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喜欢我们，设为星标，接收最新类器官进展与资讯！知识星球搜索“肠道类器官”获取更加专业的培养基配方、标准方案、AI类器官工具和技术手册。 传播科学知识 促进同行交流 推动产业发展 服务国家战略 本公众号由Organoid Agent智能体强力赋能，让您的类器官研究始终站在潮头浪尖！ 推荐语 该研究聚焦结直肠癌（CRC）肝转移中免疫检查点阻断（ICB）治疗抵抗的临床难题，针对微卫星稳定（MSS）型 CRC（尤其不良预后的 CMS4 亚型）展开机制探索与干预研究。研究团队借助 AKTP 等 CRC 肝转移小鼠模型及患者数据，结合单细胞测序、TCR 测序等技术，揭示转化生长因子 β（TGF-β）构建双重免疫屏障的核心机制：既直接阻断外周记忆 CD8+ T 细胞向肿瘤微环境（TME）招募，又诱导肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）表达 SPP1，抑制 T 细胞克隆扩增并促进胶原沉积。通过基因敲除与药物实验，证实 SPP1 是 TGF-β 介导免疫抑制的关键介质，且 TGF 抑制剂与抗 PD-L1 联合可重塑 TME、逆转 ICB 抵抗。该研究不仅阐明 CRC 肝转移免疫逃逸机制，更给 MSS 型 CRC 精准免疫治疗提供新靶点与联合策略，具有重要临床转化意义。 技术路线图科学背景与研究现状结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤，同时位列癌症相关死亡原因的第二位，每年导致超过 93.5 万人死亡。在 CRC 的进展过程中，肝脏是最常见的远处转移部位，约 50% 的患者会出现结直肠癌肝转移（colorectal cancer liver metastasis, CRLM），这也是 CRC 患者死亡的主要原因。尽管手术切除、全身化疗和靶向治疗等手段不断发展，但 CRLM 患者的预后仍不理想 —— 接受规范治疗的患者 5 年总生存率（overall survival, OS）仅为 30%~57%，而未接受治疗者的中位生存期不足 12 个月。这种严峻的临床现状与 CRC 的分子分型密切相关。根据错配修复（mismatch repair, MMR）功能状态，转移性 CRC 可分为两类：微卫星不稳定型（microsatellite instability-high, MSI-H）/ 错配修复缺陷型（dMMR）和微卫星稳定型（microsatellite stable, MSS）/ 错配修复功能正常型（pMMR）。其中，MSI-H 型因 DNA 修复功能缺陷导致肿瘤突变负荷（tumor mutational burden, TMB）升高，能产生大量新抗原，易于被免疫系统识别，约占转移性 CRC 的 5%~10%。而 MSS 型占比高达 90%~95%，其 DNA 修复功能正常，TMB 低，新抗原匮乏，对临床常用的免疫治疗手段反应极差。免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）疗法的问世为癌症治疗带来了革命性突破，其核心机制是通过阻断程序性死亡受体 1（PD-1）、程序性死亡配体 1（PD-L1）等免疫检查点分子，解除肿瘤对 T 细胞的抑制，恢复机体抗肿瘤免疫应答。在 MSI-H 型 CRC 中，ICB 疗法展现出显著疗效，客观缓解率（ORR）可达 30%~50%，2 年总生存率超过 60%。但这一突破并未惠及绝大多数 MSS 型 CRC 患者。临床数据显示，MSS 型 CRC 单药 ICB 治疗的 ORR 通常低于 5%，在 CRLM 患者中甚至可能低至 0%。即使联合 PD-1 与细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原 4（CTLA-4）抗体，疗效也未得到实质性改善，与单纯化疗相比几乎无额外获益。这种原发性抵抗的核心原因在于 MSS 型 CRC 形成了典型的 “冷肿瘤” 微环境，胡志前教授将其概括为三重缺陷：一是免疫识别启动失败，新抗原不足导致细胞毒性 T 细胞无法有效激活；二是深度免疫抑制状态，瘤内浸润的调节性 T 细胞、髓源性抑制细胞等分泌大量抑制性细胞因子；三是物理与化学屏障叠加，异常纤维化的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）阻挡 T 细胞浸润，形成 “免疫排斥” 现象。近年来，研究者尝试通过多种策略重塑肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME），如福建医科大学团队开发的 RegoNeo 联合疗法通过增加 Rgs2⁺CD8⁺T 细胞浸润起效，香港中文大学于君教授团队发现丁酸梭菌可通过抑制 IL-6 改善免疫微环境。但这些策略多针对单一环节，缺乏对免疫抑制核心调控通路的系统性解析，临床转化效果仍需验证，因此亟需明确 MSS-CRLM 免疫抵抗的关键驱动机制。转化生长因子 β（transforming growth factor-β, TGF-β）是 TME 中关键的免疫调控因子，其生物学功能具有显著的双面性：在肿瘤早期通过抑制细胞增殖、促进凋亡发挥抑癌作用；而在肿瘤进展期，通过调控细胞上皮 - 间质转化（EMT）、血管生成及免疫抑制促进转移。在 CRC 中，TGF-β 的高表达与 MSS 亚型（尤其是预后最差的 CMS4 亚型）密切相关，且被证实与 ICB 治疗无响应显著相关。基于这一关联，研究者曾寄望于 TGF-β 抑制剂破解免疫抵抗。但第一代 TGF-β 受体抑制剂（如 galunisertib、LY3200882）的临床探索均以失败告终 —— 无论是单药治疗还是与 ICB 联合，均未在 MSS-CRLM 患者中观察到理想疗效。这提示现有研究对 TGF-β 介导免疫抑制的机制理解仍存在重大空白：其一，TGF-β 调控免疫的具体环节尚不明确。已知 TGF-β 可抑制 T 细胞活化，但 MSS-CRLM 中 T 细胞浸润不足的核心原因是招募障碍还是功能耗竭？美国国立卫生研究院的研究发现，肝转移灶中肿瘤抗原特异性 CD8⁺T 细胞频率其实很高，但存在严重功能耗竭，且与 SPP1⁺巨噬细胞相关，这与传统认知的 “招募不足” 矛盾，提示 TGF-β 可能通过多重机制调控 T 细胞功能。其二，TGF-β 的下游关键效应介质未被识别。临床中 TGF-β 抑制剂效果不佳，可能是因为其下游存在未被靶向的核心介质。虽有研究提示肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）是 TGF-β 的重要响应细胞，但 TAMs 如何将 TGF-β 信号转化为免疫抑制效应？SPP1（分泌型磷蛋白 1）作为 TAMs 分泌的关键分子，已被证实与胶原沉积、免疫抑制相关，但它是否是 TGF-β 调控免疫的核心中介？这一通路尚未得到验证。其三，TGF-β 与其他免疫抑制机制的协同作用未知。MSS-CRLM 的免疫抑制是多因素叠加的结果，TGF-β 如何与 ECM 纤维化、CAFs 活化等物理屏障形成协同？是否存在 “双重屏障” 或 “网络调控” 模式？这些问题的答案直接决定了联合治疗策略的设计方向。上述研究空白共同指向一个关键科学问题：TGF-β 在 MSS-CRLM 中究竟通过何种机制构建免疫屏障，其下游是否存在可靶向的关键介质？解决这一问题具有强烈的临床与科学价值：从临床需求看，MSS-CRLM 患者占比极高且缺乏有效治疗手段，明确 TGF-β 的免疫调控机制可为这类患者提供新的治疗靶点，破解 ICB 抵抗困境。从科学价值看，现有研究对 “冷肿瘤” 微环境的认知多局限于单一细胞或分子，而该研究聚焦 TGF-β 连接先天性免疫（巨噬细胞）与适应性免疫（T 细胞）的调控网络，可能揭示免疫抑制的全新范式。此外，第一代 TGF-β 抑制剂的失败凸显了机制研究的紧迫性，只有明确核心效应通路，才能开发出更精准的联合治疗方案，避免临床探索的盲目性。实验技术方法一、核心技术：小鼠肿瘤类器官（MTOs）的构建、培养与改造 该研究以小鼠肿瘤类器官（mouse tumor organoids, MTOs）为核心实验材料，构建了3种不同突变背景的CRC类器官，是模拟体内肿瘤特征、开展转移研究的关键工具，具体技术流程如下：1. MTOs 的来源与初始构建基础类器官构建：AKP（携带 Apc、KrasG12D、Trp53 突变）和 AKTP（在 AKP 基础上新增 Tgfbr2 突变）类器官，直接从对应基因工程小鼠的原发肿瘤中分离建立；AKPS 类器官则是通过 CRISPR-Cas9 技术，在 AKP 类器官中敲除 Smad4 基因获得 —— 先设计靶向 Smad4 的 sgRNA，与 Cas9 蛋白共转染 AKP 类器官单细胞，通过测序验证敲除效率后，筛选稳定传代的克隆（科普：CRISPR-Cas9 是一种 “基因剪刀” 技术，通过 sgRNA 定位目标基因，Cas9 蛋白切割 DNA 实现基因敲除，此处用于模拟临床中 Smad4 失活的 CRC 亚型）。原代分离关键步骤：取小鼠原发肿瘤组织，用无菌剪刀剪碎后，加入含 Liberase（Roche，货号 5401119001）和 DNase I（10mg/ml，Roche，货号 10104159001）的 DMEM 培养基，37℃振荡消化 90 分钟；消化后用 70μm 细胞筛过滤去除残渣，离心收集单细胞；将细胞重悬于冷的基底膜提取物（BME，Cultrex Type 2，货号 3533-005-02）中，滴入 6 孔板形成 “类器官滴”，待 BME 凝固后，加入类器官培养基。2. MTOs 的培养条件与传代专用培养基配方：以 Advanced DMEM/F12（Gibco，货号 12634028）为基础，添加 10mM HEPES、GlutaMAX、无维 A 酸的 B-27 添加剂、50ng/ml EGF（PeproTech，货号 AF-100-15）、100ng/ml 重组 noggin（实验室自制，用于抑制 BMP 信号维持类器官干性）、1μM galunisertib（TGF 抑制剂，用于特定实验组）；所有试剂均需无菌过滤，4℃储存不超过 1 周。传代操作细节：类器官培养 3~5 天后，当直径达 100~200μm 时进行传代 —— 用冷的 HBSS（Gibco，货号 14175053）冲洗 BME 滴，溶解基底膜；收集类器官后，加入 Trypsin-EDTA（Gibco，货号 25200056），37℃消化 20 分钟至单细胞；离心后用 70% 冷 BME 重悬，按 1:3 比例接种到新的 6 孔板，补充新鲜培养基，每 2~3 天换液一次。质量控制：每周用 Mycoplasma 检测试剂盒（如 Lonza 货号 LT07-418）排查污染；每月通过 Sanger 测序验证关键基因突变（Apc、KrasG12D 等），确保类器官基因型稳定。3. Spp1 过表达类器官的构建（功能验证关键工具）为验证 SPP1 的作用，研究将类器官改造为 “SPP1 过表达型”，具体步骤：构建慢病毒载体：采用 pLenti-Pgk-Puro-DEST 载体（Addgene，货号 19068），插入小鼠 Spp1 全长 CDS 序列（由 G. Weber 实验室馈赠），构建 “Pgk-Spp1” 过表达载体；同时构建空载体（Pgk-Empty）作为对照。慢病毒包装与感染：在 HEK293T 细胞中，将载体与包装质粒（psPAX2、pMD2.G）共转染，48 小时后收集病毒上清；取处于对数生长期的 AKTP 类器官，消化为单细胞后，在超低吸附板中加入 50% 病毒上清和 8μg/ml polybrene（促进病毒感染），37℃孵育 24 小时。筛选与验证：感染后 2~3 天，加入 2μg/ml puromycin（InvivoGen，货号 ant-pr-1）筛选阳性克隆，持续筛选 1 周；通过 qPCR（引物见文档 Supplementary Table 10）和 ELISA 检测类器官上清中 SPP1 的表达量，确保过表达效率（通常较空载体组升高 5~10 倍）。4. MTOs 的关键检测：类器官活力与功能评估活力检测：采用台盼蓝排斥法，取传代后的单细胞，与 0.4% 台盼蓝溶液 1:1 混合，显微镜下计数活细胞比例（要求活率＞90% 方可用于后续实验）；转移能力验证：将 MTOs 消化为小细胞簇（约 50~100 个细胞 / 簇），通过 intrasplenic 注射（见下文小鼠模型）接种到小鼠体内，观察肝转移形成能力，验证类器官的体内致瘤性。二、小鼠结直肠癌肝转移模型构建（体内实验核心）该研究通过 “脾内注射 MTOs” 建立肝转移模型，模拟临床 CRC 肝转移的自然过程，具体步骤：1. 实验动物准备选用 7~8 周龄 C57BL/6J 小鼠（Janvier Labs），或基因工程小鼠（如 LysMCre;Tgfbr2fl/fl、Spp1-/- 等），性别与 MTOs 来源小鼠一致（避免免疫排斥）；实验前 1 天禁食不禁水，手术当天用异氟烷麻醉（吸入浓度 2%~3%），腹部剃毛并消毒（75% 乙醇 + 碘伏）。2. MTOs 的接种准备AKTP 类器官：培养 3 天后消化为小细胞簇，70μm 筛过滤，计数后调整浓度为 1~2×10³ 细胞 / 70μl HBSS；AKP/AKPS 类器官：用冷 HBSS 溶解 BME（30 分钟，4℃），完整收集类器官，计数后调整为 2×10⁵（AKP）或 0.2×10⁵（AKPS）细胞 / 70μl HBSS（因 AKPS 致瘤性更强，需降低细胞量）。3. 脾内注射操作小鼠仰卧固定，腹部左侧做 5mm 小切口，暴露脾脏；用 1ml 注射器（30G 针头）吸取 MTOs 悬液，缓慢注入脾实质（避免注入脾静脉）；注射后用无菌纱布按压脾脏 1 分钟止血，将脾脏放回腹腔，逐层缝合切口；术后皮下注射丁丙诺啡（0.1mg/kg）镇痛，单笼饲养，观察 3 天确保恢复。4. 模型监测与终点取样每周用 IVIS Spectrum 活体成像系统（PerkinElmer）监测转移情况：小鼠腹腔注射 D - 荧光素（15mg/ml，50μl / 只），10 分钟后成像，定量胸腔 - 腹腔区域的生物发光信号（光子 / 秒），判断肿瘤负荷；3~4 周后处死小鼠，取肝脏称重，肉眼计数表面转移结节数；部分肝转移灶固定于 10% 中性福尔马林（Sigma，货号 HT501128）用于病理分析，部分新鲜组织用于 MTOs 分离或单细胞测序。三、药物干预方案（体内药效验证关键）研究测试了 3 类关键药物，给药方式和剂量严格匹配临床转化场景：1. TGF-β 受体 1（TGFBR1）抑制剂galunisertib（LY2157299）：口服灌胃，剂量 800mg/kg，每天 2 次（间隔 12 小时），每次 0.15ml 体积；vactosertib：口服灌胃，剂量 412.5mg/kg，给药频率同 galunisertib；LY3200882（MedChemExpress）：口服灌胃，剂量 94.5mg/kg，给药频率同前；均从 MTOs 接种后 12~15 天开始给药，持续至实验终点，溶剂（0.9% NaCl）作为对照。2. 免疫检查点抗体抗 PD-L1 抗体（10F.9G2，BioXcell，货号 BE0101）：腹腔注射，剂量 200μg / 只，每 3 天 1 次；同型对照抗体（抗 IgG2b，BioXcell，货号 BE0090）：剂量和给药频率相同，用于排除抗体非特异性作用；与 TGF 抑制剂联合使用时，两种药物同一天给药（抗体上午注射，抑制剂下午灌胃）。3. 辅助干预药物（机制验证用）FTY720（阻断 T 细胞迁出淋巴结）：腹腔注射，剂量 10mg/kg，100μl / 只，给药 3 天前单次注射，之后每周 1 次；抗 CXCR3 抗体（CXCR3-173，BioXcell，货号 BE0249）：腹腔注射，剂量 200μg / 只（1mg/ml PBS），给药时间同 FTY720；EdU（检测细胞增殖）：腹腔注射，剂量 40mg/kg，处死前 16 小时单次注射，用于标记增殖细胞。四、关键检测技术（结果分析核心）1. 单细胞测序（scRNA-seq）与 TCR 测序（解析细胞异质性）样本制备：取新鲜肝转移灶，机械剪碎后用 Liberase+DNase I 消化 90 分钟，过滤后用流式细胞术分选目标细胞（如 CD8+T 细胞、TAMs）；文库构建：scRNA-seq：用 10x Genomics Chromium 平台，3’文库试剂盒（v3 或 v3.1），目标捕获 5000 细胞 / 样本，逆转录后扩增 cDNA；TCR 测序：用 5’ V (D) J 试剂盒（小鼠 T 细胞专用），扩增 TCRβ 链可变区；测序与分析：Illumina NovaSeq 6000 测序（约 4 万 reads / 细胞），用 Cell Ranger（v4.0.0）比对小鼠基因组（mm10），Seurat（R 包）进行聚类分析，Monocle 3 分析细胞分化轨迹（科普：单细胞测序能捕获单个细胞的基因表达信息，避免传统 bulk 测序 “平均化” 误差，此处用于区分 T 细胞亚群、TAM 亚型的异质性）。2. 流式细胞术（细胞表型与功能检测）样本处理：血液：心脏穿刺取血，EDTA 抗凝，用 RBC 裂解液（Invitrogen，货号 00-4300）处理 10 分钟，离心收集白细胞；肝转移灶：新鲜组织消化后，用 FACS 缓冲液（PBS+1% BSA+2mM EDTA+0.05% NaN3）重悬，加入 LIVE/DEAD™荧光染料（Thermo Fisher，货号 L34957）标记死细胞；抗体染色：先加抗 CD16/32 抗体（阻断 Fc 受体，避免非特异性结合），4℃孵育 10 分钟；再加入表面抗体混合物（如 CD3-BV605、CD8-BV711、PD-1-PE-Cy7 等，具体见文档 Supplementary Table 9），4℃孵育 25 分钟； intracellular 染色（如 Ki-67）需用 Foxp3 染色缓冲液（Thermo Fisher，货号 00-5523-00）固定 permeabilize；检测与分析：用 BD FACSAria Fusion 流式细胞仪检测，FlowJo（v10.7）分析数据，定量各细胞亚群比例（如 CD8+Teff 细胞占比、CXCR3+T 细胞比例）。3. 成像技术（组织结构与细胞定位分析）胶原检测（SHG 显微镜）：取 4% 多聚甲醛固定的肝转移灶，切成 100μm 厚切片，用 Leica SP5 共聚焦显微镜，Ti:Sapphire 激光（900nm）激发二次谐波信号，450±5nm 滤光片检测，获取 100μm z-stack 图像（1μm 步长），分析胶原纤维的密度和排列（科普：二次谐波成像无需荧光标记，能直接识别胶原等具有非线性光学特性的物质，比传统染色更精准）；免疫组化 / 免疫荧光：肝组织石蜡包埋切片（3μm），脱蜡后抗原修复（Tris-EDTA 缓冲液煮沸 20 分钟）；免疫组化用 DAB 显色（Dako，货号 K346811），免疫荧光用 Alexa Fluor 偶联二抗（Life Technologies），DAPI 染核；用 NanoZoomer 2.0 HT 扫描仪成像，QuPath（v0.5.1）定量 CD3+T 细胞密度、Sirius 红阳性面积（胶原）。关键结果图表该研究的核心研究问题聚焦于临床中微卫星稳定型（MSS）结直肠癌（CRC）尤其是共识分子亚型 4（CMS4）肝转移患者对免疫检查点阻断（ICB）治疗普遍抵抗的困境 —— 已知转化生长因子 β（TGF-β）在这类肿瘤微环境（TME）中高表达且与 ICB 无响应相关，但第一代 TGF-β 抑制剂单药或联合治疗疗效不佳，其介导免疫抑制的具体机制仍不明确，导致临床转化受阻。基于此，研究者提出核心猜想：TGF-β 可能并非通过单一环节调控免疫，而是通过协同影响适应性免疫（T 细胞）与先天性免疫（巨噬细胞）构建 “双重免疫屏障”，且这一过程可能依赖关键下游介质（如分泌型磷蛋白 1，SPP1）的介导，只有明确该屏障的具体构成与核心介质，才能为破解 ICB 抵抗提供精准靶点。为验证上述猜想，研究者采用了多维度整合的研究思路：首先构建携带不同突变背景的小鼠肿瘤类器官（MTOs），包括 AKTP（Apc、KrasG12D、Trp53、Tgfbr2 突变）、AKP（Apc、KrasG12D、Trp53 突变）及 AKPS（AKP 基础上新增 Smad4 突变），通过脾内注射建立结直肠癌肝转移小鼠模型，模拟临床转移过程；随后利用 TGF-β 受体 1（TGFBR1）抑制剂（如 galunisertib、LY3200882、vactosertib）、抗 PD-L1 抗体及基因敲除小鼠（如 Spp1⁻/⁻、LysMCre;Tgfbr2fl/fl、Ccr2CreERT2;Tgfbr2fl/fl）进行干预，结合单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）、T 细胞受体（TCR）测序、流式细胞术、二次谐波（SHG）显微镜成像及骨髓移植等技术，从细胞表型、分子表达、组织结构及体内功能层面，系统解析 TGF-β 调控免疫抑制的机制及联合治疗的效果。一、TGF-β 通过抑制外周 CXCR3⁺记忆 CD8⁺T 细胞招募，构建第一道免疫屏障研究者首先通过 AKTP MTO 肝转移模型分析 T 细胞浸润与功能，发现 TGFBR1 抑制剂 galunisertib 单药治疗可显著增加转移灶中 CD3⁺T 细胞密度（图 1a），且通过 Picrosirius 红染色和 SHG 成像证实，galunisertib 能有效重塑细胞外基质（ECM），减少胶原沉积（图 1b-d），但单独使用并未增强 T 细胞在 TME 内的运动能力（图 1j-l）；而抗 PD-L1 单药或与 galunisertib 联合（dual therapy）则能显著提升 T 细胞与肿瘤细胞的直接接触比例，并扩大高运动性 T 细胞在转移灶边缘的分布范围（图 1i-l）。进一步通过 TCR 测序分析发现，galunisertib 或 dual therapy 处理后，肿瘤内扩增的 T 细胞克隆与外周血中克隆存在直接相关性（图 4a），且外周血中 CD44⁺CD62L⁺中央记忆 CD8⁺T 细胞（Tcm）及 CXCR3⁺CD8⁺T 细胞比例显著升高（图 4b-e）。为验证 T 细胞招募的必要性，研究者使用 FTY720（阻断 T 细胞从淋巴结迁出）或抗 CXCR3 抗体预处理小鼠，结果显示这两种干预均显著削弱了 dual therapy 的治疗效果，使肝转移结节数量增加且完全缓解率下降（图 4f-h），同时 TGF-β 受体缺陷的 T 细胞（Tgfbr2dLck-KO/GFP）向 TME 的迁移能力显著强于野生型 T 细胞（图 4n-o）。这些结果共同证实，TGF-β 通过直接作用于 T 细胞，抑制 CXCR3⁺外周记忆 CD8⁺T 细胞向 TME 的招募，形成第一道免疫屏障，而抗 PD-L1 则主要通过增强已招募 T 细胞的运动能力发挥作用，二者在机制上存在互补。二、TGF-β 诱导 SPP1⁺肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）抑制 T 细胞克隆扩增，构建第二道免疫屏障通过 scRNA-seq 对肝转移灶 TME 的分析，研究者发现肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是 TME 中最丰富的免疫细胞群体，且可分为两个主要亚型：C1q⁺TAMs（高表达补体通路基因）和 SPP1⁺TAMs（高表达免疫抑制及 ECM 相关基因）（图 5a）。进一步分析显示，galunisertib 处理可显著下调这两种 TAMs 中 TGF-β 靶基因（如 Spp1、Trem2、Apoe、C1qa）的表达，并上调趋化因子基因（如 Ccl6、Ccl9）（图 5b-c），基因集富集分析（GSEA）证实 TGF-β 可通过 TAMs 促进 ECM 沉积并抑制 IFN-γ、IL-2 介导的免疫应答（图 5d）。为明确 SPP1 的功能，研究者利用 Spp1⁻/⁻小鼠进行实验，发现 Spp1⁻/⁻小鼠肝转移结节数量显著减少（图 7a-c），转移灶中 CD3⁺T 细胞密度显著升高（图 7d-e），且 CD8⁺效应 T 细胞（Teff）和耗竭 T 细胞（Tex）的增殖比例（Ki-67⁺）显著增加（图 7g-h）；更关键的是，向 Spp1⁻/⁻小鼠接种过表达 SPP1 的 AKTP MTOs（Pgk-Spp1）后，肝转移负担恢复至野生型水平，且对 ICB 治疗重新产生抵抗（图 7n-o）。骨髓移植实验进一步证实，向 Spp1⁻/⁻小鼠移植野生型骨髓可恢复肝转移表型，反之向野生型小鼠移植 Spp1⁻/⁻骨髓则显著减少转移（图 8b-c），表明TAMs 来源的 SPP1 是 TGF-β 介导 T 细胞克隆扩增抑制的关键介质，构成第二道免疫屏障，且该效应独立于 T 细胞招募过程。三、TGF-β 抑制剂与抗 PD-L1 联合治疗可破解双重免疫屏障，有效逆转 ICB 抵抗研究者在 AKTP、AKP、AKPS 三种不同突变背景的肝转移模型中验证联合治疗效果：在 AKP 模型中，galunisertib 单药虽会增加转移负担（因释放 TGF-β 对肿瘤细胞的抑增殖作用），但与抗 PD-L1 联合后，多数小鼠实现完全缓解（图 3e-g）；在 AKPS 模型中，dual therapy 也能显著减少转移灶数量并提升 T 细胞浸润（图 3m-t）。流式细胞术分析显示，galunisertib 处理可显著增加 CD8⁺Teff、Tpr（前体耗竭 T 细胞）的增殖比例（EdU⁺），且 dual therapy 进一步提升该效应（图 2c），同时使 Teff/Tex 比值显著升高（图 2f）；而在 myeloid 细胞特异性 Tgfbr2 敲除小鼠（LysMCre;Tgfbr2fl/fl）中，TAMs 免疫抑制表型减弱，CD8⁺Teff 细胞数量增加，与抗 PD-L1 联合治疗后可有效清除转移灶（图 5l-n）。此外，对人类 CRC 样本的分析显示，包含 SPP1、Trem2 等基因的 TAM 高风险签名（TAM-HR）在 CMS4 亚型中高表达，且与患者不良预后显著相关（图 6h-i），而 galunisertib 或 Tgfbr2 基因敲除均可显著下调该签名的表达（图 6o-p），证实TGF-β 抑制剂与抗 PD-L1 联合治疗可通过同时破解 “T 细胞招募障碍” 和 “SPP1⁺TAMs 介导的增殖抑制” 双重屏障，有效逆转 MSS 型结直肠癌肝转移的 ICB 抵抗，且该策略在不同突变背景中均具有有效性。该研究的总结与结论可归纳为：明确了 TGF-β 在 MSS 型结直肠癌肝转移中构建双重免疫屏障的具体机制 —— 第一道屏障通过抑制 CXCR3⁺外周记忆 CD8⁺T 细胞向 TME 招募，限制抗肿瘤免疫的启动；第二道屏障通过诱导 TAMs 表达 SPP1，抑制已招募 T 细胞的克隆扩增，同时促进 ECM 沉积强化物理屏障；SPP1 作为 TGF-β 调控免疫抑制的关键下游介质，其表达水平与 ICB 抵抗及患者预后直接相关。此外，该研究证实 TGF-β 受体抑制剂与抗 PD-L1 联合治疗可通过重塑 TME、恢复 T 细胞功能，有效破解双重屏障，为临床中 MSS 型结直肠癌肝转移患者的治疗提供了新的靶点（如 SPP1）和联合策略，解决了第一代 TGF-β 抑制剂单药疗效不佳的核心困境。基于上述发现，该研究引出的新延伸问题与下一步实验方向包括：一是 SPP1 调控 T 细胞增殖的具体分子机制，如是否通过与 CD44 或整合素结合影响 T 细胞信号通路，仍需体外共培养及蛋白互作实验进一步验证；二是临床转化层面，需开发基于 TAM-HR 签名或 SPP1 表达的生物标志物，用于筛选对联合治疗敏感的患者，避免无效治疗；三是探索 SPP1 特异性抑制剂（如中和抗体、小分子抑制剂），以减少 TGF-β 抑制剂可能带来的系统性副作用（如组织纤维化）；四是需在人类结直肠癌肝转移样本中开展前瞻性研究，验证 TGF-β-SPP1 轴的临床相关性，推动机制研究向临床应用转化。特色与创新之处该研究在结直肠癌（CRC）肝转移免疫抑制机制与治疗策略探索中，展现出多维度的特色与创新，且每一项创新均紧密围绕临床痛点与科学空白展开，具备明确的科学价值与转化意义：首先，在机制解析层面，该研究首次在 CRC 肝转移模型中系统阐明TGF-β 通过 “双重免疫屏障” 调控免疫抑制的具体通路，打破了此前对 TGF-β 单一免疫调控作用的认知局限。此前研究虽已知 TGF-β 与 ICB 抵抗相关，但多聚焦于其对 T 细胞活化或 ECM 沉积的单一影响，未能解释第一代 TGF-β 抑制剂临床疗效不佳的核心原因。而本研究通过单细胞测序、TCR 追踪及功能干预实验证实，TGF-β 并非通过单一环节发挥作用：一方面直接作用于 T 细胞，抑制 CXCR3⁺外周记忆 CD8⁺T 细胞向肿瘤微环境（TME）的招募，阻断抗肿瘤免疫的 “启动环节”；另一方面通过诱导肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）高表达分泌型磷蛋白 1（SPP1），抑制已招募 T 细胞的克隆扩增，同时促进胶原沉积强化物理屏障，形成 “后续抑制环节”。这一 “双重屏障” 机制的发现，不仅填补了 TGF-β 在 CRC 肝转移中免疫调控的机制空白，更从逻辑上解释了为何单纯抑制 TGF-β 无法有效逆转 ICB 抵抗 —— 需同时破解 “招募障碍” 与 “增殖抑制” 两个环节，为联合治疗策略提供了明确的机制依据。其次，在研究模型构建上，该研究创新性地采用多突变背景的小鼠肿瘤类器官（MTOs）与基因工程小鼠结合的体系，显著提升了研究结果的临床贴近性与可靠性。研究者并非依赖单一模型，而是构建了三种携带不同基因突变的 MTOs（AKTP、AKP、AKPS），分别模拟临床中 Tgfbr2 失活、Smad4 正常及 Smad4 失活的 CRC 亚型 —— 其中 AKPS 类器官通过 CRISPR-Cas9 技术敲除 Smad4，精准还原了临床中预后极差的 CMS4 亚型分子特征。同时，通过脾内注射 MTOs 建立肝转移模型，而非传统的尾静脉注射，更贴合 CRC 细胞经门静脉系统转移至肝脏的自然病理过程。此外，结合 Spp1⁻/⁻、LysMCre;Tgfbr2fl/fl 等基因敲除小鼠，实现了对 “TGF-β-SPP1-TAMs” 通路的特异性干预与验证。这种 “类器官模拟肿瘤特征 + 基因工程小鼠解析细胞互作” 的模型体系，既避免了传统细胞系模型脱离体内微环境的局限，又通过精准的基因调控排除了无关变量干扰，使研究结论更能反映临床 CRC 肝转移的真实病理状态。再者，在技术应用与验证维度，该研究创新性地整合多维度技术手段实现 “从分子 - 细胞 - 组织 - 整体” 的机制验证，大幅提升了结论的可靠性与说服力。研究者未局限于单一技术，而是将单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）、T 细胞受体（TCR）测序、二次谐波（SHG）显微镜成像、骨髓移植及流式细胞术等技术有机结合：通过 scRNA-seq 精准识别出 TME 中 C1q⁺与 SPP1⁺两种功能分化的 TAM 亚型，明确其免疫抑制特征；借助 TCR 测序追踪肿瘤内 T 细胞克隆来源，证实 galunisertib 促进的 T 细胞浸润源于外周招募而非局部扩增；利用 SHG 成像直观量化 TGF-β 抑制剂对胶原纤维的重塑效果；通过骨髓移植实验明确 SPP1 的主要来源是骨髓源性 TAMs，而非其他基质细胞。这种多技术、多层面的交叉验证，避免了单一技术可能存在的偏差，使 “双重免疫屏障” 机制的每一个环节均有扎实的实验证据支撑，结论可信度显著高于依赖单一技术的研究。最后，在临床转化层面，该研究创新性地提出 “TGF-β 抑制剂 + 抗 PD-L1” 联合治疗的精准适用场景与生物标志物，为 MSS 型 CRC 肝转移的临床治疗提供了可落地的解决方案。此前 TGF-β 抑制剂联合 ICB 的临床探索多因缺乏精准分层策略而失败，而本研究通过以下两点突破推动转化：一是在三种不同突变背景的 CRC 肝转移模型（AKTP、AKP、AKPS）中均证实，TGF-β 抑制剂（如 galunisertib）与抗 PD-L1 联合可显著抑制转移、提升 T 细胞浸润，且在 AKP 模型中实现多数小鼠的完全缓解，明确了该联合策略的普适性；二是基于人类 CRC 样本分析，筛选出包含 SPP1、Trem2 等基因的 “TAM 高风险签名（TAM-HR）”，证实该签名在 CMS4 亚型中高表达且与患者不良预后显著相关，同时发现 TGF-β 抑制可显著下调该签名表达。这一签名的提出，为临床筛选适合联合治疗的患者提供了潜在生物标志物，避免了 “一刀切” 的治疗模式，使联合策略更具精准性与可行性，为后续临床研究设计提供了关键参考。可以改进的地方[AI基于大数据总结，仅供参考]该研究虽在结直肠癌（CRC）肝转移 TGF-β 免疫调控机制领域取得重要突破，但结合研究设计与实验数据来看，仍存在几方面可改进的不足，且每项不足均基于原文实验细节展开，改进建议也贴合现有技术可行性：一、小鼠模型未能完全模拟人类 CRC 肝转移的肿瘤异质性与免疫微环境复杂性不足依据：原文核心依赖 C57BL/6J 背景的基因工程小鼠（如 AKTP、AKP、AKPS 模型）及同源小鼠肿瘤类器官（MTOs）构建肝转移模型，虽覆盖了 Apc、Kras、Trp53 等关键突变，但人类 CRC 肝转移患者的肿瘤异质性远高于实验模型 —— 一方面，人类 MSS-CRC 尤其是 CMS4 亚型，除原文涉及的 Smad4 失活外，还常伴随 PI3K/Akt、Wnt 通路异常激活及复杂的拷贝数变异，而原文模型仅聚焦有限突变组合；另一方面，人类患者 TME 中还存在肿瘤浸润中性粒细胞、肥大细胞及肠道菌群调控的免疫紊乱，原文虽提及 TAMs、T 细胞，却未纳入这些细胞类型的互作分析，且小鼠免疫系统（如 T 细胞亚型比例、巨噬细胞分型）与人类存在天然差异，可能导致联合治疗效果的临床转化存在偏差（如原文图 7 显示 Spp1⁻/⁻小鼠对 ICB 敏感，但人类患者可能因其他免疫抑制细胞存在而响应不佳）。改进建议：一是构建 “患者来源类器官（PDOs）- 人源化小鼠” 模型，将临床 CRC 肝转移患者的肿瘤组织体外培养为 PDOs，再移植到 NSG 或 NOG 人源化小鼠（重建人类免疫系统）体内，模拟人类肿瘤的基因突变谱与免疫微环境；二是在现有小鼠模型中引入额外临床常见突变（如 PIK3CA 突变），通过 CRISPR-Cas9 改造 MTOs，评估突变叠加对 TGF-β 免疫屏障的影响；三是纳入肠道菌群干预实验，比如通过抗生素清除或粪菌移植改变小鼠肠道菌群，观察菌群是否通过调控 TAMs 或 T 细胞功能影响 TGF-β 介导的免疫抑制，更贴近人类 CRC 的多因素致病环境。二、SPP1 介导 T 细胞增殖抑制的分子机制解析不充分不足依据：原文明确 SPP1 是 TGF-β 调控免疫抑制的关键介质（如 Spp1⁻/⁻小鼠 T 细胞增殖增强、过表达 SPP1 逆转 ICB 敏感性），但仅停留在 “现象验证” 层面，未深入解析 SPP1 作用于 T 细胞的具体分子通路。原文虽提及 SPP1 是细胞外基质（ECM）蛋白，可能通过促进胶原沉积发挥作用，但未排除其直接作用于 T 细胞的可能性 —— 已知 SPP1 可通过 CD44、整合素 αvβ3/αvβ5 等受体结合免疫细胞，而原文未检测 T 细胞表面这些受体的表达情况，也未验证阻断受体后是否能逆转 SPP1 的抑制效应；此外，原文图 7g-h 显示 Spp1⁻/⁻小鼠 CD8⁺Teff 增殖增加，但未检测 T 细胞内关键信号分子（如 STAT3、NF-κB、mTOR）的磷酸化水平，无法明确 SPP1 是通过抑制增殖信号还是激活凋亡信号发挥作用。改进建议：一是开展体外 “SPP1-T 细胞” 共培养实验，用重组人 / 小鼠 SPP1 蛋白处理分选的 CD8⁺T 细胞（来自 CRC 患者或模型小鼠），检测细胞增殖（EdU 掺入）、活化标志物（CD25、CD69、IFN-γ 分泌）及凋亡率，同时加入 CD44 抗体、整合素 αvβ3 抑制剂（如 cyclic RGD 肽）阻断潜在受体，观察是否能恢复 T 细胞功能；二是通过免疫共沉淀或邻近连接实验（PLA），验证 T 细胞表面受体与 SPP1 的结合情况；三是对 SPP1 处理前后的 CD8⁺T 细胞进行磷酸化蛋白组学分析，筛选差异激活的信号通路，明确 SPP1 抑制 T 细胞增殖的下游分子靶点，为开发 SPP1 特异性抑制剂提供更精准的作用位点。三、联合治疗的长期疗效与安全性评估缺失不足依据：原文中 TGF-β 抑制剂（如 galunisertib）与抗 PD-L1 联合治疗的实验周期较短（多为 3-4 周，如原文图 3、图 7 的治疗终点为 18-24 天），仅评估了短期肿瘤负荷与 T 细胞浸润，未开展长期随访观察肿瘤复发情况 —— 临床中 CRC 肝转移患者接受治疗后常面临复发问题，而原文未明确联合治疗是否能诱导长期免疫记忆（如记忆 T 细胞形成）；此外，原文未评估 TGF-β 抑制剂长期使用的安全性，已知 TGF-β 在正常组织（如肝脏、肠道、肺）中调控组织修复，长期抑制可能导致正常组织纤维化或炎症紊乱，而原文仅检测了肿瘤组织的 ECM 重塑（如 SHG 成像分析胶原），未检测正常肝脏、肠道的病理变化（如胶原沉积、炎症细胞浸润）及肝功能指标（如 ALT、AST），可能低估临床应用中的副作用风险。改进建议：一是延长动物实验周期至 8-12 周，在联合治疗结束后继续随访 4-6 周，通过活体成像监测肿瘤复发情况，同时检测小鼠外周血及脾脏中记忆 T 细胞（CD44⁺CD62L⁺Tcm、CD44⁺CD62L⁻Tem）的比例，评估联合治疗是否诱导长期免疫记忆；二是开展安全性评估实验，对长期接受 galunisertib 治疗的小鼠，取正常肝脏、肠道、肺组织进行 HE 染色和 Picrosirius 红染色，量化胶原沉积面积，同时检测血清中肝功能（ALT、AST）、肾功能（BUN、Cr）及炎症因子（IL-6、TNF-α）水平，明确安全剂量范围；三是设计 “间歇给药” 方案（如 galunisertib 每周给药 5 天停药 2 天），对比持续给药与间歇给药的疗效及安全性，为临床剂量优化提供参考。四、人类样本验证的深度与前瞻性不足不足依据：原文虽利用人类 CRC 样本数据（如 Pelka 数据集、Moorman 数据集）验证了 TAM-HR 签名的预后价值，但存在两方面局限：一是样本类型以回顾性为主，原文提及的 metacohort（787 例 MSS CRC）虽包含 stage I-III 患者，但肝转移患者亚组样本量未明确，且未针对接受过 ICB 治疗的肝转移患者进行分析，无法直接验证 “TGF-β 抑制剂 + 抗 PD-L1” 联合治疗对人类患者的适用性；二是分子验证维度单一，原文仅通过 scRNA-seq 检测了 SPP1 的 mRNA 水平，未通过免疫组化或免疫荧光检测 SPP1 蛋白在人类肝转移灶中的表达定位（如是否主要表达于 TAMs），也未分析 SPP1 蛋白水平与 ICB 疗效的相关性，可能存在 mRNA 与蛋白表达不一致的偏差（如转录后调控导致 mRNA 高表达但蛋白低表达）。改进建议：一是扩大前瞻性人类样本队列，收集至少 50-100 例接受 ICB 治疗的 CRC 肝转移患者的肿瘤组织（治疗前、治疗中、治疗后），通过免疫组化检测 SPP1、TGF-β、CD8 的表达，分析 SPP1 表达水平与 ICB 客观缓解率（ORR）、无进展生存期（PFS）的相关性；二是开展 “临床标本 - 类器官” 联动实验，将患者肝转移组织培养为 PDOs，体外加入 TGF-β 抑制剂、抗 PD-L1 抗体或 SPP1 抑制剂，检测 PDOs 活力及肿瘤浸润 T 细胞功能，筛选对联合治疗敏感的患者亚群；三是对 TAM-HR 签名进行前瞻性验证，纳入新诊断的 MSS-CRC 肝转移患者，通过 RNA-seq 检测签名表达，将患者分为高表达组与低表达组，分别给予联合治疗或标准治疗，观察两组的疗效差异，明确该签名作为治疗分层标志物的临床价值。五、TME 中其他基质细胞与 TGF-β 的互作分析缺失不足依据：原文重点分析了 TGF-β 对 T 细胞、TAMs 的调控，却忽略了肿瘤微环境中其他关键基质细胞（如癌症相关成纤维细胞（CAFs）、内皮细胞）的作用 —— 已知 CAFs 是 ECM 的主要来源，原文图 1 显示 TGF-β 抑制剂可减少胶原沉积，但未明确 CAFs 是否直接响应 TGF-β 并参与 SPP1 介导的免疫抑制；此外，原文提及 TGF-β 抑制 T 细胞招募，但未分析内皮细胞是否通过 TGF-β 调控血管内皮黏附分子（如 ICAM-1、VCAM-1）影响 T 细胞跨血管迁移，而这些细胞类型的互作可能进一步完善 “双重免疫屏障” 的机制网络（如 CAFs 通过 TGF-β 促进 ECM 沉积，内皮细胞通过 TGF-β 抑制 T 细胞迁入）。改进建议：一是通过单细胞测序细分 CAFs 亚型（如炎症型、肌成纤维细胞型），分析 TGF-β 抑制剂处理后不同 CAFs 亚型中 ECM 相关基因（如 Col1a1、Fn1）及趋化因子基因的表达变化，明确 CAFs 是否通过 TGF-β 调控 ECM 以影响 T 细胞运动；二是开展 “CAFs-T 细胞” 共培养实验，用 TGF-β 处理 CAFs 后收集条件培养基，孵育 CD8⁺T 细胞，检测 T 细胞 motility（如 Transwell 迁移实验），验证 CAFs 分泌的 ECM 或细胞因子是否抑制 T 细胞迁移；三是检测肝转移灶中内皮细胞的 TGF-β 受体表达及黏附分子水平，用 TGF-β 抑制剂处理内皮细胞，观察其对 T 细胞黏附能力的影响，补充 “血管内皮 - T 细胞” 互作在 TGF-β 免疫屏障中的作用。求点赞求分享求推荐如果你想在此显示您的广告信息，请联系我们。 与万千同行共同关注类器官！ 关注我们 肠道类器官（Organoid Bulletin）本公众号由AI智能体ORGANOID AGENT驱动赋能，您可以直接与公众号对话，获得最专业的类器官知识指导与信息。 我们致力于发布本领域优质资讯与评述，推送国内外类器官与干细胞相关领域最新研究论文、综述与技术进展。发布科普文章、专家观点评论、行业分析、招聘信息和会议通知。您可以在微信、小红书、百家号、企鹅号、今日头条、知乎和Bilibili关注我们。秉承干细胞与类器官创新计划组织(ISCO)愿景，我们积极传播科学知识，促进同行交流，推动产业发展，服务国家战略，积极为类器官与干细胞技术发展提供助力。欢迎各位关注、分享、转载、投稿！原创内容欢迎转载，直接私信即可，完全免费授权。内容多来自学术论文或网络公开资源，如有侵权还请联系删除。编辑部联系邮箱：zj@organoid.ac.cn广告赞助 欢迎找到组织类器官创新计划组织 类器官创新计划组织（Innovations in organoids organization）是由来自中国科学院、北京大学、清华大学和复旦大学等多个顶级研究机构的头部研究团队组织发起的，完全公益的学术与研究技术交流合作组织，成员主要由来自类器官行业内的企业高管、技术经理、高级PI等构成。加入“类器官创新计划”后，您将以极低的成本实现类器官资源的互换与共享，基于肠道类器官和类器官创新计划组织微信公众号平台，您将获得来自全行业的赋能与指导，进行标准化的类器官制备与检测，保证您的研究顺利且高质量开展。我们会将你纳入本组织“技术研发”、“开源公益”和“产品服务”等多个微信群，这样您能够与所有参与计划的成员及时沟通，您所有的类器官问题都能最及时的得到解答和帮助，互换类器官品系和干细胞研究工具资源，解决技术难题，获得技术支持。我们已有上万个来自全国顶级类器官研究机构、大学和企业的注册认证会员，大家一起为类器官事业发展点燃星星之火，推动类器官产业发展壮大。我们还建立了AI知识问答和开源类器官分析工具等多个公益项目为类器官研究提供帮助，构建开放包容的领域生态。在这里,我们敢为人先，始终积极寻求更新类器官更优的解决方案，勇于突破经验与预想的界限，致力打造科学卓越的行业新标准。官方网站：www.organoid.ac.cn联系邮箱：info@isco.ac.cn 组织愿景1.共建开放协作生态：搭建行业资源共享平台，促进技术互通与经验共享，降低类器官研究门槛。2.引领标准与规范：推动制定行业与国家工程标准，实现类器官培养与应用的规范化、全流程标准化。3.打造国际级资源枢纽：推动建设全球认可的类器官库与智库平台，加速技术向精准医学与药物研发转化。4.驱动技术融合创新：推动整合生物材料、智能装备等工程技术创新，突破类器官规模化制备与功能重建瓶颈。5.强化技术自主可控：推进国产化试剂、仪器研发与技术体系替代，保障核心研发链安全与战略主动权。 加入交流 ISCO面向类器官全领域同行提供交流平台和会员身份认证服务，可以加入“技术研发”、“开源公益”、“产品服务”和“专属领域”等多个类型的交流群，涵盖科学研究技术、开源工具和公益、销售产品与服务、细分领域如类器官芯片、生物材料等专属群等平台，参与讨论。高级研究员或独立PI可以申请成为荣誉发起人，成为类器官创新计划贡献者与受益者。本公益组织目前已有8000+会员，期待您加入讨论分享，让我们共同促进类器官产业发展。 现在，您只需添加发起人微信，备注自己的真实姓名与单位例如“李四-中国科学院大学”，说明申请加入类器官创新计划，提供有效身份证件如学生证、身份证、工作证或其他任何可以证明身份的真实性的证件，即可加入对应社群。而这一切都是公益的，免费的，不收取任何费用。欢迎您找到组织！~扫描二维码添加发起人微信以进群交流专业收费资源面向专业科普需求和企业级资源共享，现在扫描二维码加入“肠道类器官”知识星球，就能获得来自顶级研究机构分享的类器官培养基配方和方案，类器官创新计划组织发布的官方标准指南、AI类器官分析工具等更加专业的资料。与1000+位行业精英共同交换类器官技术资料和资源，向行业专家提问，免费参与国内领先的类器官品牌产品内测试用，获得类器官工程师认证等。全行业最专业的类器官知识社区和公益平台，让您的类器官研究少走弯路！#为什么要加入知识星球？1.最新最专业的培养基配方和技术资料即时获取。2.标准类器官培养方案和技术标准材料发布唯一渠道。3.最强AI智能体和类器官分析软件和工具解析和下载。4.类器官领域TOP专家一对一沟通，权威资料触手可及。5.类器官企业新产品评测和免费试用特权通道。6.定期发放免费会议入场券和资料，提供演讲机会。 更多福利，请移步知识星球内部了解。开源公益 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