CCR5

摘要：G蛋白偶联受体（GPCRs）是最大且最多样化的细胞表面受体家族，具有广泛的配体和功能。自从1986年第一个GPCR被克隆和表达以来，我们对这个受体类别的药物发现已经学到了大量的知识，以至于现在GPCRs作为批准药物的最成功靶标类别已经得到了广泛认可。在这里，我们带领读者经历从靶标到临床的GPCR药物发现之旅，强调关键的学习点、最佳实践、挑战、趋势和洞察，这些对于发现最终在患者中调节GPCR功能以治疗的药物至关重要。GPCR药物发现的未来是鼓舞人心的，更多理想的药物机制和新技术正在使交付更好、更成功的药物成为可能。 1.引言  GPCRs是发现新药最成功的靶标之一，代表着由约821个人类基因编码的细胞表面跨膜受体的最大超家族；见的综述。实际上，据估计约34%的上市药物是GPCR功能的调节剂，而大约140个GPCR的天然配体和功能尚未被发现——所谓的孤儿GPCRs。这篇综述集中在小分子GPCR药物发现上，因为大多数GPCR药物是小分子（约92%）而不是像抗体这样的生物制剂。这种药物模式的当前偏好主要是由于历史上GPCR具有小分子天然配体的强烈记录，加上生成受体特异性生物药物的技术难度。凭借这一广泛的功能范围，GPCR药物几乎出现在所有治疗领域，特别是神经学、心血管和炎症。有趣的是，尽管通过针对免疫细胞（例如，在免疫肿瘤学中的腺苷A2AR）的GPCR药物在肿瘤学中的存在感较少，但随着新ADCs的出现和新的疾病联系，这种状况将会增加。许多专家认为，60-85%的潜在治疗性GPCR尚未被药物化。值得注意的是，对于一些批准的GPCR药物，疾病疗效是由受体多药理学驱动的，无论是设计上的（例如，用于2型糖尿病的共激动剂肽Tirzepatide）还是偶然的（例如，非典型抗精神病药Clozapine）。获得可接受的治疗窗口的正确多药理学量是一个挑战，并且在项目开始时很难预测。所有GPCRs都表现出多功能的七跨膜框架，能够容纳各种大小的配体激活受体，从小质子到大蛋白质以及不同的物理形态，从光子到蛋白酶激活。此外，GPCRs的激活是通过许多综合生物学过程介导的，并与多种细胞功能相关联。有了这么多不同的配体和药理学，GPCRs表现出许多生理和病理生理作用，因此它们继续吸引大量的药物发现和科学兴趣。人类GPCRs被分为六个主要家族（A：视紫红质，B：分泌素，C：谷氨酸，D：真菌，E：cAMP和F：Frizzled），其中视紫红质（Class A）家族是最被研究的（94%的GPCR药物）。大多数GPCR药物要么是拮抗剂要么是激动剂（分别为53%和42%），但越来越多有利的、精细的模式，具有改进的GPCR选择性，如负性和正性异构调节剂（NAM和PAMs）和偏置配体在临床上越来越受到关注。这篇综述将突出从靶标验证到临床的现代GPCR药物发现的关键方面（见图1）。每个方面都将由相关的案例研究、挑战和最新的知识支持，然后是对这一激动人心的药物发现领域的未来展望的总结性思考。在发现阶段开始时，候选GPCR药物靶标应经过严格的评估，以确定药物靶标的可取性、发现项目的可行性和投资。这个过程涉及一系列考虑因素。关键要素包括靶标验证、疾病联系、靶标药物性、检测可行性、多靶标选择性和在进一步投资新药物发现项目之前的命中发现策略。图2展示了一个通用的命中发现过程，说明了所有当前可用于识别小分子化学起点的方法，但对于GPCRs来说，重要的途径是利用现有药理学的基于知识的和通过HTS的多样性筛选。尽管GPCR结构和生物物理信息正在增加并且非常理想，但通常更难实现并前瞻性地应用于药物发现。 图1. GPCR药物发现 - 从目标到临床的流程。 图2. 通用的候选药物发现流程。 在介绍了一般的药物发现过程和GPCR特定的命中发现方法之后，我们将进入更详细的部分，涵盖HTS、定义药物功能的检测、机制和驱动DMTA（设计-制造-测试-分析）周期的检测，GPCR蛋白表达，生物物理学，GPCR结构信息的洞察，作为进入药物和计算化学的过渡，最后是关于新兴GPCR药物的后期转化生物标志物和临床方面的部分。总之，这篇综述将探讨GPCR药物发现科学和疾病理解如何预测发展，推动新靶标、概念和有价值的药物模式，以识别更好的药物治疗。GPCR药物发现继续是一个生产力很高的新药领域（例如，2021年批准的首创C5a受体拮抗剂Avacopan用于治疗血管炎）。随着最近的趋势，如用于治疗抑郁症的迷幻剂和新的模式如偏置激动剂，这一靶标类别的新药物发现的未来看起来很有希望。 1.1.HTSHTS是一种用于快速识别药物发现活动起始分子的方法，在这种方法中，成千上万的化合物被筛选针对一个目标。一个成功的HTS活动需要显著的基础设施，包括一个高质量的结构多样化小分子库和多个科学学科的整合，包括药物化学、计算化学、信息学和生物学。HTS检测必须经过良好的验证，以确保它们高度可重复、稳健、低成本，并与检测自动化兼容。GPCRs历来是HTS活动最受欢迎的目标之一。对GPCR HTS的需求随时间波动；然而，近年来，GPCR HTS数量增加的趋势显著。GPCR HTS活动最常用的方法涉及研究受体激活下游的细胞内事件。例如，这些方法测量第二信使，如Ca2+、cAMP（环磷酸腺苷）、pERK（磷酸化细胞外信号调节激酶）和IP1（肌醇一磷酸）、基因表达报告基因，以及β-arrestin对GPCR的招募。 现在有许多HTS兼容的检测技术可用于测量这些GPCR第二信使。HTRF（均质时间分辨荧光）和AlphaScreen非常适合HTS，以均质格式产生一致的高质量数据，信号和试剂稳定性令人印象深刻，与检测自动化兼容，并且可以扩展到384和1536孔格式。一个很好的例子是Myers等人在2020年使用的‘cAMP Gs动态试剂盒HTRF®’检测，用于识别 apelin 受体的小分子激动剂。有许多其他方法可用于测量GPCR第二信使，包括最近用于从超过300,000种化合物筛选中识别35种选择性、反向激动剂GPR3的GloSensor™ cAMP检测。 测量细胞内钙瞬变是HTS Gαq偶联GPCRs的常用读数。FLIPR系统（Molecular Devices）和Hamamatsu Photonics FDSS仪器是细胞内钙测量的行业领先技术。这些技术利用敏感的钙染料来测量细胞内钙的变化。还有许多其他基于钙的筛选方法可用，包括最近开发的适用于CCR6受体的HTS兼容钙动员检测，该检测使用己糖胺酶活性作为荧光读数。 有几种HTS兼容的方法可用于测量β-arrestin GPCRs的招募，但需要修改GPCR C-末端，这可能会干扰受体的活性和信号。在2021年，Hauge Pedersen等人开发了一种名为‘MeNArC’的基于发光的β-arrestin招募检测，不涉及修改GPCR。该方法利用了一种新型NanoLuc分裂，其中N-末端NanoLuc片段‘MeN’锚定在膜上，C-末端NanoLuc片段‘ArC’与β-arrestin融合。这种方法尚未用于HTS，然而，初步数据表明这种方法将适合于未来GPCRs的HTS。 无细胞筛选纯化的GPCRs具有减少非靶标效应的优势。然而，以足够的规模为HTS生产纯化的重组膜蛋白在生物学上相关的构象已被证明具有挑战性，并限制了在无细胞环境中筛选GPCRs的能力。尽管如此，有几种无细胞HTS兼容的筛选方法可用，例如用于筛选神经肽受体1型（NTS1）配体的无细胞荧光偏振检测。质谱是一种常用的技术，用于识别蛋白质-配体相互作用，并已成功用于近年来的许多GPCR HTS活动中。在2019年，Lu等人使用亲和质谱筛选识别了A2A腺苷受体的三种新拮抗剂。随后，他们在2021年使用类似的方法识别了腺苷A2A受体的NAM。 在某些情况下，传统的高通量筛选（HTS）化合物库已被DNA编码的化合物库（DELs）所取代，因为它们允许并行亲和筛选更多的小分子。DELs非常庞大，包含超过10^8个小分子，所有这些小分子都共价连接到一个独特的DNA条形码上。DNA标签充当条形码，可以通过读取来确定每个击中目标的小分子的身份。GPCR与DEL库一起孵育，通过亲和筛选鉴定与受体结合的化合物，然后放大并测序DNA标签。最初，DEL筛选仅限于可溶性蛋白靶标，但最近，DEL筛选已适应于膜受体，并于2015年首次被Wu等人用于筛选GPCRs，以鉴定NK3 tachykinin受体的拮抗剂，并为未来的GPCR HTS提供了一个有希望的方法。 除了筛选GPCRs的小分子调节剂外，HTS还可以筛选GPCR生物制剂，如肽和寡核苷酸。可以使用一种称为SELEX（通过指数富集的配体顺序进化）的方法筛选GPCR的核酸适配体，该方法涉及筛选数十亿个寡核苷酸对目标受体。在2021年，Takahashi等人使用基于SELEX的筛选方法鉴定了P2RY2 GPCR的正性异构调节剂。 1.2.GPCR筛选和筛选级联 一个综合药物筛选级联的目标是量身定制以满足总体项目目标（例如，发现一种口服GPCR拮抗剂）和项目阶段（例如，HTS后早期命中验证，见图3或支持后期阶段的主导优化DMTA循环）。级联顶部的主筛选（图3）旨在快速且稳健地测量化合物以期望的机制（例如，激动剂或拮抗剂）与GPCR结合的能力，通常在HTS中开始。有许多类型的GPCR检测，但它们通常分为两类，细胞内信号终点（如HTS部分所讨论）或受体结合检测。使用放射性配体、荧光偏振或GTPγS交换技术的GPCR结合检测，历来是识别GPCR命中和直接化学的最简单和最快的方法。这些检测具有优势以及挑战和限制。例如，结合检测非常擅长提供有关药物-靶标相互作用的信息，包括配体结合的动力学和目标停留时间。然而，除非化合物结合到正性配体结合位点，否则仅用结合检测很难推断有关信号通路或功能性效力的任何信息，因此在命中识别过程的早期结合受体结合和信号检测很重要。此外，当通过测量细胞内第二信使来评估化合物的效力时，必须使用内源性细胞或疾病相关组织模型确认作用机制（MOA）和所测量的响应将预测体内所需的治疗效果。大多数基于细胞的检测使用转染了目标GPCR的HEK293或CHO细胞系。在这种人为增强的系统中，由于“受体储备”的丰富性，目标受体的分数占据可能会高估激动剂的效力和效力。 图3. 典型的GPCR高通量筛选（HTS）拮抗剂候选药物验证生物学筛选级联。 通常与主检测并行，会运行一个反筛选以排除由于检测技术干扰或通过非靶标活性在主检测中识别的不需要的假阳性命中。通常，这些反筛选测量在主筛选中使用的相同信号通路和检测技术在缺乏目标受体的情况下击中活性的细胞背景。被识别为Pan-Assay Interference compounds (PAINs)的各种化学物质经常被重复识别为假阳性。这些化合物通常显示出固有的氧化还原活性，作为分子聚集体，或可能含有活性杂质，如重金属，或具有内在的荧光猝灭特性，干扰各种筛选技术。从筛选库中识别和排除PAINs通常具有挑战性，导致在主筛选后回顾性地识别假阳性命中。PAINs表现出非典型的药理学特征，如暗示超化学计量相互作用的陡浓度-反应曲线，代表聚集行为的洗涤剂敏感性，非竞争性和/或时间依赖性，以及化学系列中平坦的结构-活性关系（SAR）。理想情况下，反筛选后会进行一个正交检测，使用与主细胞信号筛选不同的筛选技术（例如，生物物理或生化检测），以确保活性不局限于特定的检测技术，并验证化合物与目标受体的结合。大多数GPCR药物发现活动中的另一个关键问题是早期测量化合物对相关、不需要的GPCRs的选择性，因为缺乏选择性可能需要在项目中解决。通常，选择性检测被内置到筛选级联的早期，以防止非选择性命中的进展，并允许药物化学家提高选择性。在物种受体同源物上使用人等效化合物的效力和机制是理想的，以便可以评估下游优化化合物的体内药代动力学和药效学属性。因此，最初使用人等效的重组GPCR物种检测来评估命中同源GPCR药理学。此外，在内源性表达细胞或组织检测中早期测试命中化合物也弥合了在过度表达的重组目标系统中观察到的GPCR效力和效力与在主要细胞靶标（例如，中性粒细胞中的CXCR1）之间的差距。当人和动物同源物之间的序列差异更大和/或药物通过较少保守的别构位点工作时，药物功能和/或效力的物种交叉较差的情况更频繁发生，见GPR35药理学作为一个例子，导致开发转基因敲入人GPCR小鼠进行PK/PD研究的额外费用。 我们现在更仔细地看看在药物发现筛选级联中使用的不同类型的GPCR检测，包括生物物理、生化结合检测、细胞内信号、表型和MOA研究。 1.3.GPCR表达和纯化 包括GPCRs在内的膜蛋白由于其复杂的结构、低表达水平和较差的稳定性而难以在高产量下产生和分离。GPCR表达的一个主要挑战是实现足够高的表达水平，以实现结构研究或功能检测等下游应用。低表达水平通常归因于GPCRs的折叠和插入到细胞膜中，这是一个复杂的过程。此外，在某些情况下，必须存在正确的翻译后修饰。此外，GPCRs可能非常不稳定，导致展开或降解，使得难以获得用于下游应用的纯净和稳定的蛋白质样品。下面探讨了克服这些挑战的策略和技术。 1.4.GPCRs过表达的细胞系统 人类GPCRs的重组表达是生产高产量孤立受体的重要先驱步骤，使功能、生物物理和结构表征检测能够发现针对这些受体的药物。GPCRs必须在能够适当处理其特定的翻译后处理和修饰的系统中表达，包括折叠和插入到膜中以及侧链的糖基化。表达系统的选择可以显著影响所产生蛋白质的质量和产量，以及生产所需的时间和成本。 一些GPCRs已成功在大肠杆菌中表达；然而，大肠杆菌是一个在成功表达GPCR方面的非常有限的系统，因此，这些例子往往是例外或需要对蛋白质序列进行广泛的修改才能兼容。同样，也测试了无细胞表达系统用于生产GPCRs。有一些成功的无细胞表达GPCRs的测试案例；然而，这项技术通常比成功生产GPCR的其他系统更有限制。因此，不推荐在大肠杆菌或无细胞系统中表达GPCRs。人类胚胎肾（HEK）细胞系统更广泛地用于过度表达GPCRs。该系统为表达人类GPCRs提供了一个类似的环境，并允许进行功能性GPCR表达所需的适当翻译后修饰。然而，使用HEK细胞可能具有挑战性，因为使用这些细胞的成本高且复杂。 首选的GPCR过度表达方法是使用昆虫细胞系统。这种偏好从提交给蛋白质数据银行（PDB）的GPCR结构数量中可以明显看出，这些结构在Hi5、Sf9或Sf21昆虫细胞系统中表达，占总结构的三分之二。昆虫细胞是生产GPCRs的合适宿主，因为它们可以执行复杂的翻译后修饰，包括糖基化，并促进受体的正确折叠和插入膜中。与其他表达系统相比，昆虫细胞具有几个优点。它们易于大量培养，并且可以产生高产量的重组蛋白。此外，它们比哺乳动物细胞系统更便宜、更不复杂，使它们成为大规模生产GPCRs的一个有吸引力的选择。 1.5.GPCR生产的构建设计和纯化策略 设计GPCR构建用于重组表达时需要考虑各种因素。纯化策略对于确定必须添加到受体的标签很重要。此外，特定的分析技术可能需要额外的标签和融合。此外，受体的下游使用决定了构建的设计。例如，用于表面等离子共振（SPR）实验的GPCR构建的要求可能与用于X射线晶体学或冷冻电镜实验的要求不同。最后，在使用最天然的受体序列和允许蛋白质以给定应用所需的规模、质量和稳定性产生的修改之间必须进行权衡。这些修改可能包括标签、截断、删除、融合伙伴插入和稳定突变。 为了纯化GPCRs，通常需要一个纯化标签。此外，由于GPCRs的低表达产量和纯化步骤中使用的高洗涤剂浓度，高度特异性的标签比常用的亲和标签（如6xHis标签）更有利。使用组氨酸标签至少需要8xHis标签，以提供对金属亲和树脂的更多特异性。或者，通常使用FLAG标签和双链strep标签，提供更大的树脂结合特异性，从而在纯化过程中的初始捕获步骤中得到更纯净的产品。抗体偶联的树脂提供了最高的树脂结合特异性，但价格昂贵且树脂结合能力有限。因此，在选择合适的纯化标签时，必须考虑树脂结合特异性和容量之间的权衡。用于膜蛋白，特别是GPCRs的一种标签是将构建物的天然C末端替换为来自牛视紫红质C末端的1D4表位。由于这个标签源自膜蛋白的两亲螺旋，因此添加这个标签对天然表达谱的影响比人工纯化标签更低。 除了纯化标签外，还可以添加额外的序列以提高GPCR的表达和检测。例如，在GPCR序列的N末端添加可切割的流感血凝素信号序列可以帮助增加GPCR的表达水平，并为构建物的纯化或检测提供另一种选择。提高GPCR构建物检测的另一种方法是在构建物中添加绿色荧光蛋白（GFP）融合，允许直接从细胞使用荧光信号快速评估GPCR的表达。添加GFP标签还通过使用偶联到树脂的抗GFP抗体提供纯化选项。对于使用SPR（见生物物理学部分）的生物物理受体-配体研究，常见的添加标签是avi标签，这将允许使用细菌BirA酶对蛋白质进行位点特异性生物素化。如果蛋白质与BirA酶共表达或在准备GPCRs进行SPR研究期间使用纯化的BirA进行体外使用，这种标记方法将起作用。 在成功纯化后，从受体中去除额外的纯化标签是标准做法，通过在受体和纯化标签之间添加蛋白酶切割位点来实现。常用的位点包括TEV蛋白酶的ENLYFQ|(S/G)、HRV蛋白酶的LEVLFQ|GP和Factor Xa蛋白酶的IEGR|，其中“|”表示切割位点，括号中的氨基酸表示不分等位位置。这些蛋白酶具有高度特异性和效率，使它们成为流行的选择。 GPCRs往往不稳定，这可能是纯化和结构确定的主要障碍。受体一旦从天然双层环境中移除，就会迅速展开或失去活性。为了应对使用GPCRs的这一挑战性方面，通常采用的方法是引入热稳定的点突变。虽然向GPCR序列中添加突变可能不理想，但有时为了便于使用受体是必要的。通常包括功能测试，以确保所选的突变稳定，但不干扰配体结合。这些突变可能通过减少构象灵活性来稳定，将GPCR锁定在单一状态，如活性或非活性状态。将受体锁定在单一状态对于通过X射线晶体学确定高分辨率结构很重要。通过X射线晶体学解决的所有GPCR结构中有三分之二至少经过了一种稳定突变的工程改造。 已经使用了多种方法来确定膜蛋白的稳定突变。扫描突变无疑是确定稳定突变的最成功方法，其中GPCR的每个位置都突变为丙氨酸（或另一种氨基酸替代物），并使用热熔曲线测试每个突变体的稳定性。这个过程通常是迭代进行的，构建可以增加GPCR稳定性的突变组合。或者，定向进化通过随机突变也显示出在确定这些稳定突变方面的成功，其中实验负担降低，因为可以从随机突变池中选择稳定的突变。最近，计算方法，如IMPROvER和CompoMug，也已被用于通过建模、生物信息学和神经网络方法帮助预测稳定点突变。利用计算方法显著减少了劳动、成本，并提高了稳定受体构建物的识别速度，然而，选定的稳定突变仍需要通过实验验证。 抗体衍生物或纳米抗体与GPCR的结合可以稳定特定的受体构象，而无需修改天然受体序列，有助于促进高分辨率晶体结构的形成。然而，生产这类抗体工具所需的时间和努力使得这种方法不能被普遍使用。插入融合伙伴可以提供一个稳定的支架，可以增加GPCR的刚性并减少其构象灵活性。此外，融合蛋白增加的表面积可以促进晶体接触的形成，并提高晶体学实验的成功率。然而，与点突变一样，融合蛋白呈现非天然受体序列。在GPCR稳定中使用最受欢迎的融合伙伴是噬菌体T4溶菌酶和热稳定的细胞色素b562RIL（BRIL）。噬菌体T4溶菌酶是一个小而稳定的蛋白质，可以稳定包括GPCRs在内的广泛膜蛋白。另一方面，BRIL是细胞色素b562蛋白的热稳定变体，经过工程改造以提高其溶解度和稳定性。这些融合伙伴可以插入GPCR的不同位置，但最受欢迎的位置是细胞内环3或N末端。 1.6.通过溶解促进GPCRs的膜提取 GPCRs嵌入在细胞膜的脂质双层中；提取它们需要溶解。GPCRs在洗涤剂胶束中的溶解是常见的，然而，这种提取过程有缺点。在溶解过程中，大多数天然脂质从蛋白质中剥离，这可能导致不稳定或非活性的蛋白质产品。 为了克服这一挑战，建议在从膜中提取后采取特定步骤来稳定GPCRs。增加稳定性的一种方法是在前一节中介绍的向GPCR序列本身引入稳定点突变。然而，仔细选择用于GPCR溶解的洗涤剂是另一个重要的因素，可以帮助稳定蛋白质。温和的洗涤剂对GPCR的天然结构影响有限，并且在某些情况下，保留了强烈的天然蛋白质：脂质相互作用。用于结构研究的GPCR溶解最流行的洗涤剂是n-癸基-β-D-麦芽糖苷、n-月桂基-β-D-麦芽糖苷、n-壬基-β-D-葡萄糖苷和月桂基麦芽糖新戊基糖醇。此外，GPCRs通常也在胆固醇半琥珀酸存在下溶解，胆固醇半琥珀酸是一种类似胆固醇的分子，已知对洗涤剂溶解的GPCRs具有稳定作用。 虽然洗涤剂溶解法仍然是药物发现中生产GPCRs的流行方法，但新兴技术提供了一种无需洗涤剂的替代方法，用于从膜中提取蛋白质。其中一种技术是使用苯乙烯马来酸（SMA）共聚物，它们可以自组装在膜双层中，并充当“饼干切割器”，从膜中切除被称为SMA脂质颗粒（SMALPs）的蛋白质/脂质盘（图4）。使用SMALPs允许在天然环境中提取GPCRs，保留它们的结构、功能，并在不需要重新组装到人工脂质环境中的情况下进入下游检测。 根据下游检测的需求，GPCR可能需要以不同的可溶状态呈现，以确保其稳定性或与特定技术（如冷冻电镜（冷冻电子显微镜））的兼容性。所需的GPCR形式可能涉及将GPCR从其溶解洗涤剂转移到两亲聚合物或纳米盘。两亲聚合物（如A8-35或PMAL-C8）像SMALPs一样围绕GPCR形成稳定的脂质带。同样，纳米盘由自组装的膜支架蛋白（由Apolipoprotein A-1工程化）组成，它们环绕GPCR形成一个脂质盘（图4）。然而，GPCR必须在洗涤剂中溶解后重新组装到这些系统中，因为GPCR不能直接被提取到这些系统中。与SMALPs相比，这个较长的过程存在轻微的缺点，因为必须人工添加脂质，而不是利用细胞膜中的天然脂质。此外，在纯化过程中，通常需要将溶解的GPCR从一种洗涤剂胶束转移到另一种，因为最适合溶解和纯化的洗涤剂可能不是最适合下游应用或长期稳定性的。Digitonin和glyco-diosgenin是冷冻电镜分析常用的洗涤剂。 图4. GPCR在膜提取后的不同可溶性呈现形式的例子。左侧的描述说明了每个系统之间的差异，而右侧的详细内容展示了在每种情况下形成活性可溶化剂的化学实体。 荧光尺寸排除色谱法（FSEC）是一种强大的技术，可以作为筛选策略，用于在进行全面纯化之前快速评估GPCR的质量和属性。这种方法提供了一种快速有效的分析GPCR的方法，可以在不首先优化纯化过程的情况下，从粗提物中溶解。FSEC可以快速分析影响GPCR质量和稳定性的各种参数，包括不同的构建设计、用于溶解的洗涤剂、缓冲成分和配体添加。该技术涉及用荧光标签标记感兴趣的蛋白质，该标签可以在尺寸排除色谱期间检测。在FSEC分析期间，蛋白质样品被注入到尺寸排除柱上，该柱根据其分子量分离蛋白质。然后通过荧光检测监测洗脱剖面，并使用所得数据评估GPCR的质量。例如，如果蛋白质以单分散峰洗脱，这表明蛋白质是均匀的并且正确折叠的。另一方面，如果蛋白质以宽峰或多个峰洗脱，则表明蛋白质聚集或错误折叠。 1.7.GPCR生物物理检测 任何药物分子的生物物理评估对药物发现过程都很重要。它能够详细表征所讨论分子的结合亲和力和/或动力学，并以明确定义的方式确认目标参与。这些关键因素使体外生物物理技术成为目标参与的黄金标准，尽管细胞内目标参与技术和技术的快速扩展。传统上，膜蛋白，特别是GPCRs，由于其天然、未修改的构建通常在从细胞膜环境中分离出来时稳定性和活性较差，因此研究起来特别具有挑战性。然而，这种情况在过去十年中随着生物物理技术和GPCR蛋白的制备（见前一节）的进步而迅速改变，并有多个目标使用一系列技术进行研究。与任何目标一样，小分子治疗剂的性质可能使它们更具挑战性，无论是由于低分子量（如SPR）缺乏信号还是可能难以完全表征的初始命中的较弱亲和力。幸运的是，生物物理学家的工具箱从未如此多样化，有许多高度敏感且经过充分验证的技术是该领域的主要技术（如SPR、NMR、LC-MS和ITC（等温量热法））以及提供比既定技术更多优势的更近期的技术，通常与蛋白质的环境有关（例如，细胞内、溶液内/无基质、粗样混合物等）。这些技术都与结构表征（见下一节）紧密相连，这对于片段基础的药物发现项目同样重要，以实现更高吞吐量的结合评估，可以与更低吞吐量但更详细的结构评估相结合。 对于许多用于评估结合亲和力的生物物理技术来说，灵敏度和吞吐量是最重要的进展。例如，现在在合理的时间框架内对数千甚至数万种分子进行生物物理筛选越来越现实，特别是通过SPR，在某些情况下，每周可以完全表征数百种化合物的亲和力和动力学。对于许多筛选管道，吞吐量使项目能够按预期时间表交付，并且能够在多次大型筛选活动（例如，HTS、DEL等）之后生成高质量的生物物理数据是非常宝贵的。低分子量分析物也不再像过去那样具有挑战性，能够使用高通量SPR系统对大型蛋白质构建物（>200 kDa）进行小分子片段筛选。这同样适用于GPCRs，它们通常因表面活性低而受到阻碍，但由于这些进步而变得更加可行。SPR仍然是药物发现管道中的坚定最爱，因为它的吞吐量、灵敏度以及在标准实验中常规提供的信息量，能够表征从mM到sub-pM范围内的分子结合，除了亲和力和目标参与数据外，还可以评估化学计量和其他结合行为（不寻常的动力学、非特异性结合等），这在确认其他技术（如HTS屏幕中发现的）的命中物质时非常有用。话虽如此，生物物理技术的选择应根据所观察的系统量身定制，并且是定义筛选级联的一个组成部分。NMR在评估动态系统或寻找溶液格式中的额外结构洞察方面具有几个优势，并且已在GPCR配体结合研究中使用。像MST（微量热泳动）和DSF（差示扫描荧光测定）这样的技术也提供了无基质的溶液内方法，并且能够应对复杂溶液和/或大分子量目标或难以用生物物理学表征的目标。相关的生物物理平台，如基于细胞的SPRM（表面等离子共振显微镜），是一种正在发展的技术，可以测量小配体和生物制剂在细胞表面原位与GPCRs的结合。SPRM目前不是研究GPCR配体结合动力学的主流技术，尽管已经发表了各种早期采用者的案例研究。 尽管现有的生物物理工具箱很强大，但生物物理检测设计中最重要的步骤无疑是构建本身的设计和准备（见前一节）。许多严重问题通过调整构建长度、突变、溶解条件和标签等因素来解决，甚至在进行生物物理检测之前，可以在检测系统中进行微调。这种针对GPCRs等目标的构建设计和检测设置的协同作用确实决定了并促进了这些目标在生物物理检测中的可行性。 1.8.受体结合检测 配体结合检测是用于询问GPCRs的最悠久的检测格式之一，自20世纪70年代以来就被行业使用。结合检测相对简单，只需要受体来源和合适的配体，通常带有放射性同位素或荧光团的标记。除此之外，这种检测格式可以修改成许多格式，为许多目的提供了丰富的药理学数据。在药物发现环境中，稳健的结合检测可以作为主筛选，用于检测目标GPCR的竞争性和非竞争性配体。这些传统上是在基于滤膜的格式中使用细胞膜制备运行的，但是接近基于检测格式的出现，如闪烁接近颗粒和基于BRET（生物发光共振能量转移）的系统，已经增加了这些检测的吞吐量并减少了手动处理要求。 除了筛选之外，一个经过充分验证的结合检测可以定义标记追踪器或竞争配体的亲和力、结合动力学和结合模式。它们也可以用于询问目标受体的细胞表面表达水平和受体内化。在提出筛选目的的结合检测时需要考虑几个因素： 标记配体和相关试剂可能成本较高，特别是在高通量筛选（HTS）中筛选大量化合物时。 确定合适的标记配体有几个标准，即对目标受体/s具有良好的亲和力和特异性，以及合成路线或标签容忍性的实用性考虑。 对预期目标的配体的了解很重要。结合检测需要一个标记的配体，因此需要一个已知的配体来标记，所以孤儿受体或配体具有较差特异性或亲和力的受体可能使结合检测无法考虑。 这些检测传统上使用放射性标记的追踪配体。氢-3（^3H）是一种具有长半衰期、与固体和液体闪烁剂兼容，并且在化学上与其替代的氢原子相同的同位素，非常推荐使用。碘-125（^125I）是另一种常用同位素，由于其发展成熟且简单的化学性质，在日常肽标记中得到应用。我们发现，使用专业的肽生产和放射性标记组织对肽进行氢-3标记，也能产生一个标记良好的肽，其明显优势是具有12年的半衰期而不是60天，消除了不断重新合成/购买快速衰变碘化配体的需要。最后，使用放射性配体的GPCR结合检测在开发针对GPCR的治疗药物中继续发挥积极作用，最近在2022年批准用于治疗II型糖尿病的GIP受体激动剂Tirzepatide的专利申请中有所描述。此外，其他放射性配体，如PET（正电子发射断层扫描）标记的GPCR配体，在体内受体成像和CNS中的占有率中发挥翻译作用，例如用于多巴胺和5-羟色胺受体药物（见后面的生物标志物部分）。多年来，为了减少对放射性化学药品的处理风险和实际限制，已经开发了几种技术来替代放射性标记配体。这些技术包括荧光强度、荧光偏振、HTRF（如TagLite）、BRET、NanoBRET、流式细胞术和分割荧光素酶系统。荧光GPCR配体可以提供相对受体表达、受体内化、配体亲和力和结合动力学的实时、同时读数，同时保持与放射性标记配体通常相关的稳健信号大小。基于BRET的结合检测近年来变得流行，随着荧光配体和带有荧光标记配体的互补标记或标记受体的商业供应商越来越多。结合检测在行业和我们客户群体的许多药物发现和开发活动中继续发挥关键作用。非放射性系统越来越多地用于体外筛选，而放射性结合检测仍然需求量大，特别是用于证明其在原代细胞和组织中的可转化性。放射性配体有助于确定目标参与、位置、占有率和体内亲和力等属性，其中内源性受体以未修改的形式原位表达。 1.9.基于细胞的检测 为检测类型和筛选级联中的层次选择合适的细胞系统对成功至关重要。主要使用表达重组GPCR的非疾病相关细胞系，如CHO-K1、U2OS、Hela和HEK293，因为它们易于操作、生长特性和广泛可用性。这些细胞系统为使用第二信使检测进行命中识别提供了经过充分验证和稳健的平台。然而，需要注意的是，每种细胞类型内源性的信号和调节蛋白可能会影响检测结果，并导致“系统或细胞类型偏差”，影响测试配体的药理学特性。适当的重组或内源性GPCR细胞模型对于进入体内机制受体-配体和转化研究很重要。另一个重要考虑是是否测量GPCR激活后的近端或远端信号。近端读数将减少由于较少的潜在非靶标介入而产生的不需要的假阳性频率；然而，检测窗口可能小于远端信号。远端信号从受体后信号放大中受益，提供更高的信噪比，然而，假阳性的可能性增加。总体而言，使用精心选择的一系列检测来识别命中，然后在正交检测中进行确认，增加了化合物进展的机会。 1.10.第二信使检测 用于药物发现项目的GPCR基于细胞的筛选检测的经典方法通常测量第二信使的活性，如Ca2+释放、pERK、报告基因表达、1,4,5-肌醇三磷酸（IP3）或IP1积累和cAMP。其他方法包括检测β-arrestin对GPCR的招募或β-arrestin诱导的GPCR内化。通常用于Gq偶联GPCR的第二信使检测测量IP1或Ca2+ i瞬变。广泛使用的IP1检测是一种均质时间分辨荧光检测，它稳健且适用于HTS，虽然试剂成本较高，但检测可以微型化。越来越多地，冷冻细胞可以分配到检测就绪的板上，以避免与连续细胞培养相关的检测运行变化，实现更耐用和可重复的检测。相比之下，Ca2+ i瞬变检测由于其高通量特性和与实时荧光板阅读器（如FLIPR或FDSS）兼容的细胞通透性Ca2+敏感荧光染料的广泛可用性，成为GPCR筛选检测中使用最广泛的技术之一。任何Gi偶联GPCR也与钙结合，从而增加了其作为筛选检测的实用性。除了GPCR靶标外，这些平台还与离子通道和转运体等其他靶标类别兼容，使它们成为药物发现工具箱中有价值的补充。Ca2+ i通量检测的一个重要限制是反应的快速和短暂性质，这限制了对药物MOA的洞察，因为许多缓慢解离的化合物将由于反应的非平衡性质而被视为不可逆拮抗剂。这些方法也可以通过表达嵌合G蛋白（Gαqi5或Gαqo5）或杂种G蛋白（Gα15/16）的重组系统应用于非Gq偶联GPCR，以实现IP1和Ca2+读数，而无需了解G蛋白偶联条件。然而，这带来了风险，即药理活性可能无法从这些重组系统转化为疾病相关细胞系统中的功能检测。GPCR的另一个关键下游读数是测量细胞内cAMP水平。cAMP检测可用于筛选Gs偶联受体（促进cAMP积累）和Gi偶联受体（抑制cAMP产生）。现在有许多技术可用于测量cAMP积累，包括基于抗体的均质检测，如AlphaScreen和HTRF，在药物发现中已广泛使用。另一种方法是使用包含cAMP结合域与荧光或发光蛋白偶联的基因编码生物传感器，如Promega GloSensor，见Kim等人。cAMP生物传感器的优点之一是它们可以用于实时监测cAMP积累，以量化不仅是cAMP的最大水平，还有动力学。ERK1/2检测测量G蛋白依赖和β-arrestin机制的汇聚信号，使其成为初级筛选检测中的常见选择。从许多选项中选择一个稳健的平台是构建高效筛选级联的关键。在选择检测技术和系统时，必须考虑吞吐量、成本和可靠性等关键因素。通常使用如CHO-K1细胞等系统，因为它们易于操作目标基因表达，并且由于仓鼠来源，不太可能表达与目标具有相似同源性的内源性GPCR。用于检测pERK的HTRF均质检测可实现高通量和可重复性；我们已成功使用这种主检测进行了多个GPCR活动。与pERK相关联的一个挑战是由于CHO-K1细胞对播种条件和密度的压力非常敏感，背景较高。为了开发这些检测，我们发现制作大量的冷冻细胞库以最小化传代变化，以及在检测板播种前进行血清饥饿步骤是重要的。 β-arrestin 在 GPCRs 的激活和通过受体内化引起的脱敏中发挥作用，并且是 G 蛋白信号传导的修饰因子。测量 β-arrestin 的招募可以作为主要筛选检测；然而，了解特定的 GPCR 机制和信号偏差是必需的。有多种技术选择可用，如 NanoBit、Tango、β-半乳糖苷酶酶片段互补和 BRET 传感器。这些技术大多使用目标 GPCR 和 β-arrestin 上的亚单位标签，以至于在受体招募时，两个标签部分通过互补被聚集在一起，在底物存在的情况下产生信号。这项技术提供了高信噪比，有利于良好的筛选，并且可以实时测量。 GPCR 内化是 β-arrestin 招募的功能结果，并且已被用于配置配体。这种方法的一个关键优势是不需要事先了解 GPCR 目标信号通路，因此，它有助于为孤儿受体提供帮助。内化可以通过多种检测格式进行测量，例如，我们发现 HiBiT 系统是筛选的稳健方法。HiBiT 内化检测使用细胞外 N-末端 HiBiT 标签对目标 GPCR 进行标记，无论是使用 CRISPR 敲入还是瞬时表达。它依赖于与非细胞通透的 LgBit 在底物存在下的互补以产生发光信号。我们发现内化和 β-arrestin 招募是识别假阳性和建立对主要命中的信心的有用辅助检测。这些检测依赖于低水平的表达，由于技术的灵敏度，建议对瞬时表达进行滴定，以确保目标处于接近内源水平。内化和 β-arrestin 招募都可用于动力学测量，提供对配体激活更深入的机制洞察，但与 HTRF pERK 检测相比，由于信号的持久性，吞吐量更有限。 1.11.G 蛋白生物传感器 GPCR 信号传导主要是通过激活 G 蛋白进行的，其中 GDP 被 GTP 替换在 Gα 亚基的 Gαβγ 三聚体上。这导致 Gα-GTP 和 Gβγ 的活性信号物种。已经有广泛的工具开发来监测这些 G 蛋白的活性，作为激活的直接读数。与可能因途径串扰和信号放大而受到影响的第二信使检测相比，G 蛋白传感器使药理学配置文件基于不同 G 蛋白亚型的结构变化。这些可用于研究与大多数 G 蛋白家族的动态相互作用，包括 Gαi/o、Gαs、Gα12/13 和 Gαq/11。这些检测使用基于 BRET 的传感器，通过 NanoBit 或 BRET 测量异三聚体重排，通过单分子 BRET 测量 G 蛋白-GDP/GTP 交换，通过 MiniG 蛋白 BRET 传感器或 Gβγ/GRK BRET 传感器测量 GPCR/G 蛋白相互作用。 单分子生物传感器使用膜锚定序列融合 Nluc 作为供体，与 YFP 融合肽作为细胞内受体，通过 ER/K α 螺旋连接子连接，以测量细胞内内源性 G 蛋白的激活。这种单分子生物传感器可以在所选择的细胞中表达，具有膜锚定和活性 G-蛋白检测模块（例如，KB-1753）在生物传感器的两端融合。ER/K 连接子有两种构象“弯曲”与“开放”，并且这个比例可以通过连接到连接子两端的蛋白域增加。在非活性状态下，连接子处于“开放”位置，检测到的 BRET 信号很低。然而，当检测模块与膜上的活性 G-蛋白物种结合时，会倾向于“弯曲”构象，将 Nluc 和 YFP 聚集在一起，产生增加的 BRET 信号。这种方法可以应用于原代细胞，如神经元，以了解配体诱导的内源性 G-蛋白调节。整合仅依赖于内源性 G 蛋白表达的传感器消除了使用容易转染的系统（如 HEK293 或 CHO-K1），这些系统通常需要过度表达目标 GPCR。因此，虽然过度表达系统是用于命中发现的标准工具，并且具有显著优势，但在更疾病相关的模型中，通过开发单分子 G-蛋白传感器可能更容易获得高通量替代品。其他团体已经开发了一种传感器，利用原生受体和 G-蛋白揭示配体导向的信号偏差。虽然这些技术在发现配体偏差和近端活性测量方面具有巨大潜力，但目前尚不清楚这些技术在 HTS 命中发现活动中的扩展程度如何。常见 GPCR 检测和技术的总结表可以在补充 1 中找到。 1.12.GPCR 目标参与 GPCR 参与的一个潜在方法，无论是用于命中发现还是领先优化，是 HiBiT 或其他分裂报告标签的适应，如 Pro-link 用于细胞热漂移测定（CETSA）。这些分裂报告克服了对可靠检测抗体的需求，这是 GPCR 目标的常见问题，并且已用于 HTS 活动。虽然原生 CETSA 对 GPCR 来说比其他类别的目标更具挑战性，但有使用原生抗体进行一些 GPCR 目标的先例。原生 CETSA 方法对跨膜蛋白的挑战很明显，并且不太可能广泛适用于所有 GPCR。然而，使用替代检测系统而不是依赖于基于抗体的检测可能有助于确定这些挑战是由于缺乏合适的抗体还是 GPCR 目标的属性。当存在重组蛋白生产的固有挑战、没有可靠的抗体和缺乏 Nano-BRET 方法的探针时，分裂报告检测系统可能提供了一种前进的方式。我们发现使用易于转染的 HEK293 细胞以瞬时方法是最短时间内成功检测开发的最短途径。检测灵敏度直接与表达水平相关；因此，表达滴定对于构建稳健的筛选检测非常重要。利用反向转染直接到检测板或用于创建冷冻细胞，已经实现了中等吞吐量筛选检测的执行。 1.13.药物发现中的现象学检测 1.13.1.我们如何测量新药的效力？ 如上所述，我们选择选择新化合物的检测类型根据我们试图回答的问题差异很大。检测可以从非常简单的体外结合或信号检测，如前所述，具有高灵敏度和吞吐量的优点，到更生理相关的但吞吐量低的体内疾病模型。 使用原代人类细胞和现象学筛选可以弥合这两个极端之间的差距，提供具有足够吞吐量的检测，允许筛选大量化合物，结合目标在疾病相关细胞系统中的内源性表达。原代人类细胞中的现象学检测将使我们能够模拟复杂疾病的多个方面，因此，与动物模型相比，更有可能预测临床结果。 1.13.2.现象学筛选的重要性 现象学检测测量细胞在潜在药物处理后的行为变化。一些常用的示例包括细胞移动或增殖、介质释放和细胞分化。这些复杂的检测最好在疾病相关的细胞系统中监测，例如原代人类细胞，目标在（病理）生理水平上表达，并与正确的辅助蛋白共定位。表达水平和细胞环境对 GPCRs 尤为重要，因为不同类型的细胞以不同水平表达不同的 G 蛋白亚型，这可能会改变 GPCRs 在简单过度表达的细胞系系统中的信号传导。 GPCRs 的一个关键特征是受体激动剂表现出效力和效力，这与受体表达、储备和信号放大内在相关。例如，高效力或完全激动剂在低受体占据下产生最大效应，无论所研究系统的受体表达水平如何。相比之下，低效力或部分激动剂必须占据高达 100% 的可用受体才能启动响应。在低表达系统中，即使占据所有可用受体，部分激动剂也只能产生亚最大响应。随着受体表达的增加，部分激动剂可以占据的受体更多；因此，它们产生的响应增加，直到达到系统最大值。这一发现在许多 GPCRs 的领域已经得到证明，例如，β2 肾上腺素能受体激动剂沙丁胺醇和特布他林在支气管平滑肌中是完全激动剂，那里有大量的受体储备，但在受体表达低得多的肥大细胞中是部分的。为了获得激动剂效力的准确测量，我们必须仔细选择与我们感兴趣的疾病最相关的细胞系统。 激动剂在探索急性或慢性反应时也可能表现出不同的药理特性，因此，识别最适合的检测方法和时间点以表征药物发现中的新化合物至关重要。简单的第二信使检测并不总是能预测在更慢性的表型读数中的内在活性。例如，在人类原代肺成纤维细胞中已经证明，一系列Gs偶联GPCRs产生的cAMP的量并不能预测相同配体抑制成纤维细胞增殖或分化的能力。当选择最理想的药物特性以针对急性生理反应（如哮喘中的支气管扩张）与慢性反应（例如，纤维化中的气道重塑）时，这种细胞类型差异是一个重要的考虑因素。 1.14.药物发现中的细胞成像 根据您希望测量的细胞反应，有各种方法可以测量表型变化。这些可以从简单的检测试剂盒，量化分泌到细胞外介质中的蛋白质，到原代细胞中更复杂的多目标标记。免疫荧光显微镜是用于探索细胞表型反应的更强大的工具之一。这种方法允许我们监测细胞期望的物理特性的变化，并为我们提供了可以指示我们的化合物可能介导的细胞健康意外变化的细胞的视觉表示。 传统的显微镜是手动的、通量低、耗时且技术密集的，使其不适合药物发现筛选。高内容筛选或高内容成像（HCI）结合了强大的显微镜和基于板的检测，允许我们执行自动化和定量的荧光显微镜检测。HCI旨在通过多波长成像和自动化图像获取，尽可能多地获取有关细胞、球状体或类器官的功能和形态变化的数据。它允许在高通量检测中单细胞或多细胞成像，并且适用于微型化和自动化。因此，它已成为GPCR药物发现工具箱中有价值的工具。 HCI旨在通过多波长成像和自动化图像获取最大化数据捕获，这意味着我们可以从单独的载玻片转向96/384孔板。由于捕获的数据量很大，它还利用了自动化图像处理，其中多参数算法可以使用机器学习识别一系列形态特征。这种自动化图像获取与分析的整合允许产生高度复杂的定量数据。有许多HCI平台可用，如Molecular Devices ImageXpress、Perkin Elmer Opera Pheonix、Yokogawa CV8000或ZEISS CellDiscoverer。每个系统将为光源、放大倍数以及执行宽场或共焦成像的能力提供不同的选项。 HCI可以利用任何发出荧光信号的标签或探针。只要仔细选择探针，使激发/发射光谱不重叠（图5），不同的探针就可以在相同的视野内多重化。甚至最简单的检测通常也涉及某种形式的多重化。通常会包括像Hoechst这样的核染色，以便准确识别细胞、分离和检测量化。 图5. 可用于使用高内涵成像（HCI）进行多重检测的不同荧光探针的例子。 图表展示了通过选择不重叠的激发和发射光谱多重化不同荧光团的能力。模拟的光谱（Ex/Em波长）显示为A）350/450 - 蓝色，B）530/560 - 绿色和C）647/700 - 远红色。 任何细胞蛋白都可以使用HCI进行监测，只要有足够的选择性初级抗体可用。这些可以与荧光标记的二抗体结合使用，以高度敏感的方式准确标记细胞蛋白。这种方法允许监测目标蛋白的表达和定位，以及一些翻译后修饰，如蛋白质磷酸化。如果灵敏度不是问题，初级抗体可以被荧光染料标记，许多这样的标记试剂盒可以商业获取。在没有选择性抗体的情况下，像许多新型GPCRs一样，我们可以寻找替代方法来标记蛋白质，如荧光配体或直接将荧光基团添加到受体或目标蛋白上。这种方法可以使用配体指导GPCRs与荧光标签在活细胞中的共价标记，允许我们监测内源性受体而不是依赖标记受体的过度表达。这些方法可以监测受体与配体的结合以及这些受体的细胞位置。 除了抗体标记，我们还可以利用荧光染料有选择性地标记细胞内的不同结构和细胞器。有可用于标记质膜、细胞质、溶酶体和线粒体的例子，仅举几例。这些中的许多都有不同的颜色以允许多重化，并且有pH敏感染料，一旦它们到达细胞内囊泡的酸性环境，如晚期内体和溶酶体，就只会发出荧光。例如，法尔定常用于选择性染色F-肌动蛋白，这允许监测肌动蛋白骨架的重排，这是形状变化、伤口愈合、细胞运动和细胞粘附的典型特征。 HCI还可以利用基于FRET的生物传感器探索细胞内信号事件（图6）。最近，这些已经被靶向到不同的细胞区域，以允许详细成像亚细胞隔室。因此，这些类型的生物传感器将使我们能够探索GPCRs下游信号的动力学和隔室化，有助于解释可能发生在仅有几个G蛋白下游的不同表型响应的复杂性。 图6. 一系列高内涵成像（HCI）的例子，展示了 (a) GPCR驱动的成纤维细胞迁移 ，(b) 细胞内ERK磷酸化 和 (c) 细胞染色 。 结合这些标记技术的一些或全部，允许我们捕获细胞的特定表型或形态特征的详细图片，这个过程被称为细胞绘画。高通量成像细胞被多达6种荧光染料染色，允许我们尽可能多地“标记”细胞的不同区域（见图6）。自动化图像分析然后使用这些图像识别数百到数千个不同的细胞形态特征，提供高度详细的表型特征。 高通量表型和基于成像的检测，特别是在原代人类细胞中，可以帮助我们以更生理和病理生理的环境了解我们的GPCR目标和新化合物。这种HCI过程允许我们在漫长的体内研究之前更好地分类化合物，因此有助于减少药物发现中晚期失败。 1.15.作用机制 阐明药物的MOA涉及将实验数据与受体药理学机制模型进行比较。简单的MOA研究从更具挑战性的评估弱、命中化合物开始，到更复杂的分析，具有更丰富、高效的领先化合物。由于药物可能通过与同一受体的相互作用在不同组织中产生不同的效果，因此最有用的模型描述了药物的系统独立属性。这些模型使药物发现研究人员能够使用测试系统中的实验数据来预测化合物在目标组织中的活性。 在药物发现计划中识别的GPCR配体可能作为激动剂、中性拮抗剂、反向激动剂或别构调节剂。激动剂是激活受体以产生生理反应的配体，而中性拮抗剂结合到受体上并不启动反应，从而阻止激动剂的作用。反向激动作用可以发生在具有组成活性的系统中 - 受体的自发活性 - 这可以通过结合反向激动剂来逆转。组成活性和反向激动作用的现象可以使用双态模型来解释，在该模型中，受体可以存在于活跃或非活跃的构象中。根据这个模型，偏爱活跃受体状态的配体将促进激活，并被表征为激动剂。相反，反向激动剂对非活跃状态的亲和力大于活跃状态，并破坏自发受体激活。与活跃和非活跃状态具有相等亲和力的配体将表现为中性拮抗剂。 1.15.1.激动剂 定义细胞系统中激动剂浓度-反应曲线的参数取决于系统独立因素和系统依赖因素。因此，应在具有不同敏感性的多种细胞类型中表征新化学物质。在命中识别筛选中检测激动剂的理想场景是高度敏感的，以揭示对弱激动剂的反应。相反，为了在命中到领先或领先优化计划中区分激动剂，应该测量不太敏感的细胞反应，以便化合物可以被表征为完全或部分激动剂。 根据细胞系统中的最大反应，激动剂可以被描述为完全或部分。完全激动剂产生等于系统最大值的最大反应，而部分激动剂即使在高浓度下也只能产生亚最大反应。已经描述了一个配体子集作为超激动剂，相对于内源性配体。超激动剂能够在相同检测中产生大于内源性激动剂的最大反应。两个具有相同机制的完全激动剂的EC50值的比率在所有它们产生完全激动作用的细胞系统中应该是恒定的。因此，通过计算等效活性效力比，可以简单地量化完全激动剂的活性。可以从浓度-反应曲线中获得更多关于部分激动剂的信息，因为相对效力较低的激动剂表现出EC50值接近激动剂-受体复合物的平衡解离常数（KA）。 因此，部分激动剂可以根据效力和最大反应进行排名，分别表示亲和力和效力的等级顺序。将激动剂与反应联系起来的定量关系由Black-Leff操作模型描述。 在最大反应Em的系统中，对激动剂浓度[A]的反应由平衡解离常数KA和系统中激动剂的效力决定。后者由换能比τ给出，定义为R0/KE，其中R0是总受体浓度，KE是产生半最大效应的激动剂-受体复合物的浓度。简单来说，τ是结合亲和力和功能性效力（效力）之间的差异。因此，系统中激动剂的效力取决于激动剂的内在效力和细胞系统的敏感性。 从Black-Leff操作模型拟合中导出的系数τ/KA，衡量激动剂诱导特定反应的能力。对于完全激动剂来说，由于可以无限组合τ和KA值来拟合数据，因此很难从浓度-反应曲线中确定效力和亲和力。然而，可以确定τ/KA比率的唯一值。当Hill斜率（n）为1时，系数τ/KA等同于Emax/EC50相对活性，其中Emax是激动剂的最大反应，作为系统最大值的分数。通过计算ΔLog(τ/KA)或ΔLog(max/EC50)（当n≈1时），可以对激动剂进行排名，给出一个系统独立的指数。 GPCR配体能激活多个途径，具有不同的效力和效力，这种现象称为偏向信号。这是配体依赖性地激活特定途径而不是其他途径，例如，激活多个G蛋白依赖性信号途径，或G蛋白依赖性信号对arrestin介导的信号修饰。如果它们由不同的信号途径介导，偏向信号可能在治疗上被利用，以实现药物效力，同时避免不良反应。准确量化偏差在技术上可能具有挑战性，因为许多检测伪影可能会使偏向信号的解释复杂化。这些包括检测设计和被测量反应的动力学差异，途径之间的信号放大或受体储备的差异，以及意外的非靶标效应。然而，通过仔细控制这些因素，我们可以使用不同的模型为配体分配偏差因子，以了解多个途径之间的信号关系。获得真正的偏向药物以及理解信号偏差的治疗潜力的困难由所谓的G蛋白偏向μ阿片受体激动剂Oliceridine所说明。例如，Oliceridine在临床试验中是一种可证明的有效的镇痛药，但最初观察到的治疗窗口和显著偏差可能可以解释为在具有高受体储备的系统中部分激动剂放大反应。 这些模型已在最近的一套指南中描述，其中配体偏差可以通过比较不同途径中测试配体与参考配体的Log(τ/KA)或相对活性值来量化。然后由偏差因子10ΔΔlog(τ/KA)或10ΔΔlog(max/EC50)表示配体依赖性的途径激活差异，这是一种无论来自配体亲和力还是效力差异的偏差度量。 1.15.2.拮抗剂 分子可以通过两种机制拮抗激动剂的反应。正性拮抗作用发生在拮抗剂与正性激动剂结合在同一位点并阻止激动剂与受体结合时。相反，别构拮抗剂在特定位点结合并通过蛋白质的构象变化与激动剂相互作用。 拮抗作用的性质可以进一步用行为来描述，即可克服或不可克服，竞争性或非竞争性。这种行为描述取决于观察到拮抗作用的检测条件。在竞争性正性拮抗作用的情况下，非常高浓度的激动剂仍然能够产生最大反应；即，拮抗作用是可以克服的。在这种情况下，可以执行Schild分析以确定结合亲和力。在此检测中，进行浓度-反应曲线，随着拮抗剂浓度的增加，导致激动剂曲线平行右移。通过Schild回归得到的斜率因子的一致性来确定竞争性拮抗作用模型的符合性。检查激动剂-拮抗剂相互作用的最严格方法是使用修改的Gaddum-Schild方程进行全局非线性回归。 当我们为药物发现对新化合物的MOA进行分类时，对所有化合物执行完整的Schild回归通常不是时间高效或实际的；因此，我们可以依靠使用竞争结合检测来确定IC50和Ki。对于这种分析，我们只需要在控制追踪配体存在的情况下对每个未知化合物执行一次竞争检测，以推导IC50值。IC50是一个依赖于使用的追踪配体的浓度和亲和力的经验值；因此，我们使用Cheng-Prusoff方程将这个值转换为Ki。通过这种方式，我们可以准确地测量许多新化合物的结合亲和力。 相反，非竞争性拮抗行为是不可克服的。这种行为可能源于伪不可逆拮抗剂占据正性位点或别构效应。在高浓度的拮抗剂存在下，激动剂无法产生其最大反应，导致拮抗剂浓度依赖性地抑制激动剂浓度-反应曲线。 1.15.3.别构调节剂 别构调节剂通过结合到与正性结合位点空间上不同的位点来影响GPCRs。因此，它们可能为药物发现提供优势，通过赋予增加的受体和受体亚型选择性。 别构调节的一个独特特点是效果的饱和性，即，一旦所有别构位点都被占据，即使在更大的调节剂浓度下也不会观察到对亲和力或效力的进一步调节。对于别构拮抗剂来说，这可以被视为一个曲线Schild图，其中连续的激动剂浓度-反应曲线在高调节剂浓度处聚集在一起。别构配体可能调节正性配体的亲和力和/或效力，也可能具有直接激动作用。因此，在测量受体功能的检测中可能存在许多不同的别构效应。所有这些效应都由功能性别构模型描述。在一系列调节剂浓度存在下拟合完全激动剂浓度-反应曲线，可得到调节剂亲和力（KB）以及亲和力（α）和效力（β）的协同因子的系统独立参数值。 在药物发现中，正性别构调节剂（PAMs）的一个优势是它们区分激活和非激活受体状态，从而增强对正性激动剂的反应。通过这种方式，PAMs可以通过在适当的时间和适当的地点增强现有反应来微调对内源性配体的反应，因此可能比激动剂具有更广泛治疗窗口。PAMs可以使用传统的激动剂筛选方法检测；然而，新化合物在低浓度存在下进行测试，例如，正性激动剂的EC30，以确定它们是否可以增强其反应。 别构和正性拮抗剂可能在功能性基于细胞的和生化结合检测中共享一些行为。根据实验条件，如果在使用选择性探针来表征测试化合物时没有观察到探针依赖性，或者在测试浓度的溶解度限制范围内没有达到饱和性，NAM可能被错误地解释为正性拮抗剂。可以通过竞争关联检测或放射性配体解离动力学检测来研究疑似别构调节剂的机制。观察到的激动剂-受体复合物的解离速率常数的变化可以归因于别构效应。 有许多不同的机制，潜在药物可以通过这些机制调节GPCRs的活性，理解治疗特定疾病最合适的机制可以帮助我们制造更好的药物。早期选择所需的机制可以帮助设计相关的初始筛选检测，如PAMs，或选择适当的机制研究，如偏向配体。新化合物的不同药理属性的量化可以进入DMTA循环，允许我们通过领先优化阶段推进更好的化合物。除了标准机制研究外，我们还可以利用细胞绘画等方法获得关于化合物MoAs的非假设驱动信息。如前所述，可以开发详细的细胞配置文件，使用HCI然后用于检测不同实验化合物处理的单个细胞中的微妙差异。这个过程可以识别靶标，测量毒性，将化合物分组到功能途径中，识别作用机制或信号途径中的微妙差异，或识别疾病特征。通过设置使用非假设驱动过程的研究，我们可以最大化新发现的机会。总之，将详细的MOA研究纳入药物发现过程可以帮助设计和优化化合物，以开发更有效的治疗方法。 1.16.GPCR结构生物学 GPCR的成功结构引导药物发现在很大程度上可以通过常规提供实验结构来辅助，这些结构的分辨率允许对结合的小分子进行明确建模。然而，GPCR的结构确定通常是一个漫长而昂贵的过程，并且比可溶性蛋白靶标的失败率更高。因此，在一项运动的开始时，必须考虑GPCR结构的成本/收益分析和可交付的可行时间框架。我们认为，投资于目标GPCR的结构是值得的，因为如果成功，它有助于药物化学优化化合物并提供有关受体结构生物学的宝贵见解。我们认为，这项投资的时机最好是在HTS等命中发现活动之前或同时进行，以便有益于指导SAR。 尽管GPCR的结构生物学具有挑战性，但GPCR结构存入蛋白质数据银行(PDB)的速度正在加快，并且所达到的分辨率一直在提高(图7)，这意味着这项任务变得越来越可行和常规。有几个因素促成了GPCR结构生物学的成功，尽管它们是具有挑战性的目标。这些因素包括在构建设计、表达系统以及用于在样本准备过程中溶解和稳定受体的洗涤剂方面的技术进步，正如前面所涵盖的。此外，结构解决方案技术本身也有许多关键技术进步，这些技术在获得GPCR结构方面也起到了重要作用。 在左侧，散点图显示了随时间存入PDB的GPCR结构的累积数量。在右侧，散点图显示了随时间存入PDB的GPCR结构的最大和平均分辨率。 广义上，有两种技术可以确定GPCR的结构：X射线晶体学和冷冻电镜(Cryo-EM)。大部分情况下，由前者解决的是拮抗剂结合/非活动状态结构，而与异源三聚体G蛋白复合物的激动剂结合/活性状态结构则由后者解决。结构技术的的选择对构建设计、表达和纯化过程有很大的影响，因此有助于在项目开始时就知道要针对的理想模式是什么。在2018年之前，GPCR结构主要是通过X射线晶体学解决的。传统的蒸汽扩散晶体化方法已用于解决34%的GPCR晶体结构。另一方面，由Caffrey实验室开创并专门设计用于膜蛋白晶体化的脂质立方相(LCP)方法已用于解决65%的GPCR晶体结构。LCP方法协助晶体化的能力归因于其能够通过在疏水和亲水环境的双相混合物中容纳膜蛋白，提供适合晶体成核和生长的环境。然而，由于蛋白质晶体化需要蛋白质样品处于稳定和刚性状态，迄今为止通过X射线晶体学解决的95%的GPCR结构是A家族GPCRs，它们比其他家族成员更容易晶体化。 通常，在第三代同步辐射X射线源的微焦点光束线上收集LCP晶体的衍射数据。这些光束线旨在产生直径在1-10微米范围内的高度聚焦的X射线束，这允许将高X射线束通量传递到非常集中的区域，允许从GPCR常见的非常小和弱衍射晶体收集数据。由于从这些晶体收集衍射数据需要高X射线剂量，必须从许多晶体收集小楔形数据，以避免由于辐射损伤导致数据质量严重下降。然后合并多个数据集以记录一个完整的数据集，从而可以解决GPCR结构。 串行飞秒晶体学，自2013年首次产出GPCR晶体结构以来，使用X射线自由电子激光器(XFEL)而不是同步辐射源进行晶体学数据收集。这种方法已用于解决迄今为止许多公开可用的GPCR晶体结构。串行飞秒晶体学可以被视为典型X射线晶体学工作流程的扩展，因为数据收集之前的步骤没有不同，直到晶体化成功后。XFELs产生超高强度、超短X射线脉冲，这些脉冲非常亮和相干，它们的使用在研究GPCR结构方面比其他X射线源有几个优点。首先，超短X射线脉冲可以用来捕获不同方向上多个单晶的衍射图案，在X射线诱导的辐射损伤之前捕获衍射图案。第二，XFELs产生极高强度的X射线，这使得能够从以前太弱而无法产生有意义数据的小晶体收集衍射数据。最后，用于串行飞秒晶体学的LCP晶体不需要像在同步辐射X射线衍射实验中那样收获和冷冻，因为在串行飞秒实验中，LCP晶体直接在它们生长的LCP中喷射过去。因此，串行飞秒晶体学可以帮助解决来自LCP中极小晶体的GPCR结构，即使晶体化条件的优化无法产生足够大和质量的晶体，以便使用同步辐射数据源收集数据，即使在微焦点光束线上。 冷冻电镜是解决蛋白质分子结构的另一种技术。冷冻电镜自20世纪60年代以来一直在发展，然而，在过去十年中经历了一系列快速发展，将焦点从X射线晶体学转移开，作为蛋白质结构解决的主要方法。这场所谓的“分辨率革命”是由几个重大进步推动的，包括直接电子探测器的开发、自动化数据收集软件、改进的运动校正和CTF校正算法、复杂的粒子选择方法、单粒子分析软件包，以及对电子显微镜基础设施的普遍改善。自2018年以来，冷冻电镜已超过晶体学，成为获取包括GPCRs在内的许多蛋白质类别结构信息的首选技术(图7)。 图7. 提交至蛋白质数据银行（PDB）的GPCR结构的时间线。 在冷冻电镜实验中，不是记录衍射图案，而是将入射电子束通过在一层玻璃态冰中冷冻的蛋白质样品传递，其中产生的散射电子被放大到探测器上，形成图像。从一系列得到的微观图像中，将不同方向上的单个蛋白质粒子的图像平均在一起，首先构建2D模型，然后通过计算过程构建3D模型。冷冻电镜的优势在于不需要目标蛋白晶体化，并且成功结构解决所需的蛋白质量可能比晶体学运动所需的少10-100倍。此外，使用冷冻电镜，与GPCR结构生物学相关的更顽固的挑战，如它们的不稳定性和差表达和纯化产量，对于结构解决的障碍较小。 从冷冻电镜数据重建三维结构涉及组合成千上万到数百万在玻璃态冰中不同方向上观察到的粒子。这个过程依赖于处理软件正确识别或“选择”来自信号-噪声比非常低的图像中的粒子，并准确分配该粒子的方向。因此，有一个更低的尺寸限制，在这个限制下冷冻电镜是不可能的，因为粒子不再能成功选择。出于这个原因，大多数GPCR的冷冻电镜结构是GPCR:G蛋白复合物和越来越多的GPCR:arrestin结构，因为这些复合物比单独的受体呈现更大的粒子。然而，可以成功解决的粒子尺寸下限一直在变小，一些最新的膜蛋白结构成功解决的尺寸只有60 kDa。 在GPCR:G蛋白复合物中，GPCR必须处于活性状态，这意味着它们是激动剂结合状态的结构，而不是GPCR的非活性/拮抗剂结合状态，这在X射线晶体结构中更为常见。除了异源三聚体G蛋白复合物外，通常使用通用纳米抗体或Fab片段，它们结合并稳定G蛋白亚基界面之间的界面。例如，纳米抗体35(Nb35)是一种构象特异性纳米抗体，结合G⍺和Gβ亚基之间的界面(图8)。 图8. GPCR:G蛋白复合体的冷冻电镜结构示例。 1.16.1.腺苷A2a受体(PDB: 6GDG) 在冷冻电镜实验中增加目标蛋白粒子尺寸的替代策略是使用源自抗体的结合伙伴。最近几篇出版物突出了使用Fab抗体片段的效用，这些片段识别GPCR-BRIL融合的BRIL部分，以协助这些蛋白质的结构表征。因此，在涉及GPCR的药物发现运动中，追求X射线晶体学与冷冻电镜作为首选结构解决方法的明显区别已经变得模糊。然而，如果趋势持续下去，即使在表征小分子结合的情况下，也可能会有越来越多的GPCR目标通过冷冻电镜来解决。 1.17.药物化学见解 在本节中，我们将首先探讨前面描述的GPCR结构信息如何帮助指导药物化学优化药物，然后继续讨论一些特定的拮抗剂SAR和常见结构基元，以及别构和偏向配体SAR和化学的例子。 1.17.1.结构引导的药物发现 GPCRs是动态的信号结构，配体结合口袋可以表现出相当的灵活性以适应配体，这使得确定和建模相关受体-配体结构具有挑战性。然而，随着我们获取相关和多个GPCR-配体结构的能力的提高，以及计算药物-受体柔性对接方法的速度和预测性的提高，将配体诱导的受体构象变化纳入药物发现的能力得到了改善。 使用稳定的mGlu5受体，Cristopher等人进行了基于片段的结合检测以鉴定命中。受体-化合物复合物的X射线晶体结构允许合理化SAR，导致选择一个化合物进行进一步开发。此外，鉴定的化合物结合到mGlu5受体的一个别构口袋内。随后，Christopher等人表明不同的mGlu5配体可以通过一系列诱导拟合采取不同的结合构象。除了配体结合模式分析外，还考虑了结合位点中的水网络。这种方法对于开发GPCR别构调节剂非常有利，因为理解通过在不利环境中去除水分子以及保持与有利水分子的相互作用的相互作用对水分子的影响可以提高结合亲和力，这通过合理的SAR可能更难实现（图9）。 图9. HTL14242是通过基于片段的筛选和使用结构基础药物设计（SBDD）优化发现的。化合物16和19被开发出来，通过稳定结合口袋中的水网络来合理解释效力差异。a 来自激动剂诱导的磷脂酰肌醇水解测定的IC50值。 增加在激活和非激活状态下解决的GPCR结构数量将有助于未来的药物发现工作，为计算同源建模提供更多新颖的模板（见图7）。这些受体-配体结构可以帮助进一步发展通过深度学习或神经网络改进结构预测的人工智能（AI）技术。Deepmind开发的AlphaFold在2021年发布，提供了超过2亿个蛋白质结构模型。这项新技术导致了AlphaFold生成的模型与实验结构的比较。通常，由AlphaFold开发的GPCR模型的三级主链特征非常接近；蛋白质侧链的方向显示出最大的差异，侧链RMSD（1.90 ± 0.58 Å）。这可能是由于结合口袋的疏水塌陷导致AlphaFold结构中更小、更窄的结合口袋。 在AlphaFold和AlphaFold 2的基础上，Heo和Feig制定了一个协议，允许预测GPCR的活性和非活性状态。历史上，许多GPCR X射线晶体学数据集中，PDB数据库中非活性状态的数量过多。Heo和Feng建立了一个新的协议，使用AlphaFold 2并引导它到所需的激活状态。Lee等人的工作提供了一些当前的指导方针，介绍如何使用深度学习开发的GPCR结构模型，例如AlphaFold。两个主要组成部分是（1）选择正确的模型，使用正确的激活状态，以及（2）通过受体柔性对接使用适当的对接选项。 图10. 例子表明，简单的配体修饰可以导致不同的GPCR药理学。 1.17.2.配体的简单修饰 小分子在给定GPCR上的功能性活性可能受到小的结构变化的显著影响。Dosa和Amin在2016年对这些变化的深入审查突出了一些最近的例子，其中小的结构变化显著影响了GPCR药理学。在不同的配体修饰中，Dosa和Amin观察到，在71%的情况下，结构变化γ位置到氮，或更近，导致配体功能从激动剂转变为拮抗剂或反之亦然。这些例子包括：(a) 在CCR3拮抗剂的哌啶环的3′位置的甲基化，增加了结合但转变为激动剂。(b) 在一系列α2-肾上腺素受体激动剂中，N-甲基苯胺向二甲胺的甲基化保持了结合亲和力(Ki)，但将机制从激动剂转变为拮抗剂。在这种情况下，SAR并不总是在系列中一致，但显示了小的结构变化可以对α2-肾上腺素受体的功能产生显著差异。(c) 将 pergolide 和 Oopergolide 的 N-丙基基团修改为 N-甲基，将功能效应从5-HT2B激动剂转变为拮抗剂。有趣的是，pergolide 和 6-methpergolide 仍然是多巴胺D2受体的激动剂。 1.17.3.特权支架 特权支架是提供特定属性的化学亚结构，并且在药物化学的情况下，这是特定蛋白质类别的结合基元。特权支架通常是半刚性的，可以通过疏水相互作用结合到疏水区域，而不会崩溃配体的三维结构。特权支架自1988年以来就已经存在，当时Evans等人提出，仔细调节特权支架将有助于找到GPCRs的新型激动剂或拮抗剂。在GPCR家族中，有一些众所周知的特权结构，了解这些结构可以帮助将命中转化为领先化合物。在修改特权支架时应谨慎考虑，以及对配体的整体物理化学性质的影响，例如，通过确保在优化过程中保持配体的亲脂性。GPCRs的一些特权支架示例包括联苯、螺哌啶和苯二氮卓。 图11. 阿立哌唑，一种上市的D2受体部分激动剂，以及一些含有吲哚的类似物，它们在信号偏向性上有不同的效应。 1.18.偏向信号 配体偏向的概念自1995年以来就已经存在，基于不同配体可以通过相同的GPCR通过偏向不同途径的受体后信号（例如，G蛋白偶联反应和β-arrestin的调节）影响一系列细胞功能的想法。在超过30个GPCRs中观察到明显的偏向信号，Tan等人对这一领域的综述提供了不同配体结构和信号通路影响的深入分析。一个关于小配体结构变化如何影响信号通路的例子是一系列多巴胺2受体（D2R）激动剂。利用GPCR结构和机制数据，建立了一个假设，即修改Aripiprazole的二氯苯环为吲哚环系统可以导致与跨膜螺旋的不同相互作用，从而影响信号通路。N-H吲哚化合物1在Gi/o检测中具有与β-arrestin 2招募检测相似的效力，计算出的β-arrestin偏向因子为2.5。简单的吲哚氮甲基化导致配体化合物2在Gi/o检测中无效，但在β-arrestin 2招募检测中仍然活跃，尽管效力有所降低。进一步的甲基化α到吲哚氮化合物7提供了一个在Gi/o检测和β-arrestin 2招募检测中都活跃的配体，对G蛋白信号有显著的偏向，由β-arrestin调节。这是第一个使用基于GPCR结构信息的合理设计生成偏向GPCR配体的例子。 1.19.别构调节剂 GPCRs的别构调节剂结合在与天然配体的正性结合位点不同的位点。别构调节剂修改受体的功能效应的能力，无论是在天然配体存在下积极还是消极，可以提供一种探索潜在的差异化效力、受体选择性和与正性配体相比改善安全性的方法。在GPCR X射线晶体学衍生结构中发现了几种不同的别构结合位点，包括GPCR的细胞外侧、跨膜螺旋和脂质双层之间的结合位点，以及TM 6和7细胞内侧区域底部的结合位点。通常在别构药物化学项目中，配体的结构变化相对较小，活性变化剧烈，使得构建结构活性关系变得困难。 GPCRs的新型别构调节剂的发现是一个不断增长的领域，以下是一些最近发表的别构调节剂的例子，包括1H-咪唑[4,5-c]喹啉-4-胺类似物作为A3腺苷受体的PAMs，V-0219，一种1,2,4-噁二唑-哌啶PAM的胰高血糖素样肽-1受体，噻吩[2,3-d]嘧啶类似物作为Mas相关G蛋白偶联受体X1的PAMs，chromane CVN636 mGluR7的别构激动剂，苯乙基脲类似物作为大麻素类型1受体的NAMs，三唑苯酰胺类似物的mGlu7和噻吩[2,3-d]嘧啶类似物作为D2受体的NAMs。 在最近的一项研究中，披露了一种新型的多巴胺D1受体正性异构调节剂（PAM）。传统的正性D1激动剂曾被用于治疗帕金森病、精神分裂症、阿尔茨海默症以及其他形式的痴呆症；然而，这些正性配体存在一系列缺点，包括对其他多巴胺受体的选择性差、药代动力学特性差；“钟形”剂量反应；耐受性和脱敏；包括低血压在内的耐受性问题。通过针对D1R的正性异构调节，希望能够在不产生正性配体相关不良影响的情况下提高内源性多巴胺的效力。令人鼓舞的是，已有两种D1R PAMs进入了针对帕金森病和精神分裂症的临床开发。 D1R的命中是从在稳定表达D1R的神经母细胞瘤细胞系中进行的cAMP积累读数的PAM筛选的小化合物库中鉴定出来的（图12）。对双苯基的取代进行快速评估，导致在cAMP积累检测中测试了一系列化合物，表明在2位具有氟甲氧基团提供了最有利的活性。同样揭示了在3位具有醛基导致效力下降，与4位相比。总体而言，化合物3具有最佳的特性。最初的命中在cAMP检测中没有反应，表明该化合物作为PAM没有固有的激动剂活性。进一步的放射性配体受体结合研究表明了正性异构效应。尽管化合物3具有良好的渗透性和低hERG抑制作用，但血清稳定性差、溶解度差和高蛋白质结合意味着需要一种具有更好体外PK特性的化合物。亚磺胺类似物（化合物26）显示出显著的效力提高，并且对这种化学类型的进一步研究没有显示出进一步的效力提高。进一步的研究证实亚磺胺类似物作为PAM，ADMET分析显示比化合物3具有更优越的特性。由于亚磺胺基团是手性的，合成了两种对映体，R和S对映体在D1R上具有可比的效力。 图 12. 从最初的醛类命中发展出D1受体正向别构调节剂（PAM）。 简要地，为了完整性，一个最近报道的NAM的例子是GLPG1205，由Galapagos开发的GPR84的NAM。GPR84由中链游离脂肪酸激活，通过Gi/o途径信号传递，与炎症性疾病相关。使用cAMP检测进行了200 K化合物的HTS，GTPγS检测用于命中验证。在这个HTS中，鉴定了一个具有亚微摩尔效力和良好物理化学特性的命中，具有合理的体外和体内PK特性，但不幸地被发现是磷酸二酯酶4的抑制剂。随后的药物化学项目优化了这个起点，用于口服PK，提高了GPR84效力，确认了NAM药理学和整体良好的选择性。GLPG1205进入了临床，虽然实现了适当的PK、安全性和耐受性特性，但在IBD的IIa期研究中没有实现主要疗效终点。在特发性肺纤维化患者中进一步评估了II期研究，并计划了III期研究，但Galapagos在2021年战略性地停止了该项目。 1.20.GPCR生物标志物 为了在临床前和临床试验中有效开发生物标志物，需要了解潜在疾病病理生理学和目标参与。生物标志物可以在临床前用于选择适当的模型和监测目标效应，而在临床上用于患者选择或临床研究的分层，或作为疾病进展的生物标志物，监测随时间的干预或疾病状态的变化，或监测药物安全性。因此，生物标志物可以监测潜在新药从实验室到临床的转化，并有助于通过反向转化回实验室更好地了解潜在的病理生理过程。 FDA将生物标志物定义为可以客观测量和评估的特征，作为正常生物过程、病理过程或对治疗干预的药理学反应的指标。这个定义允许任何有助于识别疾病机制和/或治疗效应的东西作为生物标志物，从代谢物、蛋白质或基因或蛋白质/基因模式（生物签名）、生物结构的变化、生物过程或特征特征。GPCR目标参与在体外通过信号过程的变化、蛋白质或基因表达或细胞激活状态很容易测量，如本文前面部分所述，所有这些都可以作为体外和体内的生物标志物，并且许多将提供从动物模型到人类的转化。 1.20.1.临床前和临床生物标志物 生物标志物应该是可访问的，可以准确测量，并且应该在不损害样本完整性的情况下为研究增加最小的复杂性。相对直接的临床前和临床研究中容易分析的生物流体，如血液、血浆或尿液，可以用来研究GPCR功能。例如，对精神病患者（如精神分裂症和抑郁症患者）的淋巴细胞分析表明GPCR表达与疾病之间存在相关性，突出了它们作为外周生物标志物的潜力。在临床研究中，由于确保多个地点之间一致的样本处理存在问题，对活细胞、信号机制、磷酸蛋白和代谢物的分析通常更具挑战性。 由于动物模型只模拟了人类疾病机制的某些方面，并且显示出菌株间变异性，因此在选择动物模型时必须谨慎，以确保所选模型模仿了正在研究的疾病方面，并且这与患者的病理生理反应有关。不同的动物模型可能需要用于疾病的不同方面，因此对疾病机制的了解不足或不足可能导致临床转化不佳。即使在动物疾病模型中有很好的证据表明阻断了机制，这些也不总是很好地转化为临床研究。例如，动物实验表明CCR5是一个很好的RA治疗候选药物，而随后使用CCR5拮抗剂的临床试验未能证明治疗效应。 一种用于监测体内或体外GPCR目标参与的方法是测量受体-配体结合。体外GPCR占据研究在早期CNS药物开发中具有实用性，为药物暴露（剂量、血浆浓度、CSF和大脑）与目标参与之间的关系提供了额外的数据。如果这些临床前数据表明一定程度的目标参与，例如，在相关动物模型中的受体占据，那么随后确定人类目标参与可以用来指导人类概念验证（PoC）阶段的药物开发剂量，第二阶段临床试验，从而加速化合物的临床开发。 PET（正电子发射断层扫描）是一种功能成像技术，可以用来证明新化学实体在药物管理后与感兴趣的GPCR相互作用。PET成像在CNS药物发现中特别有价值，由于人类大脑的不可达性，使用小分子放射性示踪剂对于评估大脑渗透、目标参与、大脑功能和神经病理学至关重要。这需要建立体内目标占据与药理效应之间的联系，并且随着PET技术的最新进展，它已成为药物发现中的重要工具。例如，5-HT2A受体涉及各种大脑疾病，如精神分裂症、抑郁症和阿尔茨海默症，5-HT2A PET示踪剂，最著名的[11C]MDL100907和[18F]altanserin，已经在临床上使用了数十年，用于量化人类大脑中的5-HT2A受体。尽管找到提供适当目标参与的合适配体存在挑战，但PET成像在CNS药物开发的PoC确定中发挥了关键作用。然而，PET技术不仅用于CNS药物发现，也已经应用于其他治疗领域。例如，全身混合PET成像，结合计算机断层扫描和/或磁共振，用于为特定目标或生物标志物开发新的放射性配体，使评估否则难以接触的肿瘤成为可能。 成像生物标志物在药物发现和开发中越来越重要，作为发现和临床开发之间的关键桥梁。 在临床中，生物标志物可以提供有价值的数据，以便在早期阶段的临床试验中做出关键的开发决策，通过确认生物学效应并允许早期评估新药的药理活性。在临床试验的剂量递增阶段应用适当的药效生物标志物，可以为靶向参与提供证据，并在不使患者暴露于不必要的毒性的情况下给出估计的最佳剂量。生物标志物也可以在患者中进行检查，以确认机制的调节，以确定对疾病的药理影响，尽管对生物标志物的积极影响并不总是导致有利的临床结果，正如前面讨论的CCR5拮抗剂的情况。 最近，已经从每项研究的单一生物标志物转向更以患者为中心的基于精准医学的生物标志物方法，考虑到患者的遗传状态。采用这种基于精准医学的生物标志物方法，允许为特定靶向治疗选择最合适的患者，并且正在使用不同的试验设计来识别和验证潜在的生物标志物，以帮助实现这一点。 1.20.2.未来的临床应用 对于GPCR生物学，从分子科学到强大的成像平台的技术进步，有望加速新生物标志物的发现，这将促进发现治疗疾病的新方法。例如，使用无偏的、假设生成方法的GPCR组学（例如，使用RNA测序对组织和细胞类型进行鉴定和量化GPCR表达），已经发现了以前未被认识的GPCR，这些GPCR有助于功能反应和病理生理学，并且可能是治疗靶标。人们意识到GPCR过度表达和突变导致异常激活的促癌途径诱导肿瘤进展，也使GPCR作为某些类型的癌症的生物标志物获得了更多的关注。来自患者衍生细胞和细胞系的研究，以及与正常细胞前体的比较，导致了这样一种观念，即肿瘤可能具有过度表达GPCR的“GPCR签名”，这些GPCR是肿瘤类型特异性的，并且可以作为生物标志物和/或治疗干预的目标。GPCR，特别是趋化因子受体，在肿瘤浸润性免疫细胞和肿瘤微环境中的细胞上高度表达，并且可能有助于特定的生物标志物签名。 更新的多组学（基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、单细胞组学）和分析技术的进步，为在药物发现过程的每个阶段发现和验证多个与GPCR相关的生物标志物提供了激动人心的机会，并能够从微小样本（包括生物流体如血液、血浆、尿液、痰液、组织或灌洗液或活检样本）中提取高含量信息。例如，先进的质谱技术和下一代蛋白质组检测原理，如基于寡核苷酸的技术，通常需要微小量的样本，并且可以更容易地应用于大型患者队列，以识别作为治疗靶向候选物的因果蛋白。与更成熟的组学层（如转录组学）相比，蛋白质组学提供了直接测量蛋白质水平的好处，从而有助于在临床上转化为最常用的蛋白质生物标志物。 这些多组学生物标志物方法有可能为理解疾病过程、治疗干预和患者分层提供更个性化的生物标志物签名，并且来自多个来源的数据整合可能会显著增加对所获得测量值的价值和信心。然而，这一重大挑战需要适当的分析、整合和理解这些大数据集的工具和方法。来自不同来源和研究所的高含量和多因素组学数据以及来自具有多个混杂因素的不同患者群体的小样本数量，使得这种类型的数据分析特别具有挑战性，并且仍然存在对稳健和准确分析的未满足需求，以将许多这些潜在生物标志物转化为稳健的诊断和/或预后工具。人工智能和机器学习的最新进展可能会对这种类型的分析产生重大影响。 1.21.未来展望 我们对GPCR药物发现的理解持续增长，识别出新的和更好的方法来调节GPCR功能，成功地提供新的和改进的药物来治疗患者。GPCRs将仍然是一个重要的药物靶标类别，特别是当许多人预测大多数GPCRs尚未被药物化时。未来由GPCR组学技术和更高保真度的目标验证技术驱动的更深入的疾病知识将提高我们的能力，将未被药物化的GPCR调节与期望的治疗结果联系起来。新的技术平台GPCR生物技术公司（例如，Salipro 、Septerna、LeadXpro、Structure Tx）将继续出现，提供新的和流程来增加为新的GPCR机会找到化学起点的成功。 结构使能的GPCR项目将变得更加普遍，因为随着冷冻电镜的出现和计算化学力量的增加，我们生成和利用相关、天然和稳定的结构的能力得到了提高。值得注意的是，在药物发现项目开始时获得GPCR结构将提高预测配体-受体结合并加速新化学起点的药物化学优化的前瞻性能力。 不足为奇的是，难以药物化的GPCRs往往具有更大、不太可追踪的配体口袋，并且通常不太成功地采用传统的药物发现方法。然而，随着GPCR结构和功能理解的最新科学和技术进步，药物猎人正在转向天然GPCR复合物，正如在过去两年中对新检测平台（例如，Septerna、Domain Tx、OMass）的显著生物技术投资所强调的那样。特别是，新的GPCR结构信息的应用将继续扩大，以至于人工智能（AI）驱动的基于硅的分子相互作用预测将使基于硅的命中发现和优化在未来的GPCR药物发现中变得更加主流。 能够常规地识别小分子药物在天然GPCR信号复合物中的位置以及如何调节特定细胞功能及其之外的激动人心的前景，很可能成为现实。这种扩展GPCR检测设计的能力将识别和利用更理想的药物机制，超越传统的激动剂和拮抗剂，如别构调节剂和偏向信号药物，以及利用整个GPCR互作组。未来GPCR药物发现的其他激动人心的途径包括靶向细胞内GPCRs、孤受体GPCRs的去孤化、靶向GPCR降解和受体二聚体化抑制剂。 不足为奇的是，一些经过充分验证的GPCRs对小分子药物调节的抵抗力已成为生物药物模式和基于结构的流程（例如，Struct Tx）的焦点，如抗体、纳米抗体（Tectonic Tx）和内源性蛋白质-配体方法（Orion Biotechnology）。总的来说，生物药物正在成为药物发现中更可行和主流的方法，因此我们可以预期，对于特定的、高价值的GPCRs，生物药物方法将是提供新治疗的最佳方式。 我们希望这篇综述为您提供了对发现GPCRs新药的一些重要方面的最新见解，以及这个药物靶标家族所提供和挑战的激动人心的未来（图10，图11）。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

VANCOUVER, Washington, Aug. 23, 2024 (GLOBE NEWSWIRE) -- CytoDyn Inc. (OTCQB: CYDY) (“CytoDyn” or the “Company”), a biotechnology company developing leronlimab, a CCR5 antagonist with the potential for multiple therapeutic indications, announced today that it has engaged Syneos Health as the contract research organization (“CRO”) for its upcoming Phase II study exploring leronlimab and its effects on chronic inflammation. Syneos Health is a leading fully integrated biopharmaceutical solutions organization providing services across the drug development lifecycle to help customers accelerate the delivery of life saving therapies to market. Syneos Health has helped to develop or commercialize 92% of novel new drugs approved by the FDA in the last five years (2019-2023) and 91% of products granted marketing authorization by the European Medicines Agency. “We are looking forward to working with Syneos Health to advance our Phase II study of leronlimab’s effects on chronic inflammation. With the company’s support, our goal is to generate clinical data that we believe will affirm the utility of leronlimab in addressing a number of medical concerns impacting patients globally,” said Dr. Jacob Lalezari, CEO. About CytoDyn CytoDyn is a clinical-stage biotechnology company focused on the development and commercialization of leronlimab, an investigational humanized IgG4 monoclonal antibody (mAb) that is designed to bind to C-C chemokine receptor type 5 (CCR5), a protein on the surface of certain immune system cells that is believed to play a role in numerous disease processes. Leronlimab is being studied for oncology and inflammation, as well as other potential indications, including but not limited to HIV and MASH. About Syneos Health Syneos Health® is a leading fully integrated biopharmaceutical solutions organization built to accelerate customer success. Syneos Health translates unique clinical, medical affairs and commercial insights into outcomes to address modern market realities. Syneos Health brings a talented team of professionals with a deep understanding of patient and physician behaviors and market dynamics. Together, Syneos Health shares insights, uses the latest technologies and applies advanced business practices to speed its customers’ delivery of important therapies to patients. Syneos Health supports a diverse, equitable and inclusive culture that cares for colleagues, customers, patients, communities and the environment. To learn more about how Syneos Health is shortening the distance from lab to life®, visit syneoshealth.com. CONTACT CytoDynInvestor Relations CytoDyn Inc. ir@cytodyn.com

摘要:人类猴痘病毒（Mpox）被归类为痘病毒科（Poxviridae）的成员，属于正痘病毒属。Mpox具有双链DNA，并且已知有两个遗传谱系：起源于西非和刚果盆地的谱系，通常被称为中非谱系。Mpox可以通过天花疫苗接种或治疗剂进行治疗。修改天花疫苗用于治疗和预防Mpox已被证明是有益的，因为天花病毒和Mpox病毒之间有很强的联系，并且它们被归类为同一科。使用两种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的天花疫苗（ACAM2000和JYNNEOS）对Mpox的交叉保护是有效的。然而，ACAM2000有潜在的显著不良反应，如心脏问题，而JYNNEOS的风险较低。此外，尽管天花疫苗已停止使用40年，但Mpox仍以改变的特征重新出现。两种针对SARS-CoV-2及其多种变体的领先mRNA疫苗的安全性和有效性已在临床试验和随后的数据分析中得到证明。这种第一种mRNA治疗模型涉及向患者注射信使RNA以产生目标蛋白并引发免疫反应。高效力、安全给药的可能性、低成本制造和快速开发只是RNA疫苗的一些好处，为传统疫苗提供了可行的替代方案。在预防Mpox感染方面，mRNA疫苗非常有效，并且有一天可能会取代现有的全病毒疫苗。因此，本文的目的是提供对正在进行的Mpox mRNA疫苗的研究、开发和测试的概述。 引言 猴痘病毒（Mpox）可能是痘病毒科（Poxviridae）和正痘病毒属（Orthopoxvirus）中不常见的成员。西非和刚果盆地的谱系，通常被称为中非谱系，是两种基因上不同的Mpox谱系。Mpox具有双链DNA（dsDNA）。1958年，在哥本哈根血清研究所，该病毒在猴子中被发现，并被命名为“Mpox”。1970年8月，一名发烧的9岁男孩在刚果民主共和国（DRC）的Basankusu医院被诊断出首例Mpox感染。2003年，美国中西部地区首次在非洲以外地区出现Mpox。这次爆发中，土拨鼠，美国本土动物，被命名为储库，而不是猴子和松鼠。从加纳传入的感染冈比亚囊鼠将Mpox病毒传入土拨鼠，进而传入美国。此外，关于Mpox的进化历史以及病毒在非洲的多样化时间和地点，仍然有许多未知之处。世界卫生组织（WHO）表示，截至2022年7月20日，在2022年5月首次在英国确认后，Mpox爆发已蔓延至82多个地点。这项流行病学研究报告了2022年马德里爆发的前5周内508例确诊的人类Mpox病例。在这次大规模爆发中，几乎所有病例（99%）发生在与男性发生性关系的男性（MSM）中，皮疹主要发生在生殖器、会阴或肛周区域，以及腹股沟区域的淋巴结肿大，表明在性活动中的密切身体接触在这次爆发中的传播中高度相关。2022年5月，一场新的Mpox大流行在所有六个WHO地区被检测到。WHO于2022年7月23日宣布其为公共卫生紧急情况。在当前大流行之前，Mpox已在中非和西非国家的各个地区有记录。此外，非非洲人群中的绝大多数Mpox病例归因于前往疾病流行国家的国际旅行或进口牲畜。由于天花疫苗引起的免疫下降，Mpox有潜力感染全球人口。虽然该病毒通常不会在健康免疫系统的个体中引起显著的死亡率，但如果它传播到免疫受损的个体、儿童、老年人、孕妇或有包括糖尿病在内的合并症的个体，可能会发生严重的疾病和死亡。据推测，95%的感染个体通过亲密接触传播。发现41%感染HIV的人是同性恋或双性恋男性，占感染者的98%。此外，到2022年，3-6%的确诊病例已经死亡。非洲以外的首例Mpox记录发生在2003年美国中西部。共有71人感染了该病毒；然而，没有报告死亡病例。2005年，在苏丹记录了49例病例；随后的基因分析研究揭示，病毒的来源可能不是苏丹而是DRC。非洲记录了更多的麻疹病例，DRC从2011年到2014年每年报告大约2000例。2017年9月，记录了118例确诊病例；2018年9月，英国报告了首例病例。自2022年5月以来，当前爆发的病例在欧洲、大洋洲、亚洲和美洲的非流行地区报告。超过70个国家共有16000人被证实死亡；目前的死亡人数为0.03%。病毒的地理传播可能归因于从受疾病影响的国家进口或国际运输受感染的动物。Mpox在全球范围内以集群爆发的形式出现，不仅引起了WHO的关注，也促使国际卫生组织以高度警惕和广泛合作。从目前在不同国家流行的Mpox DNA分离物的基因组测序初步结果表明，影响多个国家的爆发可能归因于西非谱系。值得注意的是，从多个国家获得的Mpox基因组序列与西非谱系发现的谱系存在差异。然而，需要进一步研究以确定这些突变或基因组变化对病毒的传播性、毒力和免疫逃逸的影响。尽管Mpox症状通常持续两到四周并且是自限性的，但严重病例可能会发生，并且有3%到10%的病死率。然而，一些获得许可的药物和疫苗只给予患有严重疾病或免疫系统受损的人。目前还没有针对Mpox感染的有效和安全的治疗方法。天花疫苗接种已在大多数社区和国家停止，导致免疫力下降。尽管有证据表明天花疫苗可以85%地保护Mpox，但自从WHO在1980年宣布天花病毒灭绝以来，就没有提供过针对天花病毒的免疫接种。此外，在孕妇中，通过胎盘的传播与先天性Mpox有关，这可能在分娩期间和分娩后以及新生儿中表现出来。保护的持续时间尚不清楚。如果疫苗接种减少性Mpox传播，爆发将被控制并防止在最初高风险群体内外进一步传播。 抗病毒药物治疗已经感染了致病性正痘病毒的个体将提供即时的好处，与疫苗相比，疫苗的保护效果是延迟的。抗病毒药物在控制疫情方面的有效性尚未得到检验，因为在天花根除运动期间它们并不可用。抗病毒治疗无疑将对未接种疫苗的Mpox患者进行治疗和控制疾病传播有利。还开发了多种核酸检测技术来检测和表征Mpox。DNA聚合酶（E9L）和包膜蛋白（B6R）是实验中关注的两个正痘病毒基因。目前还没有针对Mpox引起的疾病获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的特定治疗方法。然而，有几种抗病毒药物（Tecovirimat、Cidofovir、Brincidofovir和静脉注射天花免疫球蛋白（VIGIV））是为治疗天花而开发的，现在正在用于治疗Mpox。然而，关于它们治疗Mpox感染的效力没有信息。 鉴于WHO宣布Mpox感染为全球公共卫生紧急情况，各国必须优先考虑及时和全面评估效力和效果，以确保为迅速实施疫苗接种做好准备。WHO在2022年6月24日发布了关于Mpox免疫接种的临时建议，强调目前不需要也不建议广泛接种。在疫苗效力的合作研究中，使用标准化程序和数据收集方法至关重要。WHO非常重视为疫苗接种倡议提供支持，其中包括监测和接触者追踪。此外，WHO强调需要在这种特定环境中实施有效的公共卫生沟通和强大的药物警戒。JYNNEOS疫苗已获准在美国当前的疾病爆发期间用于天花和Mpox预防。JYNNEOS可以被ACAM2000替代，ACAM2000已获批准用于帮助天花和Mpox预防。在III期临床试验中，改良的安卡拉牛痘病毒（MVA）显示出有利的安全性。然而，重要的是要注意，在MVA能够获得许可用于一般人群作为预防天花和Mpox感染的预防措施之前，还需要进行更大规模的疫苗研究。产品的定价是要考虑的因素之一。因此，使用ACAM2000或MVA对Mpox和天花进行暴露后疫苗接种仍然是首选选项。尽管有潜力，ACAM2000和MVA疫苗尚未满足全球医疗需求。新研究表明，使用JYNNEOS疫苗接种仅部分增加了针对Mpox的中和抗体（nABs）的产生。因此，为了对抗当前的Mpox，迫切需要一种安全、有效且易于获得的特定Mpox疫苗。使用核酸疫苗可以开发出针对该疾病的安全有效疫苗。大规模疫苗生产也容易且便宜。mRNA疫苗在预防病毒感染方面提供了许多优势。这些包括它们能够快速且大规模合成、出色的安全记录无需核输入以及在刺激体液和细胞免疫反应方面的效力。一旦进入，细胞将mRNA解释为一组指令并构建与病原体上的抗原结合的蛋白质。免疫系统将这些外来抗原识别为入侵者，动员称为ABs和T细胞的防御，并为免疫系统准备可能的未来攻击。斯坦福医学院的研究人员发现，旨在对抗COVID-19的辉瑞/BioNTech mRNA疫苗在刺激杀手T细胞方面表现出优越的效力，这是免疫系统的关键组成部分，与严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的自然感染相比，SARS-CoV-2是2019冠状病毒病（COVID-19）的病因。多项研究提供了支持使用脂质纳米颗粒（LNPs）作为mRNA疫苗传递机制的有利使用的证据，由于在抑制Mpox方面取得了显著进展。这种现象的原因是纳米颗粒（NPs）被广泛认为是连续传递的可靠机制，确保了mRNA的完整性，增强了细胞吸收，并提高了核酸在宿主细胞内的传递和释放效率。研究人员还应推进对Mpox、其临床管理和感染控制和预防专业知识的了解，特别是在公共卫生人员中。应保证平等获得医疗保健和疫苗的机会，并充分解决MSM社区中的歧视和污名化问题。最后，研究人员应启动国际伙伴关系，进行临床研究，以检验Mpox疫苗和抗病毒药物的有效性和安全性。 考虑到关于Mpox的现有条件，应特别关注接种这种病毒。因此，在这项研究中，我们将检查Mpox的不同特征、预防方法和不同设计的mRNA疫苗。 Mpox的特征和结构 1970年在非洲报告了首例人类Mpox感染。正痘病毒的自然储库是小型啮齿动物，人类和灵长类动物是偶然宿主。天花免疫接种诱导对Mpox的交叉保护。六十年前，全球天花根除计划（GSEP）和Mpox在非洲共存。2022年人类Mpox爆发引发了对Mpox对GSEP倡议可能影响的文献评估。由于两种正痘病毒是相同的，证明没有非人类天花储库对评估GSEP至关重要。发现非人类天花储库非常遥远。人类Mpox限于未接种疫苗的个体，并未在接种天花疫苗的人类中表现出来。1989年之前，在DRC的监测确定Mpox极不可能在人类中持续存在，并发展成为重大的公共卫生问题。在天花疫苗接种停止几十年后，2005年至2007年在DRC的Mpox监测显示，人类Mpox的发病率增加了20倍，这与以前接种天花疫苗的比率大大降低有关。 天花仅在人与人之间传播，没有公认的人畜共患宿主；相反，猴痘可以通过动物宿主传播给人类。人类猴痘在西非和中非的农村社区间歇性地存在，那里的血清学调查由WHO资助。1986年之前，基于人群的调查估计，12-15%的儿童对正痘病毒有抗体。患者的平均年龄仅为四年半。338例猴痘病例中有245例归因于动物来源。从加纳进口的啮齿动物贸易引发了疫情，这些啮齿动物被作为异国情调的宠物出售。有推测这些啮齿动物通过动物与动物的接触将感染传播给了共同饲养的土拨鼠，土拨鼠也是作为宠物购买的。尽管报告了47例确诊和可能的病例，但没有死亡发生。大多数病变是孤立的皮肤病变。为与人类病例和商业啮齿动物有直接接触的个体提供了天花疫苗（DryVax，Wyeth）。2003年美国爆发的两例人与人之间的传播可能是一个因素；然而，与感染啮齿动物的接触仍然是可能的。 在电子显微镜下，猴痘具有可识别的椭圆形或砖形结构，具有大小在200到400纳米之间的脂蛋白包膜。尽管是一种DNA病毒，猴痘在与糖胺聚糖结合并进入宿主细胞后，在感染细胞内完成其生命周期。为了进入宿主细胞，还提出了使用经典的凋亡模拟机制。其他方法包括通过基于肌动蛋白的大胞饮作用机制的内体摄取，或通过病毒包膜上的配体与宿主细胞的质膜受体（如硫酸肝素或硫酸软骨素）的相互作用，这导致病毒包膜的片段分散在质膜中。然后病毒将酶和病毒蛋白分泌到细胞质中，削弱细胞防御并促进早期基因表达，导致早期蛋白的发展，DNA复制和中间转录因子的创造。具有每个侧面的侧体的外膜，保护膜结合，一个充满dsDNA基因组和转录因子的酶填充的核心。 以前的研究表明，猴痘基因组与天花基因组高度相似，大约为96.3%。这种相似性归因于猴痘基因组内的基本酶和蛋白。此外，在190个开放阅读框（ORFs）中发现了60多个氨基酸残基。在56,000-120,000的核苷酸位置，猴痘，一个非常保守的中央编码区序列（CRS），被各种末端包围，包括倒置末端重复（ITRs）。猴痘基因组的ITR区域至少有四个已识别的ORFs。猴痘病毒颗粒包含30多种膜和结构病毒蛋白以及与DNA依赖性RNA聚合酶相关的转录酶。病毒有两种不同的传染性形式，即细胞外包膜病毒（EEV）和细胞内成熟病毒（IMV）。EEV被认为在早期扩散中起着至关重要的作用，而IMV是在细胞溶解时产生的。IMV和EEV基本上非常不同，因为IMV缺乏最外层的膜层并以不同的方式感染细胞（图1）。然而，这两种病毒颗粒具有不同程度的病毒蛋白整合。尽管猴痘复制复杂，但它与其它正痘病毒的复制方式广泛接受为相同。 图1 被双链DNA猴痘病毒感染的细胞将同时具有细胞内成熟的病毒（IMV）和细胞内包膜病毒（IEV）。猴痘是最大和最复杂的病毒之一，其特征为砖形结构，长度在220-450纳米，宽度在140-260纳米。它由核心、侧结构、外膜和外脂蛋白包膜四个组成部分构成。核心由双链病毒DNA和核心纤维组成，是中心组件。栅栏层是一个围绕这一特定层的不可渗透结构。中央的核、侧体和栅栏层都被包含在外膜中。 猴痘感染中的免疫反应 先天和适应性免疫有助于正痘病毒的识别和根除。正痘病毒利用许多DNA感应系统，如DNA依赖性蛋白激酶、Toll样受体9（TLR-9）、环状鸟苷酸-腺苷酸（环状GMP-AMP，cGAMP）合成酶和干扰素γ（IFN-γ）可诱导蛋白16，来触发免疫反应。核因子κB（NF-κB）和IFN信号通路由于DNA感应器激活刺激干扰素基因（STING）而被激活。正痘病毒产生dsRNA中间体，刺激TLR3和蛋白激酶R（PKR）。PKR和TLR激活NF-κB和IFN途径。真核翻译启动的2A复合体也被PKR磷酸化，通过这种机制抑制mRNA翻译。在识别病毒并启动早期先天反应后，随后的病毒根除严重依赖适应性免疫反应。大多数造血抗原呈递细胞（APCs）是CD14+单核细胞。这些细胞可以向CD4+和CD8+T细胞展示猴痘抗原，因此有助于细胞因子的产生，消除感染细胞和宿主的血清学反应。感染淋巴结的肺和纵隔淋巴管，以及窦充满了免疫阳性的单核细胞，用于痘病毒抗原，表明这些细胞是淋巴和随后的血液传播的主要载体。淋巴组织、皮肤、口腔粘膜、胃肠道、生殖系统和肝脏的病变似乎是通过与单核细胞相关的病毒血症进行系统性病毒传播的结果。研究人员假设单核吞噬系统在促进病毒在系统性感染期间向全身的二级和三级部位传播中起着至关重要的作用。猴痘抗原仅在表现出形态缺陷的组织中看到，主要局限于成纤维细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DCs）和受损组织的上皮细胞。自然杀伤细胞（NK细胞）与单核细胞一样，在先天免疫中起着关键作用，可能影响适应性免疫反应。NK细胞在控制猴痘病毒载量方面的作用在CAST/EiJ小鼠中被揭示，然而，病毒清除与NK细胞数量或活性之间没有相关性。由于缺乏NK细胞，这种菌株特别容易受到正痘病毒感染。最近的一项研究表明，感染猴痘的食蟹猴（通过平均46.1倍在感染后第8-9天和感染后第7天的23倍）的淋巴结和外周血液中NK细胞数量迅速增加。感染显著损害了许多NK细胞亚群在快速增殖之前的迁移能力，导致它们在淋巴和/或炎症区域的招募受到不利影响。此外，已经显示趋化因子受体如CXCR3、CCR5、CCR6和CCR7表现出下调。此外，已经证明，从血液和淋巴结分离的NK细胞在颗粒化和产生IFN和肿瘤坏死因子（TNF）的能力上有所降低。IL-15治疗在预防CAST/EiJ小鼠的致命猴痘感染方面显示出效果，即使在CD4+和CD8+T细胞数量减少的情况下也是如此。这意味着观察到的保护作用可能归因于NK细胞的扩增。IL-15治疗的给药已被观察到引起短暂增加的CD8+T细胞和NK细胞群体，它们表现出分泌IFN。猴痘的两个谱系在致病性方面不同。中非谱系引起更严重的疾病，具有出色的病死率。这种病原体的显著致病性归因于其阻碍T细胞受体介导的T细胞激活和阻碍人类细胞产生促炎细胞因子的能力，如TNF-α和IFN-γ。中非谱系还具有一个基因，可以防止补体酶的工作，这导致了一个关键的免疫调节组成部分，有助于其更高的毒力。然而，研究表明，主要组织相容性复合体（MHC）表达或MHC分子的细胞转运不受猴痘毒力的影响。西非谱系的较低毒力是由于ORF中的缺失和片段化造成的。 作为正痘病毒属的成员，天花病毒在人类中引起严重且高度传染性的疾病。1980年，由于全球性的疫苗接种运动，利用来自密切相关的牛痘病毒（VACV）的疫苗，天花被宣布灭绝。目前尚无已知针对人类猴痘感染的特定干预措施。相比之下，1980年代扎伊尔的实证证据表明，在根除工作中接种天花疫苗的个体也显示出显著的猴痘感染交叉保护。然而，目前50岁以下年龄组的相当一部分人没有天花疫苗接种记录，且最初在全球根除工作中使用的疫苗目前不可获得。在2022年全球猴痘爆发期间，为被认为对猴痘高度易感的人群提供了超过一百万剂现代化的天花疫苗，用于暴露前和暴露后的预防。随着对天花疫苗的免疫力下降，猴痘有可能在全球人口中增加。42年前，在中国使用天坛型牛痘病毒（VTT）来保护人们免受天花的侵害。重要的是要找出43年前或更早接种疫苗的人对天花的免疫程度，以及他们的免疫系统对猴痘的敏感性。一项研究使用294名志愿者来了解剩余体液免疫的水平。他们观察了牛痘特异性IgG水平、nABs滴度和猴痘A29L、B6R、A35R和M1R的交叉ABs。结果显示，人群对天花疫苗保持体液免疫，而VTT特异性NAb水平随年龄下降。在1981年之前，应该接受VTT的大部分人群仍然对猴痘免疫，特别是针对A35R和B6R抗原的ABs。基于这些结果，似乎大多数中国人群在天花疫苗接种后至少保留VTT特异性IgG ABs 42年。这些ABs可能提供一定程度的猴痘保护。研究人员发现，60人（89.6%）和40人（70.1%）的接种者分别有抗猴痘IgG和Nabs。在30%的疫苗接种者中，研究人员看到了对正痘病毒和猴痘肽池的T细胞反应。因此，研究表明，40-60年前接种天花疫苗的人群中有相当一部分表现出体液交叉免疫。然而，较小的子集（30%）的接种者对猴痘显示出T细胞特异性反应。 在COVID-19大流行期间，SARS-CoV-2病毒出现了新的变种，表现出逃避先前感染或初始疫苗获得的部分免疫力的能力。这促使开发更新的疫苗，以提供针对奥密克戎和其他令人关注的SARS-CoV2病毒变种的交叉保护。目前尚不清楚猴痘基因组中是否发生类似的突变，以及是否需要对疫苗进行未来的修改以维持免疫力。根据在卢瓦尔河谷进行的法国研究，发现有9人在免疫后六个月内突破了猴痘，尚不清楚这是否是由于免疫力下降、MVA-BN疫苗引起的猴痘特异性nAB反应水平相对较低，或是否预示着能够逃避疫苗诱导免疫力的新猴痘变种的出现。暴露前预防研究表明，突破病例的数量有限，尽管疫苗估计的有效性约为85%，但仍然可以预期。例如，Sagy等人在接种一剂疫苗后21至47天发现了5例突破猴痘。 此外，猴痘病毒已被确定具有编码多种病毒蛋白的能力，这些病毒蛋白在规避宿主的免疫反应中起着至关重要的作用。这些物质可以干扰合成与炎症相关的基因的关键转录因子，如干扰素调节因子3（IRF3）和NF-κB，并阻碍负责病原体识别的受体的信号通路。猴痘除了降低IFNα/β合成和阻碍蛋白激酶R（PKR）介导的途径外，还可以干扰干扰素信号。猴痘还分泌针对TNF、IFN-γ、IL-1β、IL-18和IL-6等重要炎症分子的蛋白。此外，猴痘可以通过合成几种破坏凋亡途径的病毒蛋白来抑制感染细胞的凋亡。猴痘免疫调节因子的另一个例子是补体控制蛋白（CCP），它阻止补体激活途径的启动。猴痘中非扎伊尔株表达的D14，抑制补体激活，但这种病毒蛋白并非西非猴痘株的特征。最后，猴痘可能通过阻止T细胞和NK细胞的激活来抑制免疫细胞功能（图2）。 图2 展示了猴痘感染可能的免疫病理学，包括体液免疫、先天免疫、适应性免疫和免疫逃逸。(a) 猴痘病毒抑制趋化因子（CCR5、CXCR3和CCR6）的表达，耗尽NK细胞功能并减少IFN-γ和TNF-α的分泌。(b) 猴痘病毒引起嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和单核细胞等粒细胞和单核细胞的异常。猴痘可能阻止自然杀伤细胞释放炎症细胞因子和清除病毒感染的细胞。猴痘也可能阻碍T细胞受体的跨信号传递，破坏适应性免疫反应。(c) 通过抑制抗病毒的I型干扰素反应，猴痘避免了先天免疫反应。猴痘可能通过降低mRNA产生和抑制I型干扰素，从而绕过蛋白激酶R途径，该途径介导蛋白激酶R的磷酸化。通过干扰MAPK/ERK1/2途径的磷酸化，猴痘也可能减少炎症介质的产生。通过增加ATK途径的磷酸化，它抑制了细胞凋亡。e) 猴痘患者可能因为一种中和病毒的单克隆抗体可能通过附着在细胞上的Fc受体（FcR）上的Fc区域增强病毒进入细胞而有更糟糕的预后。与猴痘感染引起的细胞因子风暴相关的是大量的辅助性T细胞2（Th2）免疫反应。这种反应的特点是血清中IL-4、IL-6、IL-5、IL-8和IL-10水平的增加，以及与Th1相关的细胞因子（如IFN-α、IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-12）的减少。同时观察到总抗体滴度的增加，以及IgG和IgM水平的上升。 猴痘感染疫苗 通过预防严重疾病和降低住院率，疫苗被视为抗击猴痘的关键方法。然而，对一种正痘病毒的免疫反应可以检测到其他正痘病毒。这种发现所导致的保护水平可能因不同正痘病毒之间的相关程度而异。人们认为，免疫学上越来越天真的人群是自天花免疫结束以来猴痘发病率上升的原因。由于免疫交叉反应，可以开发多种动物模型来测试疫苗和抗病毒药物。这种交叉反应有两个主要原因。首先，因为正痘病毒在许多序列上具有相似性，特别是在免疫学上重要的蛋白质方面，所以有许多共同的免疫表位。此外，至少有24种膜和结构蛋白被ABs靶向。有证据表明，天花疫苗可能提供一些针对猴痘的保护，并减轻其临床表现。目前，美国战略国家储备（SNS）中有三种天花疫苗：ACAM2000®、JYNNEOS（也称为IMVAMUNE、IMVANEX、MVA-BN）和Aventis Pasteur天花疫苗（APSV），这些疫苗可以在研究性新药（IND）程序下用于天花。 1980年，世界卫生组织（WHO）宣布全球根除了自然发生的天花。然而，随后对生物恐怖主义的担忧和猴痘的爆发促使在21世纪初基于VACV进一步授权天花疫苗接种。第一批天花疫苗，如Dryvax，是使用淋巴源的Lister/Elstree、Ikeda和纽约市卫生局VACV菌株开发的，这些菌株是在动物皮肤上培养的。相比之下，第二和第三代疫苗的开发包括使用细胞培养技术，以提高其安全性。目前，在美国，有两种官方授权的天花疫苗。美国FDA在2007年批准了基于复制VACV的第二代天花疫苗ACAM2000。ACAM2000基于Dryvax克隆。被认为对天花病毒高度易感的人应该进行积极疫苗接种作为预防措施。然而，不建议在这个人群中特别进行针对猴痘的免疫接种。ACAM2000在高度免疫抑制的个体中禁忌，因为可能会出现显著不良反应，如心肌心包炎，特别是在那些之前没有接触过天花的人中。通过在原代细胞培养或鸡蛋中使用病毒的多次通过作为减毒技术，已经实现了基于进一步减毒VACV的替代疫苗的开发。2019年，FDA批准了Jynneos。Jynneos被归类为第三代活体、非复制、减毒免疫接种，专门设计用于预防天花。2022年5月17日，在确认美国首例正在进行的猴痘流行病例后，作为预防疾病的措施，开始了由Bavarian Nordic开发的MVA疫苗JYNNEOS的接种。2022年6月28日，美国国家免疫计划提议向已经暴露或疑似暴露于猴痘的个体皮下注射疫苗。这一建议旨在扩大符合免疫资格的人群范围，作为扩大的暴露后预防（PEP）策略的一部分。2022年8月9日，FDA发布了紧急使用授权（EUA），允许经皮内注射0.1毫升JYNNEOS，增加了可用的疫苗库存。接种JYNNEOS的患者不会面临患上心肌心包炎或心肌病等严重副作用的风险。然而，ACAM2000疫苗可能会有严重的副作用，如呼吸困难、面部肿胀、头晕和心肌心包炎风险增加。ACAM2000和JYNNEOS是美国FDA批准的疫苗。然而，ACAM2000有更高的显著副作用风险，包括心脏问题，而JYNNEOS较少。因此，JYNNEOS比ACAM2000更可取。此外，建议在有暴露猴痘疾病风险的个体中使用JYNNEOS进行暴露前预防正痘病毒感染。APSV，一种复制能力牛痘疫苗，可在许可免疫不可用或不适用时，在研究性新药申请（IND）或EUA下进行接种。预计ACAM2000和APSV的安全性将具有可比性。人们还假设，像ACAM2000一样，APSV会导致心肌心包炎。美国FDA已在ACAM2000不适用或不可用的情况下给予APSV有条件的批准，作为IND或EUA。 使用牛痘的Lister（Elstree）菌株对开发LC16 m8疫苗至关重要，这是一种活体、复制、第三代天花免疫接种。这种特定的疫苗自1975年以来已在日本获得正式授权用于积极免疫接种。2022年8月，日本当局扩大了疫苗的范围，包括防范猴痘。由于更好的安全性和减毒表型，这些疫苗可以给予免疫受损的患者。通过动物研究获得的数据确定这些猴痘疫苗的有效性，这表明在非人灵长类动物中接种这些疫苗提供的保护，以及临床试验的数据，这些试验确立了它们在人类中的免疫原性（表1）。 猴痘感染新型疫苗 开发新型疫苗以对抗新兴和传染性疾病受到重大概念和科学挑战的阻碍。COVID-19大流行凸显了开发既安全又高效的疫苗配方所面临的挑战。这些配方通常基于流行的生物平台，如完整的减毒或灭活的SARS-CoV-2病毒、非复制性人类或猿猴腺病毒DNA载体，这些载体使用病毒的部分，或特定的mRNA模板，针对病毒刺突（S）糖蛋白的部分。为了降低疫苗篡改的风险并优先考虑研究人员的安全，当前生产和分发基于生物平台的病毒疫苗的协议需要使用高度规范的生物安全设施，以及严格的冷链和包装线。此外，由于它们的稳定性和特异性差，第二代疫苗不是针对亚单位疫苗的实用方法。另一方面，控制合成技术使得为许多致命疾病生成疫苗配方成为可能，如疟疾和COVID-19，这些疫苗成本低、稳定、特异性强、无毒且安全。因此，探索针对猴痘的新型疫苗策略对于降低感染风险至关重要。有希望的方法包括灭活疫苗、活减毒疫苗、病毒样颗粒（VLPs）、重组蛋白疫苗、核酸疫苗和基于NP的疫苗。 细胞内mRNA递送是由最先进技术辅助的，由LNPs领导。mRNA生产的最关键的组成部分是离子化脂质，它通常与磷脂、甾醇和脂锚定聚乙二醇（PEG）一起存在于LNPs中。根据分析，蛋白质表达不是决定疫苗效力的唯一因素。其他变量也起作用。NP生物物理特性已知会影响免疫原性，就像其他疫苗方法一样。NPs的大小影响它们刺激免疫系统的能力和当它们被用作基于蛋白质的疫苗的纳米载体时在组织和细胞中的分散。脂质体的大小是另一个影响T辅助细胞与T辅助细胞2比率（Th1/Th2）的因素。因此，与更大或更小的囊泡相比，250至750纳米之间的囊泡引发更强的Th1反应。另一方面，多层囊泡可能会触发更多的Th2反应。研究还表明，LNPs触发免疫系统的能力受到它们表面电荷的影响。例如，带正电荷或负电荷的囊泡比不带电荷的囊泡引发更强的抗体中和反应。由于它们与先天免疫系统组分的相互作用，阳离子脂质增强了LNP配方mRNA疫苗的免疫原性，从而实现适当的治疗效果。 LNP在其他mRNA递送方法（如单核吞噬系统（MPS）、细胞摄取促进、最小免疫原性和内体捕获）方面的优势使其成为一个新兴的候选者。mRNA加载的LNP遇到的几个障碍之一是免疫接触，包括先天和适应性免疫以及与LNP组分的相互作用。然而，LNP组成突出了一个重大障碍，即通过细胞质运输将mRNA临床递送到目标组织。因此，它们可能通过增加疫苗吸收到DCs和阻止mRNA与非APCs的相互作用来减少不良副作用的可能性。了解mRNA-LNP治疗引起这些不良效果的机制并制定预防措施至关重要。身体对PEG化LNPs的反应产生抗PEG抗体，这可能导致不良效果。立即超敏反应的重要细胞，嗜碱性粒细胞或肥大细胞，是IgE抗体结合到FcεRI的地方。作为介质，几种酪氨酸激酶被激活。身体在给药时将抗PEG IgM与PEG化脂质体结合。这个复合物激活了经典的补体途径，并由于Kupffer细胞吞噬作用迅速退出血流，这个过程被称为加速血液清除（ABC）现象。这种类胰蛋白酶刺激嗜碱细胞、肥大细胞和巨噬细胞，产生炎症介质。这种介质通过与平滑肌、内皮和自主效应细胞的受体结合，激活补体（C）激活相关的伪过敏（CARPA）。mRNA-LNP基于药物可能触发自身免疫的方式有：（1）先天免疫系统对LNPs作为佐剂的反应，导致自身免疫过程进行；（2）mRNA作为自身抗原，通过TLR7启动自身免疫过程；（3）在mRNA-LNP疫苗的情况下，免疫系统得到加强，可能加剧自身免疫反应。研究人员发现，编码四种参与病毒附着、进入和传播的高度保守的猴痘表面蛋白的mRNA-脂质NP疫苗可以诱导针对猴痘特异性免疫和异源保护，以应对致命的VACV挑战。与当前的猴痘疫苗MVA相比，mRNA疫苗产生了更大的中和和细胞扩散抑制活性针对猴痘和VACV，以及增强的Fc效应Th1偏向的体液免疫对四种猴痘抗原和四种VACV同源物。然而，用两种、三种或四种猴痘抗原表达的mRNA疫苗接种可防止与疾病相关的体重减轻和死亡。然而，用单一猴痘抗原mRNA疫苗接种对VACV挑战提供了最小的保护。抗体活性从中和到非中和不等，因此为什么多价猴痘mRNAs比MVA提供优越的交叉保护。研究人员证明，针对四种高度保守的病毒表面抗原的mRNA基础疫苗通过引发强效抗体迅速抑制病毒感染，对VACV提供了显著的保护。表达四种高度保守的猴痘抗原的mRNA疫苗是Freyn等人在另一项调查中评估的潜在疫苗之一。关于诱导免疫反应和预防小鼠的致命感染，mRNA疫苗的表现与MVA相当或更好。此外，研究人员还检测到对疫苗编码的四种VACV同源物和四种猴痘抗原的更高Fc效应Th1偏向的体液免疫。虽然包含编码两种、三种或四种猴痘抗原的mRNA的多价疫苗与MVA免疫相当或更好地保护了免受与疾病相关的体重减轻和死亡，但编码单一猴痘抗原的mRNA疫苗只提供了有限的VACV挑战保护。这些发现鼓励开发针对正痘病毒的mRNA疫苗，以便在爆发期间迅速响应。另外，使用两种IMVs（A29L和M1R）和两种EEVs（A35R和B6R）开发了猴痘四价mRNA疫苗mRNA-ALNP和mRNA-B-LNP。小鼠两次肌肉注射mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP后，发展出强大的VACV特异性nABs和猴痘特异性IgG抗体。此外，它在小鼠中促进了针对猴痘的保护性记忆B细胞和杀手T细胞免疫的发展。来自mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP免疫小鼠的血清被动转移也保护了裸鼠免受VACV挑战。小鼠在接受两次mRNA-A-LNP或mRNA-B-LNP剂量时免受VACV感染。结论mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP都是安全有效的免疫选择，可用于预防猴痘流行和其他由正痘病毒引起的爆发，包括天花。 在另一项研究中，J.W.Hooper等人表明，在用由四种VACV基因（L1R、A27L、A33R和B5R）组成的DNA疫苗接种后，猕猴在面对猴痘的致命攻击时免受严重疾病的影响。用单一基因（L1R）免疫的动物患上了严重疾病，但活了下来，该基因指定了一个病原体nABs靶标。这是首次证明针对天花-猴痘免疫的亚单位疫苗策略的可行性。猴痘E8L蛋白被显示包含一个环形神经节苷脂结合基序，根据另一项调查。这个基序由三个潜在的B线性表位共享，可以用来提供安全有效的猴痘疫苗。由于这三个序列在E8L蛋白中被鉴定出来，建议将它们用作未来猴痘特异性疫苗配方中的免疫原（重组蛋白、合成肽或基于遗传的）。这种基于脂筏/神经节苷脂的策略除了目前的治疗方法外，还可能为未来病毒流行提供治疗和疫苗反应。根据现有数据，仍然需要推进有效和安全的新型疫苗的开发，这些疫苗专门针对猴痘。这需要在宣布猴痘为之前探索创新的疫苗方法，包括VLPs、重组蛋白、核酸（mRNA或DNA）和基于NP的疫苗。 为了提高疫苗的特异性和效力，研究人员开发了专注于保守抗原的亚单位疫苗。这些疫苗以纯化蛋白或质粒DNA的形式接种，或通过病毒载体疫苗进行。这些方法特别针对导致感染的两种不同的免疫学形式的痘病毒，即成熟病毒粒子和包膜病毒粒子。核酸疫苗在安全性和效力方面显示出与传统灭活疫苗相当，有效地模拟了疫苗接种过程。此外，使用工业手段生产这些疫苗既经济又简单。为了确定最有效的疫苗，评估许多因素至关重要，如对机体的影响、反应原性、安全性、细胞毒性以及与疫苗接种相关的潜在副作用，特别是在那些处于较高风险或更容易出现不良结果的人群中。2022年非洲以外地区猴痘爆发突显了缺乏已显示效力和最小不良反应的疫苗。在猴痘流行期间使用这种疫苗可能有助于预防或减少感染，作为那些靠近确诊病例人群的暴露前预防（PrEP）。 mRNA疫苗 DNA中存储在细胞核中的遗传指令被运送到细胞质中，那里的核糖体负责将它们翻译成蛋白质。mRNA治疗可能恢复由特定蛋白质功能丧失引起的疾病治疗中的蛋白质活性，而大多数传统药物通过结合和阻断过度活跃的疾病引起蛋白。此外，mRNA治疗预计将只产生预期的影响，正如核酸序列所描述的。mRNA也比抗体或细胞治疗更容易大规模生产和纯化。此外，mRNA寿命短，无法进入细胞核，因此极不可能导致遗传变化。信使RNA在疫苗开发中的使用也是新颖的。尽管mRNA疫苗对公众来说是相对较新的，但专家们已经研究了一段时间。编码刺突蛋白的DNA序列作为mRNA疫苗合成的模板，然后被包装成基于脂蛋白的载体，以促进其被细胞迅速吸收并在体内保护免受破坏。当肌肉内注射时，疫苗到达更远的区域，mRNA分子进入细胞，在那里它们可能帮助加快翻译过程。当mRNA进入体内时，将触发体液免疫反应，促使B细胞成熟为记忆B细胞。通过这种方式，记忆B细胞在随后的暴露中可能有效地阻断抗原。两种最常见的mRNA疫苗已被证明在临床研究中对SARS-CoV-2及其多种变体安全有效。由Pfizer-BioNTech（纽约，纽约，美国）和Moderna（剑桥，马萨诸塞州，美国）制造的两种基于mRNA的疫苗已获得FDA授权。mRNA-1273，或“Spikevax”，是一种狂犬病疫苗。FDA为18岁以上的成年人授予了mRNA-1273的EUA。传统的、非复制型和自复制（自我扩增）mRNA基础疫苗是三种主要类型。非复制构建中使用的mRNA是短而基础的，它不编码可能无意中触发免疫反应的任何蛋白质。感兴趣的免疫原编码在一个由5′和3′非翻译区（UTRs）包围的编码序列内，一个5'帽子结构的7-甲基鸟苷（m7G）通过三磷酸桥连接到第一个核苷酸，以及一个3′-聚（A）尾部。5′ m7G帽子抑制5′-3′外切核酸酶介导的降解，激活翻译启动因子，并促进有效翻译，同时也防止被细胞质RNA传感器、RNA螺旋酶视黄酸诱导基因I（RIG-I）识别。5′和3′ UTRs的大小和组织以及这些区域中的调节元素也影响最大基因表达。mRNA疫苗构建的翻译和稳定性取决于聚（A）尾部及其长度。序列工程（密码子优化）和核苷酸改变（例如，用假尿苷替换尿苷）通过减少TLR识别和对mRNA构建的先天免疫反应来提高翻译效率。由于DNA依赖RNA聚合酶在构建合成过程中产生小的核糖核苷酸和双链RNA杂质，因此mRNA纯度至关重要。通过抑制先天免疫反应和产生I型干扰素和炎症细胞因子，刺激蛋白质翻译和合成，这些反应是由这些模式识别受体识别的污染物去除时触发的。然而，在其自然状态下，mRNA不能用于治疗。缺乏有效、耐受良好的递送机制一直是开发mRNA疫苗的主要障碍，直到最近。细胞吸收和易位的需求是主要障碍。mRNA分子面临着由于细胞膜上的负电位而造成的严重障碍。裸露的mRNA太大且带有很强的负电荷，无法被动穿透细胞膜，使其容易受到核酸酶的消化。自复制mRNA和非复制mRNA疫苗构建包含相同的属性，包括5′帽子序列、5′和3′翻译区（UTRs）、带有编码序列（CDS）的开放阅读框（ORF）和3′聚（A）尾部。自复制mRNA疫苗提供了质粒DNA疫苗的多功能性，以及改善的免疫原性和安全性。对这些疫苗按预期工作至关重要的是到达细胞的细胞质，那里编码和放大抗原蛋白。由于RNA的亲水性和大的净负电荷，细胞吸收受到阻碍。使用电穿孔或弹道颗粒的物理传递，以及与阳离子脂质或聚合物的静电复合，已被作为解决这个问题的潜在解决方案进行了研究，以改善细胞吸收。在自复制mRNA疫苗的初始临床前测试中，小动物和非人类灵长类动物显示出强大的先天和适应性免疫反应。关于mRNA不稳定性和大规模生产的实用性的担忧长期以来一直对创建mRNA疫苗的可能性表示怀疑。在现代，这些担忧被视为技术广泛采用的不可逾越的障碍。现在可以生产足够数量和质量的非放大mRNA疫苗以满足监管标准，并且它们正在人类临床试验中研究。如果自复制mRNA疫苗在人类试验中的有希望的结果得到免疫原性、效力和可接受性方面的类似优异结果的证实，这个平台有潜力将核酸疫苗建立为人类疫苗的灵活新工具。 非病毒途径施用的自复制mRNA疫苗的未来是光明的：它们可能成本低、有效、易于扩展且适应性强。自复制mRNA像病毒一样通过扩增其基因组和宿主细胞的抗原编码mRNA来发挥作用。这导致宿主免疫系统对抗原产生强大且持久的反应，包括体液和细胞免疫反应。此外，从理论上讲，自复制mRNA可以编码任何真核序列，而无需修改生产过程。这将允许与当前疫苗相比，更快和更适应的研究与开发时间表，以便更快地应对新的传染病。非复制mRNA（NRM）构建体由编码序列（CDS）编码，其5′和3′端被非翻译区（UTRs）包围，具有5′帽结构和3′-聚（A）尾部。自复制mRNA（SAM）构建体包含可以调节细胞内mRNA扩增的附加复制酶组分。NRM和SAM在LNPs中配制，这有助于封装mRNA构建体，从而促进细胞吸收并防止降解。通过其传递系统，mRNA通常通过膜衍生的内吞途径进入细胞。内体逃逸促进mRNA进入细胞质。定位在细胞质中的核糖体迅速将NRM构建体转化为目标蛋白，然后进行翻译后修饰。核糖体还能够迅速翻译SAM构建体，生成对mRNA自我扩增至关重要的复制酶装置。核糖体促进将自我扩增的mRNA构建体翻译为目标蛋白，然后进行翻译后修饰。所考虑的蛋白以细胞内、跨膜或分泌形式产生。适应性和先天免疫反应识别目标蛋白。 mRNA治疗在降低预先存在或抗载体免疫风险、提高安全性、精确剂量控制以及多次给药潜力方面提供了许多优势。Pardi等人进行了一个实验，他们通过静脉注射将单剂量的LNP封装的修饰核苷mRNAs给药，这些mRNAs编码抗HIV-1 nAB VRC01的重链和轻链，在小鼠体内。研究人员观察到这种给药后的血清中功能性AB水平显著升高。此外，这种干预有效地保护了人源化小鼠免受HIV-1感染。 LNP-mRNA货物在注射后不久通过内吞作用到达肌肉细胞，随后mRNA被翻译以产生亚稳态三聚体前融合S蛋白。肌肉旁边的血管动脉网络可能稍后吸引已经渗透的APCs。使用细胞翻译机制和其他细胞质组分通过每个注射的mRNA产生一个结构良好且完全功能的蛋白是mRNA疫苗的一个优势。使用全长S蛋白的mRNA疫苗的翻译产物中包括一个跨越氨基酸1至15的信号肽，允许蛋白质被转移到质膜或从细胞质中释放。一旦主要被内体衍生的蛋白酶体分解，I类主要组织相容性复合物（MHCs）将包括大部分蛋白质，并分别呈现给CD8+和CD4+T细胞。II类MHC复合物由转染mRNA疫苗或其内吞免疫原的DCs组装，然后呈现给免疫细胞。然而，通过B细胞激活的体液免疫反应是mRNA疫苗接种的主要方法。通过CD40的结合和与同源CD4+T细胞的相互作用激活后，幼稚B细胞将在淋巴器官中增殖并发展成记忆B细胞或分泌ABs的浆细胞。亲和力决定了新激活的B细胞是否会发展成长寿命的浆细胞或休眠的记忆B细胞。浆细胞产生的ABs在血液中循环，并在次级抗原暴露时结合和中和抗原，防止携带抗原的病毒感染其目标细胞。如果没有足够的ABs，记忆B细胞就不会被触发以产生随后的免疫反应。 mRNA疫苗还具有自我佐剂特性。当ssRNA被TLR7和TLR8在内体中识别时，会激活髓样分化标记88（MyD88）信号。TLR3、视黄酸诱导基因I蛋白（RIG-I）、黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）和其他分子识别dsRNA并触发TIR结构域含适配体诱导干扰素-β（TRIF）和线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）分子的激活，进而介导I型干扰素IFN AB形成、特定细胞免疫反应和自我佐剂效果通常通过上述过程由mRNA疫苗诱导（图3）。 图3 基于脂质的NPs和信使RNA的结构。一个mRNA分子包含以下组分：5'端帽、3'非翻译区(UTR)、开放阅读框、聚(A)尾，以及5'和3'非翻译区(UTRs)。大多数mRNA疫苗通过脂质纳米颗粒(LNPs)进行传递。LNPs通常包含胆固醇、磷脂、可电离脂质和PEG偶联脂质等脂质组分。携带抗原mRNA的LNPs被用来制造猴痘mRNA疫苗，这些抗原在转染细胞中的产生和定位如图C所示。树突细胞和其他抗原呈递细胞(APCs)摄取mRNA-LNPs或局部产生的抗原。为了刺激CD4和CD8 T细胞，这些APCs必须首先前往淋巴结。CD8 T细胞的启动导致产生细胞毒性T淋巴细胞，这些细胞可能通过从内部破坏来消除病原体。T滤泡辅助细胞(Tfh)和Th1细胞是CD4 T细胞启动抗原的两种可能结果。Tfh细胞帮助激活生发中心(GC)反应。疫苗接种引起GC反应，导致产生分泌抗体的长寿浆细胞(LPLCs)和亲和力成熟的记忆力B细胞(MBCs)。由LPLCs产生的抗体类别转换到与Th1或Th2相关的抗体，受Tfh细胞向Th1或Th2表型的倾斜影响。 mRNA疫苗载体及其优势和挑战 有效地将信使RNA疫苗输送到人类细胞中是一个巨大的挑战。由于裸露的mRNA是外源核酸，因此会被核酸酶迅速分解，并且免疫系统很容易识别它。作为疫苗的裸露mRNA的药效作用要少得多。保护给定的mRNA免受核酸酶的破坏，并促进其运输到细胞中，对于提高mRNA疫苗的免疫学效果是必要的。最近的发展提高了mRNA作为疫苗平台的雄心。例如，通过使用假尿苷等核苷类似物进行RNA化学修饰，显著增强了体内蛋白质合成，这减轻了未修饰核苷酸引起的翻译抑制。高效液相色谱（HPLC）纯化的应用通过消除体外转录副产品，包括可能阻碍mRNA翻译的dsRNA，提高了mRNA的翻译效率和纯度。脂质和LNPs已被用于运输小分子药物和siRNAs。LNPs的使用显著提高了mRNA的体外和体内传递效率。实施新的配方技术，包括连续流动微流体装置，促进了任意尺寸和规模的NPs的一致合成。mRNA COVID-19疫苗中的LNPs由四个基本组成部分构成。胆固醇、中性磷脂、聚乙二醇（PEG）脂质和可电离阳离子脂质。存在带正电荷（在低pH下）的可电离胺基，在颗粒形成期间可以与带负电荷的mRNA相互作用。这有助于在导入期间通过膜融合。此外，PEG-脂质的目的是调节颗粒大小并作为立体屏障以防止与储存相关的聚集。这些元素与mRNA一起，通过快速混合生产方法产生尺寸在60到100纳米之间的颗粒。例如，针对SARS-CoV-2的nCoVsaRNA和ARCoV疫苗候选物的平均颗粒大小分别为75和89纳米。目前的mRNA-LNP COVID-19疫苗的缺点是需要在（超）低温下储存。通过确定这些疫苗不稳定的潜在原因，可能可以提高mRNA-LNP产品的稳定性，从而便于在较低温度下储存疫苗。 阳离子脂质体最初作为mRNA疫苗的脂质体传递系统。脂质体是由磷脂单层或多层排列组成的球形囊泡。由通常包括极性头基和非极性尾部的材料组成，该囊泡具有容纳目标基因的水性内部。这些基团之间的疏水和亲水相互作用刺激了囊泡的形成。通过静电作用，带正电荷的阳离子脂质与带负电荷的mRNA组装形成脂质复合物（LP），这是一个多层囊状复合物。LP中封装的mRNA对RNase降解具有抵抗力，允许其在不降解的情况下传递。然而，由于阳离子脂质在生理环境中带正电荷，它们容易与生物液体中其他带负电荷的分子发生相互作用。此外，它们容易被免疫细胞捕获，这最终损害了它们的传递能力。pH响应性阳离子脂质在这一基础上被筛选并制成各种mRNA传递载体结构。 多年来，阳离子聚合物如聚(L-赖氨酸)、聚乙烯亚胺(PEI)、DEAE-葡聚糖、聚(β-氨基酯)(PBAE)和壳聚糖已广泛用于核酸的传递。在最基本的形式中，当过量的阳离子聚合物与核酸结合时，会形成静电结合的阳离子聚合物复合物。尽管已经制造了大量的聚合物，但它们在传递核酸方面并不像LNPs那样先进，而且很少有研究在动物上有效使用它们来提供疫苗。将PBAE与聚乙二醇(PEG)-脂质共形成mRNA/PBAE/PEG-LNPs。这些NPs通过静脉注射显示它们可以将mRNA传递到动物肺部。使用促红细胞生成素作为报告基因，研究了一种名为聚(胺-酯)(PACE)的可生物降解聚合物在静脉注射后基因传递的背景下。 作为体外转录(mRNA)的初始传递试剂，研究了二乙氨基乙基(DEAE)-葡聚糖。后来的研究表明，DEAE-葡聚糖在传递mRNA方面的效率比脂质介导的转染低100到1000倍。这一发现也促进了包括mRNA在内的核酸的基于脂质的转染试剂的发展，从而阻碍了聚合物载体的进展。进行了一项全面的研究，评估了mRNA传递后的功能和抗原特异性T细胞反应。为此，将聚合物聚乙烯亚胺(PEI)和PBAE与商业转染试剂Lipofectamine™ 2000和1,2-二油基-3-三甲基氨基丙烷(DOTAP)/1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)进行了比较。每种载体中都存在复合有gag HIV-1抗原的mRNA。在用与阳离子脂质复合的gag mRNA免疫的小鼠的脾脏和淋巴结中，鉴定了分泌IFN-γ的针对gag的T细胞。然而，这并不适用于用裸露或聚合物复合mRNA免疫的小鼠。PEI及其衍生物是经常使用的阳离子聚合物。这些物质表现出水溶性，与氨基相关的大量正电荷密度，并且已被验证为体外转染的mRNA载体。PEI因其高分子量（即超过25 kDa）而具有危险性。这种现象的可能原因是阴离子血清蛋白附着在多聚体表面，这是由于阳离子聚合物与阴离子血清血浆蛋白之间的相互作用。然而，随后尺寸的增加是暂时的，因为附着在多聚体表面的蛋白质最终防止了颗粒的聚集。为了解决这些困难，已经进行了许多努力。通过鼻内给药环糊精共价2 kDa PEI，首次展示了阳离子聚合物介导的mRNA疫苗转染的可行性和有效性。环糊精与PEI的结合促进了沿多胺主链的电荷密度的位移，导致细胞毒性降低，同时保持了可质子化的基团，最终增强了转染。 猴痘感染中的mRNA疫苗 在这项研究中，使用蛋白质组学和结构疫苗学方法设计了针对猴痘的mRNA和多表位疫苗(MVC)。首先，研究人员从猴痘蛋白质组中分离出10种可能用作疫苗靶标的蛋白质。然后使用结构疫苗学方法为B细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和辅助T淋巴细胞(HTLs)绘制了这些蛋白质的表位。使用适当的连接子将9个CTL、6个B细胞和5个HTL的表位组合起来创建MVC(多表位疫苗)和基于mRNA的疫苗。通过分子对接、结合自由能计算和体外克隆，发现在大肠杆菌K12菌株中高效表达和建议的MVC与TLR2之间有很强的相互作用。免疫模拟的结果显示，注射后的抗原滴度在第5天达到峰值，然后在IgM、IgG、IgM+IgG、DCs、IFN-gamma和IL(白细胞介素)产生后迅速下降，表明设计的疫苗候选物可能有效地诱导针对猴痘的免疫反应。通过改变连接子和佐剂附着可能进一步增强针对猴痘的免疫反应，尽管这在当前研究中尚未经过测试。由于研究，使用高度抗原性和非过敏性肽创建了既有效又动态的疫苗，以对抗猴痘。这项研究使用免疫信息学方法基于mRNA创建了猴痘疫苗模型。为了更好地预测T细胞和B细胞表位，根据其抗原性、过敏性和毒性评分选择了三种蛋白质。为了提高免疫反应，使用与表位特异性连接子和佐剂连接的主要T细胞和B细胞表位设计了疫苗结构。为了创建既稳定又高度免疫原性的疫苗，插入了Kozak序列、MITD序列、tPA序列、Goblin 5'和3' UTRs以及聚(A)尾部。研究人员使用分子建模和3D结构验证预计疫苗结构将具有高质量。基于人群覆盖和表位保守性，假设开发的疫苗模型将对多种猴痘致病株提供更好的保护。在考虑了几个对接分数和理化及免疫学因素后，Mpox-V4最有前途。通过分子动力学和免疫学模拟评估，预计最佳疫苗模型将具有高结构稳定性和与免疫受体结合的高亲和力，以诱导针对猴痘的细胞和体液免疫原性反应。对这些优先结构在实验室和人类中的进一步研究可能为有效和安全的猴痘疫苗铺平道路。 两剂针对猴痘的四价mRNA疫苗（mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP）在另一项研究中被开发出来。这些疫苗的灵感来自猴痘特异性抗原A29L、A35R、M1R和B6R。小鼠在接受mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP的两次肌肉注射后，会促进产生针对猴痘的IgG抗体和针对VACV的中和抗体。这些疫苗不仅具有强大的细胞免疫反应，而且在小鼠体内具有持久的效应记忆T细胞和生发中心B细胞活性，并对猴痘有偏向性。mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP的双重给药为小鼠提供了额外的VACV挑战保护。当被动转移来自mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP免疫小鼠的血清时，裸鼠可免受VACV挑战的保护。研究人员在体内研究中证明，猴痘四价mRNA疫苗是安全的，因为没有一种mRNA-A-LNP或mRNA-B-LNP引起任何显著的不良影响。根据研究，注射部位没有显示出任何异常的皮肤反应迹象。由于疫苗不会引起主要的皮肤反应（也称为“接种”），因此没有自体接种或意外接种的风险，这与ACAM2000形成对比（在像ACAM2000这样高度复制的疫苗中，疫苗部位的损伤通常用作成功疫苗接种的标志）。这些基于mRNA的疫苗显示出作为预防措施的前景，不仅针对猴痘，还针对其他正痘病毒，如天花。 在美国，科学家们创造了一种针对猴痘的多价mRNA疫苗（Mpoxac-097）并在小鼠中测试了其免疫原性。然后将连接五个猴痘病毒抗原（A29L、E8L、M1R、A35R和B6R）的串联2A肽进行了密码子优化。这种疫苗可以保护免受VACV挑战，并产生强大的免疫反应，包括针对猴痘的nABs和T细胞反应。接受Mpoxac-097的小鼠没有显示出显著的病理变化。总之，比较了Mpoxac-097、Mix-5和单价抗原LNP mRNA的免疫原性与多价猴痘mRNA疫苗候选物。由于Mpoxac-097产生广泛的nABs和针对猴痘的特异性T细胞反应，因此在接种Mpoxac-097疫苗后可能会避免VACV挑战。Mpoxac-097与Mix-5一样有效和具有免疫原性。由于其制造过程更简单，抗原串联共表达仍然很吸引人。用Mpoxac-097免疫的小鼠没有出现任何显著的病理变化。综合来看，研究人员的结果表明，多价猴痘mRNA疫苗是可行的。作为单独研究的一部分，生成了表达猴痘蛋白M1R和A35R的A35R-M1R融合体（VGPox1和VGPox2）以及A35R和M1R的封装全长mRNA的组合（VGPox3）。在所有三种疫苗的单次免疫后，最早在第7天检测到抗A35R的总IgGs。在接种VGPox 1和2后，很快产生了抗M1R的总IgGs；然而，直到第35天，VGPox 3才显示出任何显著的抗M1R抗体。nAB和T细胞免疫反应显示出类似的模式。接触到致死剂量的病毒的小鼠在接受任一组mRNA疫苗接种后免受感染，并且病毒从他们的肺部被清除。这些数据表明，与两个单独蛋白的共表达相比，编码A35R和M1R融合蛋白的新mRNA疫苗激发了更强的抗病毒免疫。与目前的全病毒疫苗一样有效，如果更多的话，mRNA疫苗对于保护免受猴痘病毒的侵害同样有效。 研究人员进行了一组表达各种病毒抗原组合的多组分猴痘疫苗候选物的开发和合成，例如M1R、E8L、A29L、A35R和B6R。这是通过使用LNP封装的mRNA疫苗平台实现的，该平台由Zhang等人开创。在小鼠中给予两剂mRNA疫苗候选物，即AR-Mpox5和AR-Mpox4a，已经诱导了强大的抗体反应和特定的T辅助1型（Th1）偏向的细胞反应。这已通过体外和体内特征描述得到证明。接受五价和四价疫苗候选物接种的小鼠，即AR-Mpox5和AR-Mpox4a，在VACV挑战中表现出增强的保护。猴痘mRNA疫苗候选物在BALB/c小鼠在高剂量VACV感染后减轻体重方面显示出效力。在进行临床试验之前，最好进行更多的研究，以评估预防措施在其他动物模型中的效力，如使用循环猴痘株的非人灵长类动物挑战模型。在接受多组分mRNA疫苗的AR-Mpox5和AR-Mpox4b接种组中，观察到显著的抗原特异性CD8+T细胞反应。多组分mRNA疫苗在暴露于各种抗原时，诱导了倾向于产生Th1细胞因子的CD4+T细胞的免疫反应。同样，在接受三剂多价天花DNA疫苗的猕猴中，观察到偏向Th1的抗原特异性细胞免疫反应。相反，接种MVA的小鼠在产生IFN-γ的CD8+T细胞群体中显著增加。 正痘病毒和猴痘mRNA疫苗 这项研究表明，本研究中针对猴痘、天花和牛痘的疫苗配方，通过使用in silico疫苗技术进行重复接种，有效地诱导了强大的体液和细胞免疫反应。在进行in silico疫苗接种后，B细胞群体被激活，导致免疫球蛋白、CD8 T细胞毒性和CD4 Th细胞、记忆细胞和细胞因子的产生增强。根据物理化学标准，该疫苗显示出稳定性并展现出理想的品质，分子对接显示与MHC分子良好的结合。由于本工作中抗原的遗传相似性，开发了一种针对所有三种病毒共有保守表位的mRNA疫苗。选择抗原A29、A30、A35、B6和M1，以开发普遍适用的基于mRNA的免疫接种。使用在保守区域发现的B细胞和T细胞表位，开发了多表位mRNA构建体。通过免疫信息学分析，这些表位通过比较猴痘、牛痘和天花的序列来确定。疫苗构建体显示出稳定性，并通过免疫信息学分析与MHC分子最佳结合。免疫模拟分析触发了体液和细胞免疫反应。基于in silico研究结果，建议本研究中开发的通用mRNA多表位疫苗候选物可能对猴痘、天花和牛痘具有潜在的保护作用。这对于推进旨在减少可能毁灭性大流行的发生的战略可能具有重要意义。 对牛痘的广泛研究表明，其一些抗原，包括A27、L1、A33和B5，与其他正痘病毒的同源抗原在免疫原性方面非常相似。这些结果确立了使用牛痘抗原作为疫苗靶标，以创建通用痘病毒疫苗的可行性。在科学调查领域，一组学者使用四种不同的牛痘病毒抗原，包括A27、L1、A33和B5，制造了一种新型的痘病毒疫苗候选物，称为mRNA-ALAB-LNP。在接种单一疫苗后，小鼠表现出抗L1抗体的强劲产生，同时对A33、A27和B5的免疫反应相对较弱。第二次注射后，所有IgG滴度均超过5个对数，其中抗A33 IgG的滴度在这四种抗原中最高。高结合抗体水平显示对牛痘有很强的中和能力。在测试的四种抗原中，只有A33被证明可以显著促进IFN-γ的细胞反应。血清IgG对匹配的猴痘抗原A35、M1、A29和B6的反应与对牛痘抗原的反应一样强，甚至更强，这表明编码四种牛痘抗原的mRNA-ALAB可能是未来针对猴痘、天花和其他正痘病毒感染的疫苗开发有希望的候选物。 另一项旨在创建针对猴痘的多价mRNA疫苗，该疫苗将针对EV和MV表面蛋白，并分析其有效性和保护的分子基础。在BALB/c小鼠中评估了四种mRNA疫苗的免疫原性，这些疫苗包含EV（A35R和B6R）、MV（A29L、E8L、H3L和M1R）或EV和MV表面蛋白的不同组合。第一次疫苗接种后7天，看到了动态的免疫反应，并且两次疫苗接种后，通过ELISA确认对所有免疫原产生了强大的IgG反应。观察到的更高累积IgG反应与相关的VACV中和活性之间的相关性，突出了每个免疫原在刺激免疫反应和根除VACV感染中的累积效应。此外，基于mRNA的疫苗引发了偏向Th1表型的CD4+T细胞反应，并针对抗原。研究了包含EV和MV表面抗原不同组合的mRNA疫苗在保护小鼠模型免受致命VACV挑战方面的效力。结果表明，包含EV和MV抗原的疫苗配方展示了最高水平的保护。这项研究的结果为MPV多价mRNA疫苗的保护机制提供了见解，并为开发更强大、更安全的mRNA疫苗以减轻未来猴痘爆发奠定了基础。根据研究作者的说法，mRNA-LNP疫苗显示出引发针对猴痘的免疫反应并提供针对致命VACV挑战的交叉保护的能力。该疫苗包含四种已知高度保守并在病毒附着、进入和传播过程中发挥关键作用的猴痘表面蛋白的组合。基于mRNA的疫苗接种导致对猴痘的四种抗原和VACV的四种同源物产生了更明显的Fc效应Th1偏向的体液免疫反应。此外，这些疫苗对猴痘和VACV都显示出增强的中和和细胞扩散抑制特性。这一发现与使用MVA平台的现有猴痘疫苗形成对比。表达两种、三种或四种猴痘抗原的mRNA疫苗在预防与疾病相关的体重减轻和死亡方面显示出效力。然而，单一猴痘抗原mRNA疫苗仅对VACV挑战提供了部分保护。与MVA的同源保护相比，具有中和和非nABs活性的多价猴痘mRNAs提供了显著的交叉保护。这些结果表明，针对四种高度保守的病毒表面抗原的基于mRNA的疫苗可能通过诱导高度功能性的ABs迅速减少病毒感染，从而保护免受VACV的侵害。 正痘病毒和猴痘mRNA疫苗 研究表明，夏等人开发的疫苗配方针对猴痘、天花和牛痘，通过使用in silico疫苗技术进行重复接种，有效地诱导了强大的体液和细胞免疫反应。这些抗原mRNA-LNPs单独（每个5微克）或平均组合在低剂量（每个0.5微克）下给予两次，尽管四种抗原mRNA-LNPs的免疫原性可能存在差异，但仍能引发针对猴痘的特异性IgG抗体和强大的针对VACV的中和抗体。在小鼠中，VACV感染导致体重减轻和死亡，而接受两次5微克剂量的A27、B5和L1 mRNA-LNPs，或平均混合四种抗原mRNA-LNPs（每种剂量为5微克）的小鼠受到保护。他们收集的数据支持这些抗原mRNA-LNP疫苗候选物可能在对抗猴痘和类似正痘病毒感染方面有用。桑等人在另一项研究中开发了两种猴痘四价mRNA疫苗，即mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP。这些疫苗使用两种IMVs（A29L和M1R）和两种EEVs（A35R和B6R）制造。在接受两次肌肉注射mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP后，小鼠显示出产生针对猴痘的特异性IgG抗体和强大的针对VACV的中和抗体的能力。在小鼠中，对猴痘的免疫反应包括诱导记忆B细胞免疫和杀手记忆T细胞免疫。通过被动转移来自接受mRNA-A-LNP或mRNA-B-LNP免疫的小鼠的血清，实现了对裸鼠的VACV挑战的保护。接受不同剂量的mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP的小鼠显示出可比的抵抗VACV挑战的能力。研究人员展示了mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP作为针对猴痘流行病和其他由正痘病毒引起的爆发的潜在疫苗的安全性和有效性。 研究人员通过在转录前结合DNA质粒的简化制造技术，创建了两种多抗原mRNA疫苗候选物，这些候选物编码四种（M1、A29、B6、A35，称为Rmix4）或六种（M1、H3、A29、E8、B6、A35，称为Rmix6）猴痘抗原。研究人员发现，尽管Rmix6产生的细胞免疫反应明显大于Rmix4，但这些猴痘多抗原mRNA疫苗候选物对VACV具有相似有效的交叉中和免疫反应。单独封装每个编码抗原的mRNA是一种常见的开发多抗原mRNA疫苗的方法，尽管一次性覆盖所有mRNA更有效。由于不同的LNP生产，可以很容易地确认每种mRNA疫苗成分的免疫原性。此外，接受两种疫苗候选物接种的小鼠免受致命的VACV挑战的保护。根据对猴痘单个抗原诱导的B细胞受体（BCR）谱系的分析，M1抗原有效地诱导了中和抗体反应。此外，所有中和抗体在前20种最常见的抗体中似乎都针对与7D11相同的构象表位，表明可能存在病毒免疫逃逸的潜在弱点。根据这些结果，来自简化生产方法的Rmix4和Rmix6似乎是对抗猴痘的良好选择。（表2）。 未来展望 临床建模研究的结果显示对猴痘的保护性免疫很少。这表明，在猴痘重新出现的现阶段，由于缺乏对这种疾病的免疫力，大多数人有感染病毒的危险。猴痘的复发感染可能构成挑战。全世界已有超过80,000例猴痘确诊病例，康复者被认为对再次感染免疫。然而，最近有一个案例似乎再次感染了。研究人员在这篇评论中报告了在意大利米兰的圣拉斐尔医院发现的两例可能的猴痘再次感染。这些病例表明猴痘可能存在两次再感染。研究人员在最初的病例临床和病毒学治愈后，对第二次发作进行了检测，发现循环阈值高、症状短暂、临床表现类似于猴痘，并且可检测到中和抗体。对于最近开始的猴痘，循环阈值高，表明病毒水平低。其他可能解释再感染的理论包括性污染或组织储库中的复发。其他人的共感染可能导致或加剧症状，或者可能使再感染更容易。此外，研究人员从两个患者收集的样本中分离并测序了猴痘，这些样本来自第一次发作。他们无法从第二次发作的样本中分离病毒，可能是由于循环阈值高表明的低病毒载量。SARS-CoV-2也可能有负面影响。尽管基因组数据不能确认存在两种不同的病毒，因此是再感染（与复发相反，复发将呈现相同的病毒），但临床医生需要意识到猴痘再感染的潜力，并应通过病毒培养和测序进行调查。此外，猴痘再感染的潜力对传播和疫苗政策具有影响。此外，如果猴痘中发生特定突变，降低天花疫苗对猴痘的效力，情况可能会变得更加严重。尽管猴痘的确诊病例数量每天都在下降，但病毒仍然存在于全球，并可能以相同的谱系返回或传播到其他地区，包括中非。由于其出色的安全性、生产成本效益、高效力和快速开发，mRNA疫苗的出现显著改变了疫苗学领域。临床试验为支持两种主要的针对SARS-CoV-2及其许多变体的mRNA疫苗的安全性和有效性提供了证据。目前正在使用的JYNNEOS是一种来自减毒、非复制性正痘病毒株-改良安卡拉-巴伐利亚北欧（MVA-BN）的活疫苗。与其他疫苗不同，MVA-BN无法在人体内部复制。此外，它在不产生严重不良效果的情况下引发针对正痘病毒的体液和细胞免疫反应。基于上述观察，目前可用疫苗的有效性仍然值得怀疑。人们普遍认为，它未能提供预期和必要的有效性，以遏制疾病的传播，以及与疫苗相关的严重并发症的复发发生率可能超过猴痘引起的发病率和死亡率。因此，迫切需要开发表现出针对猴痘增强特异性、安全性和有效性的新型疫苗。关于这一点，研究人员建议在宣布猴痘为大流行病和实施准备活动变得更加困难之前，开发和测试更新的灭活和/或mRNA疫苗，以克服现有疫苗的缺点。然而，在过渡期间，直到这些疫苗经过测试并商业化，MVA-BN疫苗可以被用来减缓疾病的传播，因为它在比较ACAM2000疫苗时具有更高的效力和更安全的配置文件。 由于SARS-CoV-2的新变种的出现，人群对它的抵抗力正在下降，这导致了mRNA疫苗的重新设计。mRNA疫苗的好处在于，它们可以通过改变免疫原性转基因来快速针对变种进行修改。传统疫苗通常涉及培养大量活性病毒，然后进行灭活，这可能需要数周甚至数月的时间。另一方面，mRNA疫苗可以快速生产、测试和创建。基于仅从COVID-19 mRNA疫苗中获得的信息，为猴痘开发mRNA疫苗可能提供一种更简化的方法来预防另一场可能具有毁灭性的病毒大流行。这一主动措施将有效减轻可能随之而来的严重健康和社会经济后果。 美国唯一批准使用的小pox疫苗是改良的安卡拉-巴伐利亚北欧牛痘疫苗。在猴痘大流行期间，确保ACAM2000®天花疫苗（一种既定的预防措施）和实验性的APSV（一种潜在的替代干预措施）的可用性至关重要。在美国，现在已经开发出两种疫苗来减轻猴痘感染的风险和严重程度。这些疫苗被称为JYNNEOS（有时被称为Imvamune或Imvanex）和ACAM2000。JYNNEOS已成为正在进行的猴痘流行的疫苗选择。尽管同时封装所有mRNA对于多抗原mRNA疫苗生产更可取，但隔离和封装每个编码抗原的mRNA是标准做法。使用单独的LNP准备，可以快速轻松地测试mRNA疫苗的每个组分的免疫原性。研究人员进一步证明，猴痘多抗原mRNA疫苗候选物可以诱导针对VACV的强大交叉中和免疫反应。此外，Rmix6诱导的细胞免疫反应显著高于Rmix4。 基于mRNA的疫苗相比标准疫苗提供了几个潜在的优势，如以下几点：除了引发体液和细胞介导的免疫反应外，这些疫苗还具有几个有利的特性。首先，它们没有传染性成分，也不会稳定地整合到宿主细胞的基因组中。其次，它们对健康个体具有良好的耐受性。第三，它们具有成本效益，并且可以快速生产，使用易于标准化和可扩展的程序。第四，它们增强了有效应对广泛出现的爆发的能力。最后，它们表现出高度的耐受性。例如，疫苗在预防传染病方面具有重要意义，mRNA疫苗技术在预防COVID-19方面的应用展示了其作为平台的有效性和安全性。使用猴痘mRNA序列A29L、M1R、A35R和B6R作为灵感，研究人员在一项研究中创建了两种猴痘mRNA疫苗候选物，称为MPXfus和MPXmix。MPXfus是一个由四个抗原蛋白组成的单组分系统，它们通过柔性连接物串联融合，并由单个mRNA编码为融合蛋白。MPXmix是一个多组分系统，由四个mRNA分子组成，每个分子对应一个特定的抗原蛋白。使用Lignum NPs将同等质量的MPXfus或MPXmix用于免疫小鼠，以评估和比较这两种潜在的Mpx疫苗所引发的免疫反应。免疫反应分析的结果表明，MPXfus和MPXmix都能在小鼠中引发强大的细胞免疫反应和高水平的抗原特异性抗体。此外，病毒中和实验的结果表明，用MPXfus或MPXmix免疫的啮齿动物的血清在VACV存在时表现出显著的中和活性。此外，MPXfus和MPXmix诱导的抗原特异性抗体的滴度、细胞免疫反应水平或针对VACV的nABs活性之间没有观察到显著差异。在不同的研究中，创建了三种编码猴痘蛋白A35R和M1R的mRNA疫苗。这些疫苗包括A35R胞外域与M1R蛋白的融合体（VGPox 1和VGPox 2）以及A35R和M1R的封装全长mRNA的组合（VGPox 3）。这项工作表明，在抗病毒免疫方面，由猴痘A35R胞外域和信号肽组成的融合蛋白的mRNA疫苗优于亚致死活体VACV-WR病毒。由于VGPox 1和VGPox 2在接种后7天就早期诱导了针对病毒的体液免疫，人群免受致命的VACV挑战的保护。研究人员结果中猴痘和牛痘之间的强烈相似性使它们更加显著。这表明VGPox 1或2可能是针对其他正痘病毒的有效mRNA疫苗。尽管这项工作提供了关于mRNA疫苗对猴痘的有效性的有见地的信息，但应注意许多限制。例如，研究人员使用VACV而不是猴痘进行了体外中和和体内测试。进一步将mRNA疫苗与非人灵长类动物中的其他许可疫苗（如JYNNEOS）进行比较的研究可能会在这些结果上建立。继续评估当前疫苗的安全性和有效性以预防猴痘至关重要。因此，创建一种具有广泛应用潜力的新疫苗来预防猴痘及其不断增长的变种，可能为应对感染的动态性质提供有用的预防策略。许多研究表明，基于mRNA的LNP优于传统疫苗技术，因为它产生更高水平的nABs、更有效的猴痘特异性T细胞反应和对猴痘的保护。亲脂性药物的安全性取决于剂量和组合，并且不可能预测长期不良影响，特别是在许多剂量后，因为目前没有长期健康结果数据。在低风险患者中广泛使用mRNA疫苗之前，应该进行研究进展，重新评估利弊。此外，重要的是全面评估疫苗有效性的各个方面，包括反应原性、细胞毒性测试结果、安全性和不良反应，特别关注那些处于更高风险或更脆弱的人。这种评估对于辨别传统和新型疫苗在效力方面的最优选择至关重要。BNT166疫苗候选物编码的表面抗原存在于猴痘的两种感染形式中，使它们能够有效地对抗病毒复制和感染性。两项基于mRNA的多价疫苗候选物的安全性、耐受性、反应原性和免疫原性将在临床试验（NCT05988203）中进行评估。亚研究A是一项I期、开放标签、剂量递增试验，旨在评估两种多价疫苗候选物（BNT166a和BNT166c）在大约64名健康参与者中的安全性、免疫原性和反应原性，这些参与者之前没有接种过牛痘疫苗或没有天花疫苗接种史。两剂将在大约31天间隔内给予。如果赞助商选择不激活BNT166c组，则不会进行随机化。亚研究B是一项随机化、观察者盲、赞助商非盲的I期亚研究，旨在评估两种多价疫苗候选物（BNT166a和BNT166c）在大约32名之前接种过天花疫苗的健康参与者中的安全性、免疫原性和反应原性。两剂将在大约31天间隔内给予。参与者将按照1:1的比例进行随机分配。如果赞助商选择不激活其中一个组，这个亚研究将是一个开放标签的亚研究，只有一个组。I/II期试验的目标是招募196名健康参与者，他们要么没有接种过牛痘疫苗，要么没有已知或疑似的天花疫苗接种史。 mRNA疫苗的开发是一个快速发展的领域。众多mRNA疫苗正在进行针对各种疾病的临床试验，包括癌症和流感。与mRNA疫苗相关的一个重要障碍是它们无法承受极端寒冷和热稳定性。CureVac开发的一种热稳定的疫苗(CvnCoV)显示出不到50%的临床效力，这表明当前的目标是创造一种表现出“高临床效力”的热稳定疫苗。鉴于科学文献中缺乏关于mRNA疫苗稳定性的数据，有必要进行精心设计的研究，使用延长时间、各种辅料和储存温度来填补现有的知识空白。基于研究人员掌握的有限信息，他们推断疫苗缺乏热稳定性可以归因于它们所使用的合成mRNA的困难特性。此外，根据研究人员的发现，mRNA疫苗的热稳定性可以通过有或没有实质性配方修改来增强。作为提高mRNA疫苗稳定性和储存条件的可行替代方案，例如，脱水mRNA LPN悬浮液的替代技术，如冻干，将发挥作用。提高疫苗热稳定性的第二种方法是通过mRNA序列优化。在他们的第一个热稳定疫苗临床试验初步失败之后，CureVac目前正在开发第二种COVID-19疫苗，该疫苗结合了非编码区域mRNA优化。此外，在LPN中包括辅料，如脂质和胆固醇，可能会使疫苗容易受到氧化降解。因此，通过优化NP组分和生产过程，可以提高疫苗的稳定性。最后，一项理论研究提出，重新利用mRNA生成双链区域可能是提高疫苗稳定性的另一种策略。由于可及性不足，几个低收入和中等收入国家面临mRNA疫苗的显著未满足需求。这表明可及性仍然是低疫苗接种率的一个重要决定因素，超过了对疫苗犹豫的担忧。根据研究结果，全球COVID-19疫苗公平性仍然是一个重大问题。迫切需要集中努力提高疫苗接种率，特别是在覆盖不足和对疫苗有大量未满足需求的国家。重要的是要减少疫苗获取的障碍，确保mRNA疫苗的可用性和传播，并克服疫苗犹豫，以减少未满足的需求，实现不同地理区域的更高疫苗接种率。 结论 鉴于该病毒与SARS-CoV-2相比具有较低的传染性，并且天花疫苗已显示出对猴痘的效力，研究开发针对性疫苗候选物和探索治疗方法的重要性不容忽视。当前的大流行，如COVID-19，继续威胁全球健康，凸显了需要负担得起的疫苗，这些疫苗可以用来保护全球人口免受传染病的侵害。此外，大多数感染猴痘的人从未接种过天花疫苗。结果可能有助于政府设计或倡导针对最危险人群的公共卫生政策和免疫计划。对天花疫苗产生的抗体是交叉反应性的，这意味着它们可以识别并对抗其他正痘病毒。此外，COVID-19大流行凸显了需要对猴痘病毒进行新的生物技术研究，以促进低成本治疗和疫苗的创造。最后但同样重要的是，鉴于当前流行病可能导致严重疾病和死亡，必须立即进行严格、良好控制的前瞻性试验以证明效力。在处理意外情况时，核酸平台表现出色。尽管成功将随时间衡量，但自从获得FDA批准以来，mRNA疫苗的开发和测试速度是显著的。核酸技术然后可以评估和专利治疗和预防效应分子，如抗体。SARS-CoV-2展示了在没有灵活的基础设施的情况下，要始终领先于一个快速适应的代理可能有多困难。mRNA疫苗可以迅速开发、评估并大规模生产。mRNA疫苗中缺乏活病毒使它们成为更安全的选择。然而，mRNA疫苗也有自己的问题。尽管疫苗的mRNA可能在注射后迅速被销毁或产生细胞因子风暴，过敏反应、肾衰竭、心力衰竭和梗死仍然是可能的不良反应。考虑到相关技术的快速发展，这种疗法的传递和稳定性可能只是时间问题。生物/纳米技术、复杂的纳米/制造以及开放报告和数据共享方面的突破，使得能够迅速开发出在猴痘感染期间有效的mRNA疫苗技术。在将猴痘标记为大流行之前，还有时间创造一个引人注目且安全的新一代疫苗，以根除病毒或开发创新的疫苗平台。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。