Elasomeran

摘要:核酸技术彻底改变了疫苗开发，使得RNA和DNA疫苗的设计和生产能够快速进行，以预防和治疗疾病。针对COVID-19的mRNA和质粒DNA疫苗的成功部署进一步验证了这项技术。目前，由于其更高的有效性，mRNA平台占据主导地位，而DNA平台正在快速进化，因为它拥有独特的优势，有可能克服与mRNA平台相关的问题。为了帮助理解这两种疫苗平台的最新表现，并认识到它们在未来的临床潜力，本综述比较了文献中目前已知的mRNA和DNA疫苗的优势和缺点，包括开发时间线、财务成本、分发便利性、有效性、安全性和产品的监管批准。此外，综述还讨论了正在进行的临床试验、改进策略，以及RNA和DNA平台的替代疫苗设计。 1.引言 核酸疫苗因其在临床试验中对多种疾病（包括癌症和SARS-CoV2等病毒感染）的治疗或预防显示出有希望的结果，最近受到了极大关注。与传统的基于蛋白质或病毒的疫苗相比，核酸疫苗拥有众多优势，这些优势已经并将继续使它们成为疾病控制和治疗最有希望的平台。与基于蛋白质和病毒的疫苗生产所需的在孵化鸡蛋或培养细胞中的漫长过程不同，核酸疫苗的开发和制造简单快捷，并且可以迅速扩大生产规模，特别是在应对新兴大流行病时。核酸疫苗的生产过程中不包含传染性病原体，这也消除了不完全灭活病毒或纯化的问题，并确保了它们在人类中的安全性。此外，核酸疫苗的基因序列可以轻松修改以针对特定病原体和疾病，使它们能够适应新兴传染病和快速演变的病原体，或者适应癌症等异质性疾病中的个性化疫苗。除了安全性和生产便利性，核酸疫苗能够通过MHC I类和II类分子呈现抗原，并诱导宿主免疫系统的细胞和体液反应，而蛋白质疫苗在诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞反应方面效率较低，激活这些细胞需要MHC I分子呈现抗原。同样重要的是，核酸疫苗避免了当前基于鸡蛋的疫苗中病毒适应在鸡蛋中复制的问题，这可能导致关键抗原位点的变化，干扰保护性免疫反应。核酸疫苗的另一个优势是，与基于蛋白质或病毒的传统疫苗相比，它们在最终溶液产品中的添加剂更少。传统疫苗的溶液通常含有MF59、铝盐和CpG等佐剂。Saponin作为佐剂被添加到Novavax（一种针对COVID-19的蛋白质亚单位疫苗）的溶液中。Thimerosal有时被用作传统疫苗的防腐剂，以防止细菌或真菌污染。尽管没有证据表明疫苗中使用Thimerosal是有害的，但公众担心Thimerosal可能导致儿童自闭症等神经系统疾病。相比之下，Moderna或Pfizer的COVID-19 mRNA疫苗的溶液中不包含额外的佐剂或防腐剂。用于mRNA传递的脂质纳米颗粒（LNPs）也作为疫苗佐剂。此外，疫苗溶液通常含有稳定剂。明胶是病毒疫苗溶液中常用的稳定剂（例如，Flumist®用于流感，M-M-R® II用于麻疹、腮腺炎和风疹，Varivax®用于水痘）以保护病毒在制造和运输过程中免受冻干或解冻的损害。接种疫苗的患者血液中可能产生抗明胶抗体，这可能导致严重的过敏反应。Polysorbate 80是另一种用于基于蛋白质和病毒的疫苗（例如，HPV疫苗、Novavax和J&J/Janssen COVID-19疫苗）溶液中的稳定剂，也可能在一些患者中引起过敏反应。相比之下，Moderna和Pfizer的COVID-19 mRNA疫苗使用蔗糖作为mRNA疫苗溶液中的稳定剂，没有数据显示蔗糖的存在与任何疫苗相关的不良反应有关。然而，需要注意的是，mRNA疫苗含有聚乙二醇（PEG）在脂质纳米颗粒中用于稳定脂质结构，这被认为是引起mRNA疫苗在临床上观察到的严重过敏反应的潜在因素之一。为了解决这个问题，已经开发了新的聚合物，如聚（寡（乙二醇）甲基醚甲基丙烯酸酯）（POEGMA）作为PEG的替代品，可能稳定LNPs并减少免疫原性（见第2.4.2节）。 目前，两种主要类型的核酸疫苗在研究实验室和临床上越来越受到关注，分别是DNA疫苗和RNA疫苗，它们分别以DNA和mRNA作为主要疫苗成分。RNA和DNA疫苗都通过使用宿主自身的蛋白质合成机制来产生“抗原”，这些抗原是病毒或致病细胞表面可以被宿主免疫系统识别并触发免疫原特异性免疫反应的免疫原性蛋白。这个过程模仿了自然感染而不引起疾病，允许身体以受控的方式发展免疫力。DNA疫苗通常通过将编码抗原的基因片段克隆到一个圆形载体中（如质粒和微环DNA）来创建，这些载体可以在哺乳动物细胞中高效表达，并通过肌肉内和皮内注射等途径将修饰后的DNA构建物传递给宿主。宿主细胞，例如肌肉内传递中的肌细胞，将摄取DNA，读取其序列中的遗传信息，并合成编码的抗原（图1）。RNA疫苗可以通过mRNA和其他RNA载体（如自复制RNA和环状RNA（见第3.3节））来创建。在这种情况下，RNA而不是DNA负责携带生产抗原所需的遗传信息。在抗原呈递细胞（APCs）如树突状细胞（DC）和巨噬细胞的帮助下，产生的抗原被宿主免疫系统识别为外来物，并将对其产生免疫反应。对于抗病毒疫苗，将产生能够识别和中和病毒的抗体。对于所有疫苗，T细胞也被激活以帮助破坏感染的细胞或带有目标抗原的细胞。 RNA和DNA疫苗都需要被传递到细胞中以表达抗原。单独的裸DNA已在许多临床试验中作为疫苗使用，并被证明是有用的，尽管需要进一步提高裸DNA疫苗的传递效率和因此的免疫原性，以扩大其应用。与通常直接注射到宿主中的DNA疫苗不同，RNA疫苗（例如mRNA）通常被包裹在脂质纳米颗粒（LNPs）中，这有助于保护RNA并促进其进入细胞和内质网逃逸。这些LNPs通常是免疫原性的，并表现出对RNA疫苗的重要佐剂作用。在被注射部位附近的细胞摄取后，RNA从LNPs中释放出来，进入细胞的细胞质中进行后续的翻译和呈递过程，这些过程与DNA疫苗相似（图1）。 图1. mRNA和DNA疫苗的作用途径。（1）mRNA和DNA疫苗可以通过肌肉注射或其他方法给药，之后疫苗将被宿主的体细胞内化（2）。mRNA和DNA疫苗编码抗原的遗传信息，并依赖宿主自身的蛋白质合成机制来产生抗原。mRNA需要在进入宿主细胞后从其递送载体中释放出来，例如LNP，然后直接翻译成蛋白质抗原。质粒DNA疫苗需要被运送到细胞核中，DNA中的遗传信息才能被读取并转录成mRNA。之后，mRNA从细胞核中出来并翻译成编码的蛋白质抗原。（3）合成的抗原被转移到抗原呈递细胞（APCs）中，这些细胞迁移到次级淋巴器官，通过MHC分子与T细胞受体（TCR）之间的相互作用以及共刺激分子之间的相互作用（例如APC表面的CD86和T细胞上的CD28等受体）来（4）激活T细胞。激活的CD4+ T细胞分泌促炎细胞因子以激活负责（5）建立针对抗原的体液免疫反应的B细胞。 RNA和DNA疫苗平台在包括寨卡病毒、流感、狂犬病等疾病的临床前和临床研究中都显示出了有希望的结果。正在进行的DNA和RNA疫苗的大量临床试验强调了它们在未来医学中的重要角色。然而，这两种疫苗平台也有限制，这些限制目前阻碍了它们充分发挥潜力，并在临床试验中造成了许多失败。由于这两种疫苗在疫苗接种中相对较新，缺乏来自已完成的后期临床试验的足够支持数据，而且目前可用的长期安全性和有效性数据非常有限，因此很难判断哪一种在临床使用中具有更大的潜力。此外，这两种方法都在不断地被开发和优化，这增加了未来DNA和RNA疫苗之间胜者的不确定性。 迄今为止，大多数数据都是通过质粒DNA和基于mRNA的疫苗产生的。因此，本综述聚焦于讨论和比较当前质粒DNA和mRNA疫苗的成就和正在进行的发展，尽管也提到了其他平台。目的是提供洞见，了解它们在预防和治疗疾病方面可能产生重大影响的潜力。 2.mRNA和DNA疫苗的优势和考虑因素 mRNA疫苗高效、安全且多功能。最近，由于在COVID-19大流行期间成功应用于减少可能导致患者住院或死亡的严重病例，它们成为了热门话题。这一成功也减弱了对DNA疫苗的热情。 尽管目前产生的热情较少，DNA疫苗有一些独特的优势，可能克服mRNA疫苗的局限性。它们在热稳定性上更强，保质期更长。因此，它们不需要冷链基础设施进行运输和储存，这降低了疫苗分发的成本，并允许在基础设施有限的地区获得疫苗。此外，DNA疫苗可以在细胞中提供比mRNA更持久的基因表达，这可能会延长对抗原的免疫反应。DNA疫苗更便宜且更容易扩大生产规模。此外，裸DNA疫苗可以直接交付，而不需要与生物材料（如LNPs）包装，这与mRNA疫苗相比进一步简化和降低了设计和制造过程的成本。没有包装材料中的炎症因子，DNA疫苗更安全，因为它们会引起较少的不良副作用。 此外，最近一项关于COVID-19疫苗的临床前研究表明，DNA和mRNA平台之间存在不同的免疫反应。DNA疫苗触发了更强的T细胞反应，而mRNA引发了更强的体液反应，这表明每个平台可能特别适合针对特定疾病。为了深入理解两种疫苗接种方法，我们从几个不同的方面系统比较了mRNA和DNA疫苗的优势和劣势：开发时间线和财务成本、储存和运输要求、剂量和保护效力、监管批准以及安全性和副作用。 2.1.开发时间线和财务成本 与mRNA和DNA疫苗的设计和生产相关的时间和财务成本取决于各种因素，如病原体类型、监管要求和全球需求。这两种疫苗平台有很多共同点。与传统的基于蛋白质和病毒的疫苗相比，它们的生产相对较快，因为它们的生产不需要使用受精鸡蛋或培养细胞。mRNA和DNA疫苗都需要一个类似的初始步骤，即确定正在开发的疫苗的抗原的基因序列（图2）。对于DNA疫苗，基因序列将被克隆到DNA载体中，如质粒DNA，并伴有选定的启动子和增强子以实现优化的转录。DNA载体首先在细菌中扩增，然后从细菌培养中收获。分离和纯化后，它们被重新溶解在水溶液中，准备用于给药。 图2. mRNA和DNA疫苗的生产。（左）生产mRNA-LNP疫苗的一种常见方法。（1）将目标抗原的遗传序列插入到一个环形DNA载体中。（2）然后在细菌中扩增环形DNA并分离出来。（3）线性化环形DNA模板后，遗传序列被（4）体外的噬菌体聚合酶转录成mRNA，并且（5）通过高性能液相色谱（HPLC）纯化mRNA转录本。（6）mRNA与脂质在微流体混合器中迅速混合，导致mRNA被脂质瞬间包裹并沉淀为自组装的纳米颗粒（mRNA-LNPs）。（7）通过透析或过滤纯化mRNA-LNP溶液，以去除非水溶剂和未包裹的mRNA。（8）纯化的mRNA疫苗产品在无菌瓶中包装，供使用前准备。（右）生产DNA疫苗的一种方法。（1）将目标抗原的遗传序列插入到质粒DNA载体中。（2）然后在细菌中扩增质粒DNA并分离出来。（3）通过HPLC纯化质粒DNA后，（4）得到的DNA疫苗产品在无菌瓶中包装，供使用前准备。 mRNA疫苗的设计需要相同的初始步骤，即基因序列鉴定。但是，mRNA疫苗的生产涉及更多的步骤，因为它依赖于双链线性DNA作为模板，如线性化的质粒DNA，其本身可以作为DNA疫苗。模板包含感兴趣的序列和通常来源于T3、T7或SP6噬菌体的DNA依赖性RNA聚合酶启动子。mRNA是通过体外转录（IVT）从模板产生的。通过在DNA模板的3′端包含或在IVT后通过酶反应，将聚(A)尾添加到mRNA转录本。由于mRNA分子不稳定，并且在宿主内给药后高度易受核酸酶降解，裸mRNA很少用作疫苗。相反，mRNA被包裹在纳米颗粒（NPs）中，如LNPs，以稳定mRNA，保护其免受降解，并促进其进入细胞。用于mRNA疫苗的LNPs，如针对COVID-19大流行的Comirnaty（辉瑞-BioNTech）和Spikevax（Moderna），通常包含4种不同类型的脂质：可电离阳离子脂质、中性脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质。脂质与纯化的mRNA在微流体混合器中迅速混合，形成mRNA-LNP复合物。经过透析或过滤以去除未复合的成分后，mRNA-LNP重新分散在通常含有磷酸二氢钾、磷酸二氢钠或Tris（三甲胺）（pH 7-8）的盐溶液中。NPs的设计和筛选是耗时的，因为已经开发了成千上万的NPs用于不同的目的，选择最佳的一种用于特定的mRNA疫苗取决于目标组织/器官和细胞类型、mRNA大小和序列、期望的佐剂作用以及可接受的炎症水平。通过传统实验筛选NP库是识别特定设置中最佳配方的常见方式，但可能成本高昂且耗时。随着机器学习和计算方法的最新进展，这一问题可以得到缓解，这些进展有潜力显著加快这一过程并降低成本。 除了NPs的设计和筛选，通常用于LNPs的材料，如可电离脂质，可能很昂贵。Moderna mRNA疫苗的脂质成本为每剂2.85美元。从2020年7月到2022年7月，美国政府花费了253亿美元购买辉瑞和Moderna COVID-19疫苗，平均每剂20.69美元。没有政府支持，美国那些无保险和保险不足的个人可能面临财务障碍。生活在低收入和中等收入国家的人的成本障碍将更高。mRNA疫苗的成本效益因此仍然是一个问题，需要解决。 由于不需要LNPs，DNA疫苗的开发和生产成本明显低于mRNA疫苗，但由于与临床前和临床试验以及政府法规相关的成本，仍然不特别便宜。在印度获批紧急使用的COVID-19 DNA疫苗ZyCov-D的报告价格为每剂3.57美元。 随着越来越多的mRNA和DNA疫苗进入临床试验和公共使用，预计它们的价格将下降，但也应该考虑大幅降低设计、制造和原材料成本的策略，特别是对于mRNA-LNP疫苗。 2.2.运输和储存要求 为了防止mRNA和LNPs的结构变化，mRNA疫苗必须在（超）低温下长期储存和运输。目前Moderna和辉瑞的COVID-19 mRNA疫苗分别需要在-15至-25°C和-60至-90°C之间冷冻储存。对于短期储存，Moderna mRNA COVID-19疫苗在室温下稳定长达12小时，在2-8°C下稳定长达30天；辉瑞-BioNTech mRNA COVID-19疫苗在室温下稳定长达2小时，在2-8°C下稳定长达5天。两种疫苗的温度要求差异的确切原因尚待确定。此外，已经表明，在25°C下储存7天的mRNA LNPs导致转基因表达比在-30°C下储存的减少90%以上。 关于mRNA疫苗在延长储存期间的稳定性以及LNPs中mRNA封装对疫苗稳定性的影响，公开可用的数据很少。保持mRNA疫苗在（超）低温下增加了储存和运输的成本，并限制了mRNA疫苗在全球所有地区或国家的可获得性。这可能导致疫苗获取的不平等，导致疫苗接种率和医疗结果的不均衡。解决这个问题的一个潜在解决方案是对mRNA-LNPs进行冻干，因为Muramatsu等人已经证明冻干的mRNA-LNPs可以在室温下保持物理化学稳定性长达12周，在4°C下超过24周，而不损害它们在小鼠中的免疫原性。Popowski等人也表明，冻干的mRNA疫苗干粉在室温下稳定一个月。在含有蔗糖的溶液中储存mRNA-LNP产品也可以提高其稳定性。为确保有效的全球分发，疫苗应具有足够长的保质期，理想情况下在冰箱可达到的温度（2-8°C）或以上。在这方面，DNA疫苗比mRNA疫苗更好，因为DNA的卓越热稳定性允许它们在4°C甚至环境温度下运输和储存，使它们成为控制资源有限的发展中国家和农村地区传染病传播最有希望的候选疫苗。例如，在印度获得紧急使用授权的COVID-19 DNA疫苗ZyCoV-D，可以在2-8°C下储存，并且在至少三个月内稳定在25°C，保留美国食品药品监督管理局（FDA）要求的所有规格。乙型肝炎的重组DNA疫苗（Engerix-B）可以在45°C下储存一周或在37°C下储存一个月。涉及138名健康成年人的临床研究结果表明，与在4°C的正常储存条件相比，这两种储存方式都没有改变疫苗诱导的保护性抗体滴度。DNA疫苗的显著热稳定性使得运输和储存变得容易，减轻了与冷链要求相关的挑战，并最小化了因冷链中断而导致的疫苗浪费风险。 2.3.剂量和保护效力 当前的DNA疫苗在临床试验中比mRNA疫苗具有更低的效力，并且需要更高的剂量来产生有效的免疫反应。对于初次接种COVID-19疫苗（附录表1），辉瑞的mRNA疫苗以两剂，每剂30微克的形式给予，Moderna mRNA疫苗包含两剂100微克的剂量；相比之下，ZyCoV-D被批准为三剂方案，每剂含有2毫克质粒DNA，分别是辉瑞和Moderna疫苗mRNA剂量的100倍和30倍。据报道，ZyCoV-D的两剂方案，每剂3毫克，在临床试验中产生了相当的保护，但低于6毫克的总剂量仍需验证有效的疫苗接种。 最初的单价Moderna和辉瑞mRNA疫苗在2020年的3期临床试验中对COVID-19的效力相似（附录表1），Moderna疫苗在预防COVID-19疾病方面的有效性为94.1%，在预防严重病例方面的有效性为100%，辉瑞疫苗在预防COVID-19方面的有效性为95%。然而，尽管使用了更高的剂量，ZyCoV-D的效力较低——在接种两剂后预防COVID-19的有效性为66.6%，在预防严重和中度病例方面的有效性为100%（附录表1）。值得注意的是，ZyCoV-D的3期临床试验发生在印度Delta株流行期间，这可能是单价DNA疫苗相对较低效力的直接原因。 两种疫苗平台之间在剂量和效力方面的巨大差异主要是由于DNA传递在启动抗原生产之前的细胞内障碍更大。无论注射途径如何，DNA疫苗都需要克服细胞膜和核膜的生理屏障，才能到达细胞转录机制。之后，从DNA转录的mRNA离开细胞核并在细胞质中进行翻译。相比之下，mRNA疫苗在被翻译成目标抗原之前不需要到达细胞核，LNP配方中的可电离阳离子脂质可以大大促进细胞表面的跨膜运输和细胞内mRNA的内质网逃逸。因此，开发策略以克服DNA疫苗传递的生理屏障对于提高其效力和减少所需剂量至关重要。 基于mRNA和DNA疫苗治疗癌症的临床数据也已经发表，尽管与COVID-19疫苗研究相比，涉及的患者数量较少。在针对多种自体癌症的1/2期试验（NCT03480152）中，包括肝细胞癌（HCC），编码新抗原的mRNA疫苗每两周肌肉注射一次，最多4剂，剂量为0.13毫克或0.39毫克。所有接种疫苗的患者（100%，2名患者中的2名在任何剂量水平）显示出循环抗原特异性T细胞的增加。然而，他们中没有人（在任何剂量水平）显示出对治疗的临床反应（客观肿瘤退缩）。 在完成的1期研究（NCT00199849）中，使用NY-ESO-1质粒DNA疫苗（pPJV7611）治疗表达NY-ESO-1或LAGE-1抗原的各种肿瘤患者，如非小细胞肺癌（NSCLC）。参与者在近距离的不同位置通过粒子介导的表皮传递接受pPJV7611。第一组参与者接受了4×1微克pPJV7611在4个不同位置的传递；第二组参与者接受了8×1微克pPJV7611在8个位置的传递；第三组参与者接受了2×4微克pPJV7611在2个不同位置和4个不同时间（第1、3、5和8天）的传递。治疗在4周和8周后重复。研究报告表明，在第一次疫苗治疗后13周，所有三个队列中对肿瘤反应的受试者数量为0（0.0%）。在多达13周内具有NY-ESO-1特异性CD4+T细胞免疫的受试者数量分别为第一队列3（100.0%），第二队列5（83.3%），第三队列7（100.0%）。在多达13周内具有NY-ESO-1特异性CD8+T细胞免疫的受试者数量分别为第一队列1（33.3%），第二队列0（0.0%），第三队列1（25.0%）。 这些研究中取得的有限效力可能归因于给予患者的质粒DNA或mRNA疫苗的低剂量以及缺乏与其他免疫治疗剂的联合使用；否则，在临床研究中观察到了有利的结果。在针对晚期HCC的1/2期试验（NCT04251117）中，一种编码多达40个新抗原的个性化治疗性癌症DNA疫苗（GNOS-PV02）与编码白介素-12（pIL12）的质粒共同配制，并以1毫克GNOS-PV02和0.34毫克pIL12的剂量每3周一次皮内注射给参与者，随后进行电穿孔。在前四次治疗中，参与者接受了1毫克GNOS-PV02和0.34毫克pIL12的剂量，随后每9周一次直至第二年结束，之后每12周一次直至第五年结束。此外，参与者每3周接受一次200毫克的PD-1抑制剂pembrolizumab治疗，为期2年。治疗结果很有希望，因为新抗原特异性T细胞反应率为86.4%（22名可评估患者中的19名），客观反应率为30.6%（36名患者中的11名），其中8.3%（36名患者中的3名）实现了完全反应。 在另一项1/2期研究（NCT03164772）中，NSCLC受试者要么接受Durvalumab（一种抗PD-L1抗体）和包含6个编码不同肿瘤相关抗原（MUC1、Survivin、NY-ESO-1、5 T4、MAGE-C2和MAGE-C1）成分的BI 1361849 mRNA疫苗的联合治疗（A组），要么接受Durvalumab、Tremelimumab（一种抗CTLA-4抗体）和BI 1361849 mRNA疫苗的联合治疗（B组）。BI 1361849 mRNA疫苗的每个成分分别以80微克的剂量给予两次。在研究期间，每位参与者共接受了12次mRNA皮内注射（总共960微克mRNA）。A组估计的中位无进展生存期为2个月，B组为1.8个月。在第8周无进展的受试者数量分别为A组11（47.8%）和B组11（32.4%）。这些数字在8周到第24周之间随时间单调下降。 2.4.不良事件和安全数据 2.4.1.常见观察到的不良事件 mRNA和DNA疫苗相关的不良事件（AEs）通常与注射外来物质有关，如核酸、水溶液和脂质纳米颗粒（LNPs），尽管在一些研究中，ZyCoV-D疫苗注射相关的AEs低发生率归因于使用无针皮内注射系统而非针头。大多数mRNA或DNA疫苗接种相关的AEs轻度至中度。大多数可用数据基于COVID-19疫苗的临床研究。比较两种平台COVID-19疫苗的表现，DNA疫苗在诱发和非诱发AEs的严重程度和发生率方面比mRNA疫苗展现出更好的安全档案。在mRNA-1273的3期临床试验（附录表2）中，接种组比安慰剂组更频繁地报告诱发AEs，第一剂后（87.8%对48%）和第二剂后（92.2%对42.8%）。并且局部和全身AEs的严重程度和发生率在第二剂后比第一剂后增加。在ZyCoV-D的3期临床试验（附录表2）中，接种组（4.49%）和安慰剂组（4.47%）之间诱发AEs的发生相似。中期分析还表明，疫苗作为加强剂对接受者来说耐受性良好，因为与第一剂相比，第三剂后AEs的频率没有增加，大多数报告的事件是在第一剂而不是第二剂或第三剂后。这与mRNA-1273试验的结果形成对比，表明重复接种会引发更强的诱发AEs。mRNA-1273和ZyCoV-D的非诱发AEs与相应的安慰剂组相似，但mRNA-1273的发生率高（23.9%）比ZyCoV-D试验（3.27%）。有趣的是，尽管ZyCoV-D使用的核酸剂量是mRNA-1273的30倍，但ZyCoV-D的AEs严重程度和发生率更低。这可能归因于mRNA-1273中使用的LNP在ZyCoV-D中不存在。然而，重要的是要注意，这两项临床试验由不同的科学家在不同的国家和人类群体中进行，这可能会使不同疫苗报告的AEs之间的比较复杂化。与ZyCoV-D类似，另一种DNA疫苗COVID-eVax在1期试验中显示出在第二次免疫后全身和局部诱发AEs的发生率比第一次后低。第一次后局部为35-87%，全身为40-50%，第二次后局部为20-55%，全身为30-45%，取决于疫苗剂量。这些发生率高于ZyCov-D，可能由于COVID-eVax使用了不同的给药程序：肌肉内针头注射后通过移动电脉冲发生器进行电穿孔，这些程序更具侵入性和炎症性。DNA疫苗作为加强剂比mRNA疫苗更易被耐受的原因尚不清楚，了解它们的分子机制对于设计更好的平台很重要。对于mRNA和DNA疫苗在预防除COVID-19以外的疾病方面的安全性数据也有一些，但不多。例如，一项mRNA疫苗已在临床试验中用于预防狂犬病。在10%的接受者中观察到3级全身AEs，这些被归因于mRNA疫苗的炎症特性。 2.4.2.其他安全问题 除了常见的AEs外，关于DNA疫苗的一个主要担忧是其可能被整合到受体细胞的基因组中，因为它们需要进入细胞核以表达抗原。已经进行了大量研究以确定DNA整合到人类染色体的风险，从而激活致癌基因或增加染色体不稳定性。这些研究的数据表明，这种风险低于由自发基因组突变引起的风险。人类临床试验研究进一步证实了DNA疫苗的安全性和耐受性，尽管仍需要更多的长期临床数据来完全解决这一安全问题。另一方面，mRNA疫苗在患者中相对安全，因为它们在宿主中的保留时间相对较短，mRNA不太可能进入细胞核。对于mRNA疫苗，超敏反应是一个主要问题。它们是由某些材料如非天然脂质的传递载体引起的。在一项临床前研究中，Ndeupen等人表明，一些已经过仔细表征并在临床前mRNA疫苗研究中广泛使用的商业LNPs具有高度炎症性，并导致动物中高死亡率（约80%）。还有临床证据表明，COVID-19的一些mRNA疫苗中的聚乙二醇（PEG）可以诱导血液中的抗PEG抗体，导致过敏反应。然而，报告的结果相互矛盾。Carreno等人的研究表明，BNT162b2接种患者的血清中未检测到PEG特异性抗体，并且过敏反应与mRNA-1273诱导的抗PEG抗体之间没有明显的相关性。此外，mRNA疫苗接种诱导的抗PEG抗体对疫苗效力的影响仍然未知。Kozma等人的一项研究表明，这些抗PEG抗体可能会降低疫苗效力，而Guerrini等人和Ju等人的其他研究表明，抗PEG抗体对mRNA疫苗产生的抗刺突中和抗体没有影响。因此，PEG对mRNA疫苗的潜在不良影响仍然是一个活跃的研究和辩论领域。需要更多的研究和监测数据来对这个问题得出明确结论。与此同时，已经开发了下一代PEG衍生物，如POEGMA，作为改善药物和基因传递的替代聚合物。这些聚合物具有与PEG相似的功能属性，但引起的抗PEG抗体较少。它们可能被用来稳定mRNA疫苗。mRNA和DNA疫苗的另一个潜在安全问题与反复接种可能产生的抗mRNA或DNA反应和诱导全身自身免疫疾病有关。但发表的研究有限，以解决这个问题。一项关于癌症DNA疫苗的1期临床试验报告称，在66名注册患者中，没有检测到抗双链DNA抗体或PBMCs中的质粒，并且报告称没有接受者出现自身免疫疾病的症状，但需要更大规模的临床研究的证据来完全解决这一问题。总体而言，迄今为止mRNA和DNA疫苗显示出良好的安全档案，并且由于安全问题而退出临床试验的疫苗候选者很少。有必要进行更多的研究和分析，以全面评估安全方面，为在行业和临床中建立更好的标准和法规。 2.5.临床使用的批准 由Zydus Cadila开发的ZyCoV-D获得了印度药品监管总局（DCGI）在2021年8月批准的紧急使用限制，迄今为止，它是唯一获得批准的DNA疫苗。它包含一个编码SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白和免疫球蛋白E（IgE）信号肽的单一质粒DNA，以促进转染细胞的分泌。 康希诺（研究名称：BNT162b2）由辉瑞-BioNTech开发，于2020年12月获得美国FDA的紧急使用授权（EUA），适用于成人，并于2021年8月获得同一机构的批准，用于预防16岁及以上个体的COVID-19。斯皮克瓦克斯（研究名称：mRNA-1273）由Moderna开发，于2020年12月获得美国FDA的EUA，适用于18岁及以上个体。其在成人中的完全批准于2022年1月获得。斯皮克瓦克斯和康希诺及其后续加强疫苗的更详细的临床试验和批准历史在图3中说明。到目前为止，它们是唯一获批用于常规临床使用的mRNA疫苗。更多的DNA和mRNA疫苗用于预防和治疗许多其他疾病，目前处于不同的临床试验阶段，并已显示出令人兴奋的疗效和安全数据。我们将在第3.1节中更详细地讨论正在进行和已完成的临床试验。作为首批展示强大保护效果并获得批准的疫苗，mRNA疫苗在COVID-19大流行期间受到了公众和研究领域的前所未有的关注。它们在大流行情况下的历史性批准以及后来在预防疾病传播方面的出色表现，使它们立即比DNA疫苗处于更有利的位置。当前的资金和研究重点显然倾向于mRNA疫苗，原因之一是更高的效力和较少的公众对基因插入突变的担忧。然而，考虑到上述讨论的所有DNA疫苗的独特优势，mRNA疫苗的成功不应成为忽视DNA疫苗的理由。同样，正如我们社会在应对COVID-19大流行中的经验所证明的那样，平行开发多种替代疫苗平台也很重要，在大流行之前，mRNA疫苗也基本上被忽视，不被认为是与基于蛋白质和病毒的疫苗相竞争的。 图3. COVID-19 mRNA和DNA疫苗的临床试验及里程碑。辉瑞-BioNTech于2020年4月开始对其COVID-19 mRNA疫苗候选物BNT162b2进行I/II期临床试验，随后在2020年7月进行了II/III期试验。BNT162b2（商品名：Comirnaty）是首个获得美国紧急使用授权（EUA）的COVID-19疫苗——成人使用的EUA于2020年12月授予。2021年8月，FDA完全批准Comirnaty用于16岁及以上个体。Moderna于2020年3月开始对其COVID-19 mRNA疫苗候选物mRNA-1273进行I期临床试验，5月进行II期试验，7月进行III期试验。美国FDA于2020年12月授予mRNA-1273（商品名：Spikevax）紧急使用授权，紧随Comirnaty之后获得紧急使用授权。2022年1月，FDA完全批准Spikevax用于成人。印度制药公司Zydus Cadila于2020年7月开始对其COVID-19 DNA疫苗候选物ZyCoV-D进行I/II期临床试验，并于2021年1月进行III期试验。2021年8月，印度药品监管总局（DCGI）批准ZyCoV-D在印度限制性紧急使用。 3.mRNA和DNA疫苗的正在进行开发 本节重点讨论已完成和正在进行的mRNA和DNA疫苗的临床试验结果，这些结果可能影响它们未来的临床使用，改进空间，以及新平台的开发。 3.1.已完成和正在进行的临床试验 尽管目前获批的mRNA和DNA疫苗仅用于COVID-19，但正在进行的研究正在扩大它们的应用范围，以应对其他疾病。在COVID-19 mRNA和DNA疫苗取得胜利后，核酸疫苗（图4）的临床试验数量和规模都有了显著增加。 图4. mRNA/DNA疫苗技术的临床应用。mRNA和DNA疫苗已在临床试验中广泛测试，用于治疗癌症和预防传染病，如SARS-CoV-2、流感、呼吸道合胞病毒（RSV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）、寨卡病毒（ZIKV）。目前涉及传染病临床试验的mRNA和DNA疫苗编码一种或少数几种蛋白（抗原），例如SARS-CoV-2的刺突蛋白、流感的血凝素（HA）、RSV的融合（F）糖蛋白、HIV的包膜（Env）蛋白、寨卡病毒的前膜和包膜（prME）蛋白以及寨卡病毒类病毒颗粒（VLP）。对于当前临床试验中的癌症疫苗，mRNA和DNA编码的蛋白包括个性化的新抗原、致癌病毒抗原（例如HPV E6和E7致癌蛋白）以及肿瘤相关抗原（TAA）。此外，mRNA和DNA已被用作遗传佐剂，编码细胞因子，如白介素-12（IL-12）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），以增强对抗原的免疫反应。 3.1.1.mRNA疫苗的临床试验 mRNA疫苗涉及的临床试验目标包括流感、疟疾、呼吸道合胞病毒（RSV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）、巨细胞病毒（CMV）、结核病、狂犬病和寨卡病毒（ZIKV）（附录表3）。此外，mRNA疫苗已在临床上用于癌症治疗，如非小细胞肺癌（NSCLC）、结直肠癌、胰腺腺癌、黑色素瘤、胃肠癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌等（附录表3）。 在撰写本综述时，目前有301项mRNA疫苗的临床试验正在进行，15项试验已被终止或暂停，129项已完成。它们大多数处于1期、2期或1/2期。所有24项已完成的3期或4期试验都与SARS-CoV-2有关。目前在3期试验中活跃并有积极中期结果的候选疫苗之一是Moderna的mRNA-1345（ConquerRSV），用于对抗RSV感染。该疫苗基于LNP平台，编码一种名为预融合F糖蛋白的RSV蛋白。尽管大多数以前的针对RSV的mRNA疫苗临床试验由于中和抗体产量不足而失败，Moderna最近（2023年1月）宣布了其ConquerRSV 3期关键效力试验的积极数据，涉及超过37,000名60岁及以上的成年人，声称“已经实现了主要效力终点，包括针对RSV相关的下呼吸道感染（RSV-LRTD）的疫苗效力为83.7%（95.88% CI：66.1%，92.2%；p < 0.0001），如定义的两个或更多症状。”2023年1月，美国FDA授予mRNA-1345突破性疗法认定，适用于60岁及以上的成年人。辉瑞和Moderna都已启动了基于mRNA的流感疫苗的临床研究。mRNA-1010是Moderna评估的五种流感疫苗候选之一，是一种四价疫苗，编码来自四种季节性流感病毒的血凝素（HA）蛋白，包括A/H1N1、A/H3N2、B/Yamagata和B/Victoria谱系。2023年2月，Moderna宣布了mRNA-1010 3期临床试验的中期安全性和免疫原性结果。根据新闻稿，与活性疫苗对照相比，mRNA-1010在A/H3N2和A/H1N1的血清转换率上表现出优越性，在A/H3N2的几何平均滴度（GMT）比率上表现出优越性，并且在A/H1N1的GMT比率上表现出非劣性。然而，对于流感B/Victoria和B/Yamagata谱系菌株，血清转换率或GMT比率的非劣性未达到。另一种四价流感疫苗候选是辉瑞开发的modRNA。正在进行的一项3期主动对照研究（NCT05540522）涉及53,200名参与者，旨在评估modRNA的安全性和效力，并预计将在2024年完成。 3.1.2.DNA疫苗的临床试验 DNA疫苗的临床试验针对的传染病包括SARS-CoV-2、寨卡病毒、乙型肝炎、流感、HIV等（附录表4）。值得注意的是，DNA疫苗在临床试验中用于治疗癌症已有相对较长的历史，如三阴性乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、人乳头瘤病毒（HPV）、宫颈癌和卵巢癌（附录表4）。但很少有完成和正在进行的癌症DNA疫苗试验通过了2期。 一个例子是针对晚期、erb-b2受体酪氨酸激酶2（ERBB2）阳性乳腺癌的治疗性DNA疫苗（pNGVL3-hICD）的1期试验，共有66名患者。该试验在2001年至2010年间在美国华盛顿州的Fred Hutchinson癌症中心进行，监测疫苗毒性10年。试验中使用的疫苗是一种质粒DNA，编码ERBB2的细胞内域（ICD）；它以递增剂量（10 μg、100 μg、500 μg）皮内注射，固定剂量的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）蛋白（100 μg）作为佐剂。结果分析表明，大多数患者对ERBB2 ICD的1型免疫反应呈剂量依赖性；反应显著且持久，并与外周血液中中央记忆T细胞的增加相关。疫苗在患者中耐受性良好——大多数与疫苗相关的AEs为1级和2级。在患者的PBMCs中未检测到抗双链DNA抗体或疫苗质粒，并且没有接受者出现自身免疫疾病的症状。在根据不同剂量组的73.5-118.6周的中位随访期间，只有一名患者（在100 μg剂量组）在注册后2.2年发展为可能与疫苗接种相关的淋巴细胞性结肠炎。接种疫苗后一年以上观察到的其他AEs不被认为是与疫苗接种相关的。这些观察结果表明，用治疗性ERBB2 ICD DNA疫苗免疫具有有利的短期和长期安全档案，以及显著、持久的Th1反应水平。因此，DNA疫苗目前正在低表达ERBB2的患者中进行随机2期试验（NCT05163223）。 直接比较DNA和mRNA疫苗的试验清楚地指出，mRNA目前比DNA更受青睐——几乎所有处于第三阶段的核酸疫苗试验都是基于mRNA而非DNA，这表明了早期mRNA试验取得了更好的结果。mRNA试验通常规模更大，表明资金更容易获得，公众对mRNA疫苗的接受率更高。然而，由于RNA和DNA平台都在快速发展，未来情况可能会改变。考虑到它们的独特优势，如果DNA疫苗的效力得到提高，特别是在针对特定疾病的应用场景中，DNA疫苗可能是一个更好的选择。 3.2.疫苗改进 核酸疫苗的历史相对较短，但仍在积极开发中，以满足广泛的应用需求，并在效力、安全性和稳定性方面进行优化。还进行了大量研究，以确定mRNA和DNA疫苗的物理、化学和生物特性，以及免疫反应的分子机制。正在进行的研究将解决当前的限制，并创造一个临床应用的格局，展示针对特定疾病mRNA和DNA最合适的平台。 3.2.1.mRNA疫苗的改进 mRNA疫苗的改进主要集中在RNA及其序列修饰、LNP递送系统、抗原的选择和组合以及佐剂。多个mRNA结构元素已成为修饰的目标，包括非翻译区（UTRs）、5′端帽、开放阅读框架（ORF）和聚（A）尾。为了减少mRNA的免疫原性并增强翻译效率，通常使用诸如5-甲基胞嘧啶（m5C）和假尿苷（ψ）核苷等碱基对修饰。这些修饰的核苷酸能够避开由干扰素（IFNs）诱导的抗病毒途径，这些途径特别针对并降解入侵的mRNA。结果，核苷酸修饰的mRNA疫苗大大增加了抗原的翻译效率，并诱导较少的非期望炎症反应。 其他修饰，如密码子优化和N1-甲基假尿苷（1 mΨ）核苷替换，也已进行以改善mRNA翻译。密码子优化是必要的，因为通过不同的密码子分配编码相同蛋白的mRNA序列可能具有截然不同的蛋白表达水平。因此，用哺乳动物细胞中常用的密码子替换稀有密码子可以增加抗原产量。 还进行了大量研究以优化mRNA疫苗的另一个重要组成部分，即LNPs。除了在生理环境中保护mRNA免受核酸酶降解和克服细胞内递送障碍外，LNPs还被发现对某些mRNA疫苗表现出强烈的佐剂活性。已经设计和使用了不同的LNPs进行mRNA疫苗制备，并且正在开发更多。选择具有上述最佳功能的同时，在人体中具有低毒性的LNP是一个复杂但值得的任务。为了避免上述LNPs的不良影响，也在探索其他mRNA递送策略，如基于细胞外囊泡、类脂材料、合成聚合物和生物材料。细胞外囊泡是自然分泌的，并被哺乳动物细胞用作细胞间通信的方式，特别是癌细胞。因此它们可以很容易地被重新用作mRNA和其他治疗剂的递送工具，具有出色的生物相容性和安全性，在某些情况下还具有组织靶向效果。 将针对不同抗原的mRNA组合在一个疫苗产品中，可能对单一病原体或一系列病原体诱导更广泛的免疫反应。最近，Arevalo等人已经证明，由20种编码不同血凝素的mRNA组成的多价mRNA疫苗可以保护动物免受所有已知的甲型和乙型流感病毒亚型。除了诱导广泛的交叉反应性免疫反应外，这种通用疫苗策略还可以大大减少针对一组病原体的疫苗接种复杂性，从而节省疫苗开发和部署所需的时间、金钱和努力。 3.2.2.DNA疫苗的改进 DNA疫苗的改进可以分为四个主要类别：抗原的选择和组合、DNA构建设计、DNA递送和佐剂的结合。 第一类别中的策略对DNA疫苗来说并不独特。它们与基于RNA的疫苗相似。目标是确定最佳抗原或抗原组合以实现有效的疫苗接种。 DNA构建设计涉及优化抗原的密码子组成、不同序列的最佳组合以递送几个抗原或融合蛋白与单一载体，以及结合特定启动子、增强子和DNA核靶向序列。例如，使用结合病毒和真核元素的混合启动子，以防止纯病毒启动子可能发生的转录沉默。一个特别针对APCs的启动子允许将抗原和佐剂表达限制在特定细胞类型，如DCs，从而防止调节细胞类型如骨髓源抑制细胞（MDSCs）的耐受。 Ross等人和Bros等人已经证明了使用Fascin-1启动子在小鼠和人类中实现DCs的转录靶向的可行性，Sudowe等人在随后的研究中将Fascin-1启动子应用于DCs靶向DNA疫苗的设计。 将不同抗原通过连接子组合在一个疫苗中，可以用来诱导广泛的CD4+/CD8+ T细胞反应。 与编码不变链的序列融合可以增强抗原加载到APCs表面表达的MHC II分子上。 DNA比mRNA更难递送，因为DNA需要进入哺乳动物细胞的核以表达抗原，这对mRNA疫苗来说不是必需的。在已经开发的不同方法中，电穿孔（也称为“电转染”）迄今为止是最有效和方便的方法。它基于脉冲电场，暂时在细胞质膜中创建孔，允许小的、不透过膜的分子进入细胞质。但较大的分子，如质粒和mRNA主要通过电脉冲触发的内吞作用进入细胞。电穿孔越来越多地用于人类临床试验，以增强DNA疫苗针对不同疾病的效果，包括SARS-Cov-2、HIV和HPV。Dross等人还使用基因枪递送DNA疫苗给猕猴，并证明了与mRNA疫苗相当的免疫反应。 用于改善DNA跨细胞膜递送的其他常见方法基于由各种材料组成的纳米载体，如脂质、聚合物、蛋白质和无机材料。还开发了策略以提高DNA跨核膜递送的效率。例如，Dean等人发现将DNA核靶向序列纳入DNA载体中，使其能够与具有核定位信号（NLS）的内源性蛋白结合，通过核孔复合体（NPCs）促进DNA进入细胞核。 抑制进入细胞的DNA疫苗的溶酶体降解也是提高疫苗效力的目标。然而，截至本综述之时，上述讨论的方法尚未获得FDA批准用于改善人类DNA疫苗递送。 第四类别的策略是将佐剂纳入DNA疫苗中，以增强APC激活和T细胞吸引及极化。佐剂可以是化学药品，如氢氧化铝，或遗传物质，如免疫刺激性的2′,3′-环鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）。常见的佐剂还包括促炎细胞因子，如GM-CSF。这些细胞因子可以直接作为蛋白质添加，或通过与DNA疫苗共给药的表达载体编码。探索当前佐剂的使用和设计新的强效佐剂可以显著增强DNA疫苗的效果。同时，选择临床用途的佐剂需要额外考虑，特别是在儿童、老年人和有特殊医疗状况的个体，如自身免疫疾病、糖尿病和充血性心力衰竭患者的疫苗接种中。 3.3.核酸疫苗的替代设计 除了广泛使用的mRNA-LNP和质粒DNA平台外，还有激动人心的核酸疫苗新设计正在出现。对于RNA平台，它们包括自我复制RNA（saRNA），由于其在细胞内自我复制的能力，可以在低剂量下导致更高和更长时间的抗原产生，以及与线性RNA相比具有增强稳定性的环状RNA（图5）。DNA平台的新设计包括小圈DNA（mcDNA）和纳米质粒DNA载体，由于它们的较小骨架尺寸，它们显著提高了递送效率和抗原产生水平，以及可以在不整合到基因组中的情况下实现高抗原表达水平的环状DNA载体，因为它在染色体外停留和复制。在此，我们将讨论一些有潜力开启RNA和DNA疫苗新时代的有前景的设计。 图5. 传统mRNA疫苗与自扩增RNA（saRNA）和环状RNA（circRNA）疫苗的比较。(A) 传统mRNA呈线性格式。mRNA进入宿主细胞后（1），被核糖体用于翻译蛋白抗原（2）。同时，由于mRNA的线性结构，它们容易受到核酸酶（包括内切核酸酶和外切核酸酶）的降解（3）。因此，传统mRNA在宿主细胞中的半衰期短，蛋白抗原表达有限。(B) saRNAs包含来自自复制单链RNA病毒的遗传工程复制子。saRNA进入宿主细胞后（1），通过RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）复合体在宿主细胞中进行自我扩增（2）。这导致宿主细胞中抗原编码mRNA的数量更多、可用时间更长，从而增加了蛋白抗原的产生并延长了其持续时间（3）。与mRNA类似，saRNA也可以被核酸酶降解（4）。(C) circRNA是共价连接的，并包含IRES序列以实现内部核糖体进入。circRNA进入宿主细胞后（1），被用于翻译蛋白抗原（2）。circRNA可以被内切核酸酶降解（3），但由于其共价闭合的环状结构，降解速度比mRNA和saRNA慢（4）。因此，circRNA更稳定，在宿主细胞中的半衰期更长。从这些RNA翻译的蛋白抗原将被转移到抗原呈递细胞（图中未显示）进行处理，并在MHC复合体上呈现以激活宿主的免疫反应。UTR，非翻译区。CDS，编码序列。IRES，内部核糖体进入位点。 3.3.1.自我复制RNA疫苗 自我复制RNA（saRNA）是一种替代非复制mRNA的RNA疫苗平台。它是为了解决传统mRNA疫苗由于mRNA在细胞内半衰期短导致的抗原产生不足的问题，需要重复接种以诱导足够的免疫原性。saRNA包含从自我复制的单链RNA病毒衍生的遗传工程复制子，通常是正链α病毒，如委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）、辛德比斯病毒（SINV）和Semliki森林病毒（SFV）。它们可以作为病毒复制子颗粒（VRPs）递送，saRNA包装在病毒颗粒中。由于缺陷的包膜结构，结果VRPs在最初感染细胞后无法形成传染性病毒颗粒；只有saRNA可以在宿主细胞中进一步扩增。saRNA的细胞内扩增是通过由正链α病毒复制酶基因编码的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）复合物实现的，它在原位扩增合成的转录物。为了避免病毒载体的隐患，采用了与mRNA递送中使用的非病毒制剂相似的各种非病毒制剂，如阳离子脂质、LNPs、聚合物和硫酸鱼精蛋白，以及电穿孔等物理技术，作为施用saRNA疫苗的替代方法。例如，Hekele等人已经证明了针对H7N9流感的LNP配方saRNA疫苗在小鼠中足够的免疫原性。由于自我复制能力，saRNA可以在比传统mRNA疫苗更低的剂量下施用，以达到类似的抗原表达水平。与每剂需要30和100 µg mRNA的辉瑞和Moderna COVID-19 mRNA-LNP疫苗相比，最近针对COVID-19 saRNA-LNP疫苗（COVAC1）的临床试验仅在2剂方案中每剂使用了0.1-10 µg，并在接种者中诱导了良好的（但不是100%）血清转化。在免疫后6周，接受5.0和10.0 µg疫苗的组别达到了最高的血清转化率（87%）。数据表明，saRNA疫苗在低剂量需求方面有潜力超越传统mRNA疫苗，从而允许剂量节省策略、更好的耐受性和更低的制造成本。尽管需要进一步优化以达到其全部能力，辉瑞公司开发的saRNA疫苗（PF-07852352, PF-07836391, PF-07836394, PF-07836395, PF-07836396, 和 PF-07867246）已进入I期临床试验（NCT05227001）。我们预计未来几年将有更多的saRNA疫苗被设计和临床测试。 3.3.2.小圈和纳米质粒DNA疫苗 小圈DNA（mcDNA）因其与传统质粒DNA疫苗相比的显著特点，目前正在广泛研究其在疫苗接种中的使用。mcDNA消除了质粒DNA中对细菌扩增必需但对哺乳动物细胞表达不必要的原核序列，从而产生了更小的DNA疫苗，提高了基因递送效率和编码抗原的表达。mcDNA疫苗也比质粒DNA疫苗更安全，因为它们避免了对宿主免疫系统识别的原核序列的炎症反应，并防止接受者获得由质粒DNA中包含的抗生素选择标记基因诱导的抗生素抗性。然而，复杂的生产和纯化过程以及与制造相关的高成本目前限制了mcDNA在疫苗接种中的使用。mcDNA通常通过在E. coli中通过一个重组酶如ϕC31整合酶和一个限制酶（RE）如I-SceI进行分子内重组产生，这些酶通过一个可诱导的基因表达系统激活。重组酶促进识别序列（attB和attP）的位点特异性重组，导致形成两个环状DNA分子：具有真核表达盒的mcDNA和包含细菌骨架的小质粒（MP）。然后MP被诱导的RE降解；mcDNA被提取和纯化，其程序与常规质粒DNA类似。为了改进mcDNA生产，正在探索新的方法。例如，Jiang等人开发了一个mcDNA平台，允许整个质粒DNA在体内通过Cre重组酶介导自发转化为mcDNA，并证明了mcDNA平台在保护鸡免受新城疫病毒中的效力。在另一项研究中，Kay等人构建了一个经过基因改造的E. coli菌株，可以通过稳定表达可诱导的ϕC31整合酶和I-SceI同源内切酶高效生产纯化的mcDNAs。到目前为止，mcDNA疫苗尚未在临床上进行评估。 纳米质粒载体被开发出来，旨在解决mcDNA的制造限制，同时保留其优势。纳米质粒使用RNA/RNA相互作用的非编码选择标记系统（“RNA-OUT”）来消除传统质粒骨架中对抗生素抗性标记的需求。由于其较小的骨架大小（<500 bp），纳米质粒载体已显示出在体外和体内都具有强大的转染效率，这一效率比使用传统质粒DNA高出多达十倍。由于这两个优势，它们已被用于流感[222]、委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）和埃博拉病毒的疫苗的临床前研究，并与传统质粒DNA疫苗相比显示出增强的免疫反应。EG-70，一种编码视黄酸诱导基因I（RIG-I）激动剂和IL-12的纳米质粒产品，目前正在进行针对非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）患者的I/II期临床试验（NCT04752722）。 4.结论性评论 核酸疫苗是研究和开发中的一个令人兴奋的新领域，其应用范围从预防各种传染病到治疗癌症。在COVID-19大流行之前，核酸在疫苗领域的潜力在很大程度上被忽视了，但基于mRNA和DNA的COVID-19疫苗的批准代表了它们成为与传统病毒或蛋白基础疫苗相比的替代和更好的平台的革命性突破。使用核酸技术在有效性、安全性以及简单性和快速设计和制造方面提供了几个优势。 随着核酸疫苗受到广泛关注，了解哪些平台在特定应用中更合适至关重要。通过本综述中对mRNA和DNA平台的全面比较，平均来看，目前的mRNA疫苗比DNA疫苗具有更高的临床影响，特别是在COVID-19大流行期间。从技术上讲，mRNA疫苗在抗原表达和免疫系统激活方面更有效，需要的剂量更低，并且公众对插入性突变风险的担忧较少。另一方面，DNA疫苗拥有许多其他优势，包括低成本的生产、运输和储存，以及低报告的不良事件（AEs）。 目前，RNA和DNA疫苗都在经历快速的演变，两个平台上都出现了令人兴奋的新技术，这些技术将提高有效性并影响未来在预防、治疗和控制各种疾病中平台的偏好。与此同时，由于RNA和DNA疫苗在临床开发和使用中的历史相对较短，需要更多的研究来优化平台，收集长期的有效性和安全性数据，并了解抗原呈递和免疫反应的分子机制。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：RNA分子的生产、修饰和细胞传递方面的最新进展促进了基于RNA的治疗学的扩展。对RNA生物学的不断深入理解也引发了RNA治疗学的相应增长。在这篇综述中，将讨论五类基于RNA的治疗学的一般概念，包括基于RNA干扰的疗法、反义寡核苷酸、小激活RNA疗法、环状RNA疗法和基于信使RNA的治疗学。此外，我们还提供了已经获得监管批准或目前正在临床试验中评估的基于RNA的治疗学的概述，以及这些技术面临的挑战。基于RNA的药物在临床试验中显示出积极的结果，并有能力解决以前“无法成药”的靶点，这为实现其全部临床潜力提供了巨大的希望，作为一种颠覆性的治疗技术。 1.  引言 从1961年发现信使RNA（mRNA）到2021年首个mRNA疫苗获批上市，已经过去了60年。在这60年的时间里，RNA领域发生了巨大的发展。1977年，Roberts和Sharp发现了RNA剪接，并因此获得了1993年的诺贝尔生理学或医学奖。1982年，Cech发现了四膜虫RNA的自剪接核酸酶，并与Altman共同获得了1989年的诺贝尔化学奖，因为他们的发现。这一发现为RNA领域翻开了新的一页，RNA分子被公认为具有复制和催化双重功能的生物分子。1993年，Ambros发现了第一个微小RNA（miRNA）; 1998年，Fire和Mello发现了RNA干扰（RNAi）现象，并获得了2006年的诺贝尔生理学或医学奖。RNAi成为了基因功能研究的重要工具，20年后，首个RNAi药物成功获批上市。1999年，Ramakrishnan、Steitz和Yonath完成了核糖体晶体结构，证明了核糖体作为一种核酸酶，并因此获得了2009年的诺贝尔化学奖。2011年，Charpentier和Doudna发现了CRISPR基因编辑技术，并因此获得了2020年的诺贝尔化学奖，揭示了sgRNA引导的DNA切割作为关键的基因治疗工具。RNA分子短短60年的历史产生了五个与RNA科学发现相关的诺贝尔奖，这突显了它在化学和生物领域的重要性，并强调了它作为一种不可替代的技术，将彻底改变医学。 基于RNA的药物主要分为两大类：（i）通过化学方法合成的寡核苷酸药物，如反义寡核苷酸（ASOs）、siRNAs（小干扰RNA）和RNA适体；（ii）通过体外转录合成的大分子RNA药物，如mRNA药物。全球近108种寡核苷酸药物进入临床管道，包括ASOs、siRNAs、适体、单导向RNA（sgRNAs）和miRNAs。此外，全球还有56种mRNA药物也进入临床管道。截至本文撰写之日，全球共有16种核酸药物获批上市，见表1。随着Biogen和Ionis开发的Nusinersen的推出，世界上首个治疗脊髓性肌肉萎缩症（SMA）的寡核苷酸药物出现，目前是销售额最高的寡核苷酸药物。 表1 全球上市的基于RNA的药物 由于大分子结构和负电荷，寡核苷酸药物容易被核糖核酸酶降解，难以穿透细胞膜，2008年至2013年因安全问题和递送系统问题而陷入低谷。药物递送在保护RNA结构、增加靶向能力、降低给药剂量和减少毒副作用方面起着至关重要的作用。随着关键递送系统的技术突破，寡核苷酸药物行业迎来了蓬勃发展。RNAi治疗是治疗遗传疾病和“无法成药”靶点的重要策略。siRNA和miRNA是有意义的基因沉默工具；四种siRNA药物候选已经获批，然而许多miRNA药物大多因安全问题而终止，只有五个候选药物继续进入临床开发，没有一个进入III期临床试验。siRNA和miRNA药物之间最大的区别是它们的作用机制。siRNAs是完全互补的靶向基因沉默序列，进入体内作用于特定的目标基因。相比之下，一个miRNA可以调节成百上千个基因，一个基因也可以被许多不同的miRNAs调节。因此，很难指定miRNA来调节一个特定的基因，并可能导致意想不到的副作用。只有解决miRNA药物的特异性问题，miRNA才能在临床环境中应用。 作为一种具有巨大潜力的技术平台，基于mRNA的治疗可用于传染病预防、肿瘤免疫治疗、蛋白质替代治疗，甚至基因编辑。mRNA的治疗途径可分为三类：预防性疫苗、治疗性疫苗和治疗药物。Pfizer和BioNTech开发的Comirnaty，以及Moderna开发的Spikevax，分别于2020年12月获得美国食品药品监督管理局（FDA）的紧急使用授权，以预防由SARS-CoV-2引起的COVID-19。2021年，Comirnaty和Spikevax的销售额分别达到368亿美元和177亿美元。这两种疫苗在全球大流行病的预防中大放异彩，标志着mRNA技术正式进入商业化时代。 RNA分子长期以来被认为在细胞过程中发挥着重要作用，从基因调控和表达到酶促反应。RNA治疗学是一个迅速扩大的药物和治疗类别，从实验室到临床实践的速度前所未有。最初认为RNA分子由于其不稳定性和相对较短的半衰期，将是一种较差的治疗剂。然而，随着稳定化学的进步和对其瞬时特性的应用，RNA分子作为治疗剂在临床上显示出价值。在这里，我们简要回顾了五类基于RNA的治疗：（i）基于RNAi的治疗，（ii）ASO治疗，（iii）小激活RNA（saRNA）治疗，（iv）环状RNA（circRNA）治疗，和（v）基于mRNA的治疗，以及其在后期临床开发中的药物候选。有数百种寡核苷酸和mRNA药物候选正在进行发现和临床前开发，目前有超过150种寡核苷酸药物和mRNA治疗正在进行临床试验。2018年和2020年是RNAi和mRNA领域的里程碑，因为基于RNA的治疗获批上市。随着更多的RNA治疗正在开发中，RNA基础治疗的未来是光明的。 2.  RNAi基治疗 近几十年来，小非编码RNA的发现及其在基因调控中的作用彻底改变了RNA生物学领域。RNAi最初由Andrew Fire和Craig Mello描述，他们因对RNAi的贡献而获得了诺贝尔生理学或医学奖。他们在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中发现了由外源RNA介导的基因沉默机制。像siRNA这样的小非编码RNA形成称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)的复合物，它指导目标信使RNA(mRNA)的降解，如图1所示。RNAi的转录后基因沉默机制使其成为通过抑制基因的特定碱基序列来控制基因表达的强大工具，彻底改变了药物的发现和开发。 图1 siRNA生物生成的示意图，用于沉默目标mRNA。siRNA前体是一个双链RNA，可以由病毒、转座子或其他来源在内源或外源产生。前体被酶切割，以便正确装载Argonaute蛋白，并由一个双链RNA结合蛋白协助，这允许导向链与Argonaute结合，随后乘客链被排出。最后，沉默活动可以通过目标结合和切割发生。 鉴于RNAi的特异性和效力，许多基于RNAi的策略已经开发出来用于治疗目的，包括siRNA和miRNA治疗，它们在临床试验中作为医疗干预药物显示出有希望的结果。截至2021年底，已有四种RNAi药物获得欧洲委员会(EC)和FDA的批准和授权，为RNAi治疗的有效性和安全性提供了概念验证。siRNA和miRNA治疗的作用机制及其候选药物的例子将在讨论中。 3.  siRNA治疗 2018年，美国FDA和欧洲药品管理局(EMA)批准了patisiran(ONPATTRO; Alnylam Pharmaceuticals)，这是一种siRNA药物，用于治疗由遗传性转甲状腺素(hATTR)淀粉样变性引起的多发性神经病变的成年患者。这种siRNA药物是首个获批的基于RNAi的治疗药物，标志着RNAi治疗的新时代。目前，已有四种siRNA药物获批上市，还有许多正在进行临床试验，如表2所示。 表2 已批准上市或正在进行/已完成2期和3期临床试验的代表性siRNA药物列表 siRNA属于dsRNA类分子。顾名思义，siRNA的长度很短，大约为18到25个核苷酸(nt)，每个链的3'端有无两个悬出的磷酸化碱基。siRNA治疗的机制利用了其自然能力，即通过Argonaute 2(Ago2)的催化域切割完全互补的mRNA的特定序列。设计成模仿Dicer切割的合成siRNA，称为"Dicer-ready" siRNA，可以被传递到感兴趣的细胞并直接被Ago2-RISC复合物识别和装载，使其作为药物特别有吸引力。通过设计所需效力和特异性的siRNA序列针对目标mRNA，可以沉默疾病引起的mRNA。 最新获批用于治疗ASCVD和HeFH的siRNA药物inclisiran(LEQVIO; Novartis)，是一种首创的N-乙酰半乳糖胺(GalNac)修饰的siRNA共轭物，显示出显著降低血浆胆固醇水平。动脉粥样硬化被描述为一种慢性动脉炎症性疾病，导致慢性斑块积聚阻塞血管，导致狭窄和组织缺氧，是ASCVD的主要原因。动脉粥样硬化的发病机制复杂; 然而，已知它与增加的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)水平有关。Inclisiran针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/半胱氨酸蛋白酶9型(PCSK9)的mRNA; PCSK9是一种与LDL受体(LDLR)结合的丝氨酸蛋白酶，调节胆固醇和细胞质载脂蛋白B(ApoB)，发现它增加了血浆LDL浓度。通过抑制PCSK9的产生，降低的PCSK9 mRNA表达减少了LDLR的降解，并增加了LDL的摄取，以降低LDL-c的浓度。 2期和3期临床试验显示了inclisiran在ASCVD和HeFH患者中的有希望的结果。ORION-9试验(NCT标识符：NCT033907121)招募了482名HeFH患者; ORION-10试验(NCT标识符：NCT03399370)在1561名ASCVD患者中进行; ORION-11试验(NCT标识符：NCT03400800)招募了1617名ASCVD或其风险等价物患者。在这些3期试验中，患者在第1天、第90天、第270天和第450天接受了1.5毫升皮下注射，注射了284毫克的inclisiran(相当于300毫克的inclisiran钠)。 所有3期研究报告说已经达到了他们的主要疗效终点。上述三项随机临床试验(RCT)的汇总分析显示，与安慰剂组相比，每年两次剂量的LDL-c总体降低了51%，并将主要不良心血管事件率降低了24%。此外，发现inclisiran降低了总胆固醇、ApoB和非高密度脂蛋白胆固醇水平。因此，inclisiran通过每年两次剂量抑制肝脏PCSK9的产生，有效降低LDL-c水平，并维持这种效果。 除了inclisiran的疗效外，其安全性同样可接受。三项RCT的安全性概况与之前的研究一致，并且没有与异常肝功能、肌酸激酶水平和血小板计数相关。与安慰剂相比，注射部位不良事件在使用inclisiran时报告得更频繁。尽管inclisiran的表现显示出LDL-c和PSCK9水平的显著降低，但另一项三项研究的荟萃分析观察到，在心肌梗死风险方面，使用inclisiran的患者与安慰剂相比没有统计学上的显著差异。总体而言，inclisiran通过每年两次剂量抑制肝脏PCSK9的产生，显著降低LDL-c水平，同时展现出理想的安全性概况。inclisiran及其前驱siRNA药物的成功展示了siRNA导向的RNAi治疗的有希望的未来。这也是第一个用于治疗常见慢性病的小核酸药物。 4.  miRNA治疗 miRNA治疗作为一种治疗不同疾病的新型治疗剂，因其在发育中的作用而开始出现。如前所述，miRNA和siRNA都是能够通过转录后基因沉默靶向mRNA的小双链RNA分子。然而，它们的生物合成和作用机制不同。miRNA的生物合成始于核内，其基因转录受到严格调控，如图2所示。miRNA双链——由处理过的pri-miRNA产生的结果——与RISC结合形成miRISC，由成熟的miRNA引导进行目标识别。与siRNA不同，miRNA通过部分互补碱基配对与目标mRNA结合，抑制mRNA翻译而不是目标mRNA的裂解。 图2 miRNA生物生成和作用机制的示意图。前体miRNA（pre-miRNA）由位于细胞核中的初级miRNA（pri-miRNA）产生，它由末端环和不匹配组成。pre-miRNA进入细胞质，由Dicer酶切割末端环，生成miRNA双链。随后的过程与siRNA的生物生成相似，其中RISC与其RNA双链形成，并装载到Argonaute上进行链的选择。最后，成熟的miRNA准备就绪，可以与目标mRNA结合并促进其降解。 miRNA治疗的应用有两种方法：miRNA抑制和miRNA替代。miRNA抑制利用合成的单链RNA类似物，与目标miRNA的活性链互补，并作为miRNA拮抗剂(也称为anti-miRs或antagomiRs)抑制内源性miRNA，这在结构上类似于反义寡核苷酸。Anti-miRs最初由Krützfeldt等人描述，其中这些化学修饰的、胆固醇结合的、与目标miRNA互补的寡核苷酸的静脉注射降低了小鼠中miR-16、miR-122、miR-192和miR-194的水平。后一种方法采用合成miRNA(也称为miRNA模拟物)来模拟目标miRNA的功能，促使mRNA抑制。 miRNA模拟物可以像化学修饰的siRNA一样使用，具有与目标miRNA相同的导向链，它们被装载到RISC上以抑制下游内源性miRNA。由于其与典型miRNA的相似性，miRNA模拟物可能作为癌症管理的治疗剂，因为肿瘤抑制miRNA在癌症发展中的作用。然而，miRNA模拟剂的传递仍然存在挑战。 miRNA治疗的出现尚未转化为医疗干预的批准药物候选。迄今为止，有几种miRNA分子正在进行临床试验。然而，没有进入3期试验。目前，Regulus和Genzyme(Sanofi)开发的lademirsen(RG-012)正在进行2期试验的患者招募(NCT标识符：NCT02855268)。Lademirsen是一种anti-miR药物候选物，通过皮下给药来沉默Alport综合征患者的microRNA-21(miR-21)的功能。Alport综合征是一种X连锁遗传疾病，其特征是由胶原蛋白IV基因突变引起的慢性肾病。Gomez等人的临床前研究发现，化学修饰的anti-miR-21寡核苷酸与磷酸硫酯键和修饰的糖单元增强了对miR-21的亲和力，并改善了Alport神经病变小鼠模型的生存率。关于lademirsen的临床数据在本次审查时尚未发布。 除了lademirsen的临床开发外，MiRagen Therapeutics(现为Viridian Therapeutics)开发的remlarsen(MRG-201)已完成2期试验，用于治疗瘢痕疙瘩患者(NCT标识符：NCT03601052)。Remlarsen是一种microRNA-29(miR-29)模拟物，旨在治疗病理性纤维化。miR-29家族被发现在纤维化调节途径中发挥作用，其中miR-29的表达水平在纤维化疾病中较低。Remlarsen模拟miR-29以抑制纤维化的形成，如皮肤纤维化。Gallant-Behm等人的研究总结了在健康志愿者中皮下给药的remlarsen的1期临床数据，该药物候选物减少了切口皮肤伤口中的胶原蛋白表达和纤维母细胞增生的发展。此外，该候选物在1期研究中所有研究剂量中被认为是安全且耐受性良好的。1期结果表明，remlarsen可能是预防皮肤纤维化的有效的治疗；然而，尚未发布的2期临床结果在有瘢痕疙瘩病史的患者中可能具有更重大的临床意义。尽管miRNA药物有大量的临床前研究，但只有少数miRNA药物候选物进入临床开发，50%的miRNA药物在临床开发阶段经历了终止或暂停。在开发miRNA药物候选物时面临挑战，例如确定不同疾病特定的miRNA靶标及其精确传递，同时避免进入细胞时的降解。 RNAi基治疗，如siRNA和miRNA治疗，是一个不断发展的领域，对许多疾病具有巨大的治疗前景。RNAi药物面临一些挑战，如内体逃逸和传递到非肝脏和非肾脏组织。尽管目前只有四种siRNA治疗获得了监管批准，但预计不久的将来会有更多的siRNA治疗出现。RNAi治疗提供的广泛的临床应用和安全性概况加强了其潜力。 5.  反义寡核苷酸治疗 1978年，Zamecnik和Stephenson利用与Rous肉瘤病毒目标序列互补的13个核苷酸长的反义寡核苷酸（ASO），在体外展示了病毒复制的抑制，这为ASO作为治疗手段的潜力打开了大门。自这一发现以来，寡核苷酸药物的开发取得了显著进展。ASO是短的单链且高度修饰的核酸类似物，旨在针对特定序列的RNA进行降解。如图3所示，ASO有几种作用机制。目标RNA通常是核内的前体mRNA（pre-mRNA），ASO与多聚腺苷酸识别位点结合，利用核糖核酸酶（RNase）H阻止多聚腺苷酸化；ASO也可以结合到细胞质中mRNA的翻译起始位点，以抑制翻译。 图3 ASO作用机制的示意图。A. 细胞质中的ASO与目标RNA结合，导致RNase H切割，引发目标mRNA降解。B. 细胞质中的ASO也可以结合到mRNA上，阻止RNA结合蛋白复合体的结合，抑制目标mRNA的翻译。C. ASO可以进入细胞核，通过结合并阻断剪接位点或外显子/内含子序列来调节剪接，这些可以通过核糖核蛋白(RNP)复合体催化，以跳过或包含目标外显子。 ASO的化学修饰对其作为治疗药物的转化至关重要，这有助于提高稳定性、特异性并减少不良反应。通常，ASO在两个修饰的2'糖的两个侧翼区域之间具有磷酸硫（PS）键，形成骨架。PS部分保护寡核苷酸不受外切酶的降解并提高稳定性。这种设计呈现了一个中心PS寡核苷酸间隙，赋予了“gapmer”的名称，当RNA-DNA双链形成时，可以激活RNase H1对目标RNA进行切割。此外，磷酸二胺吗啉寡核苷酸（PMOs）的修饰也在ASO中广泛使用，其中六元的吗啉环取代了五元的核糖呋喃糖，骨架通过磷酸二胺连接。这种修饰也稳定了PMO对抗核酸酶的能力，但最小化了对互补目标RNA亲和力的降低。此外，另一种ASO的设计是RNase H独立或仅占用途径，其设计为空间上的障碍，以空间上抑制或防止目标RNA的翻译或剪接。一些ASO药物已经获得了FDA和EMA的批准，如表3所示。迄今为止，已有九种基于ASO的药物获得批准，用于商业用途，所有这些药物都治疗罕见疾病。然而，目前正在开发的ASO显示出ASO平台的应用正在向治疗其他常见病迈进。 表3 已批准上市或正在进行/已完成3期临床试验的代表性反义寡核苷酸药物列表 最近获批的基于ASO的药物casimersen获得了美国FDA的加速批准，用于治疗杜氏肌营养不良症（DMD）。DMD是一种X连锁隐性退行性神经肌肉疾病，由DMD基因中的移码或无义突变引起，该基因编码肌营养不良蛋白，这些突变抑制了功能性肌营养不良蛋白的产生。Casimersen利用基于PMO的策略，引起DMD基因中第45个外显子的跳跃，以绕过移码突变，允许内部截断但部分功能性肌营养不良蛋白的产生。在其1/2期研究中，PMO药物候选物在DMD患者中耐受性良好，适合进行第45个外显子跳跃。3期ESSENCE试验（NCT标识符：NCT02500381）的中期结果显示，所有可评估的接受casimersen的患者都显示出第45个外显子跳跃的增加；然而，由于其样本量小和正在进行的3期ESSENCE试验，很难确定casimersen改善运动功能的能力。开发ASO基药物以治疗神经肌肉疾病的剩余挑战是ASO在肌肉组织中的分布和摄取不足。除了罕见疾病，心血管疾病也是ASO的目标领域。与siRNA治疗类似，ASO药物候选物也在开发中，用于治疗心血管疾病。Pelacarsen是一种首创的GalNAc结合PS ASO，它针对载脂蛋白(a)（apo(a)）的mRNA，使用RNase H1依赖性切割。脂蛋白(a)（Lp(a)）是一种含有ApoB和apo(a)的LDL样脂蛋白，通过二硫键连接，已发现与心血管疾病风险增加有关。在其2期研究（NCT标识符：NCT03070782）中，对286名已建立心血管疾病和增加Lp(a)水平的患者，Tsimikas等人观察到通过皮下给药pelacarsen后，Lp(a)水平剂量依赖性降低了35至80%，并具有良好的安全性概况。鉴于pelacarsen在2期研究中取得了有希望的结果，心血管疾病的ASO药物候选物正在进行3期临床试验（NCT标识符：NCT04023552）。反义技术的进步推动了ASO的发展，证明了基于ASO的药物是一种多功能且安全的治疗方法。大量治疗更常见疾病的ASO候选物正处于晚期临床开发阶段，这将在不久的将来产生有意义的结果。ASO需要克服一些现有的挑战，以扩大其临床应用，例如有效靶向传递到其他组织并减少在其他器官的非靶向积累。随着新型传递平台的发展，ASO治疗更常见疾病的前景是乐观的。 6.  小激活RNA治疗 小双链RNA家族还包括小激活RNA（saRNA），首次由Li等人和Janowski等人报道。研究人员发现，这些21个核苷酸长的双链RNA靶向特定基因启动子，诱导了基因转录激活，并被命名为RNA激活（RNAa）。这两项研究描述了由小双链RNA介导的基因表达诱导的自然现象。Li等人描述了设计的21个核苷酸长的双链RNA与E-钙粘蛋白、p21和VEGF（血管内皮生长因子）基因的启动子区域互补，以序列特异性方式诱导基因表达，并依赖于Ago2，类似于RNAi。Janowski等人展示了通过互补双链RNA靶向其启动子区域诱导孕激素受体表达。此外，RNAa已被证明在多种哺乳动物细胞中保守。RNAi和RNAa在分子机制上存在相似之处，如图4所示。在RNAa中，saRNA被装载到Ago2蛋白中，形成RNA诱导的转录激活（RITA）复合物。RITA复合物由saRNA/Ago2复合物、RNA解旋酶A和与RNA聚合酶相关的蛋白CTR9组成，与RNA Pol II相互作用，触发转录启动和有效的延伸。RNAa在其分子动力学、基因组靶向能力和激活核内目标基因转录延伸方面具有独特性。 图4 saRNA作用机制的示意图。引入的saRNA被装载到Ago2蛋白中，随后Ago2切割链选择形成saRNA/Ago2复合物，并被转运到细胞核。活性的RITA复合物目标并结合到基因组目标位点的启动子区域，并与RHA和CTR9结合，通过RNA聚合酶II（RNAP II）介导的转录活性。 RNAa的发现以及saRNA的作用为选择性基因激活研究提供了新的见解。此外，saRNA本身作为上调基因表达的新型治疗方式，在具有抑制性转录或翻译活性的疾病中提供了新的可能性。开发saRNA作为治疗药物有几个优点，包括低免疫原性和位点特异性基因转录激活；然而，其缺点，如对RNase降解敏感性和非靶向效应，也是关键的挑战。目前，几个saRNA药物候选物正在开发中，如表4所示。尽管大多数候选物仍处于临床前阶段，但MiNA Therapeutics开发的MTL-CEBPA已经进入2期，与蛋白激酶抑制剂索拉非尼联合治疗乙型或丙型肝炎感染的晚期肝细胞癌（HCC）患者（NCT标识符：NCT04710641）。 表4 临床开发中的代表性小激活RNA治疗候选药物列表 MTL-CEBPA是一种首创的saRNA寡核苷酸，具有2′-O-Me修饰，由SMARTICLES脂质体纳米粒子封装，并通过静脉注射给药，治疗HCC患者。转录因子C/EBP-a是一种亮氨酸拉链蛋白，通过与髓系基因的启动子区域结合，启动并激活髓系基因表达，已知与肝细胞调节相关。在小鼠肿瘤模型中，研究人员发现髓系来源的抑制细胞中C/EBP-a的下调；C/EBP-a的上调抑制了肝癌小鼠模型中的肿瘤生长。MTL-CEBPA旨在通过诱导CEBPA基因的转录来上调C/EBP-a。在与肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎或肝转移相关的HCC患者中进行的MTL-CEBPA首次人体1期研究结果显示，saRNA药物候选物的安全性概况可接受，建议的初始剂量为130 mg m−2，并通过其药效学分析显示了目标参与。然而，其疗效概况有限：在24名可评估MTL-CEBPA单药疗效的患者中，只有1名患者观察到客观的肿瘤反应和部分反应。在7名患者中使用酪氨酸激酶抑制剂（索拉非尼、lenvatinib或regorafenib）治疗，观察到3名完全反应，2名病情稳定，1名部分反应。1期研究得出结论，MTL-CEBPA对HCC的预处理有助于为酪氨酸激酶抑制剂，如索拉非尼的治疗效应创造更易接受的肿瘤微环境。 除了2期的MTL-CEBPA加索拉非尼外，MiNA Therapeutics还在开发MTL-CEBPA与PD1检查点抑制剂pembrolizumab联合治疗晚期实体瘤患者，已进入1期（NCT标识符：NCT04105335）。 尽管MTL-CEBPA的1期临床结果有希望，但这种新型寡核苷酸治疗方式仍存在不确定性和挑战。在目标序列识别方面仍缺乏明确的机制理解；当涉及额外的DNA元素时，目标基因组的可访问性也不清楚。 7.  环状RNA治疗 除了前述的RNA治疗方法外，另一种新兴的RNA治疗因其显著的研究进展而受到关注。环状RNA（circRNA）是一类具有环状结构的非编码RNA，它们没有末端结构，例如5'帽和3'聚(A)尾部，主要存在于真核细胞中。1976年，Sanger等人首次在类病毒中发现circRNA，现在通过RNA测序发现circRNA在众多物种中高度保守。由于circRNA的环状特性，它们的稳定性可能优于线性RNA，因为它们能够抵抗各种RNA外切酶的降解。此外，Wesselhoeft等人证明了外源性circRNA的蛋白表达比未修饰和修饰的线性RNA持续时间更长。因此，鉴于它们的稳定性和在真核细胞中表达时无需修饰，circRNA为医学应用提供了有希望的应用前景。 与大多数线性RNA不同，circRNA的生物生成涉及外显子的反向剪接，通过共价键将下游的“尾部”（3'）连接到上游的“头部”（5'）。这种共价键的形成使circRNA具有自然能力，能够抵抗主要的RNA降解途径。鉴于circRNA的异常稳定性，其调控和周转在管理其丰度方面非常重要。最近，更多的研究阐明了circRNA的周转机制，其中特定的circRNA，如CDR1as，可以通过完全互补的miRNA结合，然后通过Ago2介导的切割来降解；响应病毒感染的RNase L也可以降解circRNA；高度结构化的circRNA可以通过结构介导的RNA降解来调节。也就是说，需要额外的研究来确定circRNA的分子途径。 与其他RNA治疗方法一样，circRNA作为调节基因表达或携带模块化效应的潜在治疗方法而出现。合成的circRNA已被成功地证明在真核细胞中具有强大且稳定的翻译。Wesselhoeft等人设计了自剪接的前体RNA，使用间隔序列优化了圆环化效率，并能够圆环化长达5 kb的各种长度的RNA。经过工程化的高效液相色谱（HPLC）纯化的circRNA发现，与对照组相比，其翻译效率高达97%。此外，这种纯化的circRNA可以逃避细胞RNA传感器，如Toll样受体和RIG-I，同时提供比未纯化的circRNA更稳定的蛋白表达。此外，circRNA也可以与LNP配制而成，以实现在小鼠和恒河猴中有效的体内传递和翻译。最近，Qu等人展示了一种针对SARS-CoV-2的circRNA疫苗，编码了三聚体RBD的刺突蛋白，为动物提供了足够的保护。此外，他们还展示了使用合成circRNA表达SARS-CoV-2中和抗体和hACE2诱饵来中和假病毒颗粒。 最后，工程化circRNA的另一个应用是RNA编辑，其中循环ADAR招募RNA被用来招募本地ADAR1或ADAR2酶，将特定的腺苷碱基改变为肌苷，以执行精确的内源性RNA编辑。除了工程化circRNA外，circRNA治疗的另一种方法是利用基于circRNA的适体，其中一种名为Tornado（twister优化的RNA，用于持久过表达）的表达系统执行RNA圆环化，并产生能够结合蛋白的RNA适体。尽管在circRNA的研究和应用方面取得了显著进展，但大多数候选物目前仍处于发现阶段或临床前开发阶段。截至本文撰写之日，尚无circRNA治疗候选物进入临床试验。circRNA提供了几种有希望的医学和研究应用，从治疗药物和蛋白替代疗法到预防性疫苗。还应注意，circRNA的另一种潜在治疗方法是使用其他方法（如CRISPR-Cas9或siRNA）调节本native circRNA，以及使用本native circRNA进行生物标记或海绵治疗各种疾病，包括癌症、心血管疾病和神经系统疾病。最后，开发合成circRNA作为治疗剂仍存在许多挑战，例如控制circRNA的表达水平以避免由于其异常稳定性而持续过度表达，大规模生产高纯度的人工circRNA，以及circRNA的靶向传递。因此，进一步的研究伴随着临床研究可能解决和克服这些挑战。尽管如此，从线性RNA治疗方法（如基于mRNA的治疗方法）中获得的理解可以转化为基于circRNA的治疗方法，并为开发circRNA作为治疗剂提供宝贵的见解。 8.  基于信使RNA的治疗 与前面描述的RNA不同，信使RNA（mRNA）是一种生命的关键分子，是一种与DNA反义链互补的单链RNA。顾名思义，mRNA是细胞核中编码蛋白质的DNA翻译和细胞质中蛋白质生产之间的信使。鉴于mRNA在作为分子生物学中心法则中介的蛋白质生产中的关键作用，为这一类新药开发了几种治疗策略，包括基于mRNA的疫苗和mRNA替代疗法。Wolff等人首次描述了在动物中成功引入体外转录（IVT）mRNA。在过去十年中，该领域取得了显著进展，使mRNA治疗成为治疗传染病和癌症等疾病的有希望的模式。 基于mRNA的治疗方法具有许多优势，例如相对较低的插入突变风险，以及在功能性方面无需进入细胞核。此外，mRNA的短暂性质为在需要时更临时地表达蛋白质提供了好处。通过将化学修饰的mRNA引入细胞的细胞质中，可以表达遗传疾病中减少或抑制的蛋白质，以类似于天然蛋白质的方式。此外，这种mRNA也可以用作预防性疫苗，在这种情况下，mRNA可以编码特定的外来抗原，以引发针对传染病的保护性免疫；或者作为治疗性疫苗，以启动免疫系统刺激细胞介导的反应，以靶向肿瘤。 8.1.  mRNA疫苗 疫苗接种预防疾病，是防止传染病传播最有效的公共卫生干预措施之一。疫苗的广泛使用导致了许多传染病的完全根除，并减少了全世界脊髓灰质炎、麻疹和其他疾病的发病率。在过去的几个世纪里，疫苗学随着传统疫苗方法的出现而发展，如减毒活疫苗和灭活疫苗，为一系列疾病提供了持久的保护。尽管传统疫苗方法取得了进展，但在疫苗开发中仍存在挑战，以满足当前的医疗需求，如新出现的传染病病原体具有更好的能力来逃避适应性免疫反应或需求细胞免疫反应。此外，面对新出现的病毒，有必要采用能够快速开发和大规模生产并具有理想特性以广泛分发的疫苗方法。 还需要针对非传染病的疫苗，传统疫苗方法可能不适用。因此，开发更具适应性和效力的疫苗平台至关重要。最近在mRNA疫苗方面的进展，如mRNA序列工程、大规模生产开发和有效的传递方法，进一步加速了该疫苗平台的开发。 9.  预防性疫苗 如前所述，mRNA疫苗可用于预防性或治疗性目的。mRNA设计、制造和传递方法的最新进展使mRNA疫苗成为传统方法的有吸引力的替代品。对于预防性目的，合成的mRNA编码抗原被传递到细胞质中，一旦表达，就能在不穿越核膜屏障的情况下引发免疫反应，如图5所示。有两种主要类型的体外转录（IVT）mRNA，它们都模仿内源mRNA结构：非复制型mRNA和自增强型mRNA。前者结构包括5'帽、5'非翻译区（UTR）、编码抗原的开放阅读框、3'UTR和聚A尾部；自增强型mRNA还包含病毒复制机制，如复制酶基因，以表达依赖RNA的RNA聚合酶，这允许细胞内RNA扩增和充足的抗原表达。 图5 mRNA疫苗作用机制的示意图。mRNA疫苗包含脂质纳米颗粒(LNP)包裹的mRNA序列（绿色），通过肌肉注射进行注射。封装的mRNA编码感兴趣的抗原（蓝色），被肌肉细胞摄取并在细胞的细胞质中表达。内源性产生的抗原被分泌并运送到局部淋巴结，这刺激了细胞介导的免疫和体液免疫，如分化的B细胞分泌抗体（紫色）。mRNA疫苗方法通过主动免疫提供保护，而不包含实际病毒或细菌的部分。 从DNA模板转录的mRNA携带遗传信息，指导细胞内蛋白、膜蛋白和细胞外蛋白的翻译和生产。同样，mRNA疫苗的核心原则是传递编码信息，如抗原蛋白，以在细胞内翻译。从而有效激活细胞免疫和体液免疫，如图6所示。 图6 mRNA疫苗在抗原呈递细胞(APCs)中诱发免疫的示意图。APCs通过内吞作用摄取mRNA疫苗后，mRNA在核糖体中被翻译成抗原肽，并刺激细胞免疫反应。蛋白酶体复合物将抗原肽处理成更小的肽表位，这些表位可以通过主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类呈现在细胞表面，具体取决于APC的类型。MHC I类呈现的表位被CD8+细胞毒性T细胞识别，以激活并杀死感染细胞。MHC II类呈现的表位被CD4+辅助T细胞识别，这些细胞促进B细胞的激活和中和抗体的产生，并通过吞噬细胞启动体液免疫反应。 除了与内源mRNA的相似性外，mRNA疫苗还能表达复杂的抗原，没有包装限制。利用基因序列信息的无细胞制造过程允许快速、可扩展的生产，以迅速应对任何新出现的传染病。经过多年的mRNA治疗研究和投资，解决了其药理学方面的许多挑战，如稳定性和效力。 随着2020年1月严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）大流行的爆发及其完整基因组的发布，对SARS-CoV-2的有效疫苗的开发竞赛开始了。结果，针对SARS-CoV-2开发了多种疫苗，包括几种基于RNA的疫苗，如表5所示。Moderna开发的Spikevax和Pfizer及BioNTech开发的Comirnaty迅速获得了FDA的紧急使用授权（EUA）和EMA的条件性市场授权（CMA）。目前，只有Comirnaty获得了FDA的批准。这些mRNA疫苗展示了它们高效力和理想的安全性概况，以前所未有的速度被开发和施用。此外，这些疫苗的开发验证了基于mRNA的平台，并激发了对mRNA治疗应用的巨大吸引力。 表5 针对COVID-19的基于RNA的疫苗在临床试验中或已批准的列表 2019冠状病毒病（COVID-19）是由SARS-CoV-2病毒引起的一种高度传染性的病毒感染性疾病，已导致全球健康危机，对世界造成了灾难性影响。为了应对全球大流行，辉瑞和BioNTech开发的Comirnaty（BNT162b2或Tozinameran）是首个获得FDA批准的用于预防性指示的mRNA疫苗。Comirnaty疫苗是一种修饰的核苷酸mRNA，编码SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白，并由脂质纳米颗粒包裹，允许S抗原的表达。SARS-CoV-2 S蛋白是一种I型融合糖蛋白，是病毒的主要表面蛋白和中和抗体的主要靶标。S蛋白对病毒及其感染至关重要，因为它能够显著的结构重排，将病毒和宿主细胞的细胞膜融合，将其病毒基因组传递到目标宿主细胞进行感染。Comirnaty编码了SARS-CoV-2的前融合稳定和膜锚定的全长S蛋白，这保留了中和敏感表位，有效激发对S抗原的免疫反应 Comirnaty在临床试验中展现了高疫苗效力和良好的安全性。在其2/3期试验中，共有37,706名16岁以上的参与者接受了两次剂量为30微克的接种，两次接种间隔21天。在接种第一剂后，他们观察到对COVID-19有52%的疫苗效力，表明对疾病发作有初步保护作用；在接种第二剂后7天，对COVID-19的疫苗效力达到91%。总体而言，在这项2/3期试验中，所有参与者观察到95%的疫苗效力。此外，该研究还确认了其有利的安全性概况，其中反应原性事件，如疲劳、全身反应和淋巴结病，在出现几天内自行解决。在BNT162b2的早期1/2期研究中，评估了成年参与者的免疫原性，同样的剂量方案和时间表在参与者中引发了强劲的血清SARS-CoV-2中和滴度，在第二剂后7天，并在第二剂后一个月持续存在。最后，利用以色列大规模疫苗接种活动收集的数据进行的一项研究发现，接种两剂BNT162b2的3,159,136名参与者的结果显示与随机试验一致：预防有症状COVID-19的有效性为94%；预防住院的有效性为87%；预防严重COVID-19发作的有效性为92%。因此，mRNA疫苗BNT162b2证明了mRNA预防性疫苗作为一个有效的平台，以保护免受传染病的侵害，同时在反应原性和免疫原性之间显示出有利的平衡。 作为RNA病毒，SARS-CoV-2容易发生基因突变，使其进化，允许与野生型菌株相比具有不同属性的突变变种出现。对BNT162b2疫苗针对各种变种进行了多项初步研究，特别是对全球流行的高传染性B.1.617.2（Delta）和B.1.1.529（Omicron）变种。Tang等人通过匹配的测试阴性病例对照研究评估了BNT162b2针对Delta变种的实际效果，并得出结论，疫苗有效性降低至51.9%，防止有症状或无症状COVID-19。此外，Nemet等人的另一项初步实验室研究发现，两剂BNT162b2针对Delta和Omicron的中和效力显著降低，对这些变种的保护效力降低。需要注意的是，这些是初步结果，需要进一步研究以检查BNT162b2对特定变种的全面影响。也就是说，这些结果表明需要针对新出现的变种调整疫苗，这对于RNA基础的疫苗方法是可能的，因为它可以快速和可扩展地生产。除了COVID-19 mRNA疫苗外，还开发了针对其他传染病的mRNA疫苗，如呼吸道合胞病毒（RSV）、HIV-1、流感和寨卡病毒，这些疫苗已显示出有希望的临床前和临床结果。BNT162b2和mRNA-1273的批准和紧急授权为mRNA疫苗方法的安全性和效力提供了充分的证据，这加速了这种疫苗技术的发展，并为转变现代疫苗策略提供了乐观的前景。 10.  治疗性疫苗 除了mRNA预防性疫苗外，基于mRNA的疫苗还应用于癌症免疫疗法。mRNA癌症疫苗编码癌症抗原，如肿瘤相关自身抗原（TAA）或肿瘤特异性抗原（TSA），以诱导针对肿瘤的特异性T细胞反应，从而实现肿瘤排斥。基于mRNA的方法在癌症免疫疗法中具有优势，因为它具有抗原传递和表达能力，以及通过mRNA设计激活先天免疫的佐剂功能。基于mRNA的癌症疫苗有两种方法：mRNA树突状细胞（DC）疫苗和mRNA直接癌症疫苗。 基于mRNA的DC疫苗涉及将TAA加载到DCs中，因为DCs具有呈递TAA并启动针对肿瘤的强大效应反应的能力。DCs的体外操作需要从患者的血液中分离出的造血前体细胞，并将转染的细胞重新输注到患者体内，这提供了一种个性化的治疗策略，因为DCs是患者衍生的。然而，这个过程也可能是昂贵和劳动密集型的，同时增加了一层复杂性。顾名思义，后一种方法涉及直接注射编码肿瘤抗原的mRNA，可以被局部细胞摄取以进行抗原呈递。目前，有几个癌症疫苗候选物正在进行临床开发，如表6所示。 表6 目前正在进行或已完成2期或3期临床试验的代表性基于RNA的癌症疫苗列表 在Kyte等人（NCT标识符：NCT01278940）的1/2期研究中，用自体肿瘤mRNA转染的黑色素瘤DC疫苗单独或与佐剂白介素-2（IL-2）一起使用，报告说在31名晚期黑色素瘤患者中有16名患者的肿瘤特异性T细胞免疫反应与生存期改善相关，并且安全性可接受。在另一项2期研究（NCT标识符：NCT03480152）中，一种编码20种不同新抗原的mRNA直接癌症疫苗，由自体癌症表达，并与LNP配制而成，被用于四名转移性胃肠道癌症患者。这种疫苗候选物被发现是安全的，并且诱导了针对预测新表位的突变特异性T细胞反应，使用肿瘤浸润性淋巴细胞；然而，由于患者数量有限，其临床疗效尚待确定。鉴于IVT mRNA技术的安全性、稳健性和相对较低的成本，使用mRNA疫苗的癌症免疫疗法的个性化是可能的，伴随着有希望的临床前数据和正在进行的临床试验。 除了预防性和治疗性mRNA疫苗外，LNP-mRNA技术最近在小鼠模型中用于短暂的抗纤维化嵌合抗原受体（CAR）T治疗。Rurik等人证明，含有修饰核苷的mRNA编码针对成纤维细胞激活蛋白（FAP）的CARs，与CD5靶向LNPs配制而成，也称为靶向抗体/LNP-mRNA载体，可以定向传递到CD5细胞以表达功能性CAR T细胞。FAP是在活跃的组织重塑和急性心肌梗死后损伤中表达的细胞表面糖蛋白。鉴于FAP在心脏成纤维细胞中的强烈表达，它是激活的心脏成纤维细胞的可行靶标和标记。在他们的一系列概念验证实验中，Rurik等人成功证明了封装在靶向LNPs中的修饰mRNA能够传递到特定细胞类型，在体内产生功能性工程化T细胞。此外，这种传递产生了短暂有效的抗纤维化CAR T细胞，表现出肌动蛋白吞噬作用。在高血压小鼠心脏损伤和纤维化模型中，58%的CD3+ T细胞是FAPCAR+，表明在CD5/LNP-FAPCAR注射的小鼠中成功转导了FAPCAR mRNA。最后，用CD5/LNP-FAPCAR治疗的小鼠显示出改善的心脏功能和减少的间质纤维化。通过针对特定细胞类型的LNPs，修饰mRNA治疗可能会扩大其应用范围，创造出一种可扩展且相对便宜的通用治疗的可能性，具有工程化免疫功能的能力。 10.1.  mRNA作为蛋白质替代疗法 体外转录（IVT）mRNA的另一个直接应用是蛋白质替代疗法，其中IVT mRNA编码所需的蛋白质，并在目标细胞中表达以实现治疗目的。因此，以蛋白质表达不足或异常蛋白质产生为特征的疾病，如遗传性疾病，可能从蛋白质替代疗法中受益。基于mRNA的蛋白质替代疗法的优势在于其能够表达几乎所有的蛋白质，包括分泌蛋白、细胞内蛋白和跨膜蛋白。蛋白质替代疗法的临床试验主要集中在遗传性代谢性疾病上，如表7所示。 表7 临床开发中的代表性基于mRNA的蛋白质替代疗法列表 在蛋白质替代疗法的临床研究中，由于其特征是必需酶的缺乏，导致酶的缺乏导致过量的代谢产物，从而产生临床表现，因此遗传性代谢性疾病是研究的重点。上述候选药物的临床数据尚未公布。因此，需要进一步证据来证明蛋白质替代疗法的安全性和有效性。除了代谢性疾病外，蛋白质替代治疗方法也被应用于血液疾病，如血友病A和B。Ramaswamy等人使用LNP配方的mRNA编码人凝血因子IX（hFIX）治疗血友病B的FIX缺陷小鼠模型，证明了他们的传递平台LUNAR在小鼠模型中的安全性和有效性；以及传递到肝脏的FIX蛋白的治疗产生。对于这种模式，仍然存在挑战，如传递方法。目前，mRNA蛋白质替代疗法的传递方法主要针对肝脏、肺和心脏。因此，需要进一步开发传递策略以传递到其他器官。 除了传递编码缺失或异常蛋白质的mRNA外，还开发了与单导向RNA（sgRNA）和编码CRISPR相关蛋白9（Cas9）的mRNA配伍的疗法。Cas9是一种相关的内切核酸酶，能够进行双链DNA断裂，并通过与导向RNA结合形成核糖核蛋白复合物。通过传递与目标基因互补的特定sgRNA以及Cas9 mRNA，可以通过Cas9对目标基因进行切割以实现基因沉默，从而实现体内基因编辑。多个药物候选物正在使用基于RNA的CRISPR-Cas9基因编辑策略进行临床开发，以治疗遗传性疾病。Intellia Therapeutics开发的NTLA-2001是一种基于CRISPR-Cas9的体内基因编辑疗法，目前正在1期临床试验（NCT标识符：NCT04601051）中用于治疗转甲状腺素（ATTR）淀粉样变性——一种罕见的、进行性的疾病，其特征是异常的转甲状腺素（TTR）蛋白的错误折叠积累。候选药物NTLA-2001由与目标TTR基因互补的sgRNA和Cas9蛋白的修饰mRNA序列配制而成，通过LNP传递到肝脏。临床前研究和首次人体中期临床数据分析显示，在动物模型和遗传性ATTR患者中血清TTR浓度降低，证明了TTR的持久靶向敲除。这些研究为体内基于RNA的CRISPR-Cas9基因编辑作为有希望的治疗策略提供了临床证据和概念验证。 在过去几年中，mRNA疫苗领域取得了关键进展，证实了基于mRNA的治疗的可行性。制造方法和传递材料的进步加速了mRNA治疗的发展。尽管基于mRNA的治疗的临床数据令人鼓舞，但仍需要针对特定细胞类型靶向的传递材料的挑战，以及需要进一步深入理解mRNA治疗的机制，以最小化不良事件并提高效力。 11.  结论和未来展望 RNA治疗学是一个迅速发展的领域，正在经历快速扩张。目前已有超过十五种基于RNA的治疗方法获得监管批准，更多的研究进入后期临床开发阶段。这个强大且多功能的平台能够解决当前治疗方法无法满足的许多医疗需求。由于RNA治疗的基本挑战，如传递、稳定性和免疫原性已得到解决，RNA药物的开发正在迅速增长。仍然有改进和优化的空间，如特定细胞类型的传递、提高内体逃逸和增强效力。 然而，RNA活性和传递平台的持续发现和增加的机制理解为RNA治疗的前景提供了乐观的展望。GalNAc-siRNAs和mRNA疫苗的最新成功，以及CRISPR的潜力，预示着RNA治疗学新时代的到来。