Idasanutlin

“ 点击蓝字 关注我们 郭小可 中国药科大学药学院副教授，药物化学专业博士生导师。 2009 年 7 月毕业于中国药科大学，获理学学士学位， 2014 年 6 月获理学博士学位，同年留校任教于药学院药物化学系。 2015—2018 年任系主任助理。承担国家自然科学基金面上项目 2 项、青年基金 1 项，江苏省自然科学基金面上项目 1 项，参与国家级项目多项。申请或授权专利 8 项，其中国际专利 2 项。以第一或通信作者身份发表 SCI 论文 10 余篇。获 2022 年江苏省高校教师教学创新大赛一等奖、 2020 年江苏省本科高校青年教师教学竞赛一等奖、 2019 年全国高等学校药学类专业青年教师教学能力大赛特等奖等多项国家级和省部级奖励。研究方向为抗肿瘤新药分子的设计与合成，主要聚焦于表观遗传学相关修饰蛋白的小分子调控剂的设计、合成、作用机制及成药性研究。 姜正羽 中国药科大学药学院教授，博士生导师。主要从事靶向蛋白质复合物的药物化学和化学生物学研究。以第一或通信作者在 Science Adv, J Med Chem, Redox Bio， Cell Chem Bio 等期刊发表研究论文和邀请综述 40 余篇，获得授权专利 10 余项，其中 3 项已经完成成果转化， 1 个化学 1 类新药已开展Ⅰ期临床研究。主持“重大新药创制”国家科技重大专项、国家自然科学基金面上项目和青年基金等科研项目 10 余项。获得第 23 届中国药学会 - 施维雅青年药物化学奖。入选第四届中国科协青年人才托举工程和江苏省科协青年科技人才托举工程、获得江苏省杰出青年科学基金、获评江苏省“青蓝工程”青年骨干教师。担任《药学学报》与 Acta Pharmaceutica Sinica B 青年编委、 《中国医药导刊》 编委和江苏省药学会药物化学专委会委员。  E3 泛素连接酶在靶向蛋白降解中的研究进展 PPS  吴丹 1,2，张贤 1,2，尤启冬 1,2，郭小可 1,2*，姜正羽 1,2** （1. 中国药科大学 江苏省药物分子设计与成药性优化重点实验室，江苏 南京 211198；2. 中国药科大学药学院，江苏 南京 211198） [摘要] 蛋白降解靶向嵌合体（proteolysis targeting chimera，PROTAC）技术作为靶向蛋白降解领域的革命性策略，通过利用细胞内天然的泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS），为传统不可成药靶点的药物开发开辟了新路径。这一技术的核心在于其双功能分子设计：一端结合目标蛋白（protein of interest，POI），另一端招募 E3 泛素连接酶，从而诱导 POI 的泛素化标记并促使其被蛋白酶体降解。E3 泛素连接酶作为 PROTAC 技术的核心组件之一，其选择、特性及功能对于 PROTAC 分子的设计及其降解效率具有决定性的影响。综述了近年来 E3 泛素连接酶在 PROTAC 领域的研究进展，探讨了新型 E3 泛素连接酶的探索以及未来的发展方向，旨在为 PROTAC 技术的进一步优化和应用提供有益的参考。 自 2001 年 首 次 提 出 蛋 白 降 解 靶 向 嵌 合 体（proteolysis targeting chimera， PROTAC）概念以来，这一技术已从实验工具迅速迈向临床，成为小分子药物研发的新范式。截至目前，全球已有超过 30 款 PROTAC 药物进入临床试验。与传统抑制剂 不 同， PROTAC 不 依 赖 对 目 标 蛋 白（ protein of interest， POI）活性的直接抑制，而是通过诱导其泛素化降解实现治疗目的。 PROTAC 由 2 个小分子部分组成，一部分是 POI 配体，专门识别 POI，另一部分与细胞内的 E3 泛素连接酶结合。 PROTAC分子通过将 POI 和 E3 泛素连接酶连接起来，促进POI 的泛素化标记，随后被蛋白酶体识别并降解。PROTAC 的成功高度依赖 E3 泛素连接酶的选择：一方面， E3 泛素连接酶的细胞定位、表达水平及催化效率决定了降解效能；另一方面，现有常用 E3泛素连接酶的局限性促使研究者不断拓展新型 E3泛素连接酶靶标库。本文系统综述了 PROTAC 领域E3 泛素连接酶的研究进展、新型 E3 泛素连接酶的发现策略及未来发展方向，通过解析 E3 泛素连接酶在 PROTAC 领域的核心作用与前沿动态，以期为靶向蛋白降解技术的深入发展提供参考。 1 E3 泛素连接酶的分类 E3 泛素连接酶在泛素-蛋白酶体系统（ubiquitinproteasome system， UPS）中起着至关重要的作用，它们负责识别并结合底物蛋白，催化泛素分子从 E2结合酶转移到底物蛋白上。根据结构和功能的不同， E3 连接酶主要分为 3 类： RING（ really-interesting new gene） /U-box（UFD2 homology）家族、 HECT （homologous to the E6AP carboxyl terminus）家族和RBR（ RING-between-RING）家族（见图 1）。 1.1 RING/U-box 家族 RING 家族是 E3 泛素连接酶中最大的一类，具有保守的 RING 结构域。 RING 结构域通常由 70 个氨基酸残基组成，具有特定的半胱氨酸和组氨酸，这些半胱氨酸和组氨酸在空间上和两个锌离子结合，形成 2 个锌指结构。 RING 家族 E3 泛素连接酶作为支架蛋白，促进 E2 结合酶与底物蛋白之间的相互作用，但不直接参与泛素转移反应。 U-box 家族与RING 家族在结构上相似，但不包含锌离子结合位点，而是具有保守的 U-box 结构域。 U-box 结构域能够模拟 RING 结构域的功能，介导 E2 结合酶与底物蛋白的相互作用。在 RING 家族中， E3 泛素连接酶可直接介导泛素从 E2 结合酶转移到底物而无需任何中间体 [1-2]。 U-box E3 连接酶的 C 端含有保守的 U-box 结构域，其负责泛素与 E2 结合酶的相互作用以直接将泛素分子转移到目标底物蛋白，其与RING 家族具有相同的作用特征 [3]。  1.2 HECT 家族  HECT 家族 E3 泛素连接酶具有保守的 HECT结构域，该结构域位于 C 端，能够结合泛素分子并形成硫酯键。 HECT 家族 E3 泛素连接酶在泛素转移反应中起催化作用，首先将泛素分子从 E2 结合酶转移到自身 HECT 结构域的活性半胱氨酸残基上，然后再转移到底物蛋白上。这一过程使得 HECT 家族 E3 泛素连接酶在底物降解中具有更高的特异性。对于 HECT 家族，泛素化过程分为 2 个单独的步骤：泛素首先通过 E2 结合酶结合到 HECT 结构域，然后转移到 E3 泛素连接酶的催化半胱氨酸上，最后E3 泛素连接酶特异性识别底物并促进泛素与底物结合 [4]。 1.3 RBR 家族 RBR 家 族 E3 泛 素 连 接 酶 结 合 了 RING 和HECT 家族的特点，具有 2 个 RING 结构域和 1 个IBR（ in-between RING）结构域。 RBR 家族 E3 泛素连接酶在催化泛素转移反应时，首先通过第 1 个RING 结构域结合 E2 结合酶，然后通过 IBR 结构域和第 2 个 RING 结构域的协同作用，将泛素分子转移到自身活性半胱氨酸残基上，并最终转移到底物蛋白上。RBR家族E3泛素连接酶在结构上更为复杂，但具有更高的催化效率和底物特异性 [5]。 2 E3 泛素连接酶及其配体在 PROTAC 中的应用 据估计，人类基因组编码超过 600 个 E3 泛素连接酶，这些连接酶能够以受控的方式特异性泛素化不同的蛋白质，在调节蛋白质稳态的方面具有重要性。尽管已知的 E3 泛素连接酶家族规模庞大，但只有少数 E3 泛素连接酶被成功地用于 PROTAC设 计， 主 要 包 括 CRBN（ cereblon）， VHL（von Hippel Lindau）， 细 胞 凋 亡 抑 制 蛋 白（cellular inhibitor of apoptosis protein， cIAP）以及鼠双微体 2 （murine double minute 2， MDM2）等。为了丰富PROTAC 技术适用的靶标类型和治疗领域，研究人员已经进行了大量的努力，探索可用于蛋白降解的E3 泛素连接酶及其配体 [6-8]。到目前为止， E3 泛素连接酶配体的发展仍然滞后于 PROTAC 技术的快速进步。对 E3 泛素连接酶的进一步理解以及筛选技术的进步，有利于推动 E3 泛素连接酶配体的发现和 PROTAC 技术的进一步迭代优化。  2.1 CRBN CRBN 是含 442 个氨基酸的蛋白质，形成 Cul4- RING E3 泛素连接酶复合物，并与 DNA 损伤结合蛋白 1（ DNA damage-binding protein 1， DDB1）相互作用 [9]。 CRBN 配体是免疫调节亚胺类药物，包括沙利度胺、来那度胺和泊马度胺等（见图 2） [10]。机制研究发现沙利度胺与 CRBN 结合并促进 Ikaros家族转录因子的泛素化和降解，这种分子胶功能启发了使用沙利度胺类似物作为 CRBN 配体的 PROTAC 的 设 计。 2014 年， Fischer 等 [11] 解 析了 DDB1-CRBN- 沙利度胺复合物的共晶结构，为合理的 PROTAC 设计提供了结构基础。 2018 年， Arvinas 公司开发了 PROTAC ARV-471（见图 2），其在 11 nmol · L-1 浓度下有效地诱导了多种乳腺癌细胞中的雌激素受体（ estrogen receptor， ER）降解。在基于 ER 突变患者肿瘤的异种移植肿瘤模型中， ARV-471 口服给药 10 mg · kg-1 时使肿瘤体积减少 99%，表现出优异的抗肿瘤效果 [12]。表 1 总结了已进入临床试验的 PROTAC 分子， CRBN 是目前 PROTAC 技术的首选 E3 泛素连接酶，其已被成功用于靶向降解 40 多种不同的蛋白质 [13]。然而，依赖 CRBN 的 PROTAC 面临两大瓶颈：其一，实体瘤中 CRBN 的表达水平普遍低于血液肿瘤，导致降解效率较低。在非小细胞肺癌患者中， CRBN 的mRNA 表达量仅为多发性骨髓瘤患者的 30%，这可能部分解释了ARV-471在实体瘤中的疗效差异 [14-15]。其二，沙利度胺类药物的致畸性源于其脱靶降解SALL4（ Sal-like protein 4），这一问题在 PROTAC中可能被放大。通过开发新型 CRBN 配体，优化降解剂的选择性，结合 CRBN 构象动态研究设计变构调节分子，或联合其他 E3 泛素连接酶构建双 E3 降解系统，有望突破现有局限性。 近年来，随着基于 CRBN 的 PROTAC 技术迅速发展， CRBN 的天然功能和底物识别机制已得到深入研究。 Lin 等 [15] 通过开发光亲和标记探针pLen，并结合蛋白质组学技术，揭示了 CRBN 配体的动态结合模式及非降解性靶点，进一步扩展了对 CRBN 功能复杂性的认知。此外，他们进一步研究发现 C 末端环酰亚胺修饰是一种天然被 CRBN识别的降解信号。这种修饰由天冬酰胺或谷氨酰胺残基的分子内环化形成，类似于蛋白质损伤中的脱酰胺反应。 C 端环酰亚胺修饰可通过蛋白质自发性断裂形成，并广泛存在于人类组织蛋白质组中。CRBN 通过识别这一修饰，介导泛素化依赖的蛋白酶体降解，从而清除受损蛋白，防止其聚集导致的病理效应 [16]。这一发现将 CRBN 的功能从“药物诱导的降解工具”扩展为“内源性蛋白质质量控制系统”。 2.2 VHL VHL 是 Cul2 E3 连接酶的底物受体蛋白，涉及缺氧诱导因子-1α（ hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α） 的 泛 素 化 和 蛋 白 酶 体 降 解 [17]。 早 期 的PROTAC 使用一种已知能够模拟 VHL 天然底物HIF-1α 的降解的肽招募 VHL，然而该肽表现出较差的细胞膜通透性，不利于 PROTAC 设计。用含有羟脯氨酸的小分子取代 HIF-1α 所得到的衍生肽（ 如 VH101、 VH298、 VH032， 见 图 3） 对 VHL显示出更高的亲和力、结合特异性以及显著改善的膜通透性 [18-19]。这促进了基于 VHL 的降解剂（如PRT3798、 KT333，见图 3）的发展，且其已成功被用于降解超过20种不同的蛋白质 [20]。与CRBN相比， VHL 的优势在于其广泛的组织表达，但其全身性分布也可能导致正常组织毒性。例如，靶向雄激素受体（androgen receptor， AR）的 VHL-PROTAC 因在心肌细胞中过度激活泛素化通路，可能导致实验动物出现心功能异常 [21]。 2.3 MDM2 E3 泛素连接酶 MDM2 可通过 UPS 途径诱导 p53 降解 [22-23]，是经典的抗肿瘤药物靶标。虽然不如 VHL 和 CRBN 常见， MDM2 亦是较早在靶向蛋白降解系统中应用的 E3 泛素连接酶。早期发现的p53-MDM2 抑制剂 nutlin 和 idasanutlin 等（见图 4）具有纳摩尔水平的 MDM2 亲和力，能够有效地破坏 MDM2 和 p53 之间的相互作用，为基于 MDM2的 PROTAC 设计提供了较丰富的小分子配体。首个小分子 SARM-nutlin（见图 4）是利用 nutlin 的衍生物 nutlin-3a 招募 E3 泛素连接酶 MDM2 来诱导AR 的降解 [24]，促进了小分子 PROTAC 领域的快速发展。近年来，靶向 MDM2 的小分子抑制剂仍然不断发展，为基于 MDM2 设计 PROTAC 提供了更多的选择。 2.4 cIAP 凋亡蛋白依赖性蛋白擦除剂（ specific and nongenetic inhibitor of apoptosis protein-dependent protein eraser， SNIPER）是使用甲基贝他定类似物（ bestatin，见 图 5） 招 募 cIAP 的 蛋 白 降 解 技 术 [25]。 SNIPER （如 SNIPER-11，见图 5）与常规 PROTAC 不同，因为其可能会诱导 E3 泛素连接酶 cIAP 和 POI 的同时降解 [26]。尽管这限制了 SNIPER 的催化能力，但cIAP 和蛋白的同时降解可以协同诱导细胞凋亡。其实基于 MDM2 设计的 PROTAC 也有类似现象，募集 MDM2 的同时也稳定了其天然底物 p53，与降解单独的癌症相关蛋白相比，由此产生的 p53 上调协同靶向蛋白的降解可以增强抗增殖作用。 2.5 Keap1 Kelch 样 ECH 相 关 蛋 白 1（ Kelch-like ECHassociated protein 1， Keap1）是一种含 BTB 结构域的蛋白，可作为底物接头蛋白参与基于 Cul3 的 E3泛素连接酶复合物的组装，发挥 E3 泛素连接酶功能介导底物的降解，是 PROTAC 领域非常有潜力的靶点。前期研究表明，基于 Keap1 的多肽类 PROTAC能有效诱导 POI 的泛素化降解 [27]。此外，基于Keap1 配体如甲基巴多索酮（bardoxolone methyl， CDDO-Me，见图 6）和天然产物荜茇酰胺的可逆共价或非共价结合小分子 PROTAC CDDO-JQ1（见图6）也被开发出来，用于靶向降解含溴结构域蛋白 4 （ bromodomain-containing protein 4， BRD4）、细胞周期蛋白依赖性激酶 9（ cyclin-dependent kinase 9， CDK9）等蛋白 [28-29]。然而， Keap1 在降解某些底物方面可能受限，这可能与其二聚体连接酶复合物的特性有关 [13]。尽管如此， Keap1 的多功能性和丰富的配体资源为 PROTAC 的设计提供了更多可能性，其在扩展 E3 泛素连接酶工具箱和克服耐药性方面具有重要意义。 2.6 新兴 E3 泛素连接酶 近年来，化学蛋白质组学等方法推动了靶向蛋白降解技术的发展，一些新型 E3 泛素连接酶及其配体被成功发现。 2019 年， Zhang 等 [30] 通过亲电片段筛选发现，化合物 KBO2-SLF（见图 7）通过DCAF16（ DDB1- and Cul4-associated factor 16） 介导蛋白酶体依赖性降解核定位序列 FLAG-FKBP12_ NLS。进一步设计的 PROTAC 分子 KBO2-JQ1（见图 7）能够降解内源性 BRD4，证实 DCAF16 在细胞核特异性降解中的应用潜力。 Spradlin 等 [31] 研究发现，天然产物 nimbolide（见图 7）通过其亲电性环烯酮靶向 RNF114（ring finger protein 114）的 C8位点，基于此开发的 PROTAC XH2（见图 7）选择性降解 BRD4，且能稳定 RNF114 其他底物。 Ward等 [32] 通过基于活性的蛋白质分析筛选发现了 RNF4的新型共价结合剂 CCW16（见图 7），并将其优化后的配体应用于开发新型 PROTAC CCW 28-3（见图 7），用于靶向降解内源性 BRD4。 Hong 等 [33]通过化学蛋白组学方法发现了一种名为 EN884（见图 7） 的 SKP1（ S-phase kinase-associated protein 1）结合配体，能够特异性结合 SKP1 的 C160 位点，并将其应用于 PROTAC（SJH1-51B，见图 7）中，成功实现了对 BRD4 和 AR 等 POI 的降解。Henning 等 [34] 通过在能与半胱氨酸特异性反应的共价配体的化合物库中进行筛选，发现小分子EN106（见图 7）能够特异性结合 FEM1B（ FEM- 1 homolog B）的 186 位半胱氨酸，通过将 EN106与 BRD4 配 体 连 接 得 到 PROTAC NJH-1-106（ 见图 7），成功实现了 POI 的降解。基于结构的药物设计方法对于 E3 泛素连接酶配体的发现也具有重要推动作用。 2024 年， Hickey 等 [35] 基于 KLHDC2（ Kelch domain-containing protein 2）的结构特征，从头设计并通过多轮优化，发现了能够特异性结合KLHDC2 的小分子配体，并将其应用于 PROTAC技术中，成功实现了对 POI 的高效降解。此外， 2024 年， Basu 等 [36] 通过基于成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR）激活筛选的方法，确定了 FBXO22（ F-box protein 22）可作为一种候选E3 泛素连接酶，并开发了 PROTAC 分子 22-SLF（见图 7），其与 FBXO22 中的 C227/C228 半胱氨酸残基相互作用，实现 POI 的高效降解。 人体中存在超过 600 种 E3 泛素连接酶，然而现有临床 PROTAC 药物仅限于 CRBN 和 VHL。这不仅限制了 PROTAC 的应用范围，还可能导致靶向毒性和耐药性问题。大量待开发的 E3 泛素连接酶库对于推进 PROTAC 发展至关重要，有助于扩大可靶向蛋白库。因此，未来的研究应聚焦于发现和优化新的 E3 泛素连接酶配体，以充分发挥 PROTAC技术的应用潜力。 3 发现 E3 泛素连接酶配体的主要途径 E3 泛素连接酶及其配体的发现是推动 PROTAC技术发展的核心环节，其研究策略可分为“从 E3泛素连接酶到配体”和“从配体到 E3 泛素连接酶”。前者侧重于首先确定特定的 E3 泛素连接酶，随后通过结构生物学、化学合成等手段，寻找或设计能够与之高效结合的配体分子。这种方法的优势在于能够基于已知的 E3 泛素连接酶特性开发特异性配体，从而实现对特定蛋白质降解路径的精确调控。相比之下，“从配体到 E3 泛素连接酶”的策略则采取了一种逆向思维，即首先发现或设计针对 POI的特异性配体，随后探索这些配体是否招募某些 E3泛素连接酶进行降解。这种方法拓宽了 PROTAC设计的可能性，尤其是在面对那些尚未明确是否与POI 直接作用的 E3 泛素连接酶时，展现出强大的应用潜力。这些方法各具优势，通过多维度互补与整合，加速了高潜力 E3 泛素连接酶及其配体的发现 [37]。 3.1 从 E3 泛素连接酶到配体 3.1.1 基于结构的药物设计方法 基于结构的药物设计方法利用 POI 的结构指导 PROTAC 设计。这种方法通过解析 E3 泛素连接酶与底物复合物的晶体结构，确定关键相互作用位点，为设计小分子配体提供指导 [38]，其优势在于能够直观地展示配体与 E3泛素连接酶的相互作用模式，从而指导配体的优化。例如， Crews 和 Ciulli 实验室利用羟基脯氨酸核心片段开发了新型 VHL 拟肽配体 [18]；后续 Galdeano等 [19] 通过基于结构的药物设计方法获得的具有纳摩尔级亲和力的配体 VH032，是 PROTAC 设计中常用的 VHL 配体。此外， Hickey 等 [35] 基于 KLHDC2的结构特征从头设计并优化得到的 KLHDC2 的小分子配体，也已被成功用于 PROTAC 开发。这种方法还可用于难以成药靶点的配体设计，进一步扩展 E3泛素连接酶的可用范围。 3.1.2 基于片段的药物设计方法 基于片段的药物设计方法是另一种有效的 E3 配体发现策略，通过筛选小分子片段化合物库，寻找与 E3 泛素连接酶口袋或表面结合的片段，作为设计 PROTAC 的起始位点 [39]。例如， Lucas 等 [40] 通过差示扫描荧光法对符合“三规则”的小分子片段库进行筛选，并利用质子核磁共振以及 X 射线晶体结构分析进行验证，发现了针对 VHL 的 3 个弱结合配体片段。这些片段可以与E3 泛素连接酶的不同口袋结合，为后续设计提供基础。这种方法的优势在于能够发现新的结合位点，为设计具有高亲和力的配体提供基础。通过这种方法，研究人员可以逐步优化片段，提高其与 E3 泛素连接酶的结合亲和力，最终开发出有效的 PROTAC分子。 2016 年， Astex 与 GSK 的科学家 [41-42] 针对E3 泛素连接酶 Keap1 开展了基于片段的筛选，通过非电中性弱结合片段的片段融合与磺酰胺环化构象固定，成功开发了高亲和力抑制剂 KI-696 。后续多个研究团队 [43] 将 KI-696 与 POI 配体结合，开发了多个基于 Keap1 的 PROTAC 分子，展示了基于片段的药物设计在 E3 配体优化中的潜力，为 PROTAC开发提供了高效配体设计范例。 3.1.3 DNA 编码化合物库 靶向 E3 泛素连接酶的底物结合位点，可能需要占据较浅的口袋或与内源性蛋白底物竞争，这些因素都可能增加配体与 E3 泛素连接酶结合的难度。 DNA 编码化合物库（ DNA encoded compound library， DEL，相关筛选流程见图 8）提供了一种快速的组合化学方法，能够生成数十亿种化合物，广泛覆盖化学空间 [44]。 DEL 筛选已被用于发现多个 E3 泛素连接酶配体，包括 DCAF1（ DDB1- and CUL4-associated factor） [45]、 GID4（ GID complex subunit 4 homolog gene） [46] 和 MAGE-A3（ melanoma antigen A3） [47]，为 PROTAC 开发提供了支持。将DEL 筛选数据与强大的机器学习技术相结合，可以显著提升化合物的可扩展性、结构多样性、命中率、活性以及药物特性。通过 DEL 筛选可以解码化合物信息，并通过包含潜在的连接位点来额外指导 PROTAC分子的设计。 DEL 的优势在于其庞大的化合物库可以覆盖更广泛的化学空间，提高发现新型配体的机会；其局限性在于筛选通常需要在细胞外进行，直接在细胞环境中测试命中化合物的生物活性具有挑战性。 3.1.4 噬菌体展示技术 噬菌体展示技术是一种高效的方法，用于发现针对 POI 的肽段配体，尤其是那些尚未发现天然底物或配体的蛋白。该技术通过将随机合成的 DNA 化合物库插入噬菌体外壳蛋白基因中，以表达所需长度的肽，与固定靶标孵育后洗脱未结合的噬菌体，经过几轮选择后积累高亲和力肽段的噬菌体，测序鉴定这些肽段 [48]。除了能够识别线性肽段外，噬菌体展示技术还可用于发现和开发环肽和大环肽 [49]。环肽是一类结构受限的大环分子，因其能够结合并靶向传统上被认为“不可成药”的蛋白表面而备受关注。由于其“锁定”的结构特性以及可能形成的分子内氢键，环状肽通常比线性肽具有更高的细胞渗透性和代谢稳定性，是探索新型生物学机制的有力化学工具 [49]。噬菌体展示技术适用于开发难靶向的 E3 泛素连接酶肽类配体，能够快速筛选出与靶标结合的肽段用于靶向蛋白降解。2025 年， Hampton 等 [50] 开发了 2 个新型连接子用于构建噬菌体展示环肽库，筛选鉴定了靶向结合 E3泛素连接酶 ZNRF3（ zinc and ring finger 3）胞外结构域的环肽配体，进而用于开发 PROTAC 以降解膜蛋白，从而为研究特定 E3 泛素连接酶的招募工具提供基础。 3.2 从配体到 E3 泛素连接酶 3.2.1 遗传学方法 遗传学方法，特别是基于 CRISPR的功能基因组学，是识别药物靶点的有力工具 [51]。基于 CRISPR 基因敲除的筛选为 PROTAC 和分子胶降解剂的 E3 泛素连接酶的鉴别提供了一种基于功能缺失的策略。 CRISPR 筛选策略已被用于识别或验证 PROTAC 招募的新型 E3 泛素连接酶，通过敲除或激活的筛选策略，观察细胞的耐药性或报告基因稳定性，可以有效地定位关键 E3 泛素连接酶。 2024 年， Schröder 等 [52] 通 过 在 BRD9-HiBiT和 Firefly 双报告细胞中进行 CRISPR 筛选，证实了PROTAC DBr-1 通过招募 DCAF1 靶向 BRD9 降解。在另一项研究中， Sarott 等 [53] 将 JQ1 与含有丙烯酰胺基团的 RNA 病毒复制抑制剂 YKL-04-085 连接在一起，构建了 PROTAC 分子 STT-03-053-1，成功实现了 BRD4 的降解，并进一步通过 CRISPR 筛选确定 DCAF16 是 STT-03-053-1 诱导的 POI 降解的 E3泛素连接酶。此外， Basu 等 [36] 通过 CRISPR 转录激活筛选策略鉴定出 E3 泛素连接酶 FBXO22 及其亲电配体。 CRISPR 筛选的优势在于其高通量和精确性，可以快速识别与化合物活性相关的 E3 泛素连接酶。这种方法可能受到 E3 泛素连接酶冗余性和细胞适应性的影响，因此需要结合正交验证来确保结果的准确性。 3.2.2 基于亲和力的蛋白质组学 基于亲和力的蛋白质组学方法，如协同免疫共沉淀质谱和亲和纯化质谱，通过捕获降解剂诱导的三元复合物来识别 E3 泛素连接酶，广泛应用于蛋白质相互作用的研究。通过使用亲和力标签或抗体偶联，研究蛋白质相互作用和复合物，可以鉴定降解剂募集的 E3 泛素连接酶。 Zhang 等 [30] 通过将共价弹头片段和 FKBP12 配体连接发现了 PROTAC 分子 KB02-SLF 能够以 UPS依赖的方式降解核 FKBP12 蛋白，并通过 co-IP-MS方法成功识别出核 DCAF16 是潜在 E3 泛素连接酶。后续通过类似策略，该团队进一步开发了另一种FKBP12 亲电降解剂 21-SLF，并鉴定出 E3 泛素连接酶 DCAF11 及其亲电配体 [54]。这些研究强调了亲和力蛋白组学方法在分子靶标识别中的应用，并突出了将蛋白组学研究与遗传验证实验相结合以识别和验证 E3 泛素连接酶的重要性。这种方法广泛适用于共价和非共价分子，可以提供关于 E3 泛素连接酶与配体相互作用的详细信息。然而，该方法需要能够形成稳定的三元复合物，对于短暂或弱相互作用的降解物可能效果有限。此外，还需要注意化学探针的非特异性结合问题，以确保结果的可靠性。 3.2.3 化学蛋白质组学 化学蛋白组学方法，如基于活性的蛋白分析（activity-based protein profiling， ABPP）、光亲和标记和酶介导的邻近标记，可用于鉴定靶向蛋白降解的 E3 泛素连接酶。 ABPP 法在发现共价药物中具有关键性作用，可以全局范围内搜索靶标及其反应位点 [55]。光亲和标记适用于不具有固有共价部分的化合物，通过光激活与最近的蛋白质共价交联 [56]。酶介导的邻近标记可以捕获瞬态和弱相互作用，克服基于亲和力的方法的局限性 [57]。该方法使用工程酶，包括 BioID、 TurboID、miniTurbo 或 AirID 来 鉴 定 蛋 白 相 互 作 用。 以 上技术已被广泛用于小分子的靶标鉴定，并在发现PROTAC 招募的 E3 泛素连接酶方面展现出重要价值。 2023 年， Lv 课题组通过 ABPP 以及邻近标记TurboID 验证，报道了荜茇酰胺可作为 E3 泛素连接酶 Keap1 共价配体用于 PROTAC 设计 [29]，展示了化学蛋白质组学方法在识别 E3 泛素连接酶靶标方面的应用潜力，并强调了通过配体设计和验证实现靶向蛋白降解的可能性。这些方法的优势在于能够提供关于小分子与蛋白质相互作用的详细信息，但其局限性包括对共价相互作用的依赖和可能的背景噪声干扰，需要精心设计的探针和阴性对照来确保结果的准确性。 3.2.4 热蛋白质组学分析 热蛋白质组学分析（thermal proteome profiling， TPP）是一种新兴的方法，通过结合多重质谱法和细胞热漂移测定，同时监测所有可检测的蛋白质组，通过监测药物处理下蛋白质热稳定性的变化来识别因三元复合物形成而热迁移的E3 泛素连接酶 [58]。最近的一项研究使用 TPP 来分析大量 PROTAC，证实 TPP 可以验证 E3 泛素连接酶和POI在完整细胞和细胞裂解物中的靶标结合 [59]。TPP 法无需探针修饰，但受限于蛋白质表达丰度和热稳定性变化的普适性。因此，需要结合高深度质谱覆盖和严格统计学分析来提高结果的准确性 [60]。 3.2.5 计算方法学 蛋白-蛋白相互作用（proteinprotein interaction， PPI）预测技术为 PROTAC 开发中 E3 泛素连接酶的筛选提供了重要的计算生物学支持 [61]。 2022 年， Li 等 [62] 开发了一个基于深度学习的模型 DeepPROTACs，该模型通过分析 POI 和E3 泛素连接酶的结构，利用图卷积网络和双向长短期记忆网络分别提取特征，实现了对 PROTAC 降解效果的高效预测。在 PROTAC 介导的 POI 降解过程中，由 POI-PROTAC-E3 泛素连接酶构成的三元复合物的稳定性是决定降解效率的关键因素，然而目前仍缺乏通过预测三元复合物结构来筛选适配 E3泛素连接酶的成熟计算方法。近年来，随着人工智能结构预测技术的突破性发展，基于结构的 PPI 预测方法（如 RosettaDock、 ZDOCK 及 AlphaFold 3）取得了显著进步 [63]。这些技术能够通过虚拟筛选预测 POI 与不同 E3 泛素连接酶之间的潜在结合界面，从而为优先选择具有兼容性的 E3 家族成员提供结构生物学依据。然而，由于三元复合物涉及动态平衡的复杂相互作用，其精准预测仍面临巨大挑战，需要进一步的实验验证来确认预测结果。 4 PROTAC 中 E3 泛素连接酶的发展方向 4.1 组织特异性 E3 泛素连接酶的开发 组 织 特 异 性 E3 泛 素 连 接 酶 的 发 现 是 降 低PROTAC 毒性的新策略 [64]。例如， MAGE-A3 在多种肿瘤组织中高表达，而正常组织中几乎不表达，基于其配体设计的 PROTAC 分子能够只在肿瘤组织中降解 POI，对正常细胞无影响 [47]。基于组织特异性 E3 泛素连接酶设计的 PROTAC 分子能够在不影响正常组织的情况下，精准降解 POI[65]。未来，研究者将继续深入探索更多具有组织或疾病特异性的E3 泛素连接酶，为开发针对特定疾病或组织类型的PROTAC 药物奠定基础。同时，利用基因治疗技术实现组织特异性 E3 泛素连接酶的表达，将进一步增强 PROTAC 在特定器官中的活性，突破肿瘤微环境中 E3 泛素连接酶不足的限制，提高治疗效果。 4.2 应对 PROTAC 耐药性 肿瘤细胞通过多种机制逃逸 PROTAC 介导的降解，包括 E3 泛素连接酶下调、泛素化位点突变及蛋白酶体活性抑制，这是当前面临的主要挑战之一。例如，在 ARV-110 治疗后的耐药患者中， CRBN 表达量下降至治疗前的 20%，且 AR 蛋白的 L702H 突变阻断了泛素化位点 [66]。为应对这一问题，研究人员正在探索多种策略。一方面，联合使用 E3 泛素连接酶激活剂以增强 CRL 复合物的活性，或开发双E3-PROTAC 分子以同时招募多种 E3 泛素连接酶，实现泛素化通路的激活，从而提高降解效率并延缓耐药性的产生 [67-68]。另一方面，通过结构生物学和计算化学方法，预测并避免 POI 的泛素化位点突变，设计更加稳定且不易产生耐药性的 PROTAC 分子。此外， PROTAC 与其他药物（如拉帕替尼）的联用也可能为克服耐药性提供新的思路 [69]。 4.3 非肿瘤疾病中的 E3 泛素连接酶 除了在肿瘤治疗中的应用外， E3 泛素连接酶在神经、免疫及代谢系统中的功能调控为 PROTAC 技术在非肿瘤疾病中的应用提供了广阔前景。例如，红血球母细胞中特异性表达的 TRIM58（tripartite motif 58）结合配体的发现，推动了 PROTAC 在红细胞相关疾病（如镰刀型细胞贫血）治疗中的潜力 [70]。此外，靶向 Keap1 的 PROTAC 可激活核因子红细胞2 相关因子 2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2， Nrf2）通路以缓解氧化应激损伤，在代谢相关复杂疾病中具有较好的发展前景 [71]。未来，研究者将继续挖掘更多与特定疾病相关的 E3 泛素连接酶，并设计相应的 PROTAC 分子，以拓展其在非肿瘤疾病中的应用范围。 5 结语  本文介绍了 E3 泛素连接酶的类型，以及一些常见 E3 泛素连接酶（ CRBN、 VHL、 MDM2、 cIAP、Keap1）的配体及利用这些配体合成的 PROTAC，还总结了常用的 E3 泛素连接酶配体发现的方法以及 PROTAC 中 E3 泛素连接酶的发展方向，希望能为新型 E3 泛素连接酶及其配体的进一步探索提供参考。 E3 泛素连接酶作为 PROTAC 技术的核心组分，其生物学特性与化学可及性共同决定了靶向蛋白降解的成败。从 CRBN、 VHL 的机制优化到新型E3 泛素连接酶的跨学科挖掘，研究者正不断突破技术边界，推动 PROTAC 从实验室工具迈向临床突破。E3 泛素连接酶及其配体的不断发展和优化将进一步加速新兴 PROTAC 分子的发现，推动靶向蛋白降解领域迈向新的高度，有望在精准医疗和疾病治疗中发挥更大的作用。 参考文献： [1] Bulatov E, Ciulli A. 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