利用细菌递送纳米抗体治疗炎症性肠病

2023-05-01

临床3期微生物疗法

人类的很多组织和器官被成千上万种细菌定植,尤其是胃肠道和皮肤。研究人员目前正致力于对定植的细菌进行基因改造，使之成为治疗性药物的载体。这些智能微生物通过在疾病部位释放治疗药物，减少全身给药相关的副作用，尤其是那些肠道相关的疾病。由于其具有易于生产、给药以及合成和递送复杂蛋白药物的能力，改造的菌株作为传统生物治疗的载体具有巨大的潜力。马萨诸塞州总医院的研究者报道了对Nissle 1917大肠杆菌（Escherichia coli Nissle 1917，EcN）进行改造的研究，实现了将有治疗作用的蛋白质分泌到肠道中的目的。在炎症性肠病（IBD）小鼠模型中，口服这种可分泌肿瘤坏死因子抗体的“聪明细菌”后，分泌的肿瘤坏死因子抗体与腹腔注射的抗体一样有效抑制结肠炎。他们设计的“聪明细菌”平台称为PROT3EcT。EcN属于GRAS级别（公认安全）的益生菌，具有固有的抗菌和抗炎活性,一个多世纪以来一直被用于治疗各种肠道疾病。对于革兰氏阳性细菌,可以利用其一般分泌途径（Sec）和双精氨酸移位酶途径（Tat），将治疗药物分泌到周围环境中。然而这些保守分泌系统不适合革兰氏阴性菌，因为它们的主要功能是将蛋白质递送到其外膜的周质组分中。因此对于开发的大肠杆菌工程菌，需要将细菌裂解,以释放细胞内蛋白药物，或通过与外膜粘附素和淀粉样蛋白纤维融合，在其表面表达具有治疗潜力的蛋白质。许多革兰氏阴性细菌有复杂的系统,如III型分泌系统（type III secretion systems ,T3SS））,可以将细菌蛋白直接递送到宿主细胞的胞质溶胶中。组装完整的III型分泌结构（type III secretion machines (apparatuse,T3SA）先嵌入细菌的外膜，然后其针状延伸体连接到宿主细胞膜上并在宿主细胞膜中形成孔隙。研究发现,革兰氏阴性病原体（包括福氏志贺氏菌和肠致病菌大肠杆菌在内）的T3SA在大肠杆菌中表达后也具有这个功能。作者报道了PROT3EcT（益生菌Ⅲ型分泌大肠杆菌治疗药物）平台的开发，这个基因工程改造的大肠杆菌可表达经过修饰的志贺氏菌的T3SA，将蛋白质分泌到周围环境中，而不是分泌到真核细胞中。PROT3EcT可以分泌带有N末端III型分泌序列（SS）的异源蛋白。PROT3EcT在设计上是模块化的，由三个遗传元件组成：（1）编码改良过的T3SA的操纵子，（2）主转录调节因子（VirB），（3）治疗性蛋白，即有效载荷。PROT3EcT-4是一种经过工程改造的变体，在在体外和小鼠肠道中正常生长。在IBD临床前模型中，TNF-PROT3EcT(一种分泌抗TNF-αNb的变体)与全身给药的抗TNF-α单克隆抗体（mAb）一样有效地抑制炎症的发展。这些研究为PROT3EcT作为一种多功能治疗平台的持续发展奠定了基础。PROT3EcT的开发编码志贺氏菌T3SA的约20个蛋白的基因包含在质粒上彼此相邻的ipa、mxi和spa操纵子中。mxi和spa操纵子编码了形成T3SA所需的所有结构组件。ipa操纵子包括那些形成尖端复合体，使机器保持关闭配置的元件。接触宿主细胞后，这些蛋白质在宿主细胞膜上形成孔复合体，从而能够将蛋白质直接注射到靶向哺乳动物细胞的胞质溶胶中。研究人员将质粒的大部分DNA转移到大肠杆菌染色体上，开发了编码ipa、mxi和spa操纵子的大肠杆菌菌株，可以将异源蛋白质注入哺乳动物细胞。为了培养能将蛋白质分泌到周围环境中的大肠杆菌，作者比较了含有ipa、mxi和spa操纵子的DH10b大肠杆菌与含有mxi和spa操纵子的DH10b大肠杆菌的分泌活性。在不同条件下，将操纵子插入同一染色体位点，并在IPTG（异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷）诱导的Ptrc启动子的控制下，引入表达VirB的低拷贝数质粒，VirB是控制三个操纵子表达的转录因子。由此产生mT3Ec_Ipa-Mxi-Spa和mT3Ec_Mxi-Sba菌株。在刚果红的诱导下，细菌可以在没有宿主细胞的情况下分泌蛋白。当在培养液中加入刚果红，mT3Ec_Ipa-Mxi-Spa和mT3Ec_Mxi-Spa分泌了类似水平的Ptrc调节的OspC2（一种天然志贺氏菌III型分泌效应子），表明ipa操纵子在分泌活性中不起作用（图1A）。GroEL是一种高度丰富的胞质蛋白，也是细菌细胞裂解的报告蛋白，在上清液组分中未检测到GroEL（图1A），这表明蛋白质是通过T3SA系统分泌的。在没有刚果红的情况下，mT3Ec_Mxi-Spa大量分泌OspC2，但mT3Ec_Ipa-Mxi-Spa不分泌，这表明mT3Ec_Mxi-Spa在不需要宿主细胞接触的情况下可以组成性地将蛋白质分泌到其周围环境中（图1B）。检测mT3Ec_Mxi-Spa上清液中存在的蛋白质，发现OspC2是最丰富的蛋白质，因此证明Mxi-Spa操纵子和VirB的引入足以在DH10b大肠杆菌中建立强大的Ptrc调节的分泌系统（图1C）。图1.用修饰的T3SA改造的大肠杆菌能有效地将蛋白质分泌到周围环境中接下来作者研究了对两种非致病性人类大肠杆菌分离株EcN和大肠杆菌HS进行类似的修饰是否会使它们具备功能性的蛋白质分泌系统。首先，他们在类似mT3Ec_mxi-spa的染色体位点上用mxi-spa操纵子工程化EcN，开发了PROT3EcT-1。尽管其水平略低于mT3Ec_Mxi-Spa（图1E），但PROT3EcT-1（图1D）能够分泌OspC2。在不同条件下，分泌过程都依赖VirB的存在（图1A和1E），表明分泌活性依赖于功能性T3SA的表达和组装。对大肠杆菌HS的类似修饰建立了PROT3EcT-2平台产生，其分泌OspC2水平与mT3Ec_Mxi-Spa相当。在6小时内，mT3Ec_Mxi-Spa和PROT3EcT-1会不断向周围环境分泌蛋白质（图1F）。志贺氏菌是细胞内病原体，依靠其T3SS及其分泌蛋白入侵非吞噬性上皮细胞。考虑到用mxi-spa操纵子改造的细菌缺乏效应子和末端复合物的成分，不会入侵宿主细胞或将蛋白质注入宿主细胞。为了证实这一点，作者首先比较了志贺氏菌、PROT3EcT-1、mT3Ec_Mx-Spa、DH10b大肠杆菌和EcN入侵HCT8细胞（一种肠道细胞）的能力。正如预期的那样，志贺氏菌没有受到庆大霉素的保护，庆大霉素是一种杀死细胞外细菌但不杀死细胞内细菌的抗生素（图1G）。其次，作者比较了暴露于WT志贺氏菌、mT3Ec_Mx-Spa和PROT3EcT-1的哺乳动物HeLa细胞的可溶性细胞质和不溶性含细菌部分中的OspC2水平（图1H）。正如预期的那样，仅在感染WT志贺菌的细胞部分中观察到OspC2。这些研究共同证明，mT3Ec_Mx-Spa和PROT3EcT-1不会侵入或将蛋白质注入哺乳动物细胞。PROT3EcT可以分泌异源蛋白质接下来作者研究了PROT3EcT-1是否能够分泌异源蛋白。在之前的研究中作者发现多个III型效应子的前50个残基与异源蛋白的N末端融合足以分泌蛋白。这些残基编码III型SS的元件。结果发现PROT3EcT-1能够分泌修饰的异源蛋白，包括乳动物转录因子MyoD和Mef2c，转录激活物样效应子TALE，以及哺乳动物肿瘤抑制蛋白APC的60和70 kDa片段。Nbs是单纯重链抗体的约15kDa可变结构域，是理想的细菌分泌蛋白，因为它们是稳定的小蛋白，有强的抗原结合亲和力。作者筛选了一种代表性单体Nb进行修饰，使其能够通过PROT3EcT分泌。将NbASC 融合到9种志贺菌效应子（OspC2、IpaH4.5、IpaH7.8、IpaH9.8、OspE、OspF、OspD3、VirA和OspG）SS上。与OspC2和OspG SSs融合的变异体表现出最高水平分泌（图2A）。OspC2序列的融合还能够分泌单体NbPD-L1、NbCTLA4、NbNPI和NbStx238（图2B）以及单链异二聚体和异三聚体NbStx2（图2C）。通过全长OspC2观察（图1C），异二聚体SSOspC2-NbStx2是PROT3EcT-1上清液中含量最多的蛋白质（图2D）。它还表现出对其靶抗原志贺毒素的结合和中和活性（图2E和2F）。这是一个重要的发现，因为它证明了Nbs与其他III型分泌底物相同，在装载到分泌装置中时是展开的，一旦正确分泌就会重新折叠。图2. PROT3EcT可以改造以分泌纳米抗体具有组成活性分泌Nb的PROT3EcT的研制为了实现分泌系统的组成性表达，作者用几种预测在肠道中具有组成性活性的启动子，如志贺氏菌PvirF、大肠杆菌PompC和两个合成启动子PJ23115和PJ23119，取代了其主要转录调节因子VirB的诱导型Ptrc启动子。在这些启动子的控制下，携带表达VirB质粒的PROT3EcT-1变体可以分泌同等水平的Nb。因此，作者将PJ23119 virB表达盒引入PROT3EcT-1的染色体中，以生成PROT3EcT-3。接下来，为了实现组成性Nb表达，作者用组成性PJ23108启动子取代了诱导型Ptrc启动子。此外，为了实现更高水平的有效载荷表达，作者开发了一种在没有抗生素压力的情况下维持PROT3EcT质粒的方法，开发了PROT3EcT-4，这是一种缺乏alr和dadX的衍生物（图3A）。这些基因编码EcN的两种丙氨酸消旋酶，将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸，这是一种细胞壁生物合成所必需的氨基酸。同时，作者将alr插入产生Nb的质粒中。携带该质粒的PROT3EcT-3和PROT3EcT-4分泌相似水平的Nbs。在没有抗生素选择的情况下，PROT3EcT-3失去了表达和分泌Nb的能力，而PROT3EcT-4不会。值得注意的是，尽管表达组成性活性分泌系统，但分泌NbStx2的PROT3EcT-4（Stx2-PROT3EcT）在与EcN表现出基本相同的生长模式，这表明这些修饰不会增加代谢负担。图3. PROT3EcT稳定地定植在小鼠的胃肠道，但不会影响肠道菌群PROT3EcT定植不会干扰小鼠的肠道菌群作者研究了分泌Nb的PROT3EcT-4在小鼠胃肠道定植的能力。他们监测了口服接种EcN或Stx2-PROT3EcT的C57BL/6小鼠粪便中脱落细菌的滴度（图3C）。在单剂量给药约108个菌落形成单位（CFU）后，作者检测到每个菌株脱落约105个CFU/g/天，至少持续14天（图3D）。在此期间，小鼠表现良好，没有明显的体重减轻迹象。为了研究从粪便中分离的细菌是否保持分泌活性，作者在第2天、第5天和第14天监测了来自4只小鼠的39–40个分离菌的分泌情况。158个Stx2-PROT3Et菌落中，每一个菌落检测到的分泌的Nb水平都与接种菌株相当（图S2C）。这些发现表明，在小鼠的胃肠道内，在缺乏抗生素选择的情况下，PROT3EcT-4维持了正常功能性分泌系统和alr-Nb表达质粒。作者还通过进行16S rRNA基因扩增子检测，比较了用PBS或约108CFU的PROT3EcT-4接种后14天C57BL/6小鼠的粪便菌群组成。与PBS相比，接受PROT3EcT-4小鼠的肠道菌群没有显著的分类学变化。接下来，作者比较了PROT3EcT-3和EcN在的小鼠肠道内的分布，这些小鼠接种了组成性表达产生萤光素酶的luxCDABE操纵子的变体，在体外生长时表现出等效的萤光素酶活性。小鼠口服接种8天后，这两种菌株在回肠、盲肠和近端结肠的外植切片中显示出类似的萤光素酶表达模式（图3G）。为了证实PROT3EcT中修饰的T3SA在小鼠肠道内主动转录，作者开发了一种基于luxCDABE的报告基因，该报告基因只有当编码修饰T3SA的mxi-spa操纵子被转录时才被激活。携带该报告基因的PROT3EcT-3变体（不是EcN），在培养物中生长时以及在接种小鼠的外植盲肠、近端结肠和回肠内生长时，显示出了荧光素酶的生成（图3H）。总之，这些研究表明，分泌系统在小鼠肠道内表达，不会干扰EcN的定植。PROT3EcT可被改造使其分泌功能性SSOspC2-NbTNF为了建立PROT3EcT治疗平台，作者首先评估其在IBD治疗中的疗效。溃疡性结肠炎和克罗恩病的病因（统称为IBD）是复杂的，由宿主遗传、环境和菌群因素驱动。这两种疾病都表现出慢性炎症，并伴有促炎细胞因子水平的升高。靶向促炎细胞因子TNF-α单抗（如infliximab和adalimumab）在控制严重疾病和改善IBD患者的生活质量方面非常有效。然而，这些治疗药物全身给药有免疫抑制作用，导致致命性感染和淋巴瘤的风险增加。为了验证通过PROT3EcT向肠道靶向递送抗TNF-αNbs可以减少肠道炎症，作者从小鼠（m）TNF-α免疫的羊驼中分离出Nbs，其中一种 (JTT-B10) 可以高亲和力（EC50 0.1 nM）结合并中和mTNF-α（IC50 0.1 nM）。作者用SSOspC2工程生成了该Nb（NbmTNF）的单体和同源二聚体变体。同源二聚体（SSOspC2-Nb2xmTNF）的分泌效率远高于单体（图4A），在18小时培养物的上清液中检测到的浓度约为0.5μg/mL。PROT3EcT分泌的SSOspC2-Nb2xmTNF与大肠杆菌纯化的同源二聚体Nb在阻断mTNF-α诱导的小鼠L929细胞死亡方面同样有效（图4B）。使用类似的方法，作者还分离了一种羊驼来源的人特异性抗TNF-α Nb，该抗体以高亲和力（0.5 nM）结合并阻断人TNF-α诱导的小鼠L929细胞死亡。当用N-末端SSOspC2修饰时，PROT3EcT分泌该Nb的功能性同源二聚体（SSOspC2-Nb2xhTNF）。图4. TNF-PROT3EcT分泌功能完整的抗TNF Nbs并定植小鼠，但不影响肠道菌群TNF-PROT3Et抑制小鼠模型结肠炎进展为了研究PROT3EcT作为活体生物疗法在治疗肠道炎症中的疗效，作者选择了一种化学诱导的临床前小鼠结肠炎模型，将TNBS（2，4，6-三硝基苯磺酸）、半抗原和乙醇的混合物经直肠注入结肠，破坏粘膜屏障。与结肠组织蛋白结合的TNBS诱导促炎细胞因子（包括TNF-α）驱动的炎症。。如前所述，用中和抗TNF单克隆抗体腹膜内治疗的50只小鼠（TNBS给药前1天和给药后2天和4天）免受体重减轻、结肠缩短和组织学水平的结肠炎的影响。在测试分泌Nb2xmTNF的PROT3EcT-4（TNF-PROT3EcT）抑制结肠炎的功效之前，作者比较了用TNF-PROT3EcT或PROT3EcT-4定植的BALB/c小鼠的粪便菌群组成。作者对接种TNF-PROT3EcT和PROT3EcT-4小鼠14天后的粪便进行了16S rRNA基因扩增子检测（图4C）。通过Bray-Curtis评估，没有观察到TNF-PROT3EcT和PROT3EcT-4治疗小组的小鼠肠道菌群有差异（图4D；4E）。因此，PROT3EcT分泌的Nb2xmTNF不会显著影响肠道菌群的群落组成。接下来，为了测试TNF-PROT3EcT的治疗效果，在接受TNBS治疗前1天以及治疗后2天和4天，作者给小鼠灌胃108CFU的TNF-PROT3EcT、PROT3EcT-4或PBS（图5A）。所有接受细菌疗法的动物续脱落约105CFU/g细菌到粪便中（图5BH）。用TNF-PROT3EcT治疗明显缓解了体重减轻，减缓结肠缩短，减少或完全消除整个结肠黏膜（即远端和近端结肠）的上皮损伤和炎症，减少了多形核细胞和单核细胞浸润（图5C–5F）。相比之下PROT3EcT-4没有提供任何保护，证明TNF-PROT3EcT具有的疗效是由于分泌SSOspC2-Nb2xmTNF而不是EcN所固有的。图5.TNF-PROT3EcT抑制TNBS诱导的结肠炎的发展鉴于IBD患者通常用使用灌肠进行药物输送，作者研究了直肠内给TNF-PROT3EcT在抑制TNBS诱导的结肠炎中的疗效（图5G）。与口服给一样，直肠内给药的TNF-PROT3EcT（而非PROT3EcT-4），可以改善体重减轻、结肠缩短和结肠炎（图5H–5J）。两种菌株在粪便中的排出量相似。单次口服TNF-PROT3EcT可抑制TNF-α和肠道炎症鉴于TNF-PROT3EcT治疗的小鼠在TNBS给药后表现出最少的体重减轻，作者测试了单剂量预处理是否有治疗效果。TNBS给药后2天，用单次口服剂量的TNF-PROT3EcT或PROT3EcT预治疗的小鼠（图6A）在其粪便脱落相似水平的每种菌株（图6B）。引人注目的是，接受TNF-PROT3EcT治疗的小鼠表现出轻微的体重减轻、结肠缩短和结肠炎，而PROT3EcT-4和PBS没有治疗效果（图6C–6E）。当用单次口服剂量的TNF-PROT3EcT预治疗小鼠时，在TNBS给药后5天观察到类似的保护作用。图6.单次预防剂量的TNF-PROT3EcT可减轻TNBS诱导的结肠炎TNBS给药后2天处死的小鼠，作者在该时间点可重复地检测到对照组结肠组织内促炎细胞因子水平升高，用TNF-PROT3EcT而不是PROT3EcT预治疗的小鼠结肠组织中可检测到TNF-α和IL-6水平显著降低，（图6F和6G），但作者观察到无论采取何种干预措施，IL-10的水平都相当（图6H）。结论在此，作者描述了PROT3EcT的开发过程，这是一套大肠杆菌，专为将高特异性蛋白质有效载荷原位递送至疾病部位而设计。使用基于合成生物学的方法，作者设计了非致病性人类大肠杆菌分离株，具有修饰的T3SA，可以可调节性地或组成性地分泌蛋白质。此外，作者开发了PROT3EcT-3和PROT3EcT-4，这些变体配备了在没有抗生素选择压力的情况下维持的组成性活性分泌系统，当组成性分泌Nb时，在体内外表现出与天然EcN等效的生长速率和定植率。未来的研究将侧重于TNF-PROT3EcT在结肠炎诱导后抑制炎症的能力，即作为治疗手段。尽管如此，作者观察到TNF-PROT3EcT在抑制结肠炎发展方面与抗TNF-α单克隆抗体全身给药一样有效，这表明它有可能发挥类似的作用，即作为IBD患者的维持治疗。鉴于其固有的抗炎和抗菌特性，EcN是一种GRAS（Generally Recognized as Safe），一个多世纪以来一直用于治疗各种肠道疾病，并且在一些国家为非处方药品。然而，EcN含有一个操纵子，可介导大肠杆菌素的合成。无大肠杆菌素的EcN突变体至少在小鼠或灵长类动物的肠道定植能力没有削弱。在未来的研究中，作者将研究大肠杆菌素缺陷型EcN的TNF-PROT3EcT抑制肠道炎症的能力。作者报告了两个大肠杆菌素阴性菌株，E.coliHS和DH10β，和ECN一样，也可以利用功能修饰的III型分泌系统进行改造。尽管分泌抗TNFNb的大肠杆菌DH10ß的TNF-T3EcT不能在肠道内定植，但每天直肠给药的剂量对TNBS诱导的炎症的抑制作用与ECN的TNF-PROT3EcT一样有效。此外，虽然ECN已被证明可在健康人体内定植长达2周，但IBD肠道的炎症环境可能会有利于改造大肠杆菌的定植。Schmidt, Hidde L. Ploegh, Vikram Kansra, Jonathan N. Glickman, John M. Leong, Charles B. Shoemaker, Wendy S. Garrett, Cammie F. Lesser. Engineered Escherichia coli for the in situ secretion of therapeutic nanobodies in the gut. Cell Host & Microbe, 2023; DOI: 10.1016/j.chom.2023.03.007近期热门视频更多精彩视频，尽在佰傲谷视频号，欢迎关注~本周好文推荐如需转载请联系佰傲谷并在醒目位置注明出处﹀点亮在看，传递信息♥