六个维度分析CAR-NK进展缓慢的原因

2023-05-16

细胞疗法免疫疗法基因疗法临床研究

CAR-NK一度货真价实的火热过。但是临床推进好像并不像它的目标CAR-T一样顺利。六个维度问题CAR-T的经验依然值得CAR-NK借鉴，但是机制带来的差异也需要解决。（1）病毒载体与转导选择目前被批准用于商业用途的CAR-T产品都是使用慢病毒或逆转录病毒载体转导生产的，由于GvHD的风险，仅用于自体使用。其中，水疱性口炎病毒G蛋白(VSV-G)慢病毒是生产CAR-T细胞最常用的伪分型受体。与逆转录病毒载体相比，基于慢病毒的转导更安全，因为它具有较低的遗传毒性和插入诱变。但原代NK细胞中慢病毒转导的效率较低，通常需要多轮转导。同时，CAR-NK的GvHD风险很小。但是，其低密度脂蛋白受体的表达水平也很低，而这是VSV-G的主要转导受体。因此需要选择NK转导特异性的载体。目前认为狒狒包膜伪型慢病毒载体(BaEV-LV)可显著提高NK细胞的转导效率。此外，通过类病毒颗粒运送CRISPR基因组编辑成分也逐渐成为热门的方法。转导CAR和基因敲除可以共同进行。Mol Ther Methods Clin Dev.电穿孔和脂质转染等转染方法也被用于将外源基因递送到NK细胞中。目前著名的转座子系统包括PiggyBac和睡美人等。与病毒转导相比，NK细胞的转染与转基因的表达更快，细胞凋亡水平更低，个体间变异性更小，基因转移效率更高有关。不过，转座子系统在转导原代NK细胞中的适用性仍需要进一步修改，以克服转导效率低和质粒DNA电穿孔对NK细胞的细胞病变效应等问题。（2）持久性CAR-NK细胞持久性不如CAR-T是临床试验中NK细胞疗法临床疗效有限的原因之一。目前认为，短期接触IL-12、IL-15和IL-18可产生持续时间更长的记忆样NK细胞。临床前预处理也是CAR-NK实际应用中持久性的影响因素之一。通常，在接受CAR-NK治疗之前使用氟达拉滨/环磷酰胺的组合，以减少宿主对NK细胞的排斥反应，重新编程免疫抑制的TME，并降低肿瘤负担。剂量上，在过继转移未经修饰的NK细胞疗法之前，高剂量方案能够更好地使体内NK细胞的扩张和持久性满足需求，而低剂量方案不能。不过，持久性要到什么程度才合适？是越长越好吗？也不尽然。目前认为，仅需要在特定的肿瘤中强调增强NK细胞的持久性。CAR-T的经验表明，在比如淋巴瘤等类型中，患者可以在不延长CAR-T持续时间的情况下产生持久的反应。这或许是CAR-NK可以借鉴的。到目前为止，优化NK细胞CAR结构的目标大多集中在提高细胞毒性上，而非持久性。CAR-NK的低免疫原性还使其能够通过多次给药来弥补持久性问题。（3）迁移能力traffickingCAR-T改善其迁移能力的途径包括：通过CAR设计表达趋化因子受体、联合给药、改变给药途径等。这三种策略对CAR-NK都有用。NK细胞本身在正常免疫中就使用趋化因子信号，经修饰表达CXCR2、CXCR4、CCR5或CCR7的NK细胞均被证明能增强小鼠的迁移功能，同时增强其抗肿瘤能力。但是并不影响其产生细胞毒性细胞因子的程度和NK细胞的直接肿瘤杀伤活性。Sig Transduct Target Ther.（4）营养代谢主要是针对实体瘤的适应症。在TME中，相当多的营养代谢屏障阻碍了免疫细胞发挥功能，包括：缺氧、缺乏营养、低pH值和各种代谢产物水平升高。具有优化代谢功能的CAR-T细胞产品，如有更高的氧化磷酸化，已被证明在临床上更有效。例如在CLL患者中，CD8 + T细胞在刺激后表现出受损的激活和葡萄糖摄取减少，长期暴露影响代谢稳态，导致刺激时代谢重编程异常。CLL衍生的CD8 + T细胞在受到刺激时显示出线粒体生物发生受损。Blood改善代谢的策略包括：①通过在体外扩增过程中直接操纵细胞代谢；②基因工程改造T细胞。NK细胞也适用。例如，采用mIL-21在体外扩增NK和CAR-NK细胞的研究显示：扩增所得的与富集代谢途径相关的NK细胞分化程度较低，未耗尽表型、记忆样表型的比例提高，并能抑制CAR-NK的“自相残杀”。Mol Ther Methods Clin Dev.NK细胞比T细胞或B细胞更容易受到TME中过氧化氢的影响。有研究通过基因改造NK细胞使其过表达过氧化物还原蛋白-1(PRDX1)，该细胞在氧化应激下对乳腺癌细胞显示出有效的抗肿瘤活性。Cancer Immunol Res.（5）肿瘤抗原丢失CAR-T目前的探索包括：①设计双靶点CAR-T；②不同CAR的CAR-T顺序给药；③联合溶瘤病毒给药，等等。不同于CAR-T，NK细胞本身具有内在的细胞杀伤能力，能够通过NCR、CD16、DNAM-1或NKG2D/DAP10等这些先天受体，在CAR抗原丢失或者下调的肿瘤逃逸环境中保留非CAR依赖性杀伤能力。此外，双靶点CAR-NK细胞目前也有临床前开发，例如包含具有NKG19D跨膜和2B2/CD4ζ信号结构域的CD3靶向CAR表达。Blood（6）胞啃作用(Trogocytosis)：信号传导影响、抗原丢失、自相残杀Frontiers in Immunology胞啃作用对CAR-NK功能的积极影响：NK细胞可以通过胞啃作用获得趋化因子受体，如CCR5、CXCR4、CCR7或TYRO3等。CCR7的获得也增强了NK细胞归巢到淋巴结的能力，TYRO3则提高了效应器的功能和增殖水平。胞啃作用对CAR-NK功能的抑制影响：胞啃作用也可以通过使CAR-NK获得免疫抑制蛋白来抑制其细胞毒作用。例如：在白血病环境中，NK细胞能从白血病细胞上获得PD-1；在卵巢癌中，NK细胞从卵巢癌细胞上获得CD9，抑制细胞毒作用。克服胞啃作用介导的信号传递的一种方法是使用针对目标抗原的封闭抗体。例如在卵巢癌中，有研究通过在CD9的情况下，使用CD9阻断抗体在体外恢复NK细胞的细胞毒性。Cell Rep.胞啃作用的另一个后果是靶细胞抗原丢失。虽然这已经在CAR-NK中显示出来，但它在CAR-T中得到了更多的研究。由于抗原密度影响CAR的功能，靶抗原的下调或内化可导致肿瘤逃逸。因此，克服胞啃引起的抗原丢失可以提高肿瘤的清除率。一种方法是通过调整CAR与靶抗原的亲和力。低亲和力结构被认为能在保持疗效的同时减少了胞啃作用。在CAR-T中已有临床前研究证明，低亲和力的CD19 CAR-T CD19 CAR-T能够显着限制胞啃作用，同时保持抗肿瘤活性和临床疗效。 Leukemia另一种方法是调整CAR的信号域，因为胞啃作用已被证明在不同程度上影响具有CD28或4-1BB信号域的CARs。不过这种机制的影响效果差异很大，主要取决于抗原密度。胞啃作用使抗原转移到NK细胞的最终结果是介导了NK细胞对其他NK细胞的杀伤。在内源性T或NK抗原如CD7或CD38的背景下，敲除效应细胞中的靶抗原可以克服同胞杀伤，但这种方法不适用于通过胞啃转移到效应细胞的抗原。最近一项研究使用了针对NK限制性抗原的抑制性受体KIR以及靶向肿瘤的抑制性CAR，来抑制胞啃作用并提高治疗活性。研究人员设计了一系列iCAR构建体，将抗原特异性scFv与源自关键NK细胞抑制受体(KIR2DL1)的跨膜结构域和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIMs)融合在一起。研究证实，CS5靶向iCAR选择性地阻止NK细胞抗原诱导的肿瘤上/脱靶效应，同时保留aCAR对“靶向”CD1肿瘤细胞的治疗反应。Nat Med.小结说不热门，CAR-NK在血液瘤和实体瘤中均有不少企业布局。2023年5月6日，NMPA还受理了启函生物的同种异体CD19 CAR-NK的IND申请；说热门，不少备受关注的CAR-NK产品则迟迟没能推进。例如行业先锋的Fate还在2023年1月5日宣布与强生的合作终止，同时选择聚焦开发第二代CD19 CAR-NK疗法，终止开发FT596项目。这正是表明，CAR-NK结构和设计上的迭代需求和技术都已经赶上了实际临床试验的推进进度。这也给后来的企业更多的机会，通过技术弯道超车，未尝不可实现。参考文献：Kilgour Marisa K., Bastin Donald J.,et al.Advancements in CAR-NK therapy: lessons to be learned from CAR-T therapy. Frontiers in Immunology 14 2023. doi:10.3389/fimmu.2023.1166038Jo DH, Kaczmarek S,et al.Simultaneous engineering of natural killer cells for CAR transgenesis and CRISPR-Cas9 knockout using retroviral particles. Mol Ther Methods Clin Dev. 2023 Mar 15;29:173-184. doi: 10.1016/j.omtm.2023.03.006. Xie G, Dong H,et al.CAR-NK cells: A promising cellular immunotherapy for cancer. EBioMedicine. 2020 Sep;59:102975. doi: 10.1016/j.ebiom.2020.102975. Jaco A.C.van Bruggen, Anne W. J. Martens,et al.Chronic lymphocytic leukemia cells impair mitochondrial fitness in CD8+ T cells and impede CAR T-cell efficacy. Blood 2019; 134 (1): 44–58. doi: doi.org/10.1182/blood.2018885863Yang Y, Badeti S, Tseng HC, Ma MT, Liu T, Jiang JG, Liu C, Liu D. Superior Expansion and Cytotoxicity of Human Primary NK and CAR-NK Cells from Various Sources via Enriched Metabolic Pathways. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020 Jun 24;18:428-445. doi: 10.1016/j.omtm.2020.06.014. Ruyan Rahnama, Challice L. Bonifant; Engineering builds multipotency for iPSC-NKs. Blood 2022; 140 (23): 2414–2416. doi: https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1182/blood.2022017794Hamieh, M., Dobrin, A., Cabriolu, A. et al. CAR T cell trogocytosis and cooperative killing regulate tumour antigen escape. Nature 568, 112–116 (2019).Li, Y., Basar, R., Wang, G. et al. KIR-based inhibitory CARs overcome CAR-NK cell trogocytosis-mediated fratricide and tumor escape. Nat Med 28, 2133–2144 (2022). doi:10.1038/s41591-022-02003-x