POU3F3

常规的非复制线性mRNA分子的优化通常涉及5'/3'端非翻译区（UTR）和开放阅读框（ORF），并以实现持久高效的翻译为目的。目前针对线性mRNA的序列设计优化方案集中于优化ORF序列以提供稳定持久的翻译，并在此基础上形成更稳定的mRNA分子二级结构。与线性mRNA不同，除了ORF区域外，环状RNA（circRNA）通常含有用于非帽依赖性翻译启动的内部核糖体进入位点（IRES）基序。正确折叠的IRES功能基序用于募集翻译前起始复合物（PIC），也是实现circRNA高效翻译不可或缺的条件之一。由于缺乏专门用于circRNA的结构预测和序列设计工具，以及对circRNA序列中IRES和ORF区域之间交叉相互作用的理解不足，目前circRNA的序列优化严重依赖于大量重复性的模块化筛选。如果仍按照线性mRNA的优化思路，只关注ORF区域的优化将会忽视IRES基序与其他区域骨架序列在构成circRNA整体时所产生的不确定因素，影响整体的序列优化结果。2023年7月10日，斯微生物研发团队与来自“LinearDesign”主要设计团队的中国药科大学张亮教授和Coderna.AI创始人黄亮教授联合在预印本bioRxiv上发表了题为“Improving the Circularization Efficiency, Stability and Translatability of Circular RNA by circDesign（通过circDesign提高环状RNA的环化效率、稳定性和可翻译性）”的研究论文。在早前专门用于设计优化线性mRNA序列的高效人工智能（AI）算法“LinearDesign”的基础上，进一步推出了用于环状RNA结构预测与序列设计算法平台——“circDesign”，是有望提高编码蛋白质的环状RNA环化效率、稳定性和翻译效率，简化circRNA的序列优化设计的有效设计开发工具。在本研究中，设计者团队将circDesign算法应用于基于circRNA的狂犬病（RABV）和带状疱疹（VZV）疫苗的序列优化设计中，在小鼠模型中增强了circRNA的序列稳定性和翻译效率，成功验证了circDesign平台在circRNA序列设计优化上的有效性。作者说斯微生物创始人、董事长李航文博士表示，斯微生物在mRNA平台搭建上持续创新，自从将人工智能算法应用在线性mRNA的序列设计上以来，取得了显著的进展。目前将人工智能算法布局在环状RNA平台上，也是国际首个通过人工智能算法优化设计环状RNA的案例，同时是斯微生物创新实力的体现。文章第一作者，斯微生物mRNA平台研发负责人徐聪聪博士表示，此项与中国药科大学人工智能专家张亮教授，以及美国Coderna.ai公司人工智能专家黄亮教授的合作，进一步展现了人工智能算法在RNA领域应用的广阔前景，环状RNA作为一种新型RNA技术，未来在传染病预防性疫苗以及治疗性药物方面的开发方面可能与现有线性mRNA技术齐头并进，甚至在某些应用场景下具有独特的优势。本文的共同一作，circDesign算法开发人，LinearDesign共同一作，中国药科大学张亮教授认为此项工作在与斯微生物前期合作基础上产生了新的成果，针对环状RNA的序列设计需要考虑更多的因素，目前也在积极探索针对不同RNA平台的设计算法，希望人工智能技术能够加速RNA疫苗和药物的开发。CircDesign的应用概述和流程非复制线性mRNA的功能元件，包括5'-UTR和3'-UTR长度相对较短，约为100nt；而人工体外合成的circRNA通常需包含长病毒和细胞IRES序列，长度为500-800nt。IRES也需要不受其他序列的干扰完成独立有效的分层折叠才得以高效招募PIC进行翻译。基于这一特性，circDesign还着重考虑减轻ORF区域与IRES基序的交叉相互作用，以实现功能性IRES的有效折叠。同时circRNA残留的外显子片段（循环置换内含子-外显子（PIE）的残留片段）可能会给circRNA的整体功能带来不确定性，虽然目前未有深入研究报道该片段对circRNA整体功能的确切影响，但普遍认为这些片段会干扰其他元件的折叠，因此优化ORF区域时也需要采取一定的预防措施。CircDesign的基本应用流程主要有四步骤（图1a）：1. CircDesign首先基于给定的氨基酸序列，生成大量mRNA序列库；2. CircDesign基于最小自由能（MFE）*和密码子适应指数（CAI）*对circRNA的ORF区域序列进行筛选，考量ORF的稳定性和翻译效率，并将其与包括IRES、外显子片段在内的功能部分和骨架组装成完整circRNA分子；3. 在完整circRNA分子中评估IRES的位置熵（即circRNA的折叠 ）和circRNA的集合多样性，以及区域间相互作用。位置熵越低，IRES结构越保守；而集合多样性越低，表明circRNA整体结构一致性更高，更可预测。两者均有助于评估获得更高的结构严密性。区域间相互作用的评估主要目的为减轻ORF对IRES独立折叠的影响；4. 在上述筛选过程后，在体外、体内模型中对设计的circRNA进行进一步的筛选评价。“【最小自由能（MFE）】RNA 分子中碱基对以及核苷酸之间均是靠氢键进行连接的，通过破坏 RNA 二级结构中不同子结构中的氢键所需要的能量值可以得到这些子结构在组合时所需要消耗的能量，这个能量被称为自由能。RNA 分子结构之所以能够稳定，其原因就是碱基配对造成了能量的降低。因此，最小自由能算法认为，自由能趋向越小的时候RNA二级结构越稳定。【密码子适应指数（CAI）】密码子适应指数（CAI）是指编码区同义密码子与最佳密码子使用频率的相符程度，取值在0~1之间。CAI可以用来评估外源基因在宿主内的表达水平，CAI越高，则外源基因在宿主内的表达水平越高。图1. circDesign方法概述和编码RABV-G的环状RNA分子设计流程以编码RABV-G为例的circRNA设计、合成和表征设计如上图1b所示，研究团队通过circDesign设计获得了6个编码RABV-G circRNA的ORF（CR1-CR6）序列，这6种设计均分布在低MFE区域。团队遵循了早前LinearDesign的实验设计原理，同时采用了分别来自赛默飞世尔（ThermoFisher）和近岸蛋白（Novoprotein）公开平台设计的基准ORF序列（CR-Ther，CR-Novo），并使设计的每个序列MFE值（CR2, CR3 // CR4, CR5）或CAI值（CR5, CR6, CR-Ther // CR1, CR2, CR-Novo）均尽量成对保持一致，在图1b中以绿色的颜色深浅表示组装后circRNA的集合多样性。随着ORF区域的MFE降低，circRNA的集合多样性降低，表明每个序列均有明确独立折叠的结构。研究使用来自柯萨奇病毒B3（CVB3）的IRES嵌入ORF上游驱动circRNA的蛋白质翻译。合成本研究中采用了I型内含子自剪接系统（Group I intron self-splicing system），利用核酶介导circRNA的环化。自剪切I型催化内含子（group I catalytic intron）通常被设计成分离的5'-内含子和3'-内含子两部分。在线性mRNA阶段时，分子两端由互补的同源臂组成，以促进活性核酶结构的折叠，并通过两个酯交换反应（Transesterification Reactions）以形成两个外显子片段（E1和E2）之间的连接。表征研究以CR3和CR-Novo为代表进行了参数检验表征和二级结构预测。通过circDesign设计的CR3，其ORF具有相对更低的MFE，同时与IRES基序的区域间相互作用更弱。从图1d所示两者的二级结构可以发现，浅灰色代表的IRES基序在两个circRNA中具有不同的折叠，同样在CR-Ther中也观察到次优ORF在一定程度上对IRES正确折叠的影响。图1e显示，CR-Novo比CR3具有更多的区域间碱基配对（红色连接线），CR3中主要表现为区域内的配对折叠（蓝色连接线）。在circRNA环化过程中，更紧凑的ORF折叠（区域内）对活性内含子的干扰相对较小，circDesign生成的序列（CR1-6）比CR-Novo和CR-Ther具有相对更高的环化效率（图2a）。图2b所示为室温下进行的非变性琼脂糖凝胶电泳结果，在相同的核苷酸长度下，circRNA的凝胶迁移率与其MFE值密切相关。具有最高MFE的CR-Novo序列在凝胶基质中表现出最慢的迁移率，而CR1-5由于其高度紧凑的折叠结构而具有更快的迁移率，表明优化的circRNA ORF序列在调节其折叠方式上的潜力。图2. circDesign设计的CR1-6及CR-Ther，CR-Novo的表征优化circRNA的体外稳定性针对优化后circRNA体外稳定性的检验主要分为热力学折叠（thermodynamic folding）、溶液内降解（in-solution degradation）以及细胞内衰变（intracellular decay）三项。热力学折叠通过加热溶液中的circRNA逐渐展开其结构，RNA结合的RiboGreen试剂的荧光强度相应减弱，并以此可计算出熔化温度（®Tm）的荧光强度曲线。从图2C可发现，与CR-Ther和CR-Novo相比，circDesign设计的CR1-6具有更显著的热力学稳定性，且可发现热力学稳定性与MFE值呈正相关，MFE值越低该序列的热力学稳定性越好。溶液内降解circRNA与线性mRNA一样，其化学不稳定性主要源于水解反应。本研究中使用了37°C下含有10 mM Mg2+的PBS缓冲液，模拟生理条件并加入circRNA样品孵育60小时。通过在不同时间点评估circRNA完整性，将得到的随时间变化的降解率拟合到单相衰变曲线中，以表现不同的降解动力学速率（图2d）。从图2d中可对比发现CR1-3大大扩展了半衰期（t1/2），将CR-Ther和CR-Novo的9.68小时和9.14小时提升到了15.56到20.62小时，表现出更显著的水解稳定性。细胞内衰变为了评估circRNA的细胞内半衰期，研究采用了逆转录定量实时PCR（RT-qPCR）方法，在circRNA转染到人骨骼肌细胞（HSkMC）后的不同时间点（3、12、24、48和72h）定量从细胞中提取并检验circRNA的丰度。结果如图2e所示，所有测试的circRNA均表现出不同的衰变模式。由此可以发现，circRNA的细胞内降解可以通过调整其二级结构和翻译效率来控制。其中MFE值较低的CR1和CR3显示出更长的细胞内半衰期。综合条件下，CR3序列具有良好的稳定性和高翻译效率，能够抵抗化学降解和生物衰变。优化后circRNA的蛋白质编码和表达能力研究团队使用流式细胞术评估了HSkMC中转染circRNA的RABV-G表达水平，并以图2f呈现。由平均荧光强度（MFI）显示，CR1-5的蛋白质表达水平明显高于CR6和CR-Ther，其中CR-Novo显示出同样高于CR6和CR-Ther的蛋白质表达水平。这一结果表明，除CAI外需要考虑多种因素对circRNA整体表达能力的影响。研究人员进一步采用了核糖体分析（ribosome profiling）和多聚体分析法（polysome profiling）对CR3和CR-Novo进行并列比较。如图3d所示的RNA直接测序计数和核糖体测序计数表明，CR3的circRNA丰度和核糖体足迹丰度（ribosome footprints）更显著，决定其具有更高的翻译效率。通过二级结构成对可视化对比，可以推断circRNA丰度和核糖体足迹丰度的区别主要是由于部分被破坏的IRES基序阻碍了翻译机制的起始招募，导致较低的丰度。多聚体分析用于比较核糖体负载能力，由图3g显示，CR3中的核糖体载量高于CR-Novo，体现出相对更高的核糖体负载能力。图3. CR3和CR-Novo的翻译效率比较优化后circRNA狂犬病疫苗诱导的免疫效力研究团队通过小鼠模型肌肉注射编码RABV-G的circRNA疫苗评估不同设计方案circRNA的体内免疫原性。在起始剂量注射后第10天，与所有circRNA组相比，LR-Novo引起的抗体滴度略高，这可能是由于抗原的起效表达相对较快，尽管总体滴度仍然很低（图4b）。假病毒中和抗体滴度（pVNT）数据表明，circDesign优化序列组（CR1-4）可引起缓慢但更强更持久的体液免疫反应（图4d），且circRNA组在28天后均表现出pVNT的持续增加（图4e）。图4. circRNA狂犬病疫苗诱导的体内免疫反应在此基础上，研究团队一并设计了编码水痘-带状疱疹病毒（VZV）糖蛋白E（gE）作为第二抗原的circRNA疫苗（CV1-5）并进行了与circRNA狂犬病疫苗相对应的表征验证实验。实验中同样发现circDesign优化的序列CV1-5诱导了更强的水痘带状疱疹病毒gE特异性T细胞反应，验证了circDesign针对编码不同抗原circRNA时具有稳健的设计优化有效性。总结斯微生物联合中国药科大学设计的名为“circDesign”的新算法工具，通过本研究论文提供支持该算法用于优化序列增强稳定性和翻译效率的证据，将有望成为环状RNA治疗产品合理有效的设计优化工具，大大简化环状RNA的设计优化过程。但本文也强调，目前circDesign算法仅对特定的ORF序列进行了广泛的探索，还未涉及优化circRNA的其他功能区域，如IRES基序。这是由于病毒或细胞衍生的IRES基序通常对序列操作敏感，在结构域折叠良好时才具有募集PIC并完整组装的功能。目前只需要在分子水平上阐明IRES的结构-活性，就可以在circDesign算法中实现IRES序列的自下而上搜索或优化。参考资料[1] Improving the Circularization Efficiency, Stability and Translatability of Circular RNA by circDesign | bioRxiv. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.07.09.548293v1.full[2] Zhang H, Zhang L, Lin A, Xu C, Li Z, Liu K, Liu B, Ma X, Zhao F, Jiang H, Chen C, Shen H, Li H, Mathews DH, Zhang Y, Huang L. Algorithm for Optimized mRNA Design Improves Stability and Immunogenicity. Nature. 2023 May 2. doi: 10.1038/s41586-023-06127-z.

2017年7月31日下午，一名20岁的山东德州女孩，在当地街道卫生服务中心注射了中国内地的第一支宫颈癌疫苗。而在近11年之前，2006年8月28日下午，一对昆士兰少年姐妹，在澳大利亚的昆士兰州亚历山大医院接种了世界上第一支宫颈癌疫苗。作为世界上第一个能够有效预防癌症的疫苗，其背后涉及三位关键的科学家。他们其中有一位就是中国人，但由于积劳成疾已于1999年3月故去，没能看到他用生命换来的研究成果造福世界女性的这一幕，他叫周健，年仅42岁；而今年5月底，另一位与HPV疫苗发明息息相关的科学家哈拉尔德・楚尔・豪森也安然离世，享年87岁。01/ 耗费10年，换得人类首次拥有完全消灭一种癌症的可能关于宫颈癌的病因，在很长一段时间里，科学家都认为其是通过性交传播的某种病原体引起的。而这其中嫌疑最大的，就是人类2型疱疹病毒（HSV2）。人们在这条错误的道路上探寻了很久都一无所获，直到哈拉尔德·楚尔·豪森（Harald zur Hausen）的出现。哈拉尔德·楚尔·豪森出生于1936年，在德国北威州的一个工业区长大。彼时处于第二次世界大战期间，而豪森的家乡由于以煤炭生产和炼油为主，故而经常遭到飞机的轰炸。在人生的头10年里，小豪森能在学校接受正规教育的次数屈指可数，战争的硝烟充斥着他的童年生活。但这却并没有让一个孩子失去对学习的兴趣，反而因为拥有更多与大自然接触的时间，小豪森对自然和生物学充满了好奇。也正是凭借着这种探索自然奥秘的热情，豪森克服了重重困难，不仅完成了高中学业，还考入了波恩大学。图为豪森兄妹四人的童年合影，右二为豪森（来源：Annual Review of Virology）此后，他又先后在汉堡大学和杜塞尔多夫大学学习医学，并获得了医学博士学位。毕业后，他做了2年实习医生。可能正是这段医生的经历，让他对于是要将自己的一生投身于对患者的治疗还是医学研究这个问题弄清楚了，豪森逐渐意识到自己更喜欢做研究。由于在德国接受科研培训的机会有限，因此他开始在美国寻找机会，踏上了一段追寻梦想的病毒研究之旅。1965年年底，豪森来到了美国。次年，他开始在费城儿童医院的免疫学家沃纳·亨勒（Werner Henle）教授的实验室任职。在亨勒教授的实验室工作期间，受亨勒教授的启发，豪森在一次电镜观察中发现了癌细胞内部存在EBV的清晰证据，并据此得出一个结论——EBV可能在伯基特氏淋巴瘤的发生中有着重要作用。由于对此有着浓厚的兴趣，豪森便对EBV展开了一系列的深入研究。1969年年底，豪森终于获得了第一份可用的数据，并证实了不产生EBV的伯基特氏淋巴瘤细胞系Paji的每个细胞都含有多个EBV的DNA拷贝。这可能是人类恶性肿瘤中有持续存在肿瘤病毒DNA的首个证明。也正是对此的研究，为豪森积累了宝贵的技术经验，为其后续探索HPV埋下了成功的种子。1972年，豪森到埃尔兰根-纽伦堡大学新成立的临床病毒学研究所上任，并将研究方向转到了宫颈癌病因的研究上。为了验证当时的一个普遍推测——单纯疱疹病毒2型（HSV-2）是导致女性患宫颈癌的罪魁祸首，豪森联系了一些同事去检查宫颈癌样本中是否含有HSV-2的DNA。图为豪森教授接受采访照（来源：世界顶尖科学家论坛）但遗憾的是，无论如何优化实验，都无法从样本中检测到HSV-2的DNA 序列。这让豪森对当时普遍的认知产生了怀疑，而在查阅大量资料后，豪森发现，许多关于尖锐湿疣能够转变成鳞状细胞癌的报道中都同时指出，这些尖锐湿疣样本能检测到人乳头瘤病毒颗粒。这让豪森不禁猜测，导致宫颈癌的元凶会不会就是HPV。1974年，豪森首次提出了HPV长期慢性感染会导致子宫颈癌的假设，但当时并没有人愿意相信他。即使如此，豪森也并未放弃去证明这个大胆的设想，而是另辟蹊径，率领他的研究小组去寻找宫颈癌细胞中人乳头瘤病毒的遗传物质DNA。豪森认为这些在癌细胞中的病毒DNA很有可能处于长期的休眠状态，并不一定会复制新的病毒体。为了克服这一困难，其采用了一种俗称“钓鱼”的研究方法，即把人工合成的已知DNA片断做上标记，通过细胞内杂交，设法提取病毒的DNA。但这种方法在脚底疣的细胞中成功了，却在宫颈癌细胞中失败了，他们依旧没能如愿找到HPV的DNA片断。考虑到病毒DNA不断变异的特性，研究小组只能改进方法，扩大搜索范围。1974年，研究小组终于在宫颈癌细胞中发现了HPV颗粒。1977年，豪森又发现了4种不同亚型的HPV，并将其依次取名HPV–1、HPV–2、HPV–3、HPV–4，然而接下的实验结果却给了他一记沉重的打击：这四种HPV和宫颈癌一点儿关系都没有！研究一度陷入僵局。1981年，豪森发现了新亚型HPV–6，次年发现了HPV–11，但依旧无法完全证明宫颈癌就是HPV导致的。又经过几年的潜心寻找后，团队终于在1983年和1984 年先后发现了HPV-16和HPV-18，大约70%的宫颈癌样本含有这两种病毒中的一种。图为首张HPV-16 病毒的印迹照片（来源：Annual Review of Virology）直到这时，豪森才完全证实了他此前的假设，而时间却已然过去了整整10年，漫长而曲折。但也正是因为豪森教授的这一研究成果，才为后续HPV疫苗的研发开辟了道路，人类首次拥有了完全消灭一种癌症的可能。2023年5月28日，这位2008年诺贝尔生理学或医学奖得主、领导德国癌症研究中心长达20年的癌症研究专家，自称业余鸟类学家、古典音乐发烧友的老人，在德国海德堡家中去世，享寿87岁。但他送给全球女性的这份“科学礼物”，却一直被人们所铭记。02/ HPV疫苗背后的一位“无名英雄”，未亲见欢呼便已永眠为彻底根除宫颈癌带来机会的科学研究，是由两位来自不同领域的科学家通过非凡但充满悲剧色彩的合作完成的。其中一位便是中国人周健，他用生命换来了世界上第一支癌症疫苗，造福了千万女性，但却很少被人提及。请记住他的名字，他是宫颈癌疫苗的共同发明者。关于周建，要从上世纪70年代讲起。那是一个春天，杭州乍暖还寒，周健在一家工厂里忙得满头大汗，彼时的他还只是一个工厂的普通打工人。即使在当时来看，这份工作已经很不错了，但周建却心有不甘。周建出生于1957年，由于母亲是从事教育行业，并一直对他悉心教导，所以周健从小就热爱学习，并立志不论从事什么行业，都要能够通过自己所学，成为一个对社会、对国家有用的人。1977年，国家恢复了高考。这一消息对于周健而言无疑是振奋人心的。在得知消息之后，周健就拿起了书本，白天在厂里干活，晚上就回家看书学习。皇天不负有心人，也是在这一年，周健考上了温州医学院，成为了高考恢复后的首届大学生，彼时他20岁。在上大学的5年里，周健一直刻苦学习，从未有半分懈怠，这也为他日后的研究之路打下了坚实的基础。周健曾说，温医的5年对他的影响是很大的，时间也是最长的，他也一直想尽自己的能力为母校做些事情。图为1997年伊恩·弗雷泽访问温州医学院（左三）；左一，吕杰强；左二，周健；左四，李志渊；右一，瞿佳（来源：《英才济苍生》）临近毕业时，大家都在讨论以后要做什么方向的医生，只有周健却说自己想成为一名科学家。大家只将此话当作一句玩笑话，对此周健笑着回答：“做医生很好，以前我也想做医生。现在我相信做研究有发明，能造福更多的人。”为了实现自己的医学研究之梦，1982年，周健考取了浙江医科大学攻读硕士学位，师从徐英含教授，做病理学的研究。在拿到硕士学位后，他又考入了河南医科大学攻读博士，师从沈琼教授，研究食道癌。而在读博期间，周健提出了一个大胆的想法：从分子生物学的角度研究食道癌。在学校其他老师都认为此想法非常荒谬时，周健的导师却并没有对此想法表示出不赞成，反而是将周健举荐到了北京病毒所学习。也就是在北京病毒所，周健师从谷淑燕老师从事HPV的研究。周健非常珍惜这个机会，在此期间多方位地开展了HPV的研究，积累了大量的研究数据资料和方法。1988年，周健选择进入北京医科大学生物化学研究所做博士后，跟随病毒学家张乃蘅教授继续研究HPV。同年，周健申请到位于剑桥大学的英国帝国癌症研究基金会(ICRF)的肿瘤和病毒实验室作研究，并成为国际HPV研究先驱Lionel Crawford教授接收的第一位中国研究员。周健的妻子孙小依也在随后来到剑桥成为他的助手。命运的转轮从这里开启，在剑桥，周健遇到了改变他一生的好伙伴——从澳大利亚昆士兰大学来这里度学术休假年的免疫学家伊恩·弗雷泽教授，两人恰好在相邻的两个实验室工作。图左起为周健、卡米娜·罗荣、杜百强在剑桥大（来源：《英才济苍生》）当时的周健醉心于做实验，每天除了研究室，最常去的地方就是学校的咖啡店。而在这里，周健经常看到另一个身影，即同样专注于宫颈癌疫苗研究的弗雷泽。两人一见如故，常常交换彼此的研究心得并一起验证新的想法。两年时间一晃而过，两人也都顺利毕业。在谈及日后规划时，得知好友准备回澳大利亚发展，在好友的热情邀请之下，周健毅然决定带着妻子跟随好友一同前往澳大利亚，继续研发HPV疫苗。就这样，一个主攻病毒学、一个主攻免疫学，两人成了HPV研究界里的黄金搭档。在当时，研制HPV疫苗面临的最大问题，就是如何获得HPV病毒。因为这种病毒只能存活于活细胞内，无法在体外组织液中培养，而其在活细胞中繁殖时又要与宿主的细胞基因融合，那么，有什么方法能制造出这种病毒呢？如果这个问题无法解决，那就不用谈研发什么疫苗了。据周健遗孀孙小依回忆：“我永远都记得见证合成HPV病毒的那一刻，对我来说那是一个偶然，也是一个必然。”那是1990年年底的一个夜晚，周健在和孙小依散步时突然说：“已经有表达和纯化了的L1、L2（HPV晚期蛋白、病毒壳膜的主要构成）蛋白，何不把这两个蛋白放在组织液里，看看它们能否合成病毒样颗粒？”当时孙小依还笑话丈夫的异想天开，觉得如果这么简单那应该早就有其他人发现了，哪轮得到他们。图为周健夫妇在1998年圣诞节晚会上，布里斯本（来源：《英才济苍生》）但周健却对于这个想法异常认真，并一再催促妻子进行实验尝试。大约两个星期后，当夫妻俩在电子显微镜下看到一颗完整的、体外合成的病毒颗粒时，都“呆住”了。是的，世界上第一个宫颈癌病毒颗粒就是在这种“异想天开”的想法和认真的尝试中，诞生在了澳大利亚昆士兰大学，彼时周健33岁。HPV研究有了重大突破后，三人都沉浸于病毒制成的喜悦当中，并未意识到接下来三人中会有一个人永远的离开......一直以来，周健都致力于世界各地HPV疫苗的临床试验，而每年的3月，是他例行回母校温州医学院看那里的临床试验的日子，这一年也不例外。只是这一次，是一场没有归途的旅程。1999年3月8日晚，刚到杭州不久的周健立刻给家里打电话，当时还听着儿子在电话里说：“爸爸，这次回来你给我买什么礼物？给我买一个最新的lego（乐高拼装玩具）吧！”周健在电话中承诺一定给儿子买回来。然而次日，就传来了周健因感染性休克病重的消息；到3月10日，周健永远的闭上了眼睛，与世长辞，年仅42岁。“他可能太累了吧。”据孙小依回忆，周健的身体一直很好，出国十来年从未请过病假，他经常一周工作7天，日夜操劳。在回国的前一个月，周健还整天坐着写基金申请书，写完后还说自己怎么感觉这么累。孙小依劝丈夫休息一下，就先不要回国了，但他还是坚持回去了。而这一走，便是天人永隔。可以说，周健是用自己的生命在做研发。我们也应该要记住这位为了全世界妇女的健康苦心研究20载，并作出了杰出贡献的中国科学家，他不该一直籍籍无名。03/ 从此，世界有了预防宫颈癌的“武器”当然，HPV疫苗的研究也未因此停止。在周健去世后，弗雷泽选择了和默沙东一起合作开发HPV疫苗。他们首先选择了HPV-16作为研发目标，采用周健发明的实验技术，研究人员成功地在酵母细胞中重组和表达了衣壳蛋白L1，并使其聚集成病毒样颗粒。目前已经鉴定出的HPV型别超过200种，且其各自产生的抗体并不一定相互兼容，及一种抗体可能只能预防对应型别的HPV。HPV型别可分为高危型和低危型，其中至少有18种高危型HPV是与99%的宫颈癌的发生相关。而默沙东选择了HPV-6、HPV-11、HPV-16和HPV-18这四个型别同时作为抗原，研发四价的HPV疫苗。在经过不断优化，通过遗传工程，在酵母细胞中将上述四个HPV型别的衣壳蛋白L1重组表达出来，纯化后自动组装成各自的病毒样颗粒后，默沙东成功研制出了世界上首个四价HPV疫苗。历经25年的共同研究，这支全球首款HPV疫苗终于在2006年问世。澳大利亚免疫学家弗雷泽和已故中国科学家周健在这其中起着关键性作用，这是他们的共同成果。当然，这一成果亦离不开已故的豪森教授在前的铺路。可以说，这是一支用生命换来的癌症疫苗。图为2006年8月28日，在澳大利亚昆士兰州，世界第一支宫颈癌疫苗接种时的周健之子周子晞和伊恩·弗雷泽教授（来源：《英才济苍生》）也是在这一年，弗雷泽教授获得了“年度澳大利亚人”称号，但在随后的采访中，他哽咽地提到周健，称他一生中最遗憾的事，就是没能与伙伴一起见证他们的研究成果真正造福世人。同时，弗雷泽也肩负起了一份特殊的使命：将HPV疫苗推广到伙伴的祖国——中国。癌症向来让人绝望，宫颈癌就是其中一种，它每年带走全球30万人的生命。根据国家癌症中心发布数据显示，我国每年新发宫颈癌病例10万人，因宫颈癌死亡病例超过3万人。但从2006年起，世界有了预防宫颈癌的“武器”。纵观人类历史，我们从来未像现在这样幸运，拥有消除一种癌症的工具、能力和决心。截至今日，已经有一百多个国家的人民受益于宫颈癌疫苗。WHO在2020年发布的《加速消除宫颈癌全球战略》中也表示，到2030年要实现下列目标，将使所有国家走上消除宫颈癌的道路：（1）90%的女孩在15岁之前完成人乳头状瘤病毒疫苗接种；（2）70%的妇女在35岁和45岁之前接受高效检测方法筛查；（3）90%确诊宫颈疾病的妇女得到治疗（90%癌前病变阳性妇女得到治疗，90%浸润性癌病例得到管理）。到2050年，若是成功实施了“疫苗接种、筛查和治疗”这三项关键措施，可以减40%以上的新病例和500万相关死亡。但是，当我们在为医学的进步、为加速消除宫颈癌而欢呼时，也请不要忘记了宫颈癌疫苗的开路者以及共同发明人。感谢他们对科学的不懈追求以及为人类健康事业所做出的巨大贡献，让全球妇女免受宫颈癌病患的痛苦。希望他们的精神能一直被传承和发扬下去，他们的使命也被一代代年轻的科学家们所继承。最后，谨以此文纪念并致敬这些医学英雄，也愿逝者安息！参考资料1、HPV疫苗之父逝世：研究曾遭同行讥笑，他用10年逆天翻盘，拯救全球女性（生物学霸）2、纪念HPV疫苗之父：因为他，人类首次有底气“彻底消灭”一类癌症3、一苗难求的HPV疫苗，是怎么发明出来的？（学术经纬）4、《新药的故事》,梁贵柏,译林出版社,2019-07.5、《张文宏说传染》,张文宏,中信出版集团,2020-08.6、《英才济苍生——宫颈癌疫苗发明者周健博士(第2版) 》,粟明鲜/瞿佳,人民卫生出版社出版时间,2019-12.7、“无名英雄”周健：用命换来第一支癌症疫苗，不要忘了这位中国人8、请记住中国科学家周健：宫颈癌疫苗共同发明人9、中国科学家周健：宫颈癌疫苗背后的“英雄”10、宫颈癌疫苗的发明是一个温暖的故事丨遇见科学家11、中国人周健——用生命换来了世界上第一支HPV疫苗12、他发明了全人类第一个癌症疫苗，还没等到世界的欢呼却已永眠13、WHO：没有人患宫颈癌的未来：全球首次承诺消除一种癌症

导读：自2021年底出现以来，SARS-CoV-2奥密克戎变体不断进化，并产生了许多亚变体。由于高传播性和免疫逃逸特性，奥密克戎BA.2自2022年3月起在上海引起了局部爆发，导致60多万例实验室确诊感染。自2022年12月取消“零感染”政策以来，中国全国范围内的新冠肺炎感染人数激增。然而，根据储存在GISAID数据库中的序列，中国的变异组成要简单得多，在最近的COVID-19感染浪潮中只有两个主要亚变体，即BA.5和BF.7 。 https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41421-023-00569-5研究背景 01 我们之前报道过BA.1, BA.1.1, BA.2和BA.3亚系3,4，以及BA.2后代和BA.4/55逃避疫苗接种和感染诱导的中和抗体。在这项研究中，我们构建了一个假病毒(psv)面板，代表最近高频传播的奥密克戎亚变体，BA.2.75, BN.1, CH.1.1, XBB.1, XBB.1.5, BA.5, BF.7, BQ.1和BQ.1.1，以及其他一些感兴趣的突变，如BA.2.75.2, BA.2.75.6, CA.3.1, BA.5.2.7, BE.1.1.1, BF.14和BF.16。鉴于这些亚系的快速生长和不断增加的穗突变复杂性，一些研究小组已经测试了这些亚变异中的一些(6、7、8、9、10、11、12)的中和逃避。然而，全面评估加强疫苗接种或突破感染血清对所有这些不同的奥密克戎亚系的影响，特别是对中国以前(Delta和BA.2)和最近(BA.5和BF.7)波血清中和活性的独立评估，对全球公共卫生仍然至关重要。研究方法 02 我们首先收集健康成人在同源增强剂(CoronaVac)或异源增强剂(ZF2001)接种两剂CoronaVac后第14天的血清，并测试它们对这组psv的中和活性。增强组对WT (D614G)具有可检测到的中和几何平均滴度(GMTs)，但与WT相比，BA.2和BA.4/5的GMTs降低了6- 16倍。对BA.2和BA .5衍生变体的中和滴度进一步降低，CA.3.1、CH.1.1、XBB.1和XBB.1.5是最强的逃脱BA.2后代(与BA.2相比降低了4 - 8倍)。BQ.1和BQ.1.1是最强的BA.5后代(与BA.5相比减少了2 - 3倍)。通过加强疫苗接种或突破中国以前或最近的感染血清来中和Omicron亚变体我们之前报道过，在感染后第14天，BA.2突破感染显著提高了对BA.2及其衍生变体和BA.4/55的中和效价。为了确定在前几波感染的疫苗接种个体在较长时间后是否仍然保持足够的对新出现的病毒的中和效价，我们在感染后6个月收集了以前感染过Delta或BA.2突破感染的个体的血清，并检查了中和抗体逃逸的程度。对于两次灭活疫苗剂量后突破感染的血清，我们注意到与加强疫苗组相似，奥密克戎亚变体的中和效价下降趋势，并且CH.1.1, XBB.1, XBB.1.5, BQ.1和BQ.1.1显示出最强的血清逃逸，与WT相比，效力降低了约20倍。而对于BA.2突破感染个体，我们根据感染前是否接种过2剂或3剂灭活疫苗将其进一步分为两组。在这两组中，奥密克戎亚变体的中和滴度低于WT，但下降水平不如加强疫苗接种或三角洲突破感染组显著。例如，在BA.2突破感染组中，针对BA.2的中和GMTs下降了~2 - 3倍，而在加强接种或Delta突破感染组中下降了~7倍。当将BA.2突破感染与Delta突破感染(两组具有相同的2剂量疫苗接种史)进行比较时，BA.2突破感染血清对BA.2和BA.5保持较高的滴度。以及它们的一些后代病毒，这可能与Omicron和Delta变体之间的抗原差异有关。同样，CA.3.1, CH.1.1, XBB.1和XBB.1.5是最强的BA.2后代(与WT相比减少了7- 10倍，与BA.2相比减少了2.5 - 4.7倍)，BQ.1和BQ.1.1是最强的BA.5后代(与WT相比减少了6 - 8倍，与BA.5相比减少了~2倍)。我们还平行比较了不同的队列。接种强化疫苗的人只有最低的血清中和活性，对BQ.1、BQ.1.1、CA.3.1、CH.1.1、XBB.1和XBB.1.5的滴度几乎检测不到。那些在以前的波浪中接种并感染了Delta或BA.2变异的人在感染后6个月仍然对不同的欧米克隆亚变异保持明显的活性。研究成果 03 中和活性最高的是在中国最近的一波疫情中接种过BA.5或BF.7病毒并感染过的人，这可能是由于BA.5或BF.7病毒与新出现的病毒具有较高的抗原相似性，以及感染后采集样本的时间较短。仅加强疫苗接种组的大部分血清的中和抗体滴度低于我们的检测阈值，特别是BQ.1, BQ.1.1, CA.3.1, CH.1.1, XBB.1和XBB.1.5亚变体。然而，来自Omicron突破感染组的几乎所有血清的中和抗体滴度都高于我们的检测阈值，并且曲线的总体趋势向右移动进一步表明了增强的中和效力。综上所述，这些结果表明，在中国最近的疫情中接种疫苗后感染的人，至少在短时间内，应该对主要流行的SARS-CoV-2病毒具有中和活性。为了可视化和量化WT和Omicron亚变体之间的抗原距离，我们利用所有第14天的血清中和结果构建了抗原图。虽然一些Omicron亚变体，如BA.4/5、BA.5.2.7、BE.1.1.1、BF.14和BF.16倾向于聚集在一个簇中，但CA.3.1、CH.1.1和BQ和XBB亚变体在抗原性上偏离了BA.2和BA.4/5。根据每个抗原单位相当于病毒中和性差异的两倍，BQ.1.1对血清中和的抗性比WT高约12倍，而CH.1.1和XBB.1.5对血清中和的抗性比WT高约20倍，这引起了人们对抗原漂移如何影响疫苗在现实世界中的有效性的关注。继续保持警惕并持续支持开发具有广泛保护作用的最新疫苗是非常重要的。参考资料：https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41421-023-00569-5识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。