DMD患者接受CRISPR-dCas9-rAAV9基因治疗后意外死亡的病理分析和借鉴

2023-05-29

基因疗法临床结果临床研究

2022年10月27岁杜氏肌营养不良症（DMD）患者Terry Horgan 在接受AAV9载体递送的CRISPR-dCas9基因治疗后不幸去世。患者在给药六天后出现急性失代偿和持续性心脏骤停，两天后死亡。因为患者的死亡在基因治疗后8天即发生，不符合预期的毒性反应，因此对死亡原因的分析可以为后续的基因治疗提供非常重要的借鉴，包括患者的选择和一旦发生类似毒性反应的治疗策略制定。2023年5月16日，美国肌肉萎缩症学会、麻省大学医学院和耶鲁大学的研究人员在预印本平台 medRxiv 上发表了题为：Unexpected Death of a Duchenne Muscular Dystrophy Patient in an N-of-1 Trial of rAAV9-delivered CRISPR-transactivator 的研究论文，通过死检对患者的死因进行了分析。引言杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一种致命的X连锁病，由肌营养不良蛋白基因突变引起。该基因全长2.4 Mb，有79个外显子。DMD基因由于长度长，易发生缺失、重复和点突变。作为肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物的一部分，肌营养不良蛋白在心肌细胞和骨骼肌纤维的功能中起着至关重要的作用，可以将肌丝锚定在细胞外基质上，并防止应激介导的肌膜损伤。由于重组腺相关病毒（rAAV）的载体衣壳基因一般不能超过5kb，而且目标基因必须包含顺式作用元件（包括AAV反向末端重复序列（ITRs）、转录启动子和多腺苷酸信号)，肌营养不良蛋白基因对基于rAAV的基因替代治疗策略十分具有挑战。解决这个问题的方法包括才用微小肌营养不良蛋白和微型肌营养不良蛋白转基因，其中包括更少的内部杆状结构域重复。纠正肌营养不良蛋白的另一种方法是使用体内基因编辑技术，通常基于CRISPR-Cas9系统。RNA序列引导的DNA结合可用于引入双链断裂。或者，RNA引导DNA结合的特性可以指导新的工程化Cas9融合蛋白，其中核酸酶活性已失活（dead Cas9，dCas9），并引入了转录反式激活结构域。本研究涉及的方法是采用dCas9引导VP64转录激活结构域结合到目的区域，以上调肌营养不良蛋白的非肌肉型的全长异构体（Dp427c异构体）。DMD的rAAV基因治疗的另一个关键是需要高剂量的rAAV来转导心脏和骨骼肌组织，剂量范围为每公斤体重5×1013至2×1014载体。在这个剂量范围内，已经观察到许多不同的毒性综合征，包括肝毒性（通常与效应T细胞对衣壳蛋白或转基因蛋白的反应有关）、血小板减少症和血栓性微血管病（TMA），有时有肾毒性（非典型溶血性尿毒症综合征）和心脏毒性。本文所述的病例虽然结局悲惨，但为我们提供了一次在高剂量rAAV给药后的第一周至10天内监测全身、心脏和肺部毒性以及载体基因组的生物分布的机会。该病例显示晚期DMD患者在注射高剂量rAAV后可发生早期先天免疫激活，发生危及生命的心肺功能衰竭。研究也显示从治疗开始到死亡后评估的短时间间隔较短，注射的rAAV还没有足够的时间在靶器官中显著表达转基因产物。诊断和临床前研究：该患者在十岁前被诊断为DMD，每天服用类固醇（1.1 mg/kg/天deflazacort）超过20年，在二十岁失去了独立行走能力。随着心肺功能障碍的加剧，他的上肢功能逐渐下降。骨骼肌活检显示斑片状肌营养不良蛋白免疫染色（图1A）。全基因组测序显示从母体基因组遗传的肌营养不良蛋白（Dp427m）的启动子和外显子1存在约30kb的半合子缺失（补充图S2）。值得注意的是，该缺失不影响肌营养不良蛋白的皮质（Dp427c）异构体和浦肯野（Dp427 p）异构体的启动子和外显子1的完整性。研究者因此推测Dp427c可能补偿了Dp427m缺失。来自患者肌肉的RNA测序结果确实检测到Dp427c的低转录（图1B）。基于这个发现研究者设计了个体化治疗方法，目的是进一步上调全长Dp427c异构体的表达，该异构体与Dp427m的启动子和外显子1不同。通过CRISPR激活方法研究者首先确定了上调Dp427c的最佳sgRNA，并在体外模型和携带人源化DMD基因的hDMD/D2 mdx小鼠模型中证明了其有效性。图1C显示了基因设计，其中包括与dSaCas9融合的肌肉特异性启动子CK8e和转录激活单元VP64。这些片段的大小为4558bp，插入到ITR之间并成功包装到AAV9血清型中。图1D显示了新药临床试验（IND）的时间表。治疗经过患者接受了1×10-14 vg/kg静脉注射CRD-TMH001（IND 28497），由含有CK8e.dSaCas9.VP64.U6.sgRNA的AAV9载体组成。当时患者已经有严重的肌无力，通气功能障碍和轻度左心室（LV）收缩功能障碍。基线筛查未检测到AAV9抗体(ELISA <1:25)，酶联免疫斑点实验（ELISPOT）对AAV9、dSaCas9的反应为阴性(图2A)。在给药前13天开始进行预防性免疫抑制治疗（图2B）。AAV9注射后1天开始出现不良事件，包括室性早搏（PVC），血小板呈下降（D2），BNP升高（D3）（图2C），无症状高碳酸血症(pCO2 59 mmHg)伴呼吸性酸中毒。D5出现肌钙蛋白升高和心包积液，心功能恶化，推测为心包炎。D6天出现突发性急性呼吸窘迫，胸部X射线检查结果为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）及心功能恶化，进展为心肺骤停，并紧急进行体外膜氧合(ECMO)。尽管有ECMO的支持，患者仍在治疗后8天因多器官衰竭和严重的神经损伤而死亡。实验室检查显示IL-6水平较高(2.8 pg/mL)，补体C5b-9升高，血清IL-8升高，心包液中IL-6和MCP-1的水平升高。在此期间尝试的治疗包括增加类固醇，eculizumab(抗C5)， tocilizumab(抗IL-6-R)和anakinra (IL-1-R阻滞剂)。尸检心脏检查显示严重的心肌病，双心室心肌纤维脂肪替代(图3A)，与肌营养不良蛋白缺陷型心肌病一致，没有明显的心肌炎、血栓性微血管病或补体沉积。肺水肿(总重量为600克，预期为475克)；组织学表现为弥漫性肺泡损伤，其特征为透明膜形成以及肺泡间质和肺泡内水肿 (图3B)，与ARDS一致。没有血栓性微血管病变或明显炎症的证据。大脑广泛的神经元损伤可能反映了终末期脑灌注不足。病毒载体的生物分布采用qPCR对AAV载体DNA分布进行分析(图3C)。在肺组织中检测到119个病毒拷贝（vg）/每二倍体基因组。在左心室样本中检测到34vg/二倍体基因组，在右心室样本中检测到48 vg/二倍体基因组。肝脏最高，为680 vg/二倍体基因组。使用微滴式数字PCR (ddPCR)验证了确qPCR结果。转基因蛋白的表达：使用qPCR评估SaCas9转录物的表达，发现除肝脏外，在所分析的组织中检测不到（图3D）。Western blot检测到微弱的SaCas9蛋白条带 (图3E)。gRNA的水平显示出类似的组织分布。在给药后第4天或第7天，通过γ干扰素ELISPOT在患者的PBMCs中未检测到AAV9衣壳或Cas9转基因特异性T细胞反应(图2B)。讨论和结论该DMD患者在静脉给药1×1014 vg/kg的rAAV9- dCas9VP64后6天内出现严重的心肺毒性。第5天表现为心包积液，第6天迅速发展为ARDS。与rAAV试验中的其他DMD患者不同，该患者没有表现出TMA或对AAV衣壳或转基因产物的适应性体液免疫应答或细胞介导的免疫反应。没有AAV9抗体，也没有效应T细胞免疫效应。这些发现表明，在接受高剂量rAAV基因治疗的晚期DMD病例中，毒性之一是先天免疫反应导致的毛细血管渗漏。遗憾的是患者没有存活足够长的时间以评估CRISPR反式激活因子的安全性和有效性。众所周知，单链rAAV基因载体进入体内后需要数周才能形成具有转录活性的双链。虽然肝脏中存在痕量的转基因产物，但在心肌或骨骼肌中没有检测到。另一个最近的致死病例是DMD患者在接受基因治疗6天后死亡。该患者接受给药2×1014vg/kg的fordadistrogene movaparvovec。死因与抗心肌中的病毒衣壳蛋白的先天免疫反应有关，导致心源性休克和心力衰竭。然而本研究的心肌组织病理学检查没有发现先天免疫细胞浸润，先天免疫细胞浸润是心肌炎的典型表现。这是首次报道的AAV基因治疗DMD的严重ARDS病例。患者是DMD晚期，可能无法耐受rAAV基因治疗引起的急性毒性相关的心肺应激。因此，进一步研究易对AAV产生严重先天免疫反应的宿主特征，能够提高高剂量AAV介导的基因治疗的安全性。随着高剂量IV rAAV基因治疗的更多应用得到开发，应考虑潜在的此类毒性，并在患有潜在疾病，耐受不良反应能力较差的患者中进行仔细监测，尤其是个体化基因治疗产品中。方法分别由Aldevron和Andelyn提供临床级别的质粒和载体。死后19小时进行尸检。心脏组织切片中进行特殊染色（Masson三色染色确认纤维化）和免疫组织化学染色（分别检测CD3、CD20和C4d，代表T细胞、B细胞和补体）。对肺切片进行高碘酸Schiff(PAS)染色以确认透明膜沉积。此外，从组织中提取DNA、RNA和蛋白质，分别用于测定载体基因组拷贝数、转基因转录因子和蛋白质定量。图1:临床研究前评估和IND时间表。A) 正常个体（左）和先证者（右）的冷冻肌肉组织切片进行肌营养不良蛋白免疫染色。采用肌营养不良蛋白杆状结构域和C端抗体。B)底部：RNA测序读数显示全长Dp427c(皮质)，Dp427m(肌肉)和Dp427p(浦肯野)DMD异构体的外显子1-6。上：跨外显子的读数（弧线）。如Dp427c外显子1的读数所示，只有DMD皮质异构体在患者肌肉中表达。C)将治疗性构建体克隆到含有AAV2 ITRs (Addgene #99680)的质粒骨架中。引导RNA的表达受人U6启动子的调控，dSaCas9-VP64融合蛋白的表达受CK8e启动子的调控，该启动子由小鼠肌型肌酸激酶的调控元件工程化而成。dSaCas9是无DNA剪切活性的金黄色葡萄球菌Cas9。NLS：核定位序列；bGH聚(A)：牛生长激素多聚腺苷酸化信号。D) 2018年进行了患者肌肉活检；2019年春季完成了体外生物学验证；2020年春季探索性药理学研究；2020年秋季与FDA举行了pre-IND会议；2021年秋季由Andelyn公司进行了AAV生产；2022年春季开始了GLP毒理学研究；2022年夏季提交IND，并在此后给病人用药。图2：临床试验数据A）通过AAV9（左）或dSaCas9（右）肽刺激从患者分离的PBMC，通过干扰素-γELISPOT检测T细胞反应。阴性对照为未刺激的细胞，阳性对照为CD3/CD28刺激细胞。B）临床试验期间预防性免疫抑制的时间表，从治疗前13天开始到治疗后9天。黑色文字显示的药物已列入临床试验方案，红色文字显示的药品未列入。C）在临床试验期间（载体给药前30天开始）监测心脏、补体和肝脏标志物。图3 患者组织的尸检分析A)心脏检查表明左心室壁被纤维脂肪组织替代（箭头）；该区域的组织学评估显示明显的间质纤维化和残留心肌细胞被脂肪替代；没有心肌炎或血栓性微血管病的组织学证据（H&E和Masson三色染色，4X）。检查结果与严重的心肌病一致。B)肺部显微镜检查显示弥漫性肺泡损伤，其特征是透明膜沉积伴间质和肺泡内水肿（H&E和PAS染色，10X）。C)患者组织中的载体生物分布。载体基因组通过qPCR定量，计算出组织中每个二倍体基因组相对应的载体基因组拷贝数。D)通过RT-qPCR测量dSaCas9的RNA表达水平。在三个不同部位对心脏组织进行采样。E)与相同剂量注射AAV的小鼠相比，死后组织SaCas9的表达。从8周的时间点开始对GAS和HEA小鼠组织中的蛋白质表达与治疗后8天的患者组织中的蛋白表达进行比较。黏着斑蛋白作为内参抗体对照。HEA，心脏；LUN，肺；TRI，三头肌；LIV，肝脏；GAS，腓肠肌。近期热门视频更多精彩视频，尽在佰傲谷视频号，欢迎关注~本周好文推荐如需转载请联系佰傲谷并在醒目位置注明出处﹀‍‍ 点亮在看，传递信息♥