Interleukin-6(Pfizer Global Manufacturing China)

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的全球传染病，是导致人类死亡的十大主要原因之一。卡介苗(BCG)是目前唯一临床应用的结核病疫苗，但其对成人结核病的保护作用不明确。在结核病新型疫苗中，蛋白亚单位疫苗因其成分明确、安全性高的特点，且具有强化BCG效应的优势，近年来备受关注。然而，亚单位结核病疫苗中的蛋白抗原所诱导的免疫应答较弱，通常需要佐剂辅助以增强其免疫效果。本综述旨在关注结核病疫苗新制剂中使用的各类佐剂(包括已进入临床试验阶段和尚处于临床前开发阶段的佐剂)，对各类佐剂的优缺点及可应用性进行客观评价，并指出目前佐剂研究中存在的问题及未来的研究方向。 NEXT 结核病(tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)感染引起的慢性传染病，目前仍是人类健康的巨大威胁。据WHO的最新统计，2022年全球约有1 060万结核病病例以及130万死亡病例[1]。 卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)是唯一在临床应用的结核病疫苗，其对儿童重症结核病的预防效果较好，但是对成人肺结核的预防效果不佳[2]。因此，结核病新型疫苗的研究尤为重要。 目前，已经有多种新型结核病疫苗处于临床或临床前研究阶段，包括重组BCG、减毒活疫苗、病毒载体疫苗、重组蛋白亚单位疫苗和DNA疫苗等[3]。其中，蛋白亚单位疫苗成分明确、安全性好，且具有强化BCG的免疫保护效应，被认为是非常有应用前景的疫苗类型[4] ，特别是在人群广泛接受BCG接种的国家和地区。 佐剂(adjuvant)又称免疫调节剂或免疫增强剂(immunepotentiator)，是蛋白亚单位疫苗不可或缺的组分之一，具有增强机体对蛋白抗原的免疫原性并提高其保护效果、减少疫苗抗原剂量的作用[5,6]，其研究现状备受关注。本文对结核病蛋白亚单位疫苗佐剂的研究现状进行综述，以期为新型结核病疫苗的研究提供参考。 一、进入临床试验阶段的佐剂 在结核亚单位疫苗佐剂的研究中，AS01E、IC31、GLA-SE、CpG-ODN和BC02已经进入临床试验阶段[7]。基于它们构建的结核病疫苗分别有M72/AS01E、H1/IC31、H4/IC31、H56/IC31、ID93/GLA-SE、GamTBVac和AEC/BC02(表1)。 表1 进入临床阶段结核亚单位疫苗的佐剂 AS01E佐剂系统 是一种油包水型乳剂，含有QS-21(quillaja saponaria)和单磷酸脂质A(monophosphoryl lipid A，MPLA)两种关键组分[8]。 QS-21：是从皂荚树皮中分离纯化得到的一种水溶性三萜糖苷，它包括两种异构体分子QA-21Apiose和QS-21木糖，能够刺激CD4＋T细胞产生多种免疫调节因子，并促进高水平的IgG2a和IgG3生成[9]。 MPLA：是明尼苏达沙门菌(Salmonella minnesota)脂多糖的一种灭毒衍生物，作为Toll样受体4(TLR4)受体激动剂，可以直接激活表达TLR4的抗原提呈细胞(APCs)，从而增强抗原提呈功能并提高免疫应答的效果[10,11,12] 。 已有研究发现，AS01E能提高单核细胞和树突状细胞的募集能力[13]，并促进抗原特异性抗体和T细胞的生成，辅助疫苗产生持久且广泛的免疫应答[8]。在人群中，M72/AS01E疫苗可刺激产生高水平的细胞因子和自然杀伤细胞[14]。 Ⅱb阶段的临床试验结果显示，接种M72/AS01E疫苗的HIV阴性成人，在接种后3年内肺结核发病率降低50%，提示AS01E辅助构建的疫苗具有良好的抗结核保护效果[15]。虽然该临床试验显示基于AS01E佐剂的疫苗在人群中具有良好的保护效果，但其研究人群单一，因此仍需开展更多的临床试验(比如更广泛的人群和更长期的试验阶段)进行进一步验证。 目前，基于AS01佐剂的疟疾疫苗(Mosquirix)已经在欧洲药品管理局和世界卫生组织的批准下上市销售[16]，且含有AS01佐剂的疱疹疫苗也可显著刺激机体产生高水平的抗体，并增强细胞免疫应答[17]。这些研究结果提示，AS01E佐剂具有普适性，是一种非常有前景的佐剂。但是皂苷可以通过特异性地与胆固醇结合并在红细胞等细胞的脂质双层膜上打孔而发挥毒性。尽管在AS01E佐剂系统开发中，通过加入胆固醇(cholesterol)使佐剂形成脂质体，中和了QS-21和MPLA的毒性[18,19]，但该佐剂在人群(尤其是婴幼儿等特殊群体)应用的安全性仍需继续关注并进行系统性临床评价。 IC31佐剂 由天然的阳离子抗菌肽KLKL(5)KLK和人工合成的带有胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(unmethylated cytosine-phosphate-guanine, CpG)基序的寡脱氧核苷酸(oligodeoxyribonucleotide containing CpG-motifs, CpG-ODN1a)组成，通过启动TLR9/MyD88信号通路发挥免疫辅助作用[20]。 KLKL(5)KLK能够促进抗原与APCs的结合，从而辅助疫苗激发持久的适应性免疫应答[21]。 CpG-ODN1a是一种带有负电荷的DNA序列，通过与TLR9结合并招募多个下游信号分子来实现免疫激活作用[22,23]，从而诱导抗原特异性Th1或Th17型免疫应答[21] ，进而增强疫苗的免疫保护效果。 KLKL(5)KLK和CpG-ODN1a的联合应用，促进了CpG-ODN1a的摄取和递送，从而促进树突状细胞内化抗原并将其提呈给幼稚T细胞[24]。 据报道，IC31佐剂能够辅助疫苗诱导免疫细胞产生多种Th1型细胞因子，如IFN-α、IFN-γ、IL-2和TNF-α，诱导产生更多的细胞毒性T淋巴细胞[25]。基于IC31佐剂构建的H1(Ag85B-ESAT6)/IC31、H4(Ag85B-TB10.4)/IC31、H56(Ag85B-ESAT6-Rv2660c)/IC31疫苗均已进入不同的临床试验阶段[26,27,28]。近期备受关注的H56/IC31疫苗已完成Ⅱa期临床试验[29]，结果显示接种H56/IC31疫苗的Mtb感染和未感染的成年人均能够产生持久的CD4＋T细胞免疫应答[28]。 然而，CpG-ODN可能有潜在的副作用，比如诱导释放促炎因子、抗核酸酶的硫代磷酸酯骨架的非特异性免疫刺激活性等[30,31,32]。最近的研究表明，阳离子聚氨基酸聚-L-精氨酸(the cationic polyamino acid poly-L-arginine)与CpG-ODN结合可阻止CpG-ODN诱导的促炎因子的全身释放[33] 。因此，如何巧妙地将阳离子聚氨基酸聚-L-精氨酸添加到IC31佐剂系统中，是一个有意义且值得关注的科学问题。 CpG-ODN单一组分佐剂 基于CpG-ODN单一组分佐剂的疫苗也已经进入临床试验研究中，比如GamTBVac疫苗。该疫苗所包含的蛋白抗原有Ag85a单抗原和肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)右旋糖酐结合域(dextran-binding domain, DBD)修饰的ESAT6-CFP10融合抗原，佐剂是一种由DEAE-右旋糖酐(500 kDa)核心和覆盖CpG-ODN组成的混合物[34]。该疫苗已经完成了Ⅱa期临床试验，结果显示在接种卡介苗的健康成年人中，显示出较好的免疫保护作用[35]。但是，该疫苗中佐剂与抗原构建方式复杂，可能增加了生产和评估的难度，需要在未来的研究和临床实践中进一步评估其可行性和效果。 GLA-SE 由葡糖吡喃糖脂A(glycopyranosyl lipid A, GLA)和含角鲨烯的稳定乳剂(stable emulsion, SE)构成。GLA可以激活TLR4，可诱导免疫细胞释放趋化因子和促炎细胞因子、促进DC成熟，从而发挥辅助疫苗激活免疫应答作用[36]。 GLA被广泛用于多种疾病疫苗的研发，并在动物实验中显示出良好的免疫应答和安全性[37,38]。因此，GLA被认为是一种有着极高临床应用潜力的新型佐剂组分。 SE由角鲨烯和表面活性剂组成的乳剂，可以稳定疫苗中的抗原和佐剂组分，从而增强免疫细胞对抗原的响应，提高疫苗的稳定性和免疫保护效果[39]。此外，SE乳液佐剂具有很好的生物相容性和生物降解性，具有作为佐剂组分的良好安全性。 据报道，GLA-SE可辅助ID93(Rv1813-Rv2608-Rv3619-Rv3620)疫苗产生持久的Th1型免疫应答和抗体IgG的产生，并提高疫苗的保护效果[40,41]。基于GLA-SE的ID93疫苗已经在多人群(接受4个月结核病治疗的结核病患者和健康成人)完成Ⅱa期临床试验[42,43,44]，该疫苗能够诱导机体有效的免疫应答，但受试者出现了轻微的不良反应，如硬结和红斑等[43]。这些不良反应是否与佐剂有关还有待证实。此外，GLA-SE也被应用在H5N1流感疫苗和肿瘤疫苗等其他疾病疫苗的研制中[45]。 BC02 是一种基于BCG的未甲基化CpG DNA片段和铝盐两种组分的佐剂[46]。CpG可以激活免疫细胞，诱导强烈的Th1和Th2免疫应答，而铝盐则通过缓释抗原发挥佐剂作用，两者组合可以协同提升疫苗的免疫保护效果[47]。 基于该佐剂和Ag85B、ESAT6、CFP10复合抗原的AEC/BC02疫苗，是中国食品药品检定研究院自主研发的结核亚单位疫苗。 目前，该疫苗正在湖南省疾病预防控制中心开展Ⅱa期临床研究(CTR20220240)。前期的临床试验结果显示该疫苗在接种者体内能够诱导强烈的体液和细胞免疫应答，具有用于潜伏感染治疗的潜力[48]。另外，基于BC02佐剂的重组带状疱疹疫苗也正在申报临床研究[49] 。 二、处于临床前研究阶段的佐剂 除上述进入临床阶段的佐剂外，还有很多尚处于临床前研究阶段。按照其作用机制的不同分为免疫刺激类、免疫递送类和复合系统类佐剂。 1．免疫刺激类佐剂 (1)核苷酸类佐剂 环二核苷酸(cyclodinucleotides, CDN) 是一类常见的微生物信使分子，广泛存在于细菌和真菌中，主要参与细菌的次级信号传导[50]。CDN具有病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP)，可通过与胞质受体STING结合，刺激细胞释放多种细胞因子，如Ⅰ型干扰素、IL-6、IL-12和TNF-α等，同时还可以通过激活NF-κB和INK等典型炎症途径调节免疫应答[51]。在结核病亚单位疫苗的研究中，CDN作为佐剂能够诱发长寿命的免疫记忆性T细胞，并降低小鼠结核病的发病率[52]。 环二腺苷酸(cyclic diadenosine monophosphate, c-di-AMP) 是一种存在于微生物中的环状核苷酸分子，通过与宿主细胞表面的模式识别受体结合调节宿主免疫应答[53]。据报道，c-di-GMP佐剂不仅能促进Mtb抗原诱导的IgG抗体的生成，还能促进淋巴细胞的增殖并增加细胞因子的分泌，从而显著增强免疫应答[54]。 多聚肌胞苷酸(polyinosinic：polycytidylic acid, Poly I∶C) 是一种合成的双链RNA分子，它通过与TLR3受体特异性相互作用，可以激活机体的免疫应答，并诱导IL-12和Ⅰ型干扰素的释放。我们前期的研究发现，基于Poly I∶C的复合佐剂DDA-Poly I∶C-Cholesterol(DPC)，能显著增强LT70融合蛋白所诱导的Th1型免疫应答及抗结核菌的保护作用[55]。此外，基于Poly I∶C的纳米佐剂PLGA-PEG-Poly I∶C同样能增强Mtb蛋白抗原所诱导的Th1型免疫应答和体液免疫应答[56]。在临床实践中，Poly I∶C注射液通常被用作免疫调节剂，辅助治疗多种病毒感染[57,58]，提示其具有临床应用的安全性。除上述免疫增强效应外，核苷酸类佐剂还具有易溶于水、性质稳定、可量产等优势，因此具有较好的应用开发前景。 (2)菊糖类佐剂 菊糖是由D-果糖通过β-1，2糖苷键连接而形成的天然果糖聚合物。 Advax™ 是一种基于菊粉微粒的新型佐剂，可通过调节免疫细胞活性诱导多效应性T细胞反应，产生IFN-γ、TNF-α和IL-2等细胞因子[59]。在小鼠感染模型中，该佐剂可增强小鼠对流感病毒感染的防御能力[60]。Advax™在增强机体免疫应答的同时具有致炎作用小的优点，已进入临床评价研究阶段。据报道，菊糖佐剂联合Mtb抗原ESAT-CFP10(EC)，能够刺激脾脏淋巴细胞分泌更多的TNF-α[61]。 AdvaxCpG 是在Advax™的基础上添加了TLR9激动剂CpG的复合佐剂，研究发现其同样具有增强Mtb抗原Ag85B (Rv1886c)和CysD (Rv1285)免疫原性的作用[59]。鉴于其在人群应用中显示的良好安全性和耐受性，我们认为菊粉是进行疫苗佐剂开发的理想候选组分。 (3)细菌组分类佐剂 可以模拟细菌感染的特征，刺激免疫系统产生针对特定细菌的免疫应答，从而提高疫苗的保护效果。 从惰性枯草芽孢杆菌分离的芽孢 据报道，其具有促进树突状细胞成熟并提高固有免疫应答的能力[62]。将该组分与Mtb抗原MPT64和Acr-Ag85B结合后，该疫苗可刺激机体产生高水平的IgG1和IgG2a并且促进Th2/Th1谱系的分化平衡[63]。 海藻糖-6，6-二分枝杆菌酸酯(trehalose dimycolate, TDM)及其类似物海藻糖-6，6-二山嵛酸酯(trehalose-6，6-dibehenate，TDB) 是Mtb细胞壁的组成成分，可通过激活CARD9途径诱导Th1和Th17细胞应答发挥免疫效应[64]。TDB还具有激活C型凝集素受体2(C-type lectin receptor 2)，从而激活NLRP3炎症小体，诱导IL-1β产生的作用[65] 。 目前，基于TDM和TDB已构建多款结核亚单位疫苗用复合佐剂，比如CAF01等，在本文复合佐剂部分进行详述。我们团队前期也基于TDM和融合蛋白Mtb10.4-HspX构建了结核病亚单位疫苗MH，结果显示该疫苗具有很好的免疫原性和保护效果[66]。 TDM和TDB都是Mtb菌体表面的糖脂分子，具有肺部黏膜免疫的黏附优势[67]，因此在黏膜疫苗的研发中具有较好的前景。但是这些糖脂分子合成困难，从菌体分离纯化成本高且产量低，在临床应用规模化制备方面具有缺点。我们前期还评价了经热酚法提取的卡介苗多糖核酸对结核病亚单位疫苗的佐剂效应，结果显示其具有辅助疫苗减轻毒株攻击后免疫病理损伤的作用[68]。但是具体的机制和保护效应仍需进一步验证。 (4)金属类佐剂 铝盐 与抗原混合后注射到豚鼠体内，能够诱导比单独施用抗原更多的抗体产生，这一发现可以追溯到1926年，由亚历山大·格伦尼(Alexander Glenny)首次发现。随后，在1932年，铝佐剂首次被批准用于人用疫苗[69]。铝佐剂通过形成稳定沉淀来延长抗原作用时间，从而促进持续的免疫应答[70]。然而，由于其诱导Th1细胞免疫和CD8＋细胞毒性反应的能力不足，使其在结核病疫苗中的应用受到限制。 锰离子 北京大学的蒋争凡教授报道了另外一种具有佐剂效应的金属元素锰[71]。据报道，锰离子可以促进抗原摄取以及呈递，并可通过激活cGAS-STING和NLRP3途径改善免疫应答[72]，其佐剂效应已经在狂犬病、流感等疫苗中得到验证[73]。我们前期验证了锰离子对结核蛋白亚单位疫苗BrfB-GrpE(BG)的佐剂效应，结果显示其具有增强抗原诱导的长寿记忆T细胞产生和抗分枝杆菌感染的免疫保护作用[74]。锰佐剂不仅成本低、易获取，还有良好的生物相容性，可以作为理想的佐剂用于开发。 2．免疫递送类佐剂 (1)纳米颗粒(nanoparticles, NPs)佐剂 是指粒径小于100/1 000 nm的微小颗粒佐剂，通过将疫苗抗原封装在纳米颗粒内部或修饰到表面上，使抗原以完整的形式运送至淋巴细胞或者抗原提呈细胞。纳米佐剂具有缓慢释放的特点，可以促进抗原的提呈以及产生持久且高效的记忆性免疫应答[75]。 聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic acid, PLGA) 是一种在生物医学领域广泛应用的聚合物材料，由于其出色的安全性，已获得FDA批准用于疫苗和药物递送[76]。研究表明，基于PLGA佐剂的结核病疫苗，包封结核抗原Ag85B-ESAT6融合蛋白后，不仅能提高血清抗体水平，还能引发强烈的Th1细胞免疫应答[77]。此外，PLGA微粒不仅可以包封疫苗抗原，还可以包封模式识别受体的各种配体[78,79] ，以增强疫苗抗原提呈。 PLGA颗粒作为递送载体已在乙型肝炎、疟疾、利什曼病等疾病疫苗研究中得到广泛证实[80,81]。但PLGA微环境的酸性特性以及颗粒制备过程中的苛刻参数可能会影响蛋白抗原的完整性和免疫原性[82]。因此，在实际应用中需合理设计和优化制备过程，以充分发挥其作用。 壳聚糖 是一种来源于甲壳类生物外壳的高分子多糖聚合物，其具有出色的生物相容性和安全性[83]。研究显示，其带正电荷的特性可以针对性地影响树突状细胞，刺激NLRP3炎症小体，随后激活Th1、Th2和Th17反应[84,85]。在动物模型中，基于壳聚糖递送系统的结核病亚单位疫苗能够促进抗原提呈细胞摄取，并有效诱导体液和细胞免疫应答[86,87]。然而，壳聚糖在生理条件下具有低溶解度的局限性，需要在构建疫苗时合理设计。总之，纳米佐剂已在临床前试验和临床试验中取得显著进展，具有广泛的应用前景。 (2)脂质体佐剂 是一种具有磷脂层的球状结构，该佐剂不仅能够包裹抗原还能增强巨噬细胞对抗原的处理能力[88]。 阳离子脂质体二甲基双十八烷基铵(dimethyldioctadecylammonium, DDA) 具有净正电荷的特性，不仅能够将抗原引导入抗原提呈细胞，还可以将内吞的抗原直接递送至细胞质，以提高CD8＋T细胞对提呈抗原的反应[89,90,91]。 CAF01 是一种基于该佐剂和TDB组成的双组分脂质体佐剂，该佐剂在注射部位显示出持久的储存效应，并能够诱导产生强烈的体液和细胞免疫应答[92]。 基于CAF01制备的多款结核亚单位候选疫苗在临床前和临床试验中得到评价，比如：H1/CAF01疫苗能够诱导显著的免疫应答，并且这种反应可持续3年[93]。 同样，H56/CA01在接种疫苗的动物中可诱导产生高水平的IL-2、IL-17及Th1/Th17偏倚并显著降低细菌负荷[94]。这些发现表明，CAF01是一种高效的佐剂递送系统，可以与不同的抗原组合使用，并且可以引发强烈的免疫应答。但是，CAF01在临床试验中存在一些全身不良反应，包括头痛、疲劳、不适和发烧[92]，因此其安全性仍待进一步评价。此外，DDA脂质体的溶解性很差，制备需要经过高温水浴加热等复杂过程，且颗粒均一性欠佳，该过程限制了其规模化的制备和应用。 (3)免疫刺激复合物(immunostimulating complex, ISCOMS)佐剂 是一种由皂苷、胆固醇和磷脂相互作用形成的笼状结构。该佐剂通过将自然杀伤细胞、淋巴细胞等募集到淋巴结提高Th1和Th2型免疫应答[95]，已广泛应用于疫苗抗原递送[96]。将其与Mtb融合蛋白Ag85B-ESAT6组合制备的亚单位疫苗，能够显著增强蛋白抗原在小鼠体内的体液和细胞免疫应答，诱导产生高水平的IFN-γ并降低肺部细菌负荷量[97]。 ISCOMS佐剂 在提升疫苗效果方面显示出巨大潜力，且已获批应用于兽用疫苗，期待该佐剂进一步人用疫苗的临床试验和安全性评估。 3．复合系统类佐剂 随着时代不断进步和新型疫苗技术的迅猛发展，研究人员在佐剂研发方面开始追求更创新、更高效的策略。单一佐剂已经无法满足理想的免疫应答要求，因此复合系统类佐剂成为疫苗研究的前沿趋势。 复合系统类佐剂由两种或两种以上的佐剂组合而成，旨在通过协同作用最大程度地调节或增强免疫应答效果[98]。目前，已有多种对结核病亚单位疫苗的复合系统类佐剂正在开发中(表2)，这些新的研究结果为疫苗佐剂的研发带来新的希望。 表2 复合系统类佐剂 三、中药组分佐剂在结核病亚单位疫苗研究中的潜在应用 中药组分佐剂被认为是一类具有广泛潜力的疫苗佐剂，因为其含有多种生物活性成分、具有多方面的免疫活性。此外，相比传统佐剂，中药类佐剂的毒副作用较小，通常不易产生依赖性，被认为是理想的生物反应调节剂[99]。 中药组分佐剂在疫苗研究领域已得到广泛验证(表3)，主要是多糖类和皂苷类成分，比如： 黄芪多糖 在乙型肝炎亚单位疫苗的研究中，从黄芪根部提取的黄芪多糖显著增强疫苗的免疫原性[100] ； 枸杞多糖 作为一种增强免疫功能的中药成分[101] ，在甲型肝炎疫苗研究中展现出卓越的效果，并与传统铝佐剂具有协同作用[102] ； 合欢皂苷 在禽流感疫苗中，能够促进小鼠脾细胞产生Th1和Th2型细胞因子的基因表达水平，进而增强了疫苗的免疫应答能力[103]。 含有中药多糖类的Advax™和中药皂苷类的QS-21佐剂 在结核病疫苗研究中具有显著潜力，可有效提高免疫应答水平和保护效果[9,104]，进一步证实中药组分佐剂在结核病亚单位疫苗研究中应用的可行性。 中药组分在疫苗佐剂研究中具有较大的开发空间，其应用价值和效果值得进一步深入挖掘。 表3 中药组分佐剂 四、总结和展望 佐剂在亚单位疫苗的研制与应用中发挥着举足轻重的作用。但是，除了广泛应用的铝盐佐剂外，临床获批使用的佐剂数量非常有限。在我国，由于高效、安全佐剂的欠缺，严重限制亚单位疫苗、RNA疫苗等的开发应用，成为疫苗行业的"卡脖子"问题。最近几年，疫苗佐剂的开发研究在国际上进展迅速。本文深入探讨了佐剂的分类、作用机制及其在结核亚单位疫苗开发中的应用现状，旨在为结核亚单位疫苗的研发提供参考。 理想的佐剂不仅应该能够增强免疫应答，使机体获得最佳的保护性免疫，而且应该能实现工艺放大。此外，佐剂的安全性和经济性也是不可忽视的重要因素。 在新型疫苗佐剂的开发中，我们认为核苷酸类和菊糖类免疫刺激物具有很好的应用开发前景。与传统铝佐剂激活体液免疫应答相比，锰离子佐剂能够激活更全面的包括细胞免疫在内的免疫应答，值得在结核病疫苗中进行进一步的探索研究。为了激活更全面的免疫应答，复合佐剂是理想的疫苗形式，尤其是基于纳米颗粒的类型。近年来，随着分子动力学模拟、量子化学计算等高端技术的发展，使纳米颗粒的结构稳定性和相互作用机制的预测成为可能。 随着更多具有免疫刺激活性物质的发现，及其作用机制的阐明，都将为新型佐剂的开发提供理论基础。尤其是近年来，更多中药提取物免疫活性的发现和研究，使得疫苗佐剂的开发有更多组分的选择。新型佐剂的开发意义重大，但是其临床前开发和临床试验的成本高且周期很长，因此政府机构和企业应该加大对疫苗佐剂开发的持续投入和支持。 来源：中华微生物学和免疫学杂志 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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感谢关注转发，欢迎学术交流 回复药渡Cyber，领取文献原文 请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程 快看版 炎症性肠病（IBD）的特点是免疫反应异常，包括胃肠道（GI）中促炎细胞因子升高，例如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）。本研究介绍了2,4,5-三甲基吡啶-3-醇类似物的合成和抗炎活性评估，该类化合物对TNF-α和IL-6诱导的炎症具有双重抑制作用。基于3D形状的靶点识别、建模和对接，确定了化合物6-26是G蛋白偶联雌激素受体1（GPER）最有效类似物，该类似物在改善炎症和恢复结肠粘膜完整性方面表现出显著功效。SPR测定结果进一步验证了这一点，该结果显示与GPER直接结合，并且发现GPER敲低消除了化合物6-26对TNF-α和IL-6作用的抑制作用。值得注意的是，化合物6-26无细胞毒性，与G1和G15（分别是众所周知的GPER激动剂和拮抗剂）不同，G1和G15分别诱导独立于GPER的坏死性凋亡。这些发现表明GPER选择性化合物6-26有希望作为IBD的候选治疗药物。 药渡CyberSAR系统在本研究中发挥了关键作用，提供了对GPER1靶点分子的深入解析。系统通过聚类结构视图和原始结构视图，展示了与靶点相关的活性分子，并以研发阶段时光轴的形式呈现了潜力Hit。此外，CyberSAR还提供了适应症和试验设计的可视化分析，帮助研发人员快速获取靶向结构信息，开拓研究思路。尽管CyberSAR在分子的初步开发中未被使用，但其在解析和优化药物分子方面显示出巨大的应用潜力。 图1.化合物6-26发现和分子优化过程 正文版 炎症性肠病（IBD）是胃肠道的慢性复发性炎症。根据病理特征，它大致分为两种主要类型：克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。IBD的确切病因尚不清楚，认为是多因素造成的。然而，固有免疫和适应性免疫的缺陷性免疫功能是IBD发病的主要因素。尽管不同类型的T细胞参与CD（Th1/Th17相关）和UC（Th2相关），是IBD中引发白细胞浸润和随后肠道损伤的关键因素，异常高水平的促炎细胞因子，尤其是肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）。TNF-α和IL-6引起的肠上皮炎症反应具有与复发性炎症和上皮损伤相关的共同信号通路。该通路涉及NF-κB和STAT3的激活，诱导各种炎症相关基因表达，包括TNF-α和IL-6。用抗TNF-α抗体药物的靶向治疗策略已被证明对治疗IBD非常有效。这些成功的开发继续延伸到IL-6抑制剂，例如抗IL-6受体抗体（Sarilumab、Tocilizumab）和抗IL-6抗体（司妥昔单抗）。然而，一些IBD患者在最初或最初有反应后（初次和继发性无反应患者）对这些药物没有反应。此外，这些昂贵的抗体疗法可能导致不良反应，包括严重感染、免疫抑制和淋巴瘤。 越来越多的证据表明，雌激素受体有助于IBD的发病机制，与它们在其他慢性炎症性疾病（如关节炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎、系统性红斑狼疮和结肠炎）中的作用类似。流行病学研究表明，与非HRT使用者相比，绝经后激素替代疗法（HRT）可减少IBD患者发生慢性复发性炎症活性。雌激素受体α（ERα）和β（ERβ）在IBD中发挥重要作用。IBD结肠中高表达的ERβ减少，导致其抗炎作用丧失，这是通过自噬促进和P2X7R下调介导的。此外，雌激素的抗炎作用还通过G蛋白偶联雌激素受体1（GPER，也称为GPR30）（快速调节的膜结合受体）介导信号分子。GPER的抗炎作用已在研究中得到证实，其中小鼠中的GPER敲除导致血浆炎症细胞因子水平增加，对化学诱导的IBD小鼠用GPER激动剂G1可改善结肠炎。GPER已被广泛应用在许多细胞中表达，包括免疫细胞、大脑、心脏、肾脏和肠道。根据细胞类型，GPER通过不同的G蛋白发出信号，包括Gαs、Gαi、Gαq/11和Gβγ蛋白。除了cAMP和ERK的激活外，GPER信号还与其他信号分子相互作用，例如JAK/STAT3、YAP/TAZ、CREB、Elk1和NF-κB。NF-κB参与多种促炎细胞因子的基因表达，包括TNF-α和IL6，进而通过受体信号转导诱导磷酸化STAT3的核转位。对NF-κB和STAT3敲除或过度表达的细胞进行的研究也支持TNF-α或IL-6诱导NF-κB和STAT3的核转位。NF-κB 和STAT3彼此独立。总而言之，越来越多的证据表明，激活GPER可抑制TNF-α和IL-6信号传导，这对于难治性IBD患者来说是一种有效的治疗策略。 此前，采用基于表型的药物发现策略，在体外IBD模型中报道了6-烷基酰胺-2,4,5-三甲基吡啶-3-醇作为双重抑制剂，可对抗TNF-α和IL-6诱导的炎症活性。苯乙基类似物（6-29），连接到6-酰胺基的苄基和环己基侧链表现出高活性，可能是由于这些侧链提供了一定程度的平坦性。在本研究中，为了更好的双重抑制，扩大了侧链的范围以增加其平坦度并将其直接连接到酰胺基官能团上。在IBD药物发现的背景下，针对单个分子可能无法完全解决该疾病的多方面发病机制。为了克服这个问题，作者建立了基于细胞的筛选系统。该系统模拟由炎症细胞（如单核细胞和巨噬细胞）持续流入引起的结肠组织损伤，这些细胞被TNF-α或IL-6（IBD中主要的促炎细胞因子）激活。化合物对细胞因子诱导的单核U937巨噬细胞（TPA处理的U937细胞）-上皮细胞（HT-29）粘附的抑制活性通过测量附着细胞发出的荧光信号来确定。然后，使用CADD（例如基于3D形状的对齐、建模和对接）将GPER识别为有希望的分子靶标。通过SPR测定和一系列细胞功能分析，验证了该化合物与GPER的直接结合。 结构-活动构效关系研究 化合物（6-01~6-28）对TPA处理的单核U937细胞（U937巨噬细胞）与结肠上皮样HT-29细胞粘附的抑制活性在表1中以％抑制表示。黏附由TNF-α和IL-6诱导。一般来说，针对TNF-α诱导的粘附系统的活性与针对IL-6诱导的系统的活性高度相关。 在TNF-α诱导的测定中，在6-01的苯环（Ar=Ph）的邻位和对位引入甲基使活性增加2.5倍和3.5倍（分别为6-02和6-03），但在IL-6诱导的系统中则不然。而大的叔丁基取代基并没有增强活性（6-04）。苯环引入邻位F和间位F取代基使TNF-α诱导的粘附活性增加两倍和三倍（分别为6-05和6-06），而对位F取代该活性丧失。当氟和甲基取代基（6-08和6-09）活性增加。具有氟化物取代基的类似物（6-05~6-09）显示TNF-α诱导系统和IL-6诱导系统之间存在相当大的相关性。与邻-F相反，邻-Cl降低了活性，而邻位、对位双取代增加了活性（分别为6-10和6-11）。给电子甲氧基提供低活性，除非位于邻位（6-12 vs 6-13和 6-14）。在五元芳环中，含噻吩类似物的活性高度依赖于结构化学（6-17 vs 6-20），而呋喃则不依赖于结构化学（6-18 vs 6-21）。异恶唑表现出非常高的活性（6-22），而苯基取代基的引入降低了活性（6-23）。相反，呋喃环上的类似取代保持了非常高的活性（6-18vs 6-19）。联芳基的作用似乎相当复杂（6-19和6-23），这引发了对双环的探索。萘基团普遍表现出较高的活性（6-15和6-16）。未取代的3-氯苯并[b]噻吩的活性可忽略不计（6-24和6-25）。然而，6位的额外取代产生了广泛的活性。最强的吸电子氟在TNF-α和IL-6诱导的测定中产生最好的活性（6-26），分别达到90.3%和79.2%。IC50值揭示了有趣的结果。化合物6-26的IC50值分别为0.23μM（TNF-α诱导测定）和0.35μM（IL-6诱导测定），而对照药物托法替布的IC50值分别为0.70μM和0.48μM。与另一种对照药物美沙拉嗪进行比较，发现了更显著的差异。临床实践中，美沙拉嗪通常用于治疗以轻至中度疾病活动为特征的UC。每天服用4g剂量，美沙拉嗪对肠上皮细胞发挥局部作用，主要是局部作用而不是全身吸收。化合物6-26所产生的IC50比美沙拉嗪高出几乎六个数量级。从F>Cl>Me（6-26、6-27、6-28），吸电子性降低，活性降低。还比较了最好的类似物（6-26）。与化合物6-29，6-烷基酰胺类似物我们之前报道为针对TNF-α和IL-6的最佳双抑制剂。在TNFα和IL-6诱导的测定中，化合物6-26的抑制活性均优于化合物6-29。 表1中的化合物显示，对TNF-α诱导的粘附的抑制活性与对IL-6诱导的粘附的抑制活性之间存在正相关性（图2A）。包括所有化合物的简单线性回归表明，x的1单位增加（对TNF-α诱导的粘附的抑制百分比）平均与y值增加0.76（IL-6诱导粘附的抑制百分比）（P<0.0001）。在亚组分析中，活性较高的化合物（对TNF-α诱导的抑制活性大于40%）表明两个变量之间的相关性较强。x的A1单位增加平均与y值增加0.98相关（图2C，P<0.0001，R2=0.9618）。在另一组活性较低的化合物中（TNF-α诱导的粘附抑制活性≤40%），虽然x和y之间的关系具有统计学意义（β=1.48，P=0.01），但回归模型的解释力相当弱（R2=0.4670），表明两个变量之间的相关性较弱（图2B）。 化合物6-26的体内药效 6-26在IBD大鼠和小鼠模型中改善结肠炎。测量了最佳双抑制剂6-26在IBD动物模型中的体内疗效。在2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的大鼠结肠炎模型中，口服6-26（1mg/kg）显著逆转了TNBS诱导的体重下降以及结肠组织重量/长度的增加（3A）。6-26（1mg/kg）的恢复效果强于较高剂量的柳氮磺胺吡啶（300mg/kg），柳氮磺胺吡啶是一种抑制NF-κB的IBD药物，但药效非常弱。TNBS诱导的髓过氧化物酶（MPO）水平（图3B），中性粒细胞浸润的指标，和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）水平（图3C）在结肠组织中通过口服给药6-26得到显著抑制，优于300倍高剂量的柳氮磺胺吡啶（SSZ）。同样，TNBS诱导的结肠组织中炎性细胞因子、TNFα、IL-6、IL-1β和ICAM-1的表达显著减少了6-26。相反，TNBS诱导的E-钙粘蛋白（稳定上皮连接的分子）表达的减少又恢复了6-26（图3D）。 此外，还研究了化合物6-26非慢性和复发性IBD模型的剂量依赖性改善活性，对小鼠使用两个周期的葡聚糖硫酸钠（DSS）治疗6天，随后14天给水。每天口服化合物6-26，持续5周，每周6天，显著阻断DSS引起的体重下降（图4A）和结肠炎症、出血性损伤和长度缩短（图4B）。化合物6-26的体重（图4A、D）和结肠重量（图4C、D）的恢复是剂量依赖性的，并且比使用托法替布（30mg/kg）和SSZ（300mg/kg）一致。化合物6-26以剂量依赖性方式抑制DSS诱导的结肠MPO水平，其效果强于托法替布和SSZ（图4E）。 化合物6-26对DSS引起的结肠粘膜损伤的功能性愈合作用 通过评估肠渗透性的变化来进一步评估化合物6-26在IBD模型中的剂量依赖性粘膜愈合效果。肠粘膜渗透性是肠屏障功能的一个关键方面，对于保护身体免受病原体和毒素的侵袭以及促进营养吸收至关重要。DSS诱导的肠道炎症会破坏紧密连接相关蛋白的表达，损害上皮屏障的完整性，这是在人类 IBD中观察到的一个标志。这种最初的破坏随后会加剧症状，包括通透性增加、出血和死亡。在评估化合物6-26治疗效果的急性结肠炎模型中（图5A），DSS诱导的结肠炎以糜烂、溃疡、隐窝丢失和苏木精和伊红（H&E）染色组织的组织病理学检查显示明显的中性粒细胞浸润为特征（图5B）。然而，这些病理学改变是严重的。通过化合物6-26依赖性改善（图5B、C）。来自DSS治疗组的血液样本表现出口服给予的异硫氰酸荧光素（FITC）右旋糖酐（4kDa）的水平显着升高（图5D），而在给予化合物6-26后该水平显著降低（图5D）。重要的是，化合物6-26的粘膜愈合效果超过了托法替尼和SSZ治疗组。 体外安全性评估 化合物6-26在10μM浓度下对五种主要的人肝细胞色素P450（CYP）酶（包括CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6、CYP2C19和CYP3A4）的抑制作用进行了测试。如表2所示，通过这些主要CYP亚型潜在的药物相互作用，化合物6-26似乎可以忽略不计。此外，浓度为10μM时，6-26对hERG通道表现出非常弱的抑制作用（表2），表明心脏毒性（例如心律失常）的风险较低。 体内急性毒性研究 为了评估化合物6-26的安全性，通过以30和300mg/kg的剂量单次口服给予6-26，对ICR小鼠进行了急性毒性研究。给药后，在14天的过程中，与对照组（载体）相比，实验组中没有观察到体重减轻或不良反应情况，例如异常行为、食物和水摄入以及消化紊乱（图6A）。随后，对小鼠实施安乐死，并收集组织样本进行分析。通过H&Estaining进行的组织病理学检查显示，化合物6-26组没有明显的组织损伤或炎症反应（图 6B、C）。这些发现有力地支持了化合物6-26的良好安全性，值得考虑在药物开发工作中进一步推进。 药代动力学研究 在静脉内（IV，1mg/kg）和口服（PO，1mg/kg和5mg/kg）给药后，在大鼠中评估化合物6-26的药代动力学（PK）曲线。如表3所示，口服6-26（5mg/kg）显示AUC(0-t)为1849±714h·ng/mL，MRT(0-t)为5.0±0.7h，半衰期为3.3±0.4h，血浆中Cmax为760±684ng/mL，静脉注射6-26（1mg/kg）分别为1006±417h·ng/mL、1.2±0.1h、2.0±0.6h和1880ng/mL。5mg/kg口服给药显示生物利用度（F）为36.7%。AUC显示口服给药1和5mg/kg之间存在显著的剂量依赖性。综上所述，表明6-26具有良好的口服给药PK特性。 化合物6-26抑制TNF-α和IL-6诱导的NF-κB和STAT3核转位 研究了化合物6-26的细胞水平作用机制。由于化合物6-26抑制TNF-α和IL-6诱导的细胞反应，继续研究6-26的抑制作用是否与核NF-κB和p-STAT3水平的改变相关，它们是TNFR1信号通路的下游靶点和IL-6受体。虽然已知TNF-α和 IL-6可以增加核NF-κB和p-STAT3，但每种刺激激活这些转录因子的时间顺序仍然未知。本研究首先比较了TNF-α和IL-6在HT-29细胞中诱导NF-κB和p-STAT3核转位的程度。在治疗后TNF-α分别在5min NF-κB和在1h后诱导p-STAT3核转位，而IL-6在5min诱导p-STAT3和30min诱导NF-κB核转位。治疗后1小时，TNF-α和IL-6使核NF-κB增加的倍数分别为7倍和4倍，而TNF-α和IL-6使核p-STAT3增加的倍数几乎相似，均为5倍。这些结果通过免疫染色得到进一步证实。用6-26预处理HT-29细胞显着抑制TNF-α和IL-6诱导的NF-κB和p-STAT3核转位（图7A，B）。在TNF-α和IL-6处理的HT-29细胞中，6-26（1.5μM）对NF-κB和pSTAT3核转位的抑制作用大于美沙拉嗪（20mM）和托法替布（5μM）（图7C，D）。此外，化合物6-26的这种抑制作用超过了先前报道的化合物6-29（图7C、D）。 化合物6-26的靶标识别 目前已经使用相似性分析、机器学习和对接等多种方法来预测小分子的大分子靶点。这些方法是药物发现（包括药物重新定位）的宝贵工具。Kirchmair小组根据3D分子形状与非复杂分子的相似性，应用基于比对的方法来识别结构复杂小分子的靶标。他们证明了这种基于形状的靶标预测方法非常稳健且成功。受这项工作的启发，作者采用ROCS，一种领先的基于形状的分子比对软件查询分子与生物活性化合物进行匹配。IUPHAR/BPS药理学指南提供了专家驱动的药物靶点及其配体知识库，而ChEMBL提供了具有药物样特性的生物活性分子数据库。因此，作者从IUPHAR/BPS中检索了一系列药物靶点，并从ChEMBL中提取了每个靶点的生物活性分子的数据记录。活性和非活性之间的阈值pChEMBL值设置为5.0，对应10μM的IC50，EC50以及其他相关测量指标。通过去除盐和电荷中和来标准化化合物，然后滤除分子量小于250或大于600的分子。如果分子不具有明确的立体化学，则列举立体异构体。最后，使用 OMEGA.62为每个分子生成了多达50个构象异构体，总共活性化合物生成了大约2600万个构象异构体。 随后，使用OMEGA生成了化合物6-26的单一3D构象。然后将化合物6-26的形状和颜色特性与先前生成的活性化合物的构象异构体进行比对。这些命中化合物的靶标包括caspase-3、NPC1、Sentrin特异性蛋白酶、MAOB和COX-1、碳酸酐酶、menin、CCR6、PDE7A、HSP90a、S1PR4、GPER1和S6K-alpha-2。在这些靶标中，与观察到的表型结果最相关的是caspase-3、MAOB、COX-1和GPER1（表4）。随后进行了实验来评估6-26是否抑制MAOB和COX-1，但它们没有表现出抑制作用。命中化合物CHEMBL3233622得分最高，为1.575，具有caspase-3抑制活性，IC50为38.15nM。CHEMBL3233622属于1,2-苯并异噻唑-3-酮衍生物类，其中酮基的存在对于caspase-3的结合至关重要。6-26苯并噻吩环中缺乏酮基；因此，预计caspase-3活性不会很强。最后，6-26还具有与GPER激动剂CHEMBL4204670的高比对得分（Tanimoto组合得分＝1.411），其具有480nM的EC50值。使用ROCS计算的6-26和CHEMBL4204670的3D比对如图8A所示，显示了6-26的苯并噻吩环和CHEMBL4204670的吲哚环之间的大致对应关系。这些化合物之间的重叠可以进一步区分为形状和颜色成分（图8B），表明形状成分的贡献大于颜色的贡献。 化合物6-26与GPER对接实验 研究了6-26是否可以通过蛋白质-配体对接与GPER结合。从 AlphaFold蛋白质结构数据库中获得了由AlphaFold（AF-Q99527-F1-model_v4）生成的人类GPER 3D模型。利用CAVIAR来识别结合位点，并设置结合盒来包围该空腔。使用Flare6.0将6-26对接到该结合腔中。最佳结合姿势的ΔG为-9.9kcal/mol，表明6-26与GPER具有很强的结合相互作用。在图9所示的结合姿势中，主要相互作用似乎是Phe208和苯并噻吩之间的π−π相互作用。这种结合姿势与Arnatt小组提出的结合姿势一致。 化合物6-26直接结合在GPER 针对6-26的分子靶标，利用SPR研究了6-26与人GPER蛋白的直接结合。描述结合动力学的传感图如图10所示。数据分析显示6-26对GPER具有结合亲和力，KD值为2.37×10−8M。SPR数据的可靠性经过Chi2和U值。在实验中，获得了令人满意的Chi2（