抗癌新靶标之ADAM9—ADC、单抗、小分子抑制剂研究

2022-06-28

免疫疗法小分子药物抗体药物偶联物抗体合作

靶点概览ADAM9（A distegrinin and a metalloprotease 9）是一种膜锚定蛋白，主要通过用于粘附的分解蛋白结构域和用于脱落多种细胞表面蛋白的金属蛋白结构域参与多种生理功能。近年越来越多的证据表明ADAM9在肿瘤中发挥着重要作用。在多种癌症中发现了ADAM9的过量表达，并与肿瘤侵袭性和不良预后相关。此外，通过蛋白水解或非蛋白水解途径，ADAM9促进了肿瘤的进展、治疗的抗性和癌症的转移。本文描述了目前对ADAM9在生物学功能、病理生理学疾病和各种癌症中的理解，也介绍了利用ADAM9相关途径的治疗策略。下图A-C展示了ADAM9的结构域、ADAM9的激活过程以及ADAM9的两种异构体（A-C）。A. 锚定在膜上时的C型结构。B. ADAM9在通过高尔基体运输到细胞膜的过程中，通过去除抑制性的原结构而被激活。原结构的裂解是由furin或proprotein convertase在两个PC位点进行的。C. ADAM9的长（ADAM9-L，110和84 KDa）和短（ADAM9-S，55 KDa）形式的结构示意图。D. 活跃的ADAM9通过富含半胱氨酸结构域的HVR识别其底物，并释放膜结合的细胞因子和生长因子的胞外片段。它还能裂解受体和其他分子进行信号转导。吉满生物根据市场需求和研究现状，推出构建ADAM9过表达稳定细胞系的服务（详细数据见文末），可用于抗体筛选、表征、一致性评价, 充分满足药物研发的需求，助力抗体药物临床申报。相关疾病ADAM9在人体内广泛表达，并调节多种生物功能，在各类疾病中也发挥着重要作用，包括神经退行性疾病、视网膜疾病、炎症和肿瘤。虚线T形箭头，抑制ADAM9蛋白酶功能，减少ADAM10的脱落；T形箭头，抑制伤口愈合。脑部：ADAM9作为α分泌酶，可降低阿尔茨海默病的风险，但它可降低膜锚定的ADAM10的比例，导致ADAM10的α分泌酶活性降低。因此，ADAM9对大脑有不确定的影响。ADAM9能增强EMCV的进入；心脏：ADAM9在胚胎心脏发育中具有活性；血管：ADAM9能增强病理性的新生血管和动脉瘤的形成；上皮细胞：ADAM9延迟慢性伤口愈合；眼部：ADAM9增加视网膜病变，ADAM9的丢失与CRD有关；肺部：ADAM9在急性肺损伤中上调，促进COPD的发展；ADAM9还参与各种肿瘤过程的调节。除了转移，ADAM9在肿瘤增殖、血管生成、甚至免疫逃逸中都发挥重要作用。肺癌已有多项研究表明，ADAM9的过度表达会缩短总生存期（参考3,4,5）。另有研究显示ADAM9在肺癌转移的几个步骤中起主要作用。Shintani等人首先描述了ADAM9的过度表达促进了肿瘤细胞对血管内皮细胞的粘附，这表明ADAM9在转移过程中的重要性。此外，ADAM9通过一种新的机制增强了细胞的迁移和抗逆性以促进转移。沉默ADAM9可以下调含CUB结构域的蛋白1（CDCP1）和组织型血浆蛋白原激活剂（tPA）的RNA表达，但可以上调血浆蛋白原激活剂抑制剂-1（PAI-1）的表达。此外，ADAM9增强了tPA裂解CDCP1的活性，导致CDCP1的激活，促进了细胞迁移和抵抗失巢凋亡过程。因此，ADAM9通过基于tPA的途径促进肺癌转移到大脑的CDCP1的激活。（参考2）ADAM9激活CDCP1表达并增强细胞迁移：来源于参考6A. 当ADAM9被敲除时，CDCP1蛋白水平包括全长和裂解形式都下降了；B. 免疫荧光分析显示，在膜上观察到较少的CDCP1；C. 此外，在肺癌Bm7细胞中沉默ADAM9或CDCP1会减少其迁移；D. 接下来，人流感血凝素（HA）标记的CDCP1（HA-CDCP1）在肺癌F4细胞中被过度表达；E. 表达CDCP1的F4细胞（HA-CDCP1）的累积迁移距离明显比表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的对照组F4细胞远。这些结果表明，ADAM9可以通过上调CDCP1来增强肺癌迁移。此外，为了实现脑转移，血脑屏障的破坏是肿瘤细胞进入的必要条件。ADAM9也通过上调血管生成素2和TPA参与这一过程。沉默ADAM9可以增强VE-cadherin的膜表达，该蛋白负责维持内皮细胞之间的限制性屏障，并在体外降低内皮细胞的细胞通透性。这些发现说明了ADAM9在肺癌转移中的多重作用。在包括肺癌在内的众多癌症类型中，血管生成在肿瘤进展中的重要作用已得到明确，各种血管生成蛋白进行的化学刺激是关键和必要的。同时，来自ADAM9沉默的细胞的条件培养基抑制了人脐带静脉内皮细胞的管子形成；此外，沉默ADAM9抑制了体内的血管生成。通过血管生成抗体阵列和进一步的ELISA，以前的研究发现ADAM9介导了血管生成因子，白细胞介素8（IL-8）的表达。而IL-8已知会与它的高亲和力受体CXCR-2结合，然后激活。此外，CXCR-2的中和抗体可以逆转ADAM9介导的HUVAC管形成。这些证据表明了ADAM9通过IL-8-CXCR2轴介导的血管生成的可能机制（参考5）。在另一项研究中，血管内皮生长因子在ADAM9沉默的细胞调理液中被下调。这些结果表明，ADAM9通过增加肺癌中各种血管生成蛋白的活性参与肿瘤血管生成。微核糖核酸（miRNAs），如miR-425、miR-488和miR-590，已被报道为肺癌中ADAM9的调节因子。通过预测工具和荧光素酶报告实验，ADAM9的3′-UTR被确定为3种微RNA的靶点，可以下调ADAM9 mRNA的表达。前列腺癌Fritzsche等人的研究表明，ADAM9的mRNA和蛋白过表达与前列腺癌的无复发生存率低有关。通过免疫组化，60%以上的复发性前列腺肿瘤 ADAM9的蛋白表达升高。Lin等人发现了在AIPC中维持ADAM9蛋白稳定性的机制。N-α-乙酰化酶10蛋白（Naa10p）已被确定为前列腺癌的一种肿瘤蛋白，沉默Naa10p可以下调ADAM9的蛋白表达，抑制肿瘤在体外和体内的生长和转移。沉默Naa10p还能加速ADAM9蛋白的降解，Naa10p和ADAM9之间的直接相互作用已被共同免疫沉淀证实。综上所述，ADAM9的蛋白稳定性是由Naa10p高度维持的，以驱动AIPC肿瘤的生长和转移。而这种Naa10p介导的ADAM9的稳定可能也存在于其他癌症类型中，以驱动肿瘤的发生。miRNAs在调节前列腺癌中的ADAM9方面也发挥了作用，特别是miR-126。Hua等人通过荧光素酶报告实验确定了miR-126的结合位点和对减少ADAM9表达的作用。而通过miRNA沉默ADAM9在体外对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用与miR-126过表达相似。肝癌 ADAM9的过度表达导致患者预后不佳和对免疫检查点阻断疗法的反应降低。Kohga等人发现MHC I类多肽相关序列A（MICA）是癌细胞的配体，可引起自然杀伤细胞的攻击，是ADAM9的一个新靶点。膜结合的MICA（mMICA）可以被ADAM9裂解，释放出可溶性的MICA（sMICA），由ADAM9作为免疫诱饵来抑制免疫监视。敲除ADAM9可以上调细胞膜上mMICA的表达，下调体外培养上清液中的sMICA。转移也是肝癌治疗中的一个紧迫问题。IL-6是肝癌侵袭和转移的主要介质，IL-6在体外通过激活JNK途径增强ADAM9的表达。沉默ADAM9不仅可以减少原发肿瘤的大小，还可以抑制向肺部的转移率；相反，过度表达ADAM9会加速原发肿瘤的生长，促进向肺部的转移（参考8）。乳腺癌在乳腺癌中，与正常组织相比，ADAM9的表达是上调的。Micocci等人认为ADAM9在跨内皮迁移途径中起着上游作用，在体外敲除ADAM9可下调ADAM15和MMP2的mRNA表达，但不包括ADAM10、ADAM17或MMP9。三阴性乳腺癌（TNBC）是最具侵略性的乳腺癌类型。在TNBC的一些亚型中，甲基化失调导致EGFR的过度表达，以增强细胞的增殖和生存。根据染色质沉淀检测，ADAM9分享EGFR的甲基转移酶，核受体结合的SET域蛋白2是组蛋白甲基转移酶家族的成员，它可以上调ADAM9和EGFR的表达，促进TNBC细胞对EGFR抑制剂的耐药性。胰腺癌 ADAM9的mRNA表达升高会缩短胰腺癌患者的总生存期，这一发现被免疫组化法证实。ADAM9表达的增加也与肿瘤分级和病情进展有关。KRAS信号传导对于维持胰腺癌的肿瘤发生是必要的。Yuan等人发现，失调的KRAS信号通过NF-kB级联增强ADAM9的表达。值得注意的是，敲除ADAM9也会抑制KRAS和MEK-ERK信号的下游途径。综上所述，ADAM9和KRAS之间隐含着一个反馈回路。此外，有研究表明，环状ADAM9（circ-ADAM9）在胰腺癌细胞中上调，与预后不良相关。circ-ADAM9吸收并抑制miR-127，而miR-127是一种肿瘤抑制因子。过度表达circ-ADAM9会增加ERK信号，促进体外的细胞增殖和迁移，沉默circ-ADAM9会延缓体内胰腺肿瘤的生长（参考9）。ADAM9靶向疗法靶向ADAM9的ADC2021年的AACR会议上，ImmunoGen公司介绍了IMGC936的研究进展，IMGC936是由ImmunoGen与Macrogenics合作开发的首款靶向ADAM9的ADC，目前处于临床一期研究阶段。IMGC936是由高亲和力的人源化单克隆抗体、美登木素生物碱微管抑制剂载荷和稳定的三肽接头以DAR为2组成的一款创新药物。IMGC936正在进行一期剂量递增研究，以评估实体瘤患者的安全性和药代动力学(NCT04622774)。此次汇报探讨了ADAM9在实体肿瘤中的表达情况，并在源自NSCLC、TNBC、胰腺癌和胃癌的临床相关患者来源的PDX（异种移植）模型中分析了IMGC936活性。结果显示，IMGC936对具有临床相关ADAM9表达的肿瘤具有活性。IMGC936单次剂量8.6 mg/kg，对69%（24/35）的PDX模型有活性或高活性，且该剂量的耐受性良好。这些数据支持了目前对IMGC936的临床评价。抗体除了上文提到的MicroRNA，还有两种蛋白质被设计用来影响ADAM9的蛋白酶活性。一个是小鼠ADAM9的原域（proA9；氨基酸24-204），它可以阻断蛋白酶区域作为人ADAM9的竞争性抑制剂。另一种是ADAM9抗体，它可以识别蛋白酶结构域，并可以抑制胃癌的发展。敲除ADAM9或特异性靶向单克隆抗体（RAV-18）可抑制高ADAM9表达细胞的癌细胞增殖和侵袭，而在低ADAM9表达细胞中则不能。RAV-18处理后ADAM9蛋白酶活性、侵袭和增殖的变化(参考7)A. 当ADAM9蛋白酶活性高的细胞用RAV-18处理后，蛋白酶活性出现剂量依赖性下降（从SNU-638到MKN-28）。然而，ADAM9蛋白酶活性低的细胞系的蛋白酶活性没有变化（从YCC-6到Hs746T）。B. 用RAV-18处理具有高ADAM9活性的细胞系显示出剂量依赖性的增殖抑制。然而，低ADAM9活性的细胞系的增殖没有被抑制。C. RAV-18还剂量依赖性地降低了ADAM9活性高的细胞系的侵袭性，但不影响低活性细胞的侵袭性（*；P < 0.05）。D. 当用RAV-18处理细胞系时，pEGFR和pERK的表达在表达高ADAM9的细胞系中呈剂量依赖性下降；低表达的细胞系没有表现出变化。RAV-18在胃癌异种移植模型中显示出体内抗肿瘤活性。低氧诱导ADAM9在低ADAM9表达的胃癌细胞中的表达和功能活性，这种表达被RAV-18抗体抑制到常氧细胞的水平。A, ADAM9蛋白酶的活性在缺氧条件下增加。当用RAV-18处理时，ADAM9蛋白酶活性呈剂量依赖性下降。B，在缺氧条件下侵袭性也增加，在RAV-18处理后，侵袭性下降（*，P < 0.05）。C，暴露于缺氧后，所有低ADAM9细胞系的EGFR和ERK表达都增加。此外，当细胞接受RAV-18治疗时，磷酸EGFR和磷酸ERK的表达呈剂量依赖性下降。总的来说，ADAM9在胃癌增殖和侵袭中起着重要作用，虽然在一些胃癌细胞中高水平表达，对催化位点定向抗体的功能抑制和抗肿瘤活性有反应，但其他胃癌细胞的表达水平较低，只有在暴露于缺氧时，ADAM9水平才会增加，细胞对ADAM9抗体的抑制有反应。因此，ADAM9可能是晚期胃癌的一个有效治疗靶点。MMP抑制剂CGS27023（小分子，诺华）和batimastat（BB-94，羟胺衍生物，Sigma-Aldrich）是广谱的MMP抑制剂，也可以强烈抑制ADAM9蛋白酶的活性。MMPs在临床试验中并不那么理想。Sorafenib and RegorafenibSorafenib是一种多受体酪氨酸激酶抑制剂，临床上用于治疗HCC，它可以抑制ADAM9 RNA和蛋白的表达，并导致mMICA的上调，从而增强自然杀伤细胞对HCC的活性。Regorafenib是另一种多激酶抑制剂，对索拉非尼耐药的HCC患者有效，并显著降低ADAM9和ADAM10的RNA和蛋白水平，以促进mMICA在HCC细胞膜上的积累。总结迄今为止的研究已经足够支持将ADAM9作为炎症性疾病的潜在生物标志物和癌症的预后标志物。目前使用的治疗药物（如Sorafenib、Regorafenib）通过降低ADAM9水平来加强癌症治疗，这为ADAM9靶向疗法提供了新思路。另外，在ADAM9基因敲除的小鼠中，除了后来的视网膜障碍，没有发现重大发育缺陷。这表明它可能是成年患者中相对安全的靶标。然而在治疗与ADAM9相关的疾病时，应该考虑针对ADAM9药物治疗的特异性，因为调节MMPs的保护活动一般来说会引起副作用，当然，目前还有很多研究需要做。用心做好细胞，为更好的靶向药吉满生物科技（上海）有限公司，是一家专业从事生物科技前沿技术研发的高新技术企业。十年专注病毒包装，稳定株构建，拥有上千株细胞系构建经验，可提供过表达、报告基因、基因敲除等多种稳定株构建服务。GM-C19705 H_ADAM9 HEK-293 Cell Line GM-C19655 H_ADAM9 CHO-K1 Cell Line GM-C20021 Cynomolgus_ADAM9 CHO-K1 Cell Line 同时，吉满生物助力药物研发，紧随前沿靶点资讯，储备几百株现货细胞，覆盖GPCR、细胞因子、免疫检查点、TAA等多领域近200余个靶点。2020年底成立专业细胞系子品牌DDXCELL，同时已建立了DDXCELL现货查询小程序。截止当前已布局近200个热门靶向药靶点500余株细胞系，旨在助力、加速大分子早期研发，做到进口细胞的国产替代。同时可根据客户需求提供细胞系服务。细胞系现货查询请扫码👇参考文献：1. doi: 10.3390/ijms21207790；2. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-13-2995；3. Liu R., Wang F., Guo Y., Yang J., Chen S., Gao X., Wang X. MicroRNA-425 promotes the development of lung adenocarcinoma via targeting A disintegrin and metalloproteinases 9 (ADAM9) Onco Targets Ther. 2018;11:4065–4073. doi: 10.2147/OTT.S160871；4. Chang J.H., Lai S.L., Chen W.S., Hung W.Y., Chow J.M., Hsiao M., Lee W.J., Chien M.H.Quercetinn suppresses the metastatic ability of lung cancer through inhibiting Snail-dependent Akt activation and Snail-independent ADAM9 expression pathways. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res. 2017;1864:1746–1758. doi: 10.1016/j.bbamcr.2017.06.017；5. Kossmann C.M., Annereau M., Thomas-Schoemann A., Nicco-Overney C., Chéreau C., Batteux F., Alexandre J., Lemare F. ADAM9 expression promotes an aggressive lung adenocarcinoma phenotype. Tumour Biol. 2017;39:1010428317716077. doi: 10.1177/1010428317716077；6. Chiu, KL., Kuo, TT., Kuok, QY. et al. ADAM9 enhances CDCP1 protein expression by suppressing miR-218 for lung tumor metastasis. Sci Rep 5, 16426 (2015). https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/srep16426；7. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-13-1001；8.Dong Y., Wu Z., He M., Chen Y., Chen Y., Shen X., Zhao X., Zhang L., Yuan B., Zeng Z. ADAM9 mediates theinterleukin-66-induced Epithelial-Mesenchymal transition and metastasis through ROS production in hepatoma cells. Cancer Lett. 2018;421:1–14. doi: 10.1016/j.canlet.2018.02.010；9. https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1080/21691401.2019.1671856.