Pembrolizumab

据美通社2024年6月4日报道，西比曼生物在 2024美国临床肿瘤学会（ASCO）年会上 ，公布了 C-CAR031的首次人体IIT的临床数据 ，用于 既往接受过大量治疗的晚期肝细胞癌（HCC） 患者。 初步数据显示， C-CAR031在晚期肝细胞癌患者中表现出良好的安全性和有效性 ，为这些治疗选择有限的晚期患者带来了新的希望与选择，同时有望 颠覆肝细胞癌及其他GPC3阳性实体瘤的治疗模式 ！ C-CAR031：晚期肝细胞癌新曙光，疾病控制率高达91.3% C-CAR031是一种 靶向GPC3（磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3）的新型装甲型自体CAR-T细胞疗法 。由阿斯利康和西比曼生物联合研发，使用阿斯利康特有的“ 装甲发现平台 [即转化生长因子显性失活-β受体II（dnTGFβRII）]” 进行设计 ， 并在中国进行生产 。 本次公布的 C-CAR031的I期临床研究（NCT05155189） 正在中国进行。截止到2024年3月14日，共有24例 既往接受过中位数3.5项 （范围：1～6）全身治疗的患者入组。其中，有20例患者（83.3%）伴 肝外转移病灶 。这些患者在入组 接受4个剂量水平的C-CAR031回输 治疗后，在23例可评估疗效的患者中，经过为期 9.03个月 的中位随访，结果显示： 1、 疾病控制率（DCR） ：所有剂量水平（DL）患者的 疾病控制率（DCR）高达91.3%！ 这也意味着， 91.3%的患者在治疗后，出现肿瘤缩小（肝内和肝外病变）表现 ， 中位缩小率为42.2% （范围，-28.1%~94.4%）。 2、 客观缓解率（ORR） ：所有剂量水平（DL）患者的 客观缓解率（ORR）达到56.5% （详见下图）；DL4组患者的 ORR 更是 高达75.0% 。 ▲图源“ApexOnco”，版权归原作者所有，如无意中侵犯了知识产权，请联系我们删除 注： C-CAR031在晚期肝细胞癌（HCC）中，表现出令人鼓舞的肿瘤反应[包括疾病控制率（DCR）、客观缓解率（ORR）、肿瘤缩小（Tumor Size Reductions）率]。 3、 中位总生存期（mOS） ：根据Kaplan-Meier，预估的 中位总生存期（mOS）达到11.14个月 （95% CI，7.56-NE）。 如何寻求CAR-T疗法帮助？ 目前CAR-T治疗肝癌的临床试验正在进行中，主要针对 C3、MUC-1 等靶点。此外，还有多款CAR-T临床研究正在招募患者，主要针对 胰腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、头颈部肿瘤 等多个癌种。 想寻求CAR-T或其他抗癌新技术帮助的患者，可将近期检查（病理检查、影像学检查、血液检查等）结果、治疗经历等资料，提交至 全球肿瘤医生网医学部 ，进行初步评估。 肝癌：一种善于“伪装”的癌症 肝癌是全世界癌症死亡的第三大原因，而且是一种极会伪装的癌症，很多患者发现即为晚期，因而，也错过了最佳的手术时机，每年有约70万人被肝癌夺去生命！其中，肝细胞癌（HCC）是肝癌中的常见类型。 肝癌的发生可能与 肝炎病毒[尤其是乙肝病毒（HBV）]感染、长期过量饮酒、黄曲霉毒素 等多种因素有关。据统计，在原发性肝癌的患者中， 存在乙型肝炎感染背景者约占80%以上 。我国更是肝癌大国，肝癌的发病人数及死亡人数约占全球一半以上，是严重威胁国人身体健康的梦魇！ 肝癌患者的免疫功能本身就处于失常状态 ，而且 手术、放化疗还会对患者的免疫功能造成进一步损伤 。因此， 肝癌患者在常规治疗结束后，应尽快调整免疫功能，这也是预防复发或转移的“关键”！ 除了上文提到的CAR-T疗法外，还有几种治疗方法（如 TCR-T、NK细胞疗法、癌症疫苗、益生菌 等），对 提升肝癌患者的免疫功能、提高抗肿瘤活性、预防肝癌复发或转移 ，也具有举足轻重的影响。下面全球肿瘤医生网小编简单盘点一下几款疗效惊艳的抗癌新方法，以供参考。 四大免疫疗法，全面迎战肝癌 SCG101（TCR-T疗法）：痛击HBV相关肝细胞癌，完成抗癌及抗病毒双杀 PART 01 SCG101是一款 乙肝抗原特异性的TCR-T细胞疗法 ， 兼具抗癌（可清除HBV-HCC肿瘤细胞、HBV-DNA整合的癌前病变细胞）、抗病毒（可清除HBV感染细胞）的双重功效 ， 其新药IND已获中国国家药品监督管理局（NMPA）批准 ，用于治疗 乙肝病毒（HBV）相关肝细胞癌（HCC） 。 2023年国际细胞与基因治疗大会（ISCT）上，公布了一个“ SCG101治疗HBV相关干细胞癌 ”的惊艳案例，该患者经单剂SCG101治疗后，获得 部分缓解（PR） ，肿瘤病灶及HBV感染均获得改善。 1、 肿瘤病灶缩小 ：该患者在治疗后第28天， 肿瘤靶病灶 相较基线时 缩小了66% ；治疗第4个月时， 肿瘤病灶进一步缩小到74.5% 。与此同时 另1处病灶则完全消失 。截至数据统计时， 肿瘤未进展时间已超过6.9个月！ 图1 该患者在回输SCG101前后的影像学变化 ▲图源“CISION”，版权归原作者所有，如无意中侵犯了知识产权，请联系我们删除 2、 HBV感染改善 ：该患者在回输SCG101后，复查肝脏免疫组化结果显示， HBsAg （HBV血清学标志） 水平快速下降 ，从治疗前的 557.96IU/mL ，下降至 1.3 IU/mL （治疗第7天）、 0.08 IU/mL （治疗第28天）（详见下图）。与此同时， 乙肝表面抗原阳性肝细胞实现100%清除 。 图2 回输SCG101前后，HBsAg水平的变化 ▲图源“CISION”，版权归原作者所有，如无意中侵犯了知识产权，请联系我们删除 NK细胞单挑晚期肝细胞癌，患者生存期超4年 PART 02 “NK细胞”即“自然杀伤细胞”，属于人体第三类淋巴细胞，既可直接杀伤肿瘤细胞，又可通过影响肿瘤微环境的免疫调节， 发挥抗病毒及抗癌的双重功效 ，是当之无愧的 人体抗癌、抗感染的第一道防线 。 全球著名期刊《Oncotargets and Therapy（肿瘤靶点和治疗）》，曾报道过一个“ 晚期肝细胞癌经NK细胞治疗后，生存时间超过4年 ”的案例。这名幸运的患者为一位59岁 既往患慢性乙肝 的男性，他确诊为 晚期弥漫性肝细胞癌（HCC），TNM为IV期 。既往接受过 腹膜穿刺手术、顺铂、经导管动脉化疗栓塞术（TACE） 等治疗，但效果均不理想。他在入组后，接受了17个疗程的NK细胞回输治疗，结果显示如下： 1、 胸水及腹水减少 ：该患者在接受6个疗程的NK细胞治疗后，复查CT发现，其 胸水和腹水明显减少 。 2、 肿瘤病灶缩小 ：接受17个疗程的NK细胞治疗后，复查CT发现， 右肝叶多个肿瘤病灶均见显著缩小 （详见下图）。 图3 NK细胞治疗前后CT图像对比 ▲图源“Dovepress”，版权归原作者所有，如无意中侵犯了知识产权，请联系我们删除 注： ①图A1~A5：治疗6个疗程后，患者胸腔积液完全消失； ②图B1~B5：治疗6个疗程后，患者腹水几乎完全消失； ③图C1~C5：治疗17个疗程后，患者肝右叶多个肿瘤尺寸缩小。 3、 肿瘤标志物水平改善 ： 肿瘤标志物[如甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）等]水平 ， 是衡量肝癌进展的敏感标志物 。本例患者在回输NK细胞16个月后， 甲胎蛋白（AFP）显著下降 ，这也预示着患者的 病情逐渐稳定、癌症进展得到控制、肿瘤负荷明显减轻 （详见下表）。 ▲数据源自“OncoTargets and Therapy”，，全球肿瘤医生网医学部整理汇总 4、 生活质量提高 ：根据EORTC QLQ-C30，该患者 症状维度得分下降 ，从治疗前 60 ，下降到 ≤10 ；同时 健康维度及功能维度得分显著增加 ，从治疗前 ≤20 ，增加到 80 左右。上述两项结果，也标志着治疗后， 患者的生活质量明显提高 ！值得一提的是， 目前该患者已存活超过4年！ GNOS-PV02疫苗联合派姆单抗，2例肝细胞癌患者获得完全缓解 PART 03 GNOS-PV02属于一种 个性化癌症DNA疫苗 ，可编码40余种患者的特异性新抗原。 关于“ GNOS-PV02治疗不可切除或转移性肝细胞癌 ”的 Ib/IIa期（GT-30试验）临床研究（NCT04251117） ，共入组24例中位年龄为66.5岁（范围40-78岁）的肝细胞癌患者，既往接受过 酪氨酸激酶抑制剂（仑伐替尼/索拉非尼）一线治疗 ，出现不耐受或病情进展。入组接受GNOS-PV02治疗后，结果显示如下： 1、 客观缓解率（ORR） ：根据实体瘤评价标准RECIST1.1，患者的 客观缓解率（ORR）达到29.2% （7/24）。 2、 疾病控制率（DCR） ： 疾病控制率（DCR）达到54.2%（13/24） ！其中，有 2例 患者幸运地获得 完全缓解（CR） ，另 5例获得部分缓解（PR） ，还有 6例达到病情稳定（SD） 。 总之，上述数据显示，GNOS-PV02疫苗+质粒IL-12（pIL12），联合派姆单抗，治疗晚期肝细胞癌的效果，要优于PD1单一疗法。 益生菌长双歧杆菌：提高肝细胞癌术后1年总生存率 PART 04 全球知名期刊《Cell Host Microbe》，曾报道过我国进行的一项“ 通过口服含长双歧杆菌的益生菌混合物，促进肝细胞癌（HCC）患者术后肝功能恢复 ”的相关研究。 本次研究共纳入169例患者，将其随机分为两组，即 益生菌（BL）组 （n=83，在在围手术期口服含双歧杆菌的益生菌混合物）、 对照（CON）组 （n=86，未服用益生菌混合物或其他益生菌补充剂）。结果显示如下： 1、 总生存期（OS）改善 ：截至2023年6月， 益生菌组术后1年的总生存期（OS），明显高于对照组 （详见下图）。 ▲图源“Cell Host&Microbe”，版权归原作者所有，如无意中侵犯了知识产权，请联系我们删除 2、 肝功能恢复情况 ：术后延迟恢复（DR）情况， 11% （益生菌组） vs 33% （对照组）。这也意味着， 术后口服益生菌，有助于降低延迟恢复患者的比例，提高肝功能正常患者的比例 。 3、 住院时间缩短 ：术后平均住院时间， 8.34天 （益生菌组） vs 9.67天 （对照组）。显然，相比对照组患者， 益生菌组的患者住院时间明显缩短 。 综上， 口服含有长双歧杆菌的益生菌混合物，有利于提高1年的总体生存率、促进肝功能恢复、缩短患者的住院时间 。 小编寄语 过去十年间，肝癌治疗已取得了长足的进展，尤其是随着 CAR-T、TCR-T、NK细胞疗法、癌症疫苗、益生菌 等新型疗法的出现，逆转了晚期肝癌患者的生存期，部分疗法甚至可以实现“抗癌”及“抗病毒”双杀的作用，重拳出击乙肝病毒相关肝细胞癌这一罪魁祸首。 尤其是2024 ASCO大会公布的C-CAR031这一新型CAR-T疗法，竟然能将疾病控制率提高到91.3%！全球肿瘤医生网小编也期望未来会有更多的抗癌新兴疗法上市，从而实现 巩固治疗效果、延长生存期、预防复发、提高生存质量 等目的，让越来越多的癌症患者获益！ 参考资料 [1]Hong G,et al.Progression-free survival of a patient with advanced hepatocellular carcinoma treated with adoptive cell therapy using natural killer cells: a case report[J]. 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摘要:目前获批的人类治疗性抗体中，近80%是由中国仓鼠卵巢（CHO）细胞生产的。为了实现更好的细胞生长和高产量的重组蛋白，通常采用连续进料批量培养（fed-batch culture）技术来生产CHO细胞中的重组蛋白。根据营养物质消耗的需求，含有多种组分的进料培养基可以影响细胞生长的特性，并提高重组蛋白的产量和质量。连续进料优化应与培养环境参数、进料组成和进料策略等综合因素相结合。目前，人们正在探索过程强化（Process Intensification, PI）技术，以保持生产的灵活性并满足生物治疗过程的即将到来的需求。本文综述了CHO细胞培养、连续进料培养中的进料组成、连续进料培养环境参数、进料策略、连续进料培养中的代谢副产物、恒化器培养以及强化的连续进料培养等方面的内容。 引言 近年来，随着医药市场对重组治疗性蛋白（RTPs）的需求不断增长，包括重组抗体在内，RTPs的生产发展迅速。已有超过120种重组抗体获得了欧洲药品管理局（EMA）和美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，市值数千亿美元。一份报告估计，到2025年，单克隆抗体（mAbs）的市值将超过3000亿美元。在重组蛋白表达系统中，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞因其多种优势成为RTP生产的首选细胞：①不易感染人类病毒，安全性高；②RTPs具有与人类细胞相似的翻译后修饰；③高密度CHO细胞可适应悬浮培养，使用化学定义无血清培养基（CD-SFM）并分泌蛋白质到培养基中。 目前，哺乳动物细胞培养中的mAbs生产主要采用大规模生物反应器中的连续进料过程。CHO细胞通常在连续进料模式下培养，以实现最大细胞密度和产品滴度，通过连续或脉冲式进料添加。初始细胞生长由基础培养基支持。在连续进料培养中添加浓缩进料培养基以补充营养物质并延长培养时间。进料培养基可以避免营养物质限制，并能促进重组蛋白的更高产量。连续进料处理后细胞在静止期的培养时间比批次培养更长。连续进料培养需要了解细胞生长和细胞代谢的特点，以及影响RTPs质量和产量的关键过程参数。CHO细胞在指数生长期生长速度快，加速消耗葡萄糖和氨基酸，导致乳酸和氨的积累。在连续进料培养中，温度、pH和其他过程参数也会影响抗体表达和质量属性。连续进料培养可以改善CHO细胞中RTPs的表达和生产，但传统的脉冲式进料输送也会导致代谢副产品的积累。因此，合理的进料策略非常重要。连续进料培养已将降低RTPs生产成本作为重点，这已成为制药工业的研究焦点。 CHO细胞培养 贴壁CHO细胞在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基中，于37℃、5% CO2的条件下生长。选择无血清培养基（SFM）进行悬浮培养，支持从贴壁培养到悬浮培养模式的转变。基础培养基用于贴壁培养，包含胎牛血清成分。血清成分复杂，容易受到污染。SFM分为普通无血清培养基、无异种血清培养基、无动物血清培养基、无蛋白培养基和化学定义无血清培养基。在细胞悬浮培养中，SFM可以有效避免血清培养带来的缺点，如污染和纯化困难。 批次培养是指一次性添加SFM后，可以在一个时间点收获重组蛋白的培养方法。由于培养时间短，收集样本时细胞密度不理想，RTP生产不理想。连续进料模式提高了RTP生产。据报道，在连续进料培养中，单克隆抗体（mAb）的滴度已达到10 g/L以上。近年来，连续进料工艺已成为大规模生产RTP的重要生产过程。然而，保持细胞的高生产力和蛋白质的质量属性仍然是一个挑战。因此，连续进料培养已经从仅仅追求高产量的重组蛋白转变为同时追求高产量和高质量的生产目标。 连续进料培养中的进料组成 优化关键的进料组成和组分的浓度对工艺开发至关重要。在连续进料工业中，使用偏最小二乘回归（PLSR）或多元线性回归（MLR）的拉曼光谱被应用于监测和控制葡萄糖和氨基酸的浓度。除了拉曼光谱，液相色谱-质谱（LC-MS）也被认为是分析氨基酸和无机盐的方法。首次，在连续进料培养中进行了脂质组学分析，用于脂质鉴定和脂质定量。此外，进料组成已与细胞代谢调节联系起来，以证明连续进料培养（图1）。 进料培养基的成分与SFM相似，包括氨基酸、碳源、无机盐、微量元素、维生素、脂质以及腐胺和酵母水解物等（表1）。 氨基酸 在上游过程优化中，氨基酸是主要关注点之一。氨基酸在批次培养中耗尽，这对RTP生产不利。氨基酸的进料与三羧酸循环（TCA循环）有关。TCA循环依赖于替代代谢物来补充中间体。来自进料培养基的氨基酸可以通过细胞质和线粒体之间的转换被导向TCA循环。此外，氨基酸的分解代谢是TCA循环的供给。进料培养基中的氨基酸是有限的。与嘌呤核苷酸循环相关的AMP有助于提高细胞健康。苹果酸和甘氨酸的积累来自TCA循环。细胞增殖在氨浓度超过5 mM时会受到负面影响，而氨是从氨基酸的水解中产生的。因此，控制氨基酸的进料可以减少副产品积累。尽管细胞可以合成非必需氨基酸，但细胞生长和重组蛋白的表达仍然依赖于进料培养基中的氨基酸。 图1 CHO细胞的连续进料培养。通过转染将感兴趣的基因（GOI）引入CHO细胞。使用阳性CHO细胞进行摇瓶培养。然后，在生物反应器中加入CHO细胞和进料培养基。在连续进料培养模式下，监控和控制营养物质以实现RTPs的产量和质量。RTPs的生产由连续进料系统指示。 N-乙酰乙酰亮氨酸（Lac-Leu）和N-乙酰乙酰异亮氨酸（Lac-Ile）可以分别替代未修饰的亮氨酸和异亮氨酸。Lac-Leu和Lac-Ile提高了在培养基中的溶解度。添加2倍浓缩进料培养基，其中70%为上述两种N-乙酰乙酰氨基酸（Lac-AA）的混合物，与添加1倍浓缩进料培养基相比，重组蛋白的产量提高了58%。Schmidt等人发现2倍浓缩培养基减少了进料培养基的体积。根据代谢通量分析（MFA），Xing等人优化了进料培养基，在CHO细胞中生产抗体融合蛋白（B1）。降低了丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸的浓度，同时增加了甲硫氨酸、色氨酸、天冬酰胺和丝氨酸的浓度。最终，在连续进料培养中，B1蛋白的滴度提高了27%。Fouladiha等人使用计算建模方法设计了CHO细胞的进料策略。为了研究CHO细胞中mAb生产的效果，通过Plackett-Burman（PB）设计分析了15种代谢物。结果表明，经苏氨酸处理后，mAbs的产量可以显著提高2倍。Hecklau等人报道，S-硫酸-L-半胱氨酸（SSC）替代了半胱氨酸，在连续进料培养中非常稳定；补充SSC的进料培养基延长了细胞活性，并提高了产品滴度78%。同时，这种策略减少了氨（NH4+）的积累。Zhang等人利用高浓度酪氨酸和低浓度酪氨酸实验组，他们在生物反应器中培养表达抗CD20 IgG1的CHO细胞。除了含有酪氨酸的进料培养基外，高浓度酪氨酸组还添加了88 mM酪氨酸溶液。高浓度酪氨酸促进了细胞生长，降低了生物反应器培养环境的渗透压，并增加了mAbs的产量。 氨基酸是进料培养基的关键组成部分，它们的浓度和性质可以影响连续进料培养中RTPs的产量和质量。参与连续进料培养的氨基酸需要严格设计。然而，一些高浓度的氨基酸由于溶解度的限制容易沉淀。改性氨基酸基于原始结构。我们需要全面考虑CHO细胞的特点，并建立最佳的添加策略。 碳源 葡萄糖是指数生长期TCA循环的主要碳源，而在指数生长期的后期，葡萄糖消耗迅速。然而，葡萄糖消耗会导致丙酮酸和乳酸的积累，这会导致细胞生长受到抑制。Wilkens等人发现，3.6 g/L的葡萄糖浓度缩短了CHO细胞培养时间，并且在120小时后乳酸浓度达到了2.7 g/L。尽管1.08 g/L的葡萄糖和2.52 g/L的半乳糖都被用来减少乳酸的积累，并且在向CHO细胞培养中添加1.08 g/L的葡萄糖和2.52 g/L的半乳糖时，组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）的产量增加了100%，但在160小时后葡萄糖的最终浓度接近零，并且细胞活性降低。在细胞培养过程中，需要将最低葡萄糖浓度控制在2 ~ 3 g/L。 表1 连续进料培养中的组分 谷氨酰胺是细胞指数生长期的次要碳源，但它增加了乳酸水平。研究发现，当以40%的替代比例补充半乳糖，并将葡萄糖碳源替换时，CHO细胞中Fc融合蛋白的表达增加了43%，细胞的总唾液酸含量增加了37%。转染了GLUT5果糖转运体的CHO细胞在连续进料培养系统中培养，并且添加了含有14.5 g/L果糖的进料培养基。果糖改善了细胞生长，并减少了乳酸的积累。Wlaschin等人指出，CHO细胞有能力通过表达GLUT5果糖转运体来替代碳源。根据培养基中的葡萄糖含量，可以向CHO细胞培养基中添加高浓度葡萄糖溶液。由于高浓度的碳源也会导致代谢副产品的积累，因此碳源的浓度应严格控制。适当的替代碳源可以避免葡萄糖消耗后副产品抑制细胞生长。 无机盐和微量元素 连续进料培养还需要无机盐来调节细胞培养环境中的pH和渗透压。Zhu等人使用2升生物反应器进行连续进料培养，他们添加了Na+来控制渗透压和二氧化碳分压(pCO2)。140~160 mmHg的pCO2和400 mOsm/kg的渗透压使CHO细胞的活细胞密度(VCD)降低了18%，但这些因素显著增加了蛋白B1的产量。在细胞培养中，以亚硒酸钠形式存在的硒(Se)可以保护细胞免受氧化损伤。Zhang等人发现，在添加亚硒酸钠的14天连续进料培养中，VCD超过了1×10^7个细胞/mL，大约3 g/L的产品滴度得以实现。 Gangwar等人发现，锌(Zn)、铜(Cu)、铁(Fe)和锰(Mn)影响电荷异质性，并减少细胞培养中代谢副产品的积累。Fe、Mn和镍(Ni)增强酸性变体，而Cu则抑制它。Zn减少了碱性变体。Chung等人发现，存放了7周的进料培养基中的硫酸亚铁(Fe2+)可以减少电荷异质性，但它提高了CHO细胞表达的mAb的产量。Graham等人发现，在生物反应器中添加的50和100 μM锌离子(Zn2+)促进了CHO细胞中β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的产生，并使GUS的比活性增加了2倍。进料培养基中5 μM的硫酸铜(Cu2+)得到的最终mAb滴度为11.9±0.6 g/L，用于在CHO细胞中表达IgG1，这比传统连续进料培养的最终mAb滴度高出4.8倍。 维生素 维生素增强了CHO细胞的生产力，并影响电荷异质性。Gangwar等人还指出，维生素可以抑制酸性变体，同时增强碱性变体。Hou等人发现，增加维生素C和烟酰胺的进料速率可以将CHO细胞中的磷酸化水平降低到3%，并将羟化水平降低到9.4%。添加B族维生素，包括0.005 g/L维生素B2、0.0035 g/L吡哆醇(维生素B6)、0.03 g/L吡哆醛(维生素B6)、0.0985 g/L叶酸和0.024 g/L维生素B12，可以提高细胞包装体积(PCV)和抗体滴度。Lee等人在表达重组人凝血因子II(rhFII)的CHO细胞培养中，在4天连续进料培养中添加了10 g/L用13%泊洛沙姆20(PS20)制备的维生素K溶液。当维生素K的最终浓度为0.1 mg/L时，γ-羧基谷氨酸(Gla)水平降低。 脂质 乙醇胺是哺乳动物细胞膜磷脂结构的组成部分之一。就CHO细胞中TNFR-Fc的生产而言，添加了乙醇胺和脂质的进料培养基的添加，实现了最大VCD为4.3×10^6个细胞/mL和378 mg/L的抗体滴度，这比批次培养高出三倍。因此，脂质可以适当地补充到进料培养基中。 其他组分 腐胺对细胞生长至关重要。Zhang等人通过PB设计确认了腐胺的重要性，它显著增加了mAb的产量。在添加了41.67 mg/L腐胺的进料培养基后，观察到TNFR-Fc产量显著增加。Jardon等人发现自噬对重组蛋白生产有负面影响。在连续进料培养中使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA），与未使用3-MA的对照组相比，t-PA产量增加了2.8倍。自噬诱导肽（AIP），作为自噬蛋白Beclin 1的衍生物，通过调节细胞自噬，促进了CHO细胞中mAb的生产。在连续进料培养中添加3 µM的AIP，改善了人IgG1的表达水平，IgG1浓度超过了1200 µg/mL。酵母水解物（YE）使连续进料培养中Fc融合蛋白（Fc）的产量提高了两倍，YE还增加了CHO细胞的大小和细胞内核苷酸含量。表达人类mAb和Fab片段的CHO细胞在14天连续进料培养中培养，第二天添加了25 mg/L的脱氧尿苷，VCD和蛋白质产量都增加了。Takagi等人使用脱氧尿苷、胸腺嘧啶和脱氧胞嘧啶收获了9.2 g/L的人类mAb和超过4 g/L的Fab片段抗体。由于脱氧尿苷、胸腺嘧啶和脱氧胞嘧啶都是嘧啶核苷酸，外源性核苷可能通过补救合成途径提供嘧啶核苷酸的前体，为高效抗体生产提供平台。Aki等人筛选了4-(2,5-二甲基-1H-吡咯-1-基)-N-(2,5-二氧吡咯啉-1-基)苯甲酰胺（MPPB）。MPPB处理的mAb浓度增加到1098 mg/L，比对照组的mAb浓度高出1.5倍。在连续进料培养中进行的进一步研究有助于开发更多的添加剂，除了上述组分。 连续进料培养环境参数 培养参数可以影响CHO细胞生长、重组蛋白表达、蛋白质糖基化、细胞代谢产物以及其他因素。生物反应器被设计用于在CHO细胞中培养悬浮的RTP生产。细胞通过冷冻管或摇瓶扩增，然后在生物反应器中生长。对于连续进料培养，生物反应器中的培养环境参数通常通过实验设计（DoE）或逐因素分析（OFAT）研究进行优化，如温度、溶解氧。 pH 细胞培养的pH值需要优化，以生产高质量的重组蛋白。CHO细胞生长的pH值范围在7.2到7.6之间。在3升生物反应器中培养表达抗血管内皮生长因子（VEGF-MA）的mAb的CHO细胞，并对培养条件进行了优化。通过添加碳酸氢钠来调节pH值。当pH值设定为7.10时，VEGF-MA的产量增加到4.1 g/L，电荷异质性、糖基化水平和蛋白质纯度分别为26.1%、59.1%和95.1%。在设计连续进料培养的pH值时，需要遵循CHO细胞的标准pH范围。如果细胞培养的pH值维持在6.8以下或7.6以上，CHO细胞生长会受到负面影响。细胞培养的pH值通常由CO2和无机盐交互调节，以改善CHO细胞生长，实现大规模重组蛋白生产。 溶解氧 DO是大规模过程中的关键环境参数之一，它影响细胞生长和重组蛋白生产。CHO细胞中大多数DO值通常在20%到50%的范围内。Ventini等人报道，在连续进料培养模式下，当DO值为20%时，最终重组促甲状腺激素（rTSH）的滴度为1.6 mg/L。为了提高人IgG1 mAb的产量和质量，Mahé等人将DO值调整到40%，在连续进料培养中，使用铜醋酸盐和铁柠檬酸盐培养表达人IgG1 mAb的CHO细胞。在14天的连续进料培养中，mAb的产量超过10 g/L，铜醋酸盐和铁柠檬酸盐减少了man5含量和mAb的酸性电荷变体，并增加了G1F的比例。 进料策略 除了调整进料培养基的组成和设置合理的工艺参数外，设计和开发有效的进料策略对于生产高产量和高质量的重组蛋白是必要的。进料策略应该考虑控制标准和进料方式。通过控制标准，将一种或两种主要营养物质的浓度保持在理想水平。根据化学计量进料组成，将剩余的营养物质添加到培养系统中。进料策略通常分为两种添加方法：连续进料和脉冲式进料。脉冲式进料操作简便、设备要求低、生产成本低。脉冲式进料策略增加了CHO细胞中mAb的表达，是大规模哺乳动物细胞培养中最广泛使用的连续进料培养方法。然而，大量添加培养基会导致代谢副产品的积累和渗透压的增加。连续进料可以解决上述两个问题，它可以调整进料速率以维持营养物质的浓度，这基于营养物质的消耗。因此，连续进料在细胞培养方面具有更多优势。 为了促进CHO细胞中抗HER2 mAb的高表达，在第3、5、7和9天分别添加了初始培养体积5%的Feed 4。连续进料培养中峰值VCD为17.1×10^6个细胞/mL，mAb产量达到437 mg/L。为了提高CHO细胞中表达人鼠嵌合抗表皮生长因子受体变体III（EGFR vIII）抗体C12的表达，采用了连续进料策略，从第3天开始向生物反应器中添加培养基。与脉冲式进料方法相比，连续进料方法减少了细胞代谢副产品的比例、培养渗透压和高甘露糖型，提高了CHO细胞的VCD和活性，抗体产量超过10 g/L。Horvat等人使用连续进料优化了连续进料培养过程，培养CHO细胞。从第4天开始，补充了浓度超过400 g/L的葡萄糖溶液，以保持最终葡萄糖浓度低于5.55 mmol/L。从第5天开始，连续添加含有丝氨酸的进料培养基。连续进料可以降低细胞培养的渗透压和甘露糖基化比例，但增加了mAb产量。如果CHO细胞的VCD和细胞活性在指数生长期的后期或静止期早期呈现下降趋势，应在细胞培养中添加培养基。优秀的进料策略对RTP生产有积极影响。 在连续进料培养中引入了监测和控制系统，保持关键细胞营养物质在理想水平。脉冲式进料策略广泛用于连续进料培养，但它不能将介质浓度调节到不同代谢阶段细胞的动态营养物质消耗率。 拉曼光谱用于监测营养物质和副产品（葡萄糖、乳酸和氨基酸）。动态进料策略用于通过拉曼光谱控制进料培养基的输送。在开发的早期阶段，Domján等人建立了一个考虑细胞代谢行为和营养消耗的偏最小二乘（PLS）校准模型。随后，营养物质保持在理想水平。对于CHO细胞中mAb的生产，Eyster等人开发了拉曼光谱来控制连续进料培养中的乳酸和葡萄糖，并建立了预测葡萄糖和乳酸浓度的PLS模型。在细胞代谢、生产力和产品质量方面评估了三种进料策略。通过将乳酸控制在2 g/L，铵水平降低了68%，而mAb的半乳糖基化水平大约增加了50%。 代谢副产品在连续进料培养中 在细胞培养的后期，连续进料培养通常会积累乳酸和氨等代谢副产品。代谢副产品的高浓度对细胞生长和抗体表达有害。在CHO细胞中，葡萄糖通过运输蛋白GLUT1转移到细胞质中，并通过糖酵解产生大量丙酮酸。部分丙酮酸使用乳酸脱氢酶进一步转化为乳酸。为了培养表达Fc融合蛋白的CHO细胞并减少连续进料培养中乳酸的积累，使用半乳糖作为碳源以减少乳酸的积累。在连续进料培养中培养表达抗HIV抗体VRC01的CHO-K1细胞。从第3天开始每天添加进料培养基。细胞接种后12小时，向CHO细胞培养基中添加10 mM和30 mM的NH4Cl。与对照组相比，用30 mM NH4Cl处理的组的VCD和培养时间显著减少，包括乳酸、葡萄糖、氨和谷氨酰胺在内的副产品积累。特别是，氨对抗体滴度和细胞特异性生产力有负面影响。 向CHO细胞中添加TCA循环中间体，包括α-酮戊二酸（α-KG）、苹果酸和草酸，可以减少连续进料培养中乳酸和氨的积累，并提高细胞特异性生产力和抗体滴度。Xiao等人设计了连续进料策略。他们发现，由于在7升生物反应器中大量营养进料培养基，连续进料减少了乳酸和氨的积累。最终，促进了C12抗体的生产。在连续进料培养中，应避免副产品的产生。建议连续进料培养选择有效的进料策略，以减少代谢副产品积累的可能性和浓度。 恒化器培养 为了提高RTPs的细胞特异性生产力，成功的策略需要在培养温度和介质中的葡萄糖浓度方面进行调控。不幸的是，细胞培养的变化会影响特定生长速率，特别是在这两个操作变量中。为了在CHO细胞中生产重组人组织型纤溶酶原激活剂（rh-tPA），Vergara等人利用恒化器培养，并设置了三组关于进料培养基，葡萄糖浓度分别为20 mM、30 mM和40 mM。总共40 mM的葡萄糖限制了细胞生长，但它提高了rh-tPA的细胞特异性生产力和处于G2/M期的细胞。此外，当温度条件为33°C时，葡萄糖消耗和乳酸产生速率降低。Vergara等人指出，降低的特定生长速率与高进料葡萄糖迅速提高CHO细胞中的蛋白质生产力。 强化连续进料培养 在生物制造业中，与传统连续进料相比，强化过程需要更多的时间来开发。 Schulze等人在15 mL和250 mL生物反应器中进行了标准连续进料（sFB）和强化连续进料（iFB）过程，起始时分别添加4%（体积/体积）的进料培养基A和4%（体积/体积）的进料培养基B。最终葡萄糖浓度为5 g/L。通过N-1灌注达到的细胞浓度为1×10^8个细胞/mL，用于iFB。在15 mL生物反应器中，两个iFB分别在接种浓度为2.5和5×10^6个细胞/mL时来自N-1灌注。与sFB过程相比，在更短的过程时间内达到了相似的滴度，但分别为2.5和5×10^6个细胞/mL方法的空间-时间产量（STY）分别大幅增加了16%和36%。在250 mL生物反应器中，接种浓度为5×10^6个细胞/mL的iFB在48小时后添加了2.5 mM丁酸（BA）。与未添加BA的5×10^6个细胞/mL接种的iFB相比，通过BA处理后STY提高了50%，KPI被发现。通过BA补充，平均细胞特异性生产力从25提高到37 pg/细胞/天。 讨论 RTPs正在快速发展。每年大约有40种新抗体被引入。如何在RTP药物开发中实现高水平的表达和生产是一个挑战。这些是提高RTP生产和质量的最先进策略，例如优化基因序列、表达载体和糖基化。 一份报告显示，Pembrolizumab的生物仿制药开发可以由设计质量（QbD）指导。QbD是生物仿制药开发的一种有效但具有挑战性的方法，因为过程、质量和效力之间存在复杂的关系。为了确保mAbs生产的CQAs，QbD强调了对生产过程的理解。Jafar-Aghaei等人发现了一个由QbD指导的制药测量，以承担Pembrolizumab生物仿制药候选药物PSG-024（Keytruda®）在连续进料培养中的任务。目前，Keytruda®已成为治疗性mAbs的王牌。 尽管Handlogten等人指出，超过1 g/L的葡萄糖浓度已经带来了10 g/L的mAb滴度，但他们仍然指出脉冲式进料存在缺陷。最近，在连续进料平台过程中，通过12 g/L的葡萄糖浓度达到了4 g/L的最终mAb滴度；同时，最终葡萄糖浓度为5 g/L。这种葡萄糖进料策略也有效地促进了细胞生长。 Komuczki等人提出，低细胞密度下超过2.5 mM的半胱氨酸会导致抵消的氧化应激，但是高半胱氨酸浓度与更高的细胞浓度可以抵消氧化应激。Wang等人报道，在14天连续进料培养中，温度升高至33℃，对产品滴度的提高产生了影响，并将100%的标准化滴度设置为第14天的最高滴度。尽管连续进料优化是可行的，但是由于资源和时间的限制，优化所有过程参数是不可能的。 在COVID-19的背景下，生物仿制药将进入市场，这取决于一个稳健且可扩展的制造过程，具有出色的生产力。PI是一个涉及过程策略的关键趋势。随着灌注和其他过程的发展，连续进料培养已经越来越多地被研究。目前，在连续进料培养中仍然有改进的空间。 总结与展望 总体而言，连续进料培养技术已经实现了高产量和高质量的蛋白质生产，并延长了细胞培养时间。在连续进料培养中，进料培养基是连续或间歇补充的。近年来，连续进料培养取得了显著进展。进料组分的优化对工艺开发仍然至关重要。同时，连续进料培养还应考虑培养参数、营养物质消耗和代谢副产品的积累等。随着对CHO细胞中重组治疗性蛋白（RTPs）生产的深入探索，我们在未来仍将考虑这些指标，如细胞生长、RTPs的产量和质量。然而，连续进料培养在工艺开发方面存在缺陷，选择最佳参数具有挑战性，包括温度、pH值、溶解氧、基础和进料培养基以及添加剂。探索一系列优秀的工艺参数受到限制因素的制约。随着多组学、新的监测和分析技术、人工智能以及其他方法的广泛应用，强化连续进料培养将进一步提高重组蛋白生产的产量和质量。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。