物利用度为41%，脑穿透Kp,uu为0.22。接下来，测定化合物的细胞效力。不幸的是，酶促试验的荧光底物Z-AAN-Rh110不能渗透细胞。其他例如通过Western blot观察内源性底物或使用化学探针，如LE28或AP-1是可行的，但不适合高通量。于是，Roche公司设计了一种细胞渗透的荧光底物，结合亲和力和选择性，提供化合物6o的左手边（即1-(4-(三氟甲氧基)苯基)环丙羧酸(7)的酰胺）连接荧光氨基甲基香豆素（AMC）（图4）。图4. 用于细胞试验的荧光可渗透底物有了底物8，使用过表达HEK293细胞的AEP建立了细胞实验。用这种方法分析化合物，发现腈在细胞水平具有很好的酶促抑制作用，其效力变化约为200倍（表2）。表2.选定腈的细胞潜能a至少2次测定的几何平均值±SEMRoche设想了一种更持久、潜在不可逆的抑制剂，以确保AEP的完全阻断。弹头是多种多样的，不同的不可逆反应基团附着在相应的肼支架上（表3）。化合物孵育0.5h后的酶抑制活性总体上与亲电中心的反应活性相关，氯乙酰胺12被认为是最有效的，但存在一些稳定性问题。自氟乙酰胺11，反应性逐渐降低。表3.含不可逆结合基（弹头，WH）的6o衍生物的效价及表征a至少2次测定的几何平均值±SEM。bpH值为7.4时测得的log D。cPAMPA有效渗透率（10-6cm/s）。d小鼠肝微粒体CLint（μL/min/mg）。氟乙酰胺11在二级功能分析中具有良好的效力，具有良好的选择性和药物代谢和药代动力学（DMPK)谱，并在体内进一步表征（表4）。表4.化合物6o和11的生化、物理化学和DMPK性质a至少2次测定的几何平均值±SEM。b从抑制试验开始测定。c小鼠肝细胞孵育后清除率。dP-gp抑制剂作用下P-gp过表达的小鼠LLC-PK1细胞的顶端外排比和表观通透性。e血浆蛋白结合、未结合部分。fClean是指在10μM条件下，所有检测结果的结合率<50%，或者酶检测结果的选择性>1000倍。g用自动膜片钳yy y测量。C57BL/6小鼠单次给药1mg/kg iv和10mg/kg po灌胃（11）和3mg/kg iv和30mg/kg po灌胃（6o）后的PK参数。药代动力学评估化合物11在给药后表现出中等的生物利用度和良好的半衰期，但由于细胞渗透性低，故化合物11的脑渗透性较差。此外，尽管p -糖蛋白（P-gp；MDR1）转运蛋白含量较低（表4），根据以往经验，Roche公司认为这可能是由主动外排的显著贡献所引起的。P-gp测定法对低被动渗透率化合物的定量达到极限。然而，由于其高效、选择性和不可逆的结合模式，它仍是一种合适的目标化合物，可以解决体内潜在的靶外周毒性，这在KO动物中观察到。为了评估外周AEP抑制剂的体内安全性，给CD1小鼠口服化合物11，每天2次，剂量水平分别为40和60mg/kg/天，持续8周。在这项研究中，没有观察到生活中的发现和复合相关死亡率。在两种剂量的组织病理学分析中均无不良发现。NOAEL考虑为20mg/kg/BID。脱靶特征是睾丸中生殖细胞的中度耗损和变性，少量至中度的腔细胞碎片，以及少量至显著的附睾精子细胞减少。不能排除与11治疗有关。毒性动力学分析显示，第56天最大（Cp,max,free）和平均（Cp,avg,free）游离血浆暴露分别至少为464/436nM（男性，m/女性，f）和123/204nM（m/f）。因此，在HEK细胞中，游离暴露与细胞效力的比值至少为2.7/2.6（m/f）（Cp,max,free）和0.7/0.7 （Cp,avg,free）。在第1天测定799/838nM的Cp、max、free水平（4.6/5.0倍）和224/204nM的Cp、avg、free水平（1.3/1.2倍）。考虑到不可逆的结合方式，外周AEP抑制剂在安全性研究中通过。由于脑脊液-血浆Kp,uu较低，AEP在脑内仅部分受到抑制。接下来，Roche公司将注意力转向了炔10，以提高脑外显率和代谢稳定性。炔以前被描述为不可逆的弹头，并与半胱氨酸形成硫烯醇醚，与结合口袋近距离结合。37-39它们比氟乙酰胺亲脂性更强，因此被认为更适合于实现脑渗透。此外，化合物6o的代谢物鉴定研究表明脯氨酸部分是代谢热点。因此，接下来探索了化合物10中的多种脯氨酸替代品，并研究了它们对效力和代谢稳定性的影响（表5）。表5.脯氨酸核心片段的优化a至少2次测定的几何平均值±SEM。bpH值为7.4时测得的log D。cPAMPA有效渗透率（10-6cm/s）。d小鼠肝微粒体CLint（μL/min/mg）。首先，(4R)-甲基取代脯氨酸（16）优于其(4S)配置的非对映体（17），无论是细胞效力还是微粒体稳定性，这一趋势也适用于氟取代类似物(18)。环合的环丙基环提高了细胞效力，但微粒体稳定性较差（化合物19、20和21）。苯基环接吡咯烷对这两个参数都有良好的影响（化合物22）。总体而言，也考虑到进一步的表征，例如对肝细胞的稳定性和P-gp转运体外排比和通透性，化合物18显示出最平衡的特征（表5和8）。接下来，通过炔取代基的变化来研究炔的电位活化的影响（表6）。可以看出取代基不仅是耐受的，而且确实导致了显著的效价增加。表6.杂芳基取代对炔的活化作用a至少2次测定的几何平均值±SEM。b小鼠肝微粒体CLint（μL/min/mg）。cd6（μg）DMSO相对于经颅磁刺激。d与补充NADPH和还原性GSH的人肝微粒体复合孵育后，发现谷胱甘肽（GSH）加合物（Flag）或未发现（No Flag），采用MS/MS分析测定。e可逆结合模式。如图5所示，似乎有两个主要因素影响不同炔取代的pIC50值。首先，与炔基亲电中心的13C位移有相关性，这是衡量弹头亲电性的一个指标。其次，与具有相似反应活性但没有这种结构特征的类似物相比，在邻位上具有氮孤对的杂芳基取代始终显示更高的pIC50值。例如，化合物34（R=Ph）和29（R=o-pyr）在Cel处具有相似的化学位移，但效价相差10倍（表6）。图5.在d6-DMSO中，相对于TMS，酶对碳原子细胞13C位移的效力散点图，单位为ppm。带有邻氮原子的杂芳基片段（蓝色）比没有这个特征的片段（红色）具有更高的效价。谷胱甘肽加合物形成用圆圈表示，而不是加合物形成（菱形）。配体复合物X射线晶体结构研究为了进一步阐明这一有趣的发现，他们测定了化合物36与AEP配体复合物的X射线晶体结构。尽管在底物结合位点附近存在晶体接触，但这些接触在不对称单元中的四个AEP分子之间是不同的，并且存在一致的抑制剂结合模式。此外，围绕炔段的AEP相互作用非常相似。如图6所示，其中显示了内部炔碳原子与Cys-189的共价键，导致sp→sp2杂化变化。噁唑环与相邻的乙烯π系接近共面（扭转角~16°），其氮原子与一个水分子形成弱氢键（d=3.5Å），该氢键通过与Glu-190和Ser-215侧链的相互作用保持在原位。推测该炔抑制剂与相邻杂环中的邻氮的亲和力增加是由于额外的氢键相互作用，并进一步稳定了蛋白质结合的水分子。此外，这种杂环与相邻双键共轭作用的增强可能进一步贡献结合能。图6. AEP与化合物36共晶（PDB ID：7fqk）。氢键用红线表示，与Cys189的共价键用蓝线表示。水晶触点已从图中省略。不幸的是，大多数这些化合物在微粒体稳定性试验中的表现很差，可能是由于三键亲电中心的高反应性（表6）。这种反应性可以通过谷胱甘肽（GSH）加合物形成试验中的广泛标记来证实。无法推导出13C位移、芳香片段R中邻位氮的存在与GSH加合物形成之间的相关性（图5）。随后基于炔基弹头，进一步优化了与S3和S4口袋的相互作用（表7），发现五元杂环在S4中是耐受的，并且邻位的硫原子或氯取代基可以提高配体效率LE41（化合物38和40）。此外，虽然对位上的环烷基甲氧基取代基对效价有有利影响（化合物42和43），但与简单的三氟甲氧基（化合物10，LE 0.36）相比，配体效率没有提高，而且代谢稳定性降低。表7. P3和P4残基的进一步优化a至少2次测定的几何平均值±SEM。bpH值为7.4时测得的log D。c配体功效，见（41）。一般可以通过将炔作为亲电共价反应基团来获得两位数纳摩尔范围内的细胞电位。不可逆的结合模式有助于在细胞环境中胜过内源性底物并增加了炔的渗透性。通过抑制动力学起始实验（图7）和共晶结构研究了丁腈和炔作为战斗部的结合模式。两个示例性化合物，腈6q和炔43与Cys189形成共价键。随着腈6q浓度的增加，酶的进程曲线呈线性，这表明了一种快速、可逆的结合模式（图7B）。相比之下，炔43存在时的进展曲线显示出平台曲率（图7C），表明不可逆的结合模式。抑制开始的速率常数kobs与炔43浓度呈线性关系（图7D），这与不可逆失活的一步机制一致。利用斜率确定的Kinact/KI为10,361/s/M，是衡量化合物43失活效率的总体指标。优化后的化合物具有良好的生物化学和细胞效力，具有良好的体外DMPK谱。这些化合物的选择在体外和小鼠体内进行了更详细的表征（表8）。据知，这是第一类既可口服又可脑渗透的AEP不可逆抑制剂。其中，化合物18的生物利用度为83%，脑外显率约为30%。这些化合物在体外能够抑制Tau N368片段的形成，如表8所示。那么该片段的形成在体内是否也同样受到抑制？事实上，在表达含有P301L突变Tau蛋白2N4R亚型的Tau转基因小鼠中，经过5天的处理，化合物18表现出显著抑制脑内AEP活性（图8A），并在所有测试的外周器官中完全抑制。同时，观察到Tau N368片段的形成减少（图8B），证实了体外测量的结果。对总Tau蛋白的影响不显著（图8C）。原因是Tau与Tau N368片段的大量过剩。另一个偏差可能是由于只有一个裂解位点被监测，并且只有未磷酸化的物种被基于质谱的分析检测到。表8.候选化合物的体外和体内表征a至少2次测定的几何平均值±SEM。b从抑制试验开始测定。c测定SH细胞中Tau N368片段还原的有效浓度。dP-gp抑制剂存在时P-gp过表达的小鼠转染的LLC-PK1细胞的外排比和表观通透性。e血浆蛋白结合，未结合部分。FGSH加合物与补充NADPH和还原性GSH的人肝微粒体复合孵育后发现（Flag）或未发现（No Flag），采用MS/MS分析测定。gClean表示在10μM的所有测试中，与酶分析中的AEP相比，在所有测试中<50%的结合或>1000倍的选择性。hIC50（Casp 3）>100μM, IC50（Cat S）>100μM。IC57BL/6小鼠单次iv给药1mg/kg和20mg/kg po给药后的PK参数。图8. AEP抑制剂18、20mg/kg BID给药5 d后对TauP301L转基因小鼠AEP的抑制作用。（A）最后一次处理后4小时脑组织样本相对于载药对照组的AEP活性。（B）Tau N368片段浓度。（C）未裂解Tau水平，均与总蛋白和载体平均水平归一化Tau N368片段数量减少导致Tau聚集减少并最终改善认知的基本假设仍有待长期实验证明。这次实验的结果将在之后报告。结论研究首次鉴定出具有细胞活性、可口服、脑渗透性不可逆结合的AEP抑制剂，并在体内证实了靶向性。酶学和X射线共晶分析证实了未开发炔类的不可逆作用模式。在此过程中，已经开发了一种细胞渗透荧光，AEP选择性底物，并降低了潜在靶诱导肾毒性的风险。不可逆抑制剂被证明具有持续的细胞效应，并且在未来的研究中可作为选择性的，体内适用的候选化合物。最后，AEP的正位抑制与大脑中Tau N368片段的减少之间的联系得到了证实。文章来源J. Med. Chem. 2023, 66, 17026−17043请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程1.药渡CyberSAR结合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性的结构，通过CyberSAR以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就阿尔兹海默症靶点Tau举例如下：首页输入Tau，即得。2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于Tau相关实验测试活性的分子以“母核结构聚类”的形式展示。其中“绿色字体高亮的”为文献报道的体外酶、细胞活性测试实验中IC50<100nM的活性分子结构、具体实验、实验结果及实验来源。3.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“原始结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献具有关于Tau相关实验测试活性的分子以“研发阶段时光轴“的形式展示。其中绿色高亮展示了潜力Hit。登录方式CyberSAR在电脑浏览器端登录网址：https://data.pharmacodia.com/cybersar/，欢迎猛烈试用。请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程如需进一步沟通，请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。