TRAF3

01OX40/OX40L概述OX40/OX40L 相互作用在炎性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤以及移植免疫的发生、发展中起非常重要的作用。近年来，此研究越来越受到国内外学者的关注。OX40又叫做CD134、ACT35、TNFRSF4，于1987年首次在激活的老鼠CD4+ T细胞上被发现，属于TNFR超家族的一员。OX40基因和其它几个TNFR家族的分子(TNFR2, 4-1BB, HVEM, CD30, GITR, DR3)成簇的排列在人的1号染色体上。OX40是一个由249个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其中49个氨基酸在细胞质内，186个氨基酸在胞外区域。OX40包含了具有三个全半胱氨酸结构域（CRD）和一个部分C端CRD。图1.OX40结构展示，包含3个完整的CRD，一个残缺的CRDOX40主要在活化的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞上表达，而在NK细胞和NKT细胞上的表达水平相对较低。OX40L也称为CD252、TNFSF4、CD134L或gp34,是OX40的配体。是一种II型糖蛋白，具有23个氨基酸的胞质尾巴和133个氨基酸的胞外结构域。作为TNF超家族的一员，它以三聚体的形式表达。OX40L主要表达于抗原呈递细胞（APCs），如B细胞和树突状细胞。与TNF家族的其他成员类似，OX40信号通过TNF受体相关因子(TRAF)进行转导。OX40 信号在体内通过TRAF2 和 TRAF5以及在体外通过TRAF1、TRAF3 和 TRAF5转导至 T 细胞。OX40和OX40L的表达受到多种因素的调控。图2.表达 OX40 / OX40L 的人类细胞OX40通过TCR、CD28/CD80、CD40/CD40L等信号在T细胞上诱导表达，并在T细胞激活后的48-72小时达到峰值。TCR信号传导可以启动多种细胞上OX40的表达，CD28和其他细胞因子可以进一步促进其在活化的T细胞上的表达。也有报道称，IL-2、IL-4和TNF可以增强或延长OX40的表达。IL-2、TNF-α和IFN-γ在非酒精性脂肪性肝炎动物模型的肝组织中高表达，但只有外源性IL-2刺激才能上调CD4+ T细胞上OX40的表达。OX40L主要在抗原递呈细胞（APCs）上表达，APC在接触抗原后的1-3天内可以检测到OX40L的表达。通过Toll样受体传递的CD40信号和炎症信号可诱导抗原提呈细胞（APCs）上OX40L的表达。IL-18、IFN-g、胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）、前列腺素E2等因子也能促进OX40L的表达。除在活化B细胞、树突状细胞（DC）和巨噬细胞等专业APCs外，OX40L也在NK、肥大细胞及平滑肌细胞和血管内皮细胞上表达。02OX40/ OX40L信号通路OX40-OX40L信号通路的生物学作用是增强T细胞受体（TCR）对T细胞的激活信号。图3. OX40/OX40L 相互作用模型缩写：Th2（辅助性T细胞2）、NK（自然杀伤细胞）、TCR（T细胞受体）、MHC（主要组织相容性复合体）、APC（抗原提呈细胞）OX40L是三聚体，每个OX40L与三个OX40分子结合。OX40/OX40L信号可通过PI3K-PKB/AKT、活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）和 NF-κB等途径启动下游系列信号途径。OX40/OX40L信号对这些途径的持续激活导致部分抗凋亡B淋巴细胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族成员（如 Bcl-xL、Bcl-2 和 Bfl-1）及调节细胞分裂分子上调，从而介导细胞因子及T细胞活化和增殖。OX40/OX40L 存在逆向信号转导，其逆向信号可通过调节胞内游离钙离子水平参与内皮细胞中基质金属蛋白酶 9（matrix metalloprotein 9，MMP-9）表达调控 。此外，OX40/OX40L 的逆向信号则能促进 DCs成熟及B细胞活化，并促进生发中心（Ger-minal centers，GCs）形成和 DCs 分化成熟，使B细胞产生高效价抗体及抗体类别转换。图4.OX40下游信号通路吉满生物根据市场需求和研究现状，推出OX40/OX40L过表达稳定细胞系/抗体/蛋白相关产品及服务（详细数据见文末），可用于抗体筛选、表征、一致性评价, 充分满足药物研发的需求，助力抗体药物临床申报。（咨询吉满客服联系同微信：18916119826）03OX40与疾病治疗癌症OX40信号可以促进CD4和CD8T细胞的存活，维持BCL-XL、BCL-2和survivn等抗凋亡蛋白的表达，增强细胞因子的产生，如IL-2、IL-4、IL-5和IFN-γ，增强肿瘤特异性效应T细胞的免疫应答，并增强肿瘤特异性记忆T细胞的产生。尽管OX40的研究结果很有希望，但单药并不足以治疗所有癌症类型或所有患者。通过小鼠模型研究表明，抗OX40与其他单克隆抗体、化疗药物和细胞因子联合使用相比单药疗法显示出了更高的治疗效果，因此为临床开发提供了鼓舞人心的方向。自身免疫性疾病与炎症自身免疫性疾病是OX40的重要应用领域。OX40通过与与OX40L结合导致T细胞活化以及效应功能增强。OX40/OX40L阻断可改善自身抗原特异性T细胞反应并降低自身免疫性疾病中的免疫活性。因此，阻断 OX40/OX40L通路对于治疗自身免疫性疾病具有重要意义。临床试验和动物模型已经证明阻断OX40或OX40L可以对自身免疫性疾病起到治疗作用，包括EAE、SLE、RA、结肠炎、AEU、1型糖尿病、多发性硬化、移植物抗宿主病（GVHD）和炎症性肠病（IBD）。另外，OX40L通过激活OX40信号通路，促进Th2等辅助性T细胞的活化，从而促进炎症的发生。因此，OX40和OX40L也有望成为特应性皮炎（AD）等治疗的一个新靶点。04OX40相关药物进展目前欧美以及国内的相关药企均已涉足该靶点药物研究，全球范围内，其中已有多款药物进入临床阶段，最快的已经进入3期临床。​点击图片上滑查看更多rocatinlimab（AMG 451/KHK4083）中国药物临床试验登记与信息公示平台官网公示，安进（Amgen）启动了三项国际多中心3期临床试验，以评估rocatinlimab（AMG 451）不同治疗方案治疗中度至重度特应性皮炎（AD）成人和青少年受试者的有效性、安全性和耐受性。公开资料显示，rocatinlimab是一种创新的全人源化抗OX40单克隆抗体，安进通过与协和麒麟（Kyowa Kirin）达成一项高达12.5亿美元的合作，以共同开发和商业化该产品。 Amlitelimab2023年11月14日、12月25日，赛诺菲陆续在Clinicaltrials.gov网站上注册了OX40L抗体Amlitelimab治疗中至重度特应性皮炎的两项三期临床，于2024年上半年启动，分别计划入组420例患者，预计2025年9-10月完成。BGB-A445百济神州OX40抗体新药BGB-A445，启动临床二期，联合治疗招募PD-（L）1治疗失败的非小细胞肺癌患者。IBI3562023年12月25日，据CDE临床试验登记与信息公示平台，信达生物OX40L单抗 IBI356 启动临床，用于特应性皮炎。这是国内首款获批临床的OX40L单抗。IMG-0072023年8月21日，创想生物宣布了其产品OX40抑制性抗体 IMG-007的I 期研究的顶线结果。在这项研究中，IMG-007表现出良好的安全性，IMG-007组未见比安慰剂组更高比例的特别不良事件（除了无剂量相关性的一些孤立 COVID-19病例），没有受试者报告任何与治疗相关的不良事件。重要的是，未报告发热或寒战事件。IMG-007是一种人源化IgG1单克隆抗体，能特异性地结合OX40受体，并阻断OX40和OX40L之间的信号转导。因其Fc区经过了生物工程改造，具有更长半衰期并没有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应，可以消除ADCC所导致的潜在安全风险。目前，使用OX40靶向药物的临床试验最大的挑战是它作为单药或与ICB联合使用时的安全性。OX40/OX40L新药研发纵然有很多艰难挑战，但也很难阻挡研发热情。近两年制药巨头纷纷布局OX40领域，期待未来能够有更多的优秀产品问世。吉满生物助力药物研发，自主设计并开发了一系列稳定表达OX40/OX40L细胞系以及一系列高特异性、高灵敏性OX40/OX40L单克隆抗体。除此之外，吉满生物还可提供高活性OX40/OX40L重组蛋白，涵盖多种不同的功能Domain以及多个种属的蛋白产品，可满足客户在动物免疫、抗体筛选以及表位鉴定等不同场景中的需求，所有产品均已通过严格的质量监测。数据展示（部分）01蛋白相关数据验证GM-83111RP：Human OX40L Protein; His Tag02功能细胞系生物活性验证GM-C30855 H_OX40 Reporter Cell Line03表达细胞系流式验证用心做好细胞，为更好的靶向药吉满生物科技（上海）有限公司，是位于上海浦东的一家以创新为驱动的工程化细胞系研发公司，基于自有的国内最大报告基因平台、慢病毒平台以及最迅速的药研网资讯平台。目前，已构建出700余株现货单克隆细胞系产品，覆盖ROR1/DLL3/SLC39A6/TROP2/BCMA/BDCA/TREM2……200余新药热门靶点，其中有100余靶点开发有对应luciferase reporter方法，更有国内独家/首家CCR8, BDCA, TREM2和GAPR等luciferase的assay平台。参考资料https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.2147/OTT.S214211https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.3389/fimmu.2021.670637doi：10.1615/critrevimmunol.v29.i3.10https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1136/esmoopen-2019-000573doi:10.1016/j.molimm.2017.01.006

Toll样受体(TLR)在触发先天性和适应性免疫反应中发挥着至关重要的作用。它们不仅启动先天免疫反应，而且还是先天免疫和适应性免疫之间的重要连接器。 Toll样受体(TLR)可分为十个，除了TLR10与其他不同，被认为是Toll样信号传导的免疫调节剂。特异性免疫可分为四类，涉及不同的TLR组合。BiomedicinesTH1免疫反应TH1免疫反应是对抗细胞内细菌、原生动物和真菌的宿主免疫反应，涉及的免疫细胞包括M1样巨噬细胞、产生IFN-γ的CD4+ T细胞、细胞毒性CD8+ T细胞和iNKT1等。Biomedicines涉及TH1免疫通路的自身免疫性疾病包括1型糖尿病、多发性硬化症、接触性皮炎和结核病等。关键TLR：TLR7、TLR8和TLR9这三者都位于巨噬细胞的内体区室中。TLR7、TLR8 和 TLR9对应的配体分别是单链RNA、细菌核糖体RNA和未甲基化的CpG DNA寡核苷酸。这些配体是在巨噬细胞吞噬溶酶体中细菌或原生动物的消化过程中产生的。TLR7、TLR8和TLR9主要的信号通路涉及IRF5和IRF7，它们上调IL-12和IFN-γ等下游靶标。TLR8信号转导激活IRF5，而TLR7/9信号转导激活IRF7。TLR7和TLR9首先激活MyD88复合物，包含TRAF3、TRAF6、IRAK4、IRAK1、IKKα、OPNi 和 DOCK2等等。其激活顺序为：TLR7通过激活MyD88从而首先激活IRAK1，再影响IKKα，使其触发转录因子IRF7。IRF7也可以被IRAK1磷酸化。TLR8则通过激活MyD88首先激活TAK1，再影响IKKβ。TAK1还可以激活下游分子JNK。当IKKβ易位到细胞核中时，它会触发转录因子IRF5。IRF5和IRF7的协同作用以产生IL-12，从而引发TH1反应，上调IFN-γ。TH2免疫反应TH2免疫反应是应对寄生虫的免疫反应，分为TH2a和TH2b。TH2a涉及炎性嗜酸性粒细胞、产生IL-4/5的CD4 T 细胞、具有类胰蛋白酶活性(MCt)的肥大细胞、iNKT2细胞和IgG4 B细胞。BiomedicinesTh2b则涉及嗜碱性粒细胞、产生IL-13/4的CD4 T细胞、具有类胰蛋白酶/糜酶活性的肥大细胞(MCtc)、iNKT2 细胞和产生IgE的B细胞。BiomedicinesTH2免疫与1型IgE相关的过敏性疾病密切有关，如哮喘、过敏性鼻炎和特应性皮炎等。关键TLR：TLR1、TLR2和TLR6TLR2和TLR6在嗜碱性粒细胞或肥大细胞等APC的表面上表达。TLR2可以在细胞表面与TLR6或TLR1形成异二聚体，共同识别三酰基脂蛋白，从而触发MAL接头分子，其激活MyD88非依赖性通路，产生IL-4，触发TH2免疫反应。TLR2-TLR6异二聚体则激活下游PI3K和AKT通路。TLR2激活导致TPL2(MAP3K8)被激活，继而通过IKK2介导激活NFκB通路。TPL2还激活MEK1/2和ERK1/2信号转导，从而触发TH2免疫通路。除了IL-4之外，依赖TLR6而上调的IL-25和依赖TLR1/TLR6的IL-33也是驱动TH2免疫反应的关键细胞因子。Th22免疫反应Th22免疫代表宿主针对细胞外细菌、原生动物和真菌的免疫反应。涉及中性粒细胞N1、分泌IL-22的Th细胞、iNKT17细胞和IgG2 B细胞。BiomedicinesTH22主导的免疫通路与3型免疫复合物超敏反应有关，包括阿瑟氏反应和类风湿性关节炎等疾病。关键TLR：TLR2、TLR4和TLR5与TH22免疫通路相关的主要TLR是TLR2、TLR4和TLR5，在中性粒细胞、树突状细胞和单核细胞/巨噬细胞的表面表达。TLR2同型二聚糖可识别革兰氏阳性细菌细胞壁中的肽聚糖和脂磷壁酸，同时还与真菌细胞壁中的β-葡聚糖相互作用。TLR4则负责识别革兰氏阴性菌细胞壁中的 LPS 内毒素。此外，TLR5可识别在运动细菌中发现的鞭毛蛋白。TLR4 信号转导触发MyD88、IRAK1和IRAK4组成的复合物。IRAK4激活IRAK1导致IRAK1自磷酸化及其与MyD88复合物的解离。随后，IRAK1 与泛素结合酶UBC13和UEV1A结合，促进TRAF63/TAK6复合物的泛素化。IRAK1的激活也会诱导TAK1和TRAF6激活，诱导下游NFκB易位到细胞核中，从而触发炎症基因的表达，上调IL-1、IL-6和TNF-α。此外，TAK1激活也导致转录因子AP1依赖于MAPK的激活。Thαβ免疫反应THαβ免疫是宿主针对病毒和朊病毒等传染性分子的免疫反应，涉及NK1细胞、分泌IL-10的CD4 T细胞、iNKT10细胞、CD8 T细胞和IgG1 B细胞。BiomedicinesTHαβ 免疫与2型抗体依赖性细胞毒性超敏反应有关。涉及THαβ免疫通路的自身免疫性疾病包括Graves病、重症肌无力和系统性红斑狼疮等。关键TLR：TLR3、TLR7和TLR9TLR3、TLR7和TLR9主要在浆细胞样树突状细胞的内体区室中表达，内体区室为病毒和 TLR 之间的相互作用提供了理想的环境。TLR3可识别病毒复制过程中产生的dsRNA，而TLR7可检测该阶段也存在的ssRNA。TLR9则可识别在细菌和病毒基因组中未甲基化的CpG DNA。涉及TLR3、TLR7和TLR9的信号通路汇聚在IRF3和IRF7上，启动下游1型IFN信号通路，从而启动THαβ免疫应答。激活后，TLR3直接触发TRIF-IRF3信号通路，TLR7和TLR9激活IRAK1-IRF7信号通路。TRIF-IRF3信号通路触发涉及TRAF3、TBK1和IKKε的级联反应。另一方面，TLR7和TLR9激活MyD88通路，通过IRAK1进一步激活IKKα，在细胞核激活转录因子IRF7。IRF3和IRF7均能激活IFN-α和IFN-β的产生，从而启动THαβ免疫应答。此外，IL-27和IL-10也是驱动细胞因子之一。小结TLR不仅可以通过拮抗剂来治疗自身免疫性疾病，在其他领域也有应用。例如TLR激动剂可用于触发宿主对癌症的免疫反应，诱导癌细胞凋亡，从而作为肿瘤治疗的辅助药物。在疫苗开发中，配方里增加TLR激动剂也可以加强疫苗对致病原的效力。参考文献：1.Chu, Y.-T.; Liao, M.-T.; Tsai, K.-W.; Lu, K.-C.; Hu, W.-C. Interplay of Chemokines Receptors, Toll-like Receptors, and Host Immunological Pathways. Biomedicines 2023, 11, 2384. https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.3390/biomedicines110923842.Jang YH, Choi JK, et al.House Dust Mite Increases pro-Th2 Cytokines IL-25 and IL-33 via the Activation of TLR1/6 Signaling. J Invest Dermatol. 2017 Nov;137(11):2354-2361. doi: 10.1016/j.jid.2017.03.042.

导读：不受控制的病毒复制和过度炎症是感染病毒的宿主死亡的主要原因。因此，抑制细胞内病毒复制和先天细胞因子的产生是宿主对抗病毒感染的关键策略，需要微调以消除病毒，同时避免有害炎症。调节病毒复制和随后先天细胞因子产生的E3连接酶仍有待充分表征。7月4日，浙江大学医学院免疫学研究所、中国医学科学院北京协和医学院、海军医科大学、南开大学曹雪涛院士在《Cell Death & Disease》上发表题为“E3 ligase HECTD3 promotes RNA virus replication and virus-induced inflammation via K33-linked polyubiquitination of PKR”的研究论文，结果表明，一旦发生药理学抑制或降解，HECTD3是同时抑制RNA病毒复制和病毒诱导的炎症的潜在治疗靶点。https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41419-023-05923-9研究背景 01 PKR 是一种由 551 个氨基酸组成的蛋白质，包含一个 C 端激酶结构域和两个 N 末端双链 RNA 结合基序 （dsRBM）。dsRNA分子通过dsRBM被PKR识别，并导致PKR二聚化和自磷酸化，代表其激活。除了通过EIF2α磷酸化抑制蛋白质翻译外，PKR的激活还通过NF-κB，P53和FADD/caspase8信号调节炎症，细胞增殖和细胞死亡，从而在体内平衡调节中发挥关键作用。然而，PKR的激活如何通过翻译后修饰特别是泛素化来调节尚不清楚，需要进一步阐明。蛋白质的泛素（Ub）修饰在免疫反应的调节中起关键作用。E3连接酶介导底物蛋白的泛素化，导致这些蛋白的功能发生变化。据报道，几种E3在先天抗病毒反应中起着至关重要的作用，但它们在抗病毒信号传导中的重要性仍有待进一步研究。例如，据报道HECTD3催化TRAF3的K63连锁多泛素化，从而促进TRIF/STING介导的先天抗菌和抗致病DNA免疫反应。然而，目前尚不清楚HECTD3是否在抗致病性RNA反应中起作用，或者HECTD3是否介导K63连接的多泛素化和TRAF3以外的底物在先天免疫应答中的泛素化。研究进展 02 我们发现VSV感染后小鼠腹膜巨噬细胞中HECTD3的mRNA和蛋白质水平下调。然后我们研究了其潜在的机制，发现HECTD3的蛋白质水平在放线菌素D（ActD，一种转录抑制剂）的存在下也有所降低，并且该过程不受VSV感染的影响。当MG132用于抑制蛋白酶体介导的蛋白质降解时，HECTD3的量逐渐增加，而该过程被VSV感染逆转。这些结果表明，VSV主要抑制HECTD3在转录水平上的表达，而不是蛋白酶体介导的降解。在功能上，我们发现Hectd3敲低（KD）抑制VSV感染诱导的IL-6和IFNβ的mRNA和蛋白质水平。HECTD3缺乏会损害RNA病毒诱导的先天细胞因子产生并抑制病毒复制为了进一步研究HECTD3在先天抗病毒免疫反应中的作用，我们建立了Hectd3敲除小鼠。研究表明，HECTD3在抗RNA病毒和抗DNA病毒复制反应中发挥了抑制或促进作用。通过测量感染早期细胞表面或细胞内的病毒载量，我们发现HECTD3不影响病毒粘附或进入巨噬细胞的数量。此外，我们验证了Hectd3−/− L929成纤维细胞中的抗RNA病毒作用，并且还发现敲低HECTD3抑制IL-6和IFNβ的产生，可以抑制一旦感染GFP-VSV的人单核巨噬细胞THP-1细胞中的病毒复制。因此，我们假设HECTD3选择性地促进RNA病毒复制和随后病毒诱导的炎症先天反应。HECTD3缺乏会损害先天反应并限制病毒在体内的繁殖我们进一步研究了HECTD3的体内效应。腹腔注射VSV后，我们发现Hectd3−/−小鼠的存活时间明显长于Hectd3小鼠，Hectd3+/+-/−小鼠血清IL-6和IFNβ水平以及肺和肝脏中的病毒滴度显著低于Hectd3小鼠。此外，我们观察到Hectd3 + / ++ - / - - 小鼠在肝脏中的CD45细胞浸润比Hectd3小鼠更少。这些数据表明，HECTD3缺乏保护小鼠免受RNA病毒复制和病毒诱导的炎症。研究结论 03 宿主通过抑制病毒复制和产生炎性细胞因子、干扰素来消除RNA病毒感染，并且必须微调这两种宿主防御反应，以避免病毒传播和致命炎症。在这项研究中，我们提供了体外和体内证据，证明HECTD3在促进RNA病毒复制和病毒诱导的炎症中的关键作用。我们的研究结果表明，HECTD3缺乏可以加速病毒清除，同时抑制病毒诱导的炎症。此外，HECTD3抑制PKR的抗复制能力，但通过泛素化促进PKR对RNA病毒的促炎功能。这些结果表明，一旦发生药理学上抑制或降解，HECTD3将成为控制RNA病毒感染和病毒诱导的炎症损伤的潜在靶标。参考资料：https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41419-023-05923-9