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Rishi R. Shah等人的综述报道了首个共价 VHL 配体的设计和优化过程，以及将其纳入 PROTACs 以用于 TPD 应用的过程。已知 VHL 结合体的羟脯氨酸基团可以被磺酰氟分子取代，并通过结构指导优化生成了一种配体，将它们加入双功能降解剂中可诱导 BRD4 或雄激素受体的靶向蛋白降解，而无需进一步优化链接。文章要点如下：这是首次报道缺乏羟脯氨酸基团并通过磺酰氟分子与 VHL 共价结合的 VHL 配体也是首次通过设计而非筛选开发的共价 E3 连接酶结合剂扩大了共价 E3 连接酶 PROTAC 的底物范围01研究背景蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）是一种异多功能分子，通过利用细胞蛋白水解降解机制诱导靶向蛋白质降解（TPD）。（VHL）蛋白是 PROTAC 广泛使用的 E3 连接酶之一。以共价方式与 E3 连接酶配位的 PROTACs 引起了人们的浓厚兴趣，可将三元复合物转化为修饰 E3 与底物之间的简单二元相互作用（图 1A），因而比可逆配位的 PROTACs 具有潜在优势。迄今为止，已报道的共价 PROTACs 包括 DCAF1、DCAF11、DCAF16、RNF4、RNF114 和 FEM1B，每种都带有半胱氨酸靶向亲电弹头（如氯乙酰胺或 α、β-不饱和羰基），而且都是通过筛选而非设计发现的。然而，通过设计发现具有广泛兴趣蛋白（POI）范围的共价 PROTACs 具有挑战性。02第一代磺酰氟共价 VHL 配体VH032 是迄今为止在 PROTACs 中应用最广泛的 VHL 配体， VHL-SF1 是探究 VHL 共价修饰的合理起点。VHL-SF1 的合成首先通过一系列简短的反应生成 (S)-羟脯氨酸（方案 S1）。用硫代乙酸酯置换甲磺酸盐 1 得到化合物 2，化合物 2 通过磺酰氯 3 转化为磺酰氟 4（方案 1）。虽然这一反应生成了所需的磺酰氟，但脯氨酸环发生了外嵌合，导致 LC-MS 分析检测到非对映异构体混合物。为了避免这种情况，研究者开发了新的反应条件，直接从硫代乙酸酯 2 一步合成所需的磺酰氟，只得到所需的立体异构体 5。方案 1. 开发在 VHL-SF1 和 VHL-SF1 生物素中引入磺酰氟分子的新合成路线为了评估 VHL-SF1 对 VHL 进行共价修饰的能力，研究者首先开发了一种链霉亲和素转移试验，通过这项检测得出结论：室温下培养 2 小时后，10 μM VHL-SF1 生物素修饰了 32% 的 VHL，进一步证实这与探针的浓度有关。在竞争性荧光偏振（FP）试验中，浓度高达 100 μM 的 VHL-SF1 无法取代荧光团标记的 HIF1α 肽，而已知 HIF1α 肽同时占据了 VH032 结合位点和第二个 VHL 结构域。接下来开发第二代共价 VHL 结合剂，提高其效力和占据率。03第二代磺酰氟 VHL 共价配体为了提高共价配体的效力，优化羟脯氨酸外围基团可以增强对 VHL 的亲和力。研究 VHL-SF1 类似物的对接姿势，包括 VHL-SF2，其中的叔亮氨酸分子换成了甲基异噁唑，连接载体移到了苄基位置（图 2A）。与 VHL-SF1 不同的是，这一分析表明 VHL-SF2 可与 Ser110 共价结合，同时保持与 VH032 的许多非共价相互作用（图 2B）。VHL-SF2在链霉亲和素转移试验中显示出比第一代VHL-SF1更高的VHL修饰效率（44% vs 32%）。此外，VHL-SF2在荧光偏振（FP）试验中能够以35 μM的IC50值置换标记肽，表明其能够有效占据VHL的HIF1α结合位点。在活细胞中，VHL-SF2通过竞争性牵引试验进一步证实了其与VHL的结合，且这种结合可以通过预处理进行剂量依赖性竞争。磺酰氟弹头在生理pH和40°C下的稳定性降低可能是导致细胞试验中效力降低的原因之一。总体而言，VHL-SF2的开发和评估表明了其作为一种有效的共价VHL配体的潜力，能够在细胞内特异性地修饰VHL并诱导目标蛋白的降解。VHL-SF2 的合成分为 11 个步骤。04基于 VHL-SF2 的 PROTAC 可诱导蛋白酶体依赖性的 BRD4 TPD在离体蛋白和完整细胞中验证了 VHL-SF2 与 VHL 的接合后，研究者合成了一种 BRD4 靶向 PROTAC--BRD-SF2，其中包含 VHL-SF2 和一种已知的 BRD4 配体（图 3A），并使用 BRD4 HiBiT 检测法评估了靶蛋白降解情况。而 VHL-SF2 本身并不影响 BRD4 水平（图 3B），在这些条件下，BRD-SF2 和 VHL-SF2 没有显示出细胞毒性。用蛋白酶体活性抑制剂或 NEDDylation 抑制剂（分别为 epoxomicin 和 MLN4924）处理时，BRD4 在 BRD-SF2 存在的情况下不会被耗尽，这证明蛋白酶体和 Cullin E3 连接酶依赖机制与 VHL 的招募是一致的。05基于VHL-SF2的PROTACs诱导AR的TPD为了进一步证实 VHL-SF2 在加入 PROTAC 时招募 VHL 诱导靶蛋白降解的多功能性，研究者合成了两种 AR 配体衍生的 VHL-SF2 共轭物 AR-VHL-SF2 和 AR2-VHL-SF2，它们基于具有诱人细胞效力的已知 AR 配体，这些配体以前曾被加入 AR 双功能降解剂中（图 3F）。在 LNCaP 前列腺癌细胞中使用 AR HiBiT 检测法评估了这些化合物诱导 AR 降解的情况，其中内源性 AR 被标记了 HiBiT 肽（图 3G）。AR-VHL-SF2和AR2-VHL-SF2都能诱导AR降解，此外，Arvinas的AR降解临床候选药物ARV110也能诱导AR降解。根据 MLN4924 存在下的 AR 降解阻断，AR-VHL-SF2- 和 AR2-VHL-SF2- 介导的蛋白质降解都是蛋白酶体和 E3 连接酶依赖性的（图 3H、I），并且在这些条件下没有表现出细胞毒性。与非共价 PROTACs 的标准三元复合物相比，共价 E3 连接酶招募剂在催化效率和延长预测的二元复合物功效方面具有优势。未来，应通过全蛋白质组学进一步研究这种加合物群对 VHL 天然底物的影响，以确定最小的占有率是否足以在不改变 VHL 功能的情况下促进 TPD。06共价 VHL PROTACs 的优势  为了进一步研究共价 VHL 配体的潜在优势，在Washout实验中对 BRD-SF2 和 MZ-1 进行了正面比较。在该实验中，BRD-SF2 的降解活性相对于 MZ-1 的降解活性降低了（图 4A,B），分别为 27% 和 48%。在有竞争浓度的 VH032 正交存在的情况下进行的 BRD4 HiBiT 检测证实，在 6 小时后，MZ-1 降解 BRD4 受竞争者存在的影响更大。这些结果进一步支持了 BRD-SF2 的共价作用机制，并强调了在去除游离 PROTAC 或存在竞争性结合剂的情况下延长降解活性的潜力。总结本研究为羟脯氨酸中心的其他结构修饰铺平了道路，最终可改善针对 VHL 的 PROTAC 的药代动力学和药效学特性。并为进一步优化 VHL 共价配体以提高药效和稳定性的药物化学研究奠定了基础。本文还报告了 BRD4 和 AR 的新型双功能降解剂，这些降解剂可作为开发具有更好药代动力学和药效学特性的 PROTACs 的起点。参考文献https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1021/acs.jmedchem.3c02123声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓