Moderna, Inc.

摘要:自然杀伤（NK）细胞是癌症免疫疗法的有力候选者，它们具有强大的先天细胞毒性，并且在嵌合抗原受体（CAR）治疗方面比T细胞具有独特优势。对病毒载体的安全性、成本和可扩展性的担忧激发了对非病毒基因传递替代品的研究。本综述全面分析了非病毒遗传修饰NK细胞在异体CAR-NK疗法中的最近进展和挑战。包括电穿孔和多功能纳米颗粒在内的非病毒替代品在CAR表达和转化反应方面受到检验。至关重要的是，NK细胞生物学与药物传递技术设计之间的联系被建立起来，这对于未来非病毒方法的发展至关重要。本综述为非病毒CAR-NK细胞工程的现状提供了宝贵的见解，旨在实现基于NK细胞的免疫疗法的全部潜力。 图形摘要:非病毒生产“现成的”CAR-NK细胞。 1.NK细胞可以从捐赠者血液中纯化，从干细胞分化，或在实验室中从永生化细胞系生产。 2.从CAR-T设计修改而来的NK特异性CAR设计，包括NK跨膜域（NKG2D、NKp44）、共刺激受体（例如，DAP10、2B4）和NK细胞受体（NKG2D）。 3.非病毒遗传修饰NK细胞可以包括通过DNA或mRNA传递CAR构建体，以及使用基因编辑工具（例如，CRISPR Cas9、转座子）敲入/敲出特定基因。这需要一种基因传递方法，可能包括电穿孔、脂质和多功能纳米颗粒和细胞。 1.引言 嵌合抗原受体（CAR）疗法是一种过继细胞疗法，其中T细胞、树突状细胞、巨噬细胞或自然杀伤（NK）细胞被遗传工程化以识别和消除癌细胞。CAR-T疗法是最成熟的形式，涉及修改患者的T细胞在体外表达一个CAR，该CAR能够识别癌细胞表面的肿瘤相关抗原（TAA），例如在许多B细胞淋巴瘤和白血病上表达的CD19。然后CAR-T细胞被扩增并重新输回患者体内，以靶向并杀死表达特定TAA抗原的肿瘤细胞。第一个CAR-T疗法于2017年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，到2022年又有五个产品获得批准；针对CD19+恶性肿瘤，包括白血病和淋巴瘤，或表达B细胞成熟抗原（BCMA）的多发性骨髓瘤（在表1中总结）。 基本CAR结构（图1）模仿T细胞受体激活，包括几个部分：一个识别癌细胞表面的特定抗原的细胞外域；一个对将信号发送到细胞内域至关重要的跨膜域，激活CAR-T细胞增殖和存活。CAR-T构建体设计已经经历了几代的发展，如图1所示。目前商业化的CAR-T细胞产品使用第二代CAR设计，增加了一个共刺激域（CD28或4-1BB）以增强T细胞增殖、持久性和细胞毒性（表1）。共刺激域的选择可以显著影响体内持久性；基于CD28的CAR T细胞持续约30天，而4-1BB CAR T细胞在某些患者中可能超过4年。 图1. CAR-T构建设计元素进展的详细示意图。第一代CAR由单链可变片段（scFv）抗原识别域、跨膜域和源自CD3ζ链（CD3ζ）的细胞内T细胞激活域组成，发展到第二代CAR设计，增加了额外的共刺激域（CD28或4-1BB），增强了T细胞的增殖和细胞毒性，被商业产品所采用。进一步的第三代CAR构建包含两个不同的共刺激域（例如，CD28和4-1BB）。“武装”的第四代CAR（也称为T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤（TRUCKs））包含可诱导表达的成分，如细胞因子（例如，IL-12），这可以增加CAR-T细胞的激活和肿瘤杀伤，第五代或称为“下一代”CAR包含一个截短的白细胞介素-2（IL-2）受体β链（IL-2Rβ），具有与转录因子STAT3的结合位点，以充分利用通过JAK-STAT3/5信号传导的CAR激活信号；增强T细胞的激活、增殖和持久性。此图使用BioRender.com创建。 血液系统恶性肿瘤，包括白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤，迄今为止一直是CAR-T疗法的主要目标，治疗效果令人印象深刻。在2015年和2017年之间，针对tisagenlecleucel的第二阶段ELIANA临床试验，包括75名难治性或复发性B细胞急性淋巴细胞性白血病（ALL）的儿童患者，结果显示在三个月时的总体缓解率为81%。然而，73%的患者经历了严重的不良事件，其中47%发展为严重的细胞因子释放综合征（CRS）。CAR-T疗法的安全性问题是一个主要关注点，患者遭受的毒性包括CRS和肿瘤溶解综合征、神经毒性以及移植物抗宿主病（GVHD）的风险。此外，用CAR-T疗法治疗实体瘤已被证明更加困难，因为肿瘤异质性、炎症和肿瘤微环境中的免疫逃逸（TME）。与自体细胞疗法相关的成本也极高，CAR-T疗法的治疗费用从373,000美元到475,000美元不等，还有与白细胞分离、淋巴细胞清除疗法以及CAR-T免疫疗法的副作用相关的额外成本。例如，使用tisagenlecleucel治疗的患者的总治疗费用据报道，对于没有CRS的患者范围从478,777美元到对于有严重CRS的患者531,823美元，由于需要进一步的治疗和医院护理，包括在某些情况下的重症监护治疗。因此，有必要开发更安全的替代品，以减少患者的并发症风险，同时也有助于降低制造成本和与医院治疗相关的成本，以管理严重的副作用。这样的替代品之一是使用自然杀伤（NK）细胞进行CAR疗法，它们有潜力克服CAR-T疗法中的一些问题。 2.自然杀伤（NK）细胞 NK细胞是高度细胞毒性的免疫效应器，被定义为CD56+ CD3–淋巴细胞，能够发挥自然细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。它们在癌症监测中扮演重要角色，具有对癌细胞的自发细胞毒性的独特能力，无需事先暴露或由其他免疫细胞刺激，这归功于一系列激活受体。NK细胞可以通过下调通常在健康细胞上表达的人类白细胞抗原（HLA），与主要组织相容性复合体（MHC）同义，或上调应激诱导配体，如主要组织相容性复合体类1链相关蛋白A和B（MICA, MICB）来识别异常细胞。在识别目标细胞后，NK细胞通过涉及多种受体、共受体和细胞内蛋白的复杂信号传导途径被激活，包括自然细胞毒性受体（NCRs）、杀伤Ig样受体（KIRs）、NKG2D和DNAM-1。许多NK激活和抑制受体协同作用，提供一种自我调节机制，以防止对健康细胞的损害，如图2总结，更详细的内容在表2中。 图2. NK细胞常见的激活性A和抑制性B受体及其相应配体的简化示意图。NK受体协同作用，提供一种自我调节机制，以防止对健康细胞造成损害，并且可能通过下调人类白细胞抗原（HLA，与主要组织相容性复合体MHC同义）或上调应激诱导配体（如主要组织相容性复合体类1链相关蛋白A和B，MICA，MICB）来识别异常细胞。在识别靶细胞后，NK细胞通过涉及多种受体、共受体和细胞内蛋白的复杂信号传导途径被激活，包括自然细胞毒性受体（NCRs）、杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIRs）、NKG2D和DNAM-1。此图使用BioRender.com创建。 抑制性受体识别HLA分子，使自然杀伤（NK）细胞能够区分正常细胞和异常细胞。当激活受体的平衡倾向于激活时，会释放含有穿孔素和颗粒酶B的细胞毒性颗粒，通过caspase介导的凋亡直接杀死目标细胞。NK细胞还表达死亡受体，如FasL、TRAIL和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）受体，以诱导表达相应受体的目标细胞凋亡。产生多种细胞因子和趋化因子，如干扰素-γ（IFN-γ）和TNF-α，激活其他免疫细胞，包括树突状细胞、巨噬细胞和T细胞，并促进炎症。此外，NK细胞能够通过识别被抗体包被的目标细胞进行抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。成熟的NK细胞表达CD16受体（也称为FcγRIIIA），该受体识别与目标细胞表面表位结合的免疫球蛋白G（IgG）的Fc片段。与IgG包被的细胞相互作用后，含有免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM）的CD16亚基将受体连接到细胞内信号传导途径，触发肌动蛋白和微管的重组以实现ADCC。这最终导致含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒的释放，FasL和TRAIL死亡受体的参与，以及促进进一步招募多种免疫细胞的细胞因子和趋化因子的释放。CD16的表达对于NK细胞的ADCC功能至关重要，并且表达在更成熟的NK细胞上。因此，CD16的表达在命名法中用于分类NK细胞的成熟状态。人类NK细胞通常被细分为两个主要亚群：CD56brightCD16dim/−和更成熟的CD56dimCD16+。CD56dim亚群在外围血液中更为常见，而CD56bright在组织中更丰富。CD56bright NK细胞被认为是不成熟的，表达NKG2A但不表达KIRs。它们的细胞溶解能力差，分泌细胞因子IFN-γ、GM-CSF，并对IL-2或IL-15产生反应而增殖。相反，CD56dim被认为是成熟的，表达NKG2A和/或KIR受体，并在激活时具有强大的细胞溶解活性和细胞因子分泌能力。最成熟的、终末分化的NK细胞被分类为CD56dim KIRpos CD57pos CD16bright（图3）。成熟的CD56dimCD16+亚群是癌症治疗的理想选择，因为它们具有强大的细胞溶解活性和ADCC能力。因此，采用NK细胞的过继免疫疗法已成为一种有希望的治疗选择，研究正集中在探索如何利用NK细胞的力量用于癌症免疫疗法，如CAR-NK细胞疗法。[图3]。 图3. NK细胞成熟度与其他免疫细胞的相互作用。A. NK细胞根据成熟状态改变受体状态，从未成熟的CD56bright/CD16−细胞到成熟的CD56dim/CD16+细胞，以及最终分化的NK细胞，这些细胞有时也被称为“记忆样”NK细胞。B. NK细胞在激活后与髓系细胞和靶细胞的信号传递和相互作用。NK细胞通过直接杀伤（激活受体包括NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、KIRs）、凋亡（TRAIL和FasL死亡受体）和/或ADCC（CD16）对靶细胞发挥细胞毒性，并产生炎症细胞因子和趋化因子，这些因子刺激并招募其他免疫细胞。此图使用BioRender.com创建。 2.1.CAR-NK疗法的优势 与T细胞相比，NK细胞在CAR疗法中具有几个潜在优势，包括增强的安全档案、异体疗法的潜力以及通过CAR依赖和非CAR依赖的癌细胞靶向实现更广泛的目标特异性。CAR-Ts分泌包括IL-1、IL-2、IL6、TNF-α、MCP1、IL8、IL10、IL-15在内的一系列细胞因子。这些细胞因子，特别是促炎性的TNF-α、IL-1和IL-6，被报道是与CAR-T疗法相关的严重副作用的原因，包括神经毒性和CRS。相比之下，CAR-NK与不同的细胞因子档案相关，它分泌IFN-γ和GM-CSF。事实上，在给药CD19+淋巴样肿瘤患者后，CAR-NK细胞的炎症细胞因子并未超过基线。这种细胞因子释放档案的差异被认为是NK细胞增强安全档案的原因之一，导致毒性较小，减少细胞因子风暴的发生。尽管重要的是要注意这些结论是基于有限数量的临床CAR-NK研究和有限的患者数量，与许多大型CAR-T临床研究相比，并且尚未在CAR-T和CAR-NK疗法之间进行直接比较。CAR-NK细胞的另一个潜在安全优势是降低了与CAR-T细胞相关的靶向内肿瘤毒性的风险。所有细胞，无论是恶性还是非恶性的，如表达CAR靶抗原的CD19+ B细胞，都可能被CAR-T细胞靶向。NK细胞上的抑制性受体可能在非恶性细胞被CAR抗原识别时充当安全开关。如果识别非恶性细胞，将启动NK抑制信号，防止靶向内肿瘤毒性。 NK细胞在异体应用中的潜力在于CAR-NK细胞治疗后GVHD（移植物抗宿主病）的低风险。在T细胞的情况下，由于它们的αβ T细胞受体（TCRs）高度多变，供体T细胞与受体组织细胞广泛表达的HLA I类分子结合。在供体T细胞输注后，TCR识别HLA为外来物，启动针对受体细胞的免疫反应，导致导致GVHD的异体反应。相比之下，NK细胞的活性不依赖于HLA I类识别，允许NK细胞针对经常丢失HLA I类受体作为免疫逃逸手段的恶性细胞。因此，NK细胞治疗的GVHD风险较低，并且NK细胞的研究在安全性方面取得了有希望的结果。 由于安全性档案的改善和GVHD风险较低，有可能开发出一种“现成的”CAR-NK产品，这可能对领域产生变革性影响。尽管正在研究自体NK细胞治疗，但异体NK细胞可能比自体NK治疗更有效，克服了来自免疫抑制患者的耗尽NK细胞的问题。异体供体NK细胞可以大规模培养，便于更有效的质量控制测试、转染和输注；允许从同一批次治疗多名患者，这可能消除了对专业中心的需求。相比之下，目前CAR治疗中使用的T细胞通常来源于患者自身的细胞，这可能既耗时又昂贵，并且难以收获和工程化。自体CAR-T治疗的费用可能高达每次治疗475,000美元，由于CAR-T治疗劳动密集、难以扩展且容易失败。相比之下，一个周期的异体“现成的”NK-92治疗的费用可能不到20,000美元，使其成为一个更具成本效益的选择。需要注意的是，只有在多个患者之间共享工程化的异体NK细胞产品时，才能实现这样的成本节省。此外，生产异体T细胞的努力也在进行中，也可能有助于克服自体T细胞工程化过程中遇到的问题。 CAR-NK疗法可能在实体瘤治疗中具有潜力。CAR-T疗法在实体瘤中产生了令人失望的治疗结果，原因是诸如肿瘤异质性、免疫抑制性肿瘤微环境（TME）、不足的交通和渗透以及毒性等障碍。CAR-NK细胞已在多种实体瘤中进行了研究，如胶质母细胞瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌和胰腺癌，并且提出NK细胞的天然属性可能对治疗实体癌有益。与稳定过表达B细胞抗原的淋巴瘤相比，实体瘤通常具有可变的抗原表面表达水平和肿瘤内及原发与转移组织之间的异质性，使得用单一CAR目标成功治疗变得困难。除了任何CAR修饰外，NK细胞还有潜力通过多个激活和抑制受体识别异质性肿瘤细胞，尽管HLA-I分子的表达减少或缺失。激活信号的存在，如NKG2D，允许NK细胞直接对缺乏特定CAR抗原并可能被CAR-T细胞遗漏的转化细胞发挥其细胞毒性，这在异质性实体瘤环境中很常见。这是NK细胞相对于CAR-T细胞的一个明显优势，后者只对表达CAR抗原的细胞活跃，并允许NK细胞针对更广泛的癌细胞群体。实际上，即使没有CAR抗原的添加，未修饰的NK细胞已被用于针对癌细胞，并已在临床试验中显示出其有效性的早期迹象。此外，除了它们对癌细胞的直接细胞毒性效应外，NK细胞对于招募常规1型树突状细胞（cDC1）和随后的CD8+ T细胞也很重要，这将促进癌症免疫周期的激活，有潜力克服免疫抑制性TME。 3.CAR-NK 疗法的发展现状 目前市场上还没有获批的基于 NK 细胞的产品，但自 2016 年以来，研究 NK 细胞疗法的临床试验数量激增，截至 2023 年 5 月，已有近 60 项试验启动。该领域仍处于新兴阶段，大多数试验处于 I 期或 II 期，并且仍在进行中，因此结果尚未完全报告。然而，早期数据令人鼓舞，表明 CAR-NK 细胞疗法是安全的，并有潜力成为癌症的有效治疗方法，尽管尚未报告显著的临床效果。虽然针对多种抗原和恶性肿瘤，但相当数量的 CAR-NK 试验集中在针对 CD19 的血液癌症，这是 CAR-T 疗法成功的目标之一。一个针对 CD19 的 CAR-NK 细胞的例子是，一项 I/II 期临床试验，研究 CD19 靶向 CAR-NK 细胞在复发或难治性 CD19+ B 淋巴样恶性肿瘤患者中的安全性和有效性，包括急性淋巴细胞性白血病（ALL）、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）和非霍奇金淋巴瘤（NCT03056339）。来源于脐带血的 HLA 不匹配 NK 细胞与 K562 饲养细胞共培养，并与 IL-2 一起在第 6 天通过逆转录病毒载体转导，表达抗 CD19 CAR、IL-15 以增强 CAR-NK 细胞在体内的扩增和持久性，以及诱导性 Cas9 作为安全开关，在不可接受的毒性效应情况下触发 CAR-NK 细胞的凋亡。扩增后，CAR-NK 细胞在第 15 天收获用于新鲜输注，并给与 37 名复发或难治性 CD19+ 癌症患者，包括非霍奇金淋巴瘤和 CLL。临床对疗法的反应基于 2018 年慢性淋巴细胞性白血病国际研讨会（iwCLL）的标准和 2014 年非霍奇金淋巴瘤的卢加诺分类。1 年总生存率为 68%，无进展生存率报告为 32%。重要的是，没有发生显著毒性，包括 CRS、神经毒性或 GVHD，炎症细胞因子水平也没有增加，包括 IL-6。这一有希望的临床结果和安全概况突出了 CAR-NK 疗法作为异体疗法的潜力，可以开发成“现成”产品。CAR-NK 细胞疗法治疗实体瘤的潜力推动了这一领域的研究，目前正在进行的几项临床试验涉及胶质母细胞瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌和胰腺癌。这些研究中的许多还处于非常早期阶段，仍在招募患者，因此结果尚未完全报告。最近，Burger 等人发表了第一项探索胶质母细胞瘤患者中 CAR-NK 细胞疗法的临床试验结果；一项 I 期试验，研究在复发手术期间颅内注射针对人表皮生长因子受体 2（HER2）的 CAR-NK 细胞在 9 名复发 HER2+ 胶质母细胞瘤患者中的疗效（NCT03383978）。这项研究调查了慢病毒转导的 NK-92 细胞表达 CAR，包括 HER2 特异性单链抗体、CD8α 铰链区和 CD28 及 CD3ζ 信号域。在手术期间将 CAR-NK 细胞注入手术腔边缘后，五名患者的病情稳定，持续了 7 至 37 周。四名患者病情进展，两名患者在注射部位出现假性进展，提示治疗诱导的免疫反应。对于所有患者，中位无进展生存期为 7 周，中位总生存期为 31 周。此外，没有剂量限制毒性，也没有患者发展为 CRS 或免疫效应细胞相关神经毒性综合征。这项研究表明 CAR-NK 细胞治疗胶质母细胞瘤的可行性和安全性。尽管这是一项非常侵入性的研究，需要在手术期间注射 CAR-NK 细胞，但需要进一步研究以评估 CAR-NK 细胞通过静脉输注靶向和渗透实体瘤的能力。希望这些有希望的结果也能在其他实体瘤类型中复制，早期阶段的临床试验正在进行中。 4.CAR-NK 生产考虑因素 尽管安全性和治疗结果令人鼓舞，但 CAR-NK 疗法仍处于起步阶段，在它们被批准用于临床之前还有很多工作要做。如果需要实现 CAR-NK 疗法的潜力，需要解决的一些考虑因素包括 NK 细胞的来源、CAR 结构设计以及 NK 细胞的遗传修饰方法。 4.1.异体 NK 细胞来源 异体 NK 细胞可从多种来源获得，包括外周血（PB）、脐带血（CB）、诱导多能干细胞（iPSCs）和永生化细胞系。这些来源在扩增和遗传修饰方面都有其独特的考虑因素，目前都在临床研究中。 从外周血（PB）和脐带血（CB）衍生的 NK 细胞 从 PB 或 CB 来源的 NK 细胞是获取 CAR 疗法 NK 细胞的主要方法，广泛用于 NK 细胞应用。然而，细胞增殖能力可能较低，细胞存活时间短。大约 85-95% 的 PB NK 细胞是 CD56dimCD16high，具有高度的细胞毒性，但与其产生细胞因子的 CD56bright 对应物（占 PB NK 的 5-15%）相比，增殖能力较低。相比之下，由于常规储存，CB 衍生的 NK 细胞可能更容易获得，并且比 PB NK 细胞更具增殖性，允许在体外轻松扩增。然而，CB NK 细胞在表型和功能上不成熟，可能不如其他来源的 NK 细胞具有细胞毒性。从 PB 或 CB 分离 NK 细胞后，需要扩增以创建异体剂量，由于治疗剂量所需的 NK 细胞数量大，这已被证明是具有挑战性的。扩增协议可分为基于饲养细胞的或无饲养细胞的系统。与饲养细胞（例如 Epstein-Barr 病毒转化的淋巴母细胞系（EBV-LCL））共培养，这些细胞向 NK 细胞呈现配体，刺激 NK 细胞的激活和扩增，相对快速地扩增到大量（几周内）。然而，使用饲养细胞与安全和监管问题相关，包括最终 NK 细胞产品中残留活性饲养细胞的潜力。因此，已开发了使用细胞因子和抗体刺激 NK 细胞的无饲养细胞扩增方法。包括 IL-2 和 IL-15 在内的细胞因子是强大的 NK 细胞刺激剂，但包括 IL-15、IL-21、IL-12、IL-18 和 IL-27 在内的一系列细胞因子组合已显示出扩增 NK 细胞的前景。虽然无饲养细胞系统避免了与饲养细胞相关的安全问题，但产生的 NK 细胞产量较低。将饲养细胞遗传修饰以表达刺激细胞因子的组合已产生高度细胞毒性和增殖性的 NK 细胞。例如，K562 饲养细胞遗传修饰以表达膜结合 IL-15 和 41BB 配体（K562mbIL12-41BBL）在培养 10 天内导致大量扩增 PB NK 细胞在透气静态细胞培养袋（G-REX）中。另一个可能影响 NK 细胞效力的因素是冷冻保存。从 PB 或 CB 来源的 NK 细胞可能在扩增前或在“现成”产品的情况下需要冷冻保存，这可能对 NK 细胞的增殖和细胞毒性功能产生不利影响。潜在的解决方案包括准备额外的细胞以弥补冷冻保存后的损失，或在解冻后立即用 IL-2 等细胞因子刺激，或用 IL-15 和 IL-18 预处理以提高冷冻保存后的活性。此外，在非病毒遗传工程方法的背景下，与 iPSCs 和细胞系相比，PB 和 CB NK 细胞仍然难以操纵。与 NK 细胞的培养和扩增相关的因素可能影响转染率，包括 NK 细胞的激活状态、扩增期间的转染时机、扩增方法（饲养或无饲养方法）和冷冻保存。病毒转导率在体外扩增（激活）的 NK 细胞中得到增强，而在静止的原代 NK 细胞中观察到较低的转导。大规模扩增 NK 细胞的标准协议需要在病毒转导前的初始扩增，然后是第二阶段的扩增。这种顺序的原代扩增、遗传编辑和次级扩增协议也适用于电穿孔，基于饲养细胞或无饲养系统的扩增方法和时机也可能影响转染率。饲养细胞可能通过诱导细胞分裂增强遗传编辑，饲养刺激可能支持 NK 细胞在体外操纵后的恢复。例如，Pomeroy 等人观察到在与 K562-mbIL-21-41BB 饲养细胞共培养的 PB NK 细胞电穿孔后第 4 天 TcBuster 的转位最高。根据协议阶段调整饲养细胞与 NK 细胞的比例（电穿孔前 2:1 饲养：NK，电穿孔后 48 小时 5:1 或所有随后扩增的 1:1）。同样，Gurney 等人使用 EBV-LCL（10:1 饲养：NK 比例）在 IL-2 和 IL-21 存在下激活 NK 细胞。NK 细胞在第 4 天电穿孔并在 IL-15 存在下休息 48 小时，然后重新刺激饲养细胞。进一步扩增进行到第 25 天，观察到不同捐赠者之间细胞扩增的变化。这突出了遗传工程和扩增 NK 细胞所需的优化的复杂性，并且一系列因素可能影响转导/转染率，尚未建立标准协议。需要进一步的研究来阐明最佳条件，并且可能需要根据基因传递方法定制条件。 iPSC 衍生的 NK 细胞 作为解决原始 PB 和 CB 衍生 NK 细胞问题的替代方案，iPSC 提供了无限的资源来生产同质 NK 细胞，并且可以在大规模上进行遗传修饰和扩增。从单一 iPSC 系生成的 iPSC 衍生 CAR-NK 细胞，然后进行分化和扩增，成为通用的细胞产品，有潜力成为“现成”疗法。2021年12月，Fate Therapeutics 的新闻稿详细介绍了一项 I 期研究的中期临床数据，该研究调查了表达 CD19 的“现成” iPSC 衍生 CAR-NK 细胞（称为 FT596），用于治疗复发/难治性 B 细胞淋巴瘤（NCT04245722）。FT596 iPSC CAR-NK 细胞被设计表达高亲和力不可切割的 CD16 变体，以增强 ADCC；一种膜结合 IL-15/IL-15R 融合蛋白，以支持体内持久性；以及针对 NK 细胞优化的抗 CD19 CAR，用于直接肿瘤靶向。据报道，接受第二个 FT596 周期治疗的 11 名患者中有 10 名持续反应，其中三名患者在≥6 个月的随访中持续完全反应。此外，FT596 治疗方案耐受性良好，没有剂量限制毒性，如神经毒性或 GVHD，尽管在 FT596 单剂量递增队列中有两例低级别不良事件的 CRS 报告，这些事件在未经重症监护治疗的情况下得到解决。这些早期数据突出了 iPSC CAR-NK 疗法的潜力，但在这种疗法在临床上更大规模推广之前，需要完成进一步的研究和优化。iPSC NK 细胞的一个问题是需要高度专业化的培养条件，其中 iPSC 被分化为 CD34+ 造血祖细胞，然后进一步分化为 NK 细胞。从 iPSC 生产 NK 细胞的成熟协议可能需要 4-5 个月，尽管最近开发了一种新方法，将处理时间缩短到大约 2 个月。控制 iPSC 的分化是一个劳动密集型的制造过程，需要遗传工程和细胞培养专业知识，这对于大规模生产财务上可行且能够被更广泛患者群体接受的“现成”产品可能是有问题的。此外，存在对 iPSC 遗传突变风险的主要关注，特别是当需要长时间的培养时。此外，还存在未分化 iPSC 潜在的肿瘤形成风险。因此，需要开发稳健的质量测试对 iPSC 衍生的细胞进行筛选，包括筛选在培养过程中可能发生的任何遗传改变。 NK 细胞系 迄今为止，已有 10 个永生化模型 NK 细胞系，包括 NK-92、KHYG-1、NKL 和 YT，它们是从 NK/T 淋巴瘤患者中建立的，并用于 CAR 疗法的临床前开发。NK 细胞系对恶性细胞具有高度的细胞毒性，并且比原始 PB 或 CB 来源的 NK 细胞更容易进行遗传修饰和扩增。尽管需要注意的是，与其他类型的细胞系相比，NK 细胞系更难培养，因为它们对培养条件的变化非常敏感，通常需要添加细胞因子 IL-2 或 IL-15 来支持增殖。由于 NK 细胞系的恶性特性，因此在转移给患者之前需要进行辐射处理，这可能对输注的 NK 细胞的存活和细胞毒性效应产生不利影响。尽管如此，NK-92 细胞已获得 FDA 批准用于临床使用，到 2021 年，它们是临床试验中最常用的工程化 NK 疗法来源（占试验的 43%），其次是 PB NK（21%）、iPSC（17%）和 CB NK（13%）。NK-92 细胞系源自 1994 年一名 50 岁男性非霍奇金淋巴瘤患者，由于表达 CD56 和许多主要 NK 激活受体，包括 NKp30、NKp46、2B4、NKG2D 和 CD28，被认为是类似 NK 的细胞系。相反，NK-92 细胞几乎缺乏所有的 KIR 受体，并且表达很少的抑制性受体（NKGA/B、低水平的 KIR2DL4、ILT-2），并且不表达负责 ADCC 的 CD16 受体。NK-92 细胞的强细胞毒性可以归因于这种受体表达谱，当激活时，它触发穿孔素-颗粒酶细胞毒性途径，以及由 FasL、TRAIL、肿瘤坏死因子样弱诱导凋亡因子（TWEAK）和 TNF-α 引导的死亡受体细胞毒性途径。为了克服 NK-92 细胞的局限性并朝着开发“现成” CAR-NK 细胞的方向迈进，已经开发了几个衍生细胞系。NK-92MI 被设计为产生 IL-2，从而不需要补充 IL-2。首个人体临床试验（NCT02944162）中，NK-92MI 表达 CD33 CAR 用于治疗复发和难治性急性髓系白血病（AML）患者，证明了这些细胞的临床安全谱。NK-92MI 细胞被慢病毒转导 CAR CD33.CD28.41BB.CD3z 构建体，扩增并在输注前共辐射（10 Gy）。在每个患者输注高达 5×10^9 个细胞后，未观察到显著的不良效应，尽管一名患者经历了 I 级 CRS。接受治疗的三名患者中，一名患者对治疗没有反应，而另外两名患者在 1 个月和 4 个月后复发。尽管这是一项小规模研究，患者数量有限，但它有助于证明 CAR-MI 细胞的积极安全谱，但治疗效果并不令人印象深刻。 NK-92细胞系的进一步优化产生了高亲和力NK-92（haNKs），这些细胞表达CD16受体，增加了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性。目标亲和力NK-92（taNK）经过改造，能够针对特定的肿瘤细胞配体，此外，t-haNKs结合了所有这些特性，表达高亲和力CD16，分泌IL-2，并识别特定的肿瘤配体，如PD-L1。在II期QUILT 88试验（NCT04390399）之后，t-haNKs治疗典型难以治疗的胰腺癌的潜力得到了突出，该试验调查了ImmunityBio的Nant癌症疫苗，包括PD-L1靶向t-haNK细胞与IL-15受体激动剂Anktiva（N-803）、阿霉素、白蛋白修饰剂以及低剂量化疗在胰腺癌治疗中的组合。在联合治疗后，第三、第四和第五线患者的总生存期为5.8个月，几乎是历史生存期3个月的两倍，严重副作用不常见，为8%。随着许多关于CAR表达NK-92细胞的试验正在进行，调查使用包括CD19、MUC-1、HER2、ROBO1和PD-L1在内的一系列癌症靶标治疗血液和实体肿瘤，这些早期积极的结果可能预示着利用NK-92细胞的CAR-NK疗法的未来潜力。 KHYG-1细胞系已被证明比NK-92细胞具有更强的细胞毒性。这表明这个细胞系也可以作为“现成的”CAR-NK疗法的治疗应用，如Stikvoort等人的概念验证研究中所报告的。KHYG-1细胞通过逆转录病毒转导了含有CD28共刺激域的CD38-CAR，并产生了针对CD38high多发性骨髓瘤（MM）细胞系（UM9和THP-1）和来自患者的原发性MM细胞的有效CD38依赖性细胞毒性。此外，CD38-CAR KHYG-1细胞显著减缓了UM9肿瘤在具有人骨髓样生态位的RAG2–/–γc–/–小鼠异种移植模型中的生长。植入了表达荧光素酶的UM9 MM肿瘤的RAG2–/–γc–/–小鼠接受了多次静脉注射CD38-CAR KHYG-1细胞的治疗，治疗后20天，与未经治疗的对照组的24倍增长相比，CD38-CAR KHYG-1治疗小鼠的生物发光仅增加了四倍。这项研究突出了KHYG-1细胞被开发成类似于NK-92细胞的CAR-NK细胞的潜力，但需要进一步的研究来评估这在人类中的潜力，因为小鼠模型中的结果并不总是能够转化为人类。 从恶性来源衍生的NK细胞系在临床应用前需要进行辐射，这可能会影响其在体内的增殖和持久性。例如，NK-92细胞在体内的寿命很短，通常在初次输注后两天，这在减少副作用方面可能是有利的，与可以循环数月或数年的CAR-T疗法相比。然而，这种短暂的寿命可能导致较差的治疗结果和多次治疗的需求。已经对NK-92细胞进行了工程改造，以表达IL-2，增强体内扩增，但需要更复杂的工程来对抗TME中的NK耗竭，特别是对于实体肿瘤的治疗。KHYG-1细胞强烈表达抑制性受体NKG2A，当与MM细胞共培养时，发现其表达高水平的PD-1。这可能是CAR-NK疗法发展的一个主要障碍，需要在这些疗法成功之前加以解决。 4.2.NK细胞的CAR构建设计 最初的CAR-NK研究采用了旨在模仿T细胞受体的CAR-T骨干。然而，NK细胞毒性是由一组不同的激活和抑制受体调节的，这些受体可以并入CAR设计中，以激活天然NK受体并利用NK功能。CAR-NK细胞可以通过表达包含NK特异性跨膜信号域以及共刺激受体（例如，NKG2D、DNAM-1、2B4、CD28或4-1BB）的抗原特异性CAR分子来工程化，以优化NK细胞效应功能。这些设计旨在增强NK细胞在识别肿瘤抗原时的激活，并提高CAR-NK细胞的持久性、细胞毒性和细胞因子产生能力（图4）。 图4. 比较CAR-T和CAR-NK疗法中CAR构建设计元素的示意图。最初研究CAR-NK细胞时使用的构建与第三代CAR-T疗法中使用的构建相同，这些构建旨在模仿T细胞受体。此后，已开发出针对NK细胞的特定CAR构建，以纳入NK跨膜信号域以及共刺激受体（例如，DAP10、2B4、CD28或4-1BB），以增强NK细胞的效应功能。激活受体NKG2D也被纳入NK特异性CAR构建中；尽管NKG2D不是经典的“CAR”因为它不是单链可变片段（scFv），但在文献中它们被称为CAR。此图使用BioRender.com创建。 Li等人筛选了几种为NK细胞活动优化的CAR构建，包括各种跨膜和共刺激域的组合。比较了表达针对间皮素的CAR的iPSC-NK细胞（称为CAR-iPSC-NK），该CAR包含NKG2D跨膜域、2B4共刺激域和CD3ζ信号域，与基于T细胞的CAR包含两个CD28域与4-1BB（CD137）和CD3ζ（称为T-CAR-NK）在荧光素酶表达的A1847卵巢癌异种移植模型中的活性。与T-CAR-NK治疗组相比，CAR-iPSC-NK在生物发光成像后导致肿瘤负担显著减少并改善了生存期。此外，在与表达CAR的原代T细胞进行比较后，CAR-iPSC-NK组在70天时的生存期提高到80%，而T-CAR组为20%。重要的是，T-CAR组表现出严重副作用的证据，包括显著的体重减轻（>50%，在第23天和第39天各有2个n），严重的内脏出血和缺血，脾脏肿大以及对包括肝脏、肺、肾脏和肠道在内的内部器官的病理性损害的证据。相比之下，CAR-iPSC-NK治疗组没有观察到这样的效果。 我们知道NKG2D是一个主要的激活受体，负责在识别肿瘤细胞上表达的“杀伤我”压力信号，即MICA、MICB和UL16结合蛋白（ULBP-1和ULBP-6）后，引发caspase介导的凋亡。利用NKG2D可以增强NK细胞的抗肿瘤细胞毒性。Xiao等人报告了一项小型临床试验，研究PBMC衍生的NK细胞表达NKG2D与DAP12共刺激域融合，通过腹腔内（i.p.）输注给三名转移性结直肠癌患者（NCT03415100）。作者报告说，在两名患者中，腹水生成减少，腹水中的肿瘤细胞显著减少，而在第三名患者中，通过超声观察到肝脏区域的肿瘤迅速退缩，并通过PET-CT扫描确认完全的代谢反应。所有三名患者均报告病情稳定，重要的是，没有观察到剂量限制性毒性或GVHD。尽管这项研究中使用的CAR构建只有一种细胞内域的第一代设计，但它为进一步开发携带NKG2D受体的下一代CAR构建铺平了道路。这强调了精心设计的NK特异性CAR构建的重要性，以最大化CAR-NK治疗效应并减少与CAR-T构建相比的副作用，仍有相当数量的NK受体、共刺激域和每种组合需要探索。 4.3.CAR-NK制造的遗传改造方法 对于大规模生产“现成的”CAR-NK产品，用于遗传工程NK细胞的方法是一个重要的考虑因素，这可能影响生产时间、成本和可扩展性。理想情况下，用于创建CAR的转染方法应该是高效的、可扩展的，且非免疫原性的。目前，大多数CAR疗法是使用病毒载体工程化的，与非病毒方法相比，病毒载体产生稳定的基因表达和更高的转导率。NK细胞极难转导，特别是原发性PB和CB NK细胞，即使使用通常非常有效地转导广泛细胞的病毒载体；由于高表达免疫受体，如模式识别受体（PRRs），这些受体在病毒转导后触发NK细胞的凋亡。因此，通常用于CAR-T生产的遗传编辑的病毒载体，如水泡性口炎病毒G蛋白（VSV-G）慢病毒，在NK细胞中的转导率降低（<10%转导效率）。在VSV-G的情况下，这据说是由于NK细胞上低密度脂蛋白受体的低表达，这是VSV-G细胞进入所需的。 狒狒包膜假型慢病毒载体（BaEV-LV），它结合钠依赖性中性氨基酸转运蛋白（ASCT1和ASCT2）进行细胞进入，已被报道在新鲜分离的人NK细胞中产生23%的增强转导，并至少持续21天的稳定转基因表达。对于体外遗传工程，慢病毒载体的稳定表达是一个重要考虑因素，因为细胞被工程化以永久表达转基因，然后扩增后再输注给患者。然而，病毒载体有显著的缺点，包括关于突变、毒性、免疫原性的安全问题；昂贵且耗时的生产，除此之外还有漫长的NK细胞扩增协议；以及有限的核酸载体能力，这在传递更大的第三代、第四代和第五代CAR构建时可能是有问题的。例如，用于慢病毒生产的第二代CAR构建可能在10 kbp左右，随着后续几代中添加更多组件，这个数字会增加到20 kbp。因此，需要开发更安全、更高效的非病毒遗传改造方法用于CAR-NK生产。 5.基因编辑工具用于CAR-NK细胞 遗传编辑工具的发展，如DNA转座子和规律成簇短回文重复序列（CRISPR）技术，提供了一种稳定的转基因表达的非病毒方法。转座子系统是一类具有从一个位置移动或“转座”到基因组内另一个位置能力的遗传元素，通过“剪切和粘贴”机制，使它们成为遗传工程的强大工具。最有希望用于基因治疗的转座子是源自睡美人（SB）和猪儿虫（PB）系统。转座子系统由两个组成部分构成，转座子包含感兴趣的基因，通常以质粒形式存在，以及相应的转座酶酶，可能以蛋白质或编码转座酶蛋白的mRNA形式存在。转座子由特定的DNA序列包围，称为反向末端重复序列（ITRs），被转座酶识别。一旦识别ITR，转座酶就会切出转座子，然后将其插入新的基因组位置。尽管转座子系统有稳定的基因传递潜力，但由于担心意外的基因组中断或插入性突变和免疫原性导致难以获得监管批准，还没有转座子系统进入临床。最近，为SB系统开发的迷你圈载体的生产改进，这些载体具有最小的表达盒，缺乏细菌质粒骨架，有助于克服与质粒DNA载体相关的变量转染效率和宿主细胞毒性问题，与mRNA转座酶配对使用，有助于将转座子推向临床。BioTechne的TcBuster转座子系统是一个例子，它专门为CAR-T和CAR-NK生产而开发。它由一个含有基因表达盒的纳米质粒组成，与编码转座酶酶的mRNA配对。TcBuster成功地向原代人PB NK和T细胞传递了CD19-CAR构建，也表达了EGFP，产生的CAR表达NK和T细胞产生的细胞因子（IFNγ、TNFα和CD107a脱颗粒标记）显著多于CAR阴性对照，并且有效地杀死了目标CD19表达的Raji细胞。截至2023年11月，clinicaltrials.gov上注册了七项使用转座子系统的CAR-T细胞的临床试验，表明这项技术有可能应用于CAR-NK生产。 CRISPR是一类重复的DNA序列，与CRISPR相关（Cas）基因协同作用。CRISPR技术包括三个主要组成部分：crispr-RNA，与目标基因互补；Cas核酸酶蛋白，这是一种由crispr-RNA引导到DNA上特定位置的酶，像分子剪刀一样切割DNA；tracer-RNA有助于处理和绑定crispr-RNA和Cas核酸酶。CRISPR技术已被用来增强与原代NK细胞相比免疫功能较弱的NK-92细胞系的细胞毒性。使用针对CD96和KLRC1（编码NKG2A）的Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物通过核糖体电穿孔成功敲除抑制性CD96和NKG2A受体，结果只有2.8%的编辑NK-92细胞表达这些受体，而未编辑的亲本细胞为92.5%。此外，作者敲入了一个荧光mCherry基因，并替换了一个沉默的启动子，重新激活内源性CD16和DNAM-1。由此产生的CRISPR工程化NK-92细胞与未编辑的NK-92细胞相比显示出显著增强的细胞毒性，并且可以通过CD16介导的ADCC（抗体依赖性细胞介导的细胞毒性）对抗包括MDA-MB-231和BT-474乳腺癌细胞在内的一系列癌细胞。这项研究突出了CRISPR在工程化中利用各种NK激活和抑制受体以获得治疗效益的潜力。 转座子和CRISPR技术也可以同时使用，结合强大的遗传编辑活动。实际上，转座子工程和CRISPR/Cas9基因组编辑的结合被用来产生在PB NK细胞中表达髓样相关抗原CLL-1的强大CAR-NK细胞。TcBuster转座子系统传递了CLL-1 CAR构建，而CRISPR/Cas9载体被用来敲除NK细胞细胞因子检查点细胞因子诱导的含有SH2的蛋白（CIS，CISH基因的产物）。在CLL-1 CAR-NK细胞中同时敲除CISH与DNAM-1的减少和CD69表达的增加，NKG2D、NKp30、NKG2A、PD-1和TIGIT表达的减少有关。对控制和CLL-1 CAR-NK细胞都观察到增强的原发性AML芽细胞毒性，表明这些技术有潜力增强细胞毒性和改变NK细胞表型。同样，这种CISH敲除方法已在人类iPSC衍生的NK细胞和CB衍生的NK细胞中使用；导致增强的体内持久性、代谢健康和抗肿瘤活性。这些研究作为非病毒遗传编辑潜力的例子，但是NK激活和抑制受体之间平衡的复杂性需要进一步研究，以优化和利用这种治疗。 同样重要的是要承认围绕基因编辑工具存在安全性和伦理问题，包括转座子和CRISPR技术的风险，即插入性突变的风险。转座子基因组整合可能会激活潜在的原癌基因或中断肿瘤抑制基因，这可能导致恶性转化。尽管到目前为止SB转座子系统已经显示出良好的安全档案，但一项使用PB工程供体衍生的CD19 CAR-T细胞的临床试验导致10名患者中有2名发展出源自CD19-CAR-T细胞的T细胞淋巴瘤。尽管这项技术具有潜力，但在向临床进展之前，需要进一步的研究以确保转座子系统的安全性。包括避免可能增加原癌基因激活风险的强病毒增强子、使用“安全港”位点和位点特异性DNA结合域以实现位点特异性转座等策略，是克服转座子问题的潜在解决方案。在CRISPR的情况下，“非目标”DNA切割可能会引入不需要的突变，并可能加剧逆转录转位。减少非目标效应的方法包括优化CRISPR-Cas9系统的不同组成部分，开发主要编辑器和RNA编辑。尽管如此，在2023年11月，英国药品和保健产品监管机构（MHRA）成为第一个批准CRISPR-Cas9基因编辑疗法Casgevy（exagomglogene autotemcel）用于治疗输血依赖性β-地中海贫血和镰状细胞病的机构。这一里程碑式的批准在12月由FDA对Casgevy和Lyfgenia（lovotibeglogene autotemcel）以及欧洲药品管理局（EMA）对Casgevy的批准跟进。尽管接受Casgevy和Lyfgenia治疗的患者仍在进行这些治疗的安全性和有效性的长期评估，但这一批准无疑将为CRISPR基因组编辑技术的进一步使用和批准打开大门。 图5. 非病毒基因工程化“现成”CAR-NK细胞需要高效转染和CAR转基因的稳定表达。 1.引入编码DNA和/或mRNA中的CAR结构的CAR构建，或使用CRISPR Cas9或DNA转座子技术如PiggyBac和Sleeping Beauty进行基因编辑，以实现稳定的基因表达。2. 编码CAR构建的核酸可以通过多种非病毒递送策略传递给NK细胞，包括电穿孔、脂质纳米颗粒、细胞穿透肽或多功能纳米颗粒。3. 转染后，表达CAR构建的NK细胞在体外扩增，以生产可用于治疗多个患者的“现成”CAR-NK产品。 6.向NK细胞的非病毒基因传递 尽管非病毒基因组编辑方法具有巨大的潜力，但一个主要障碍是细胞内传递的方法。总的来说，转座子和CRISPR技术由核酸组成，无论是DNA还是RNA形式，因此需要一种细胞进入的方法。一般来说，最常用的非病毒传递方法通过物理电穿孔裸核酸，或涉及与脂质体、阳离子聚合物、蛋白质或细胞穿透肽（CPPs）的复合物的化学方法，这些复合物包装核酸并促进细胞内传递，在图5中总结。尽管在其他细胞类型中取得了成功，但与病毒转导相比，NK细胞更难转染，非病毒转染率令人失望。对于体外基因传递，基因传递的主要障碍是细胞膜、内体陷困，在DNA的情况下，是进入细胞核，为了成功的基因传递，理想的传递载体必须克服这些障碍，同时无毒。电穿孔（包括核糖体电穿孔）是用于NK细胞非病毒传递的最广泛使用的方法，转染效率高达90%，但由于对细胞施加的强电场可能导致问题，可能会增加制造时间表和成本。在电穿孔传递质粒编码报告基因绿色荧光蛋白（GFP）时，原代NK细胞的细胞存活率报告低至2%，尽管通过仔细优化提高到50%，一些电穿孔器制造商引用的存活率为80-90%。尽管如此，这些方法需要仔细优化，使用细胞因子刺激或与饲养细胞一起扩增以获得足够的转染效率和存活率。少数研究使用非病毒传递系统作为NK细胞基因传递的方法（在表3中总结），取得了不同程度的成功。 6.1.基于脂质的NK细胞递送 脂质在脂质体和脂质纳米颗粒（LNP）中被用来递送核酸，用于多种应用，包括最重要的，使用脂质纳米颗粒递送mRNA新冠疫苗，由BioNTech和Moderna两家公司开发。这些基于LNP的疫苗的批准代表了非病毒递送系统领域的一个重大突破，并为后续产品铺平了道路。脂质是含有极性头基团与疏水尾部相连的两亲分子，具有一系列属性的脂质已被用于基因递送。阳离子脂质，如1,2-二-O-十八烷基-3-三甲基铵丙烷（DOTMA）及其衍生物1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）允许包装遗传货物并通过静电相互作用和膜融合进行细胞内递送。在生理pH值下呈中性的可电离脂质，在内体的低pH值下变得质子化，促进内体释放货物。其他脂质，如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂胆碱（DSPC）和胆固醇类似物已被用来帮助稳定LNP结构。LNPs可能通过各种内吞途径被内化，如巨胞饮作用、网格蛋白介导的和洞穴蛋白介导的内吞作用，这在不同细胞类型之间有所不同。内化后，LNPs通常进入内体隔室，需要一种逃逸机制来释放货物。因此，通常使用具有不同属性的脂质组合来优化LNP功能。Nakamura等人开发了一种多功能信封型纳米装置（MEND），其中包含一种可电离-阳离子脂质，以促进内体逃逸，称为YSK12-C4脂质（YSK12-MEND），用于递送siRNA到免疫细胞系。作者证明了YSK12-MEND在一系列人类免疫细胞中递送编码GAPDH的siRNA的转染能力。在NK-92细胞中的基因沉默为75%，远高于商业上可用的Lipofectamine RNAiMAX的19%沉默。然而，YSK12-MEND LNP在NK-92细胞中引起了细胞毒性（在30 nM siRNA剂量下60%的细胞存活率）。该团队最近生产了由pH敏感阳离子脂质CL1H6组成的LNP，用于siRNA递送到NK细胞系。CL1H6具有与YSK12-MEND相同的亲水头基团和油酸结构作为疏水尾部，用氨基取代了甲基基团，这促进了NK-92细胞通过膜融合的细胞摄取和内体逃逸。CL1H6与LNP中的胆固醇的比例被优化为25/75，以获得更好的基因沉默效果（在递送针对GAPDH的siRNA后，GAPDH的基因沉默为90%），同时保持NK-92细胞中的良好细胞存活率（90%存活率）。对于KHYG-1细胞也报告了类似的结果。作者将这种改善的细胞存活率归因于内体逃逸期间的膜融合活性。YSK12-MEND以高度的膜融合从内体逃逸，而CL1H6-LNP仅以轻微的膜融合从内体逃逸。同样，Doukas等人最近优化了LNP配方，用于mRNA递送到NK细胞，使用可电离脂质。优化的LNP由可电离的“Lipid 5”，DSPC，β-谷甾醇和1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2K）组成，在KHYG-1细胞系中产生了>80%的转染效率，在CB衍生的NK细胞中为75%，每种细胞类型的细胞存活率都>95%。Wilk等人提出了使用电荷改变可释放转运体（CARTs）将基因递送到NK细胞。CARTs是由≥1个脂质块和为mRNA递送设计的电荷改变块组成的多块寡聚体。CARTs最初是阳离子，可以与阴离子核酸复合，但在生理条件下（pH7.4）生物降解为中性二酮哌嗪小分子，促进阴离子货物的释放。在用CART递送31 ng mRNA编码GFP到PB NK细胞后，32%的细胞表达了GFP，细胞存活率为78%，这明显优于Lipofectamine 2000（0% GFP+细胞，90%存活率）和电穿孔（2% GFP+细胞，40%存活率）（注：当通过电穿孔递送的mRNA质量增加到10 μg时，转染效率提高到28% GFP+细胞，存活率为40%）。此外，CART成功产生了CD19-CAR-NK细胞，这些细胞对CD19+ Nalm6细胞具有强大的细胞毒性，死亡目标细胞比例为10%，而原始NK细胞为5%。这表明CARTs作为一种非病毒系统用于CAR-NK生成的潜力，但瞬时mRNA递送可能对体内CAR-NK细胞的扩增和效力构成问题。需要进一步的研究来扩大这种方法用于更大的体内研究，评估体内CART产生的CAR-NK细胞的寿命，并与病毒转导的CAR-NK细胞的效力进行比较。 6.2.多功能纳米颗粒用于NK细胞递送 Kim等人描述了一种由磁性Zn/Fe核、咖啡酸封顶以及表面涂覆阳离子多巴胺聚合物组成的多功能纳米颗粒（MFNPs），这些纳米颗粒与阴离子核酸形成复合物，用于向NK-92MI细胞递送CAR。磁性核使NK细胞的磁共振成像成为可能，并促进体内细胞追踪。通过MF-NPs向NK-92MI细胞递送编码表皮生长因子受体（EGFR）CAR结构的质粒，转染效率为60%，细胞存活率为98%。将EGFR-CAR-NK-92MI细胞通过尾静脉注射到无NK细胞的NOG小鼠（NOD/Shi-scid/IL2Rγnull）体内，这些小鼠携带MDA-MB-231异种移植物，与接受原始NK-92MI和PBS对照处理的小鼠相比，CAR-NK-92MI组的肿瘤生长明显减少（与原始NK-92MI和PBS对照相比，肿瘤大小分别减少了两倍和3.5倍）。进一步的工作将需要评估基于磁性NPs的生物相容性和降解特性，并确保MF-NP编辑的CAR-NK细胞在临床应用中有足够的扩增和持久性。 6.3.基于肽的NK细胞递送 基于肽的载体因生物相容性、灵活性和低毒性等优势而受到基因递送的关注。从病毒中衍生或设计模仿病毒载体序列的肽具有广泛的特定功能，使基因递送成为可能并得到增强，通常根据功能分类；DNA凝聚肽、细胞穿透肽（CPPs）、内体溶肽和核定位序列（NLS）。CPPs是短肽（5-30个氨基酸），它们有效地携带大分子货物穿过细胞膜，无需受体或其他载体。开发了一种肽辅助基因组编辑（PAGE）CRISPR-Cas系统，该系统利用CPP和内体逃逸肽在髓系细胞、原代T细胞和NK-92细胞中进行基因组编辑。设计了一种细胞穿透Cas9，由N端融合HIV TAT（GRKKRRQRRR）和4×Myc NLS，C端融合2×SV40 NLS和GFP。然后，这种细胞穿透Cas9与一个“辅助肽”共递送；融合肽（称为TAT-HA2（RRRQRRKKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG））由源自HIV-1的CPP TAT肽和流感A病毒血凝素（HA2）蛋白的内体逃逸肽组成。TAT-HA2辅助肽在mCherry+ EL4 T淋巴母细胞报告细胞中增强了Cas9编辑，效率从无法检测提高到85%，细胞存活率超过80%。此外，PAGE系统在NK-92细胞系中实现了78%的基因编辑，突出了CPPs在NK细胞基因编辑中的潜力。然而，这是一种复杂的工程策略，如果要递送CAR结构，将需要更多的开发。 7.NK细胞基因递送的特定挑战 目前非病毒转染NK细胞的困难因对这些高度专业化细胞中特定生物学障碍的理解不足而更加复杂，设计针对NK细胞治疗的非病毒递送系统时必须考虑NK细胞特有的元素。细胞摄取是基因递送的第一个生物学障碍，而具有专门激活和抑制受体的NK细胞比大多数细胞类型更为复杂。在细胞内摄取之后，内体逃逸是成功基因递送的第一个障碍。考虑NK细胞的特殊溶解机制很重要，以避免遗传货物在内体/溶酶体隔室中降解。此外，NK细胞通过模式识别受体（PRR）信号传导的先天免疫活性，促进了NK细胞的抗病毒活性，被认为是NK细胞对病毒载体的抵抗力，非病毒载体必须设计得避免同样的命运。克服这些NK特定的基因递送障碍对于非病毒基因递送系统在NK细胞治疗中取得成功至关重要。 7.1.NK细胞的细胞内递送 内吞作用被认为是大多数非病毒基因递送系统的主要摄取途径，可以分为网格蛋白介导、洞穴蛋白介导或微囊泡形成。摄取可能受到递送系统的性质和细胞类型等因素影响。在NK细胞的情况下，激活和抑制受体的平衡由受体的内吞作用和再循环到细胞表面来调节。例如，抑制性受体CD94/NKG2在细胞表面和细胞内隔室之间不断循环，这一过程类似于巨胞饮作用。流感病毒通过网格蛋白和洞穴蛋白依赖性内吞作用直接感染PBMC-NK细胞。感染是通过病毒HA蛋白与NK细胞表面存在的α-2,3和/或α-2,6连接的末端唾液酸的结合而发生的，特别是在激活性受体NKp46上。NKp46与病毒感染细胞表面的HA的相互作用是NK细胞识别和杀死感染靶细胞的已知机制，但看来病毒本身也可以通过与NKp46的相互作用感染NK细胞，这导致感染的NK细胞凋亡增加，NK细胞毒性活性降低。这些关于病毒感染方法的知识可能被利用来设计非病毒递送系统，就目标或避免特定摄取途径以增强基因递送而言，而不会引起不希望的激活导致NK细胞内表型变化。 阳离子递送系统，特别是富含精氨酸的肽，已知会通过静电作用结合细胞膜外表面存在的阴离子物种（例如脂质头基、肝素硫酸蛋白聚糖（HSPGs）和细胞膜上的syndecans），启动细胞摄取。Letoha等人报告称，syndecans促进阳离子CPPs（例如，TAT）的摄取。该研究表明，syndecan-4特别结合并介导阳离子CPPs通过质膜进入K562红细胞白血病细胞，更高的syndecan-4水平与更高的转染效率相关。根据细胞分化的不同阶段和细胞类型，syndecans上存在的肝素硫酸链的数量和大小各不相同。因此，不同细胞表达的syndecans可能导致不同的转染结果。HSPGs和syndecans由NK细胞表达，并已报告与激活性NCRs（NKp30、NKp44和NKp46）和KIR2DL4（抑制性受体）相互作用并调节其功能。这些受体可以识别并结合HSPG，这些HSPG通常在靶细胞（例如癌细胞）中上调，但它们也可能与NK细胞表面的HSPG结合；通过掩盖与靶细胞的相互作用或可能影响NCRs的内吞作用、降解和再循环途径，影响NK受体的功能。如果递送系统结合HSPG或syndecans进行内吞作用，可能会触发不希望的NCRs激活；影响NK细胞的激活状态或触发凋亡。因此，需要仔细设计以获得最佳的转染效率，而不扰乱NK受体状态。 受体介导的内吞作用通常被用来增强基因递送系统的转染，而主动靶向策略可能有助于克服与HSPG相关内吞作用的问题。同样，从病毒载体中获取灵感，当确定适合受体介导的内吞作用的靶标时。例如，BaEV慢病毒转导是通过与新鲜分离的人类NK细胞中的ASCT1和ASCT2结合来介导的，这可能被非病毒递送系统所针对。 7.2.NK细胞的内体逃逸 非病毒递送系统被设计为通过“质子海绵”效应或对内体中低pH值的融合活性来促进内体逃逸。然而，内体隔室的确切pH值可能因细胞类型而异，细胞系和原代细胞之间存在差异，内体中的具体功能或货物内容也会影响。在设计基因递送系统方面，关于NK细胞内体pH的文献资料很少。我们可以比较其他免疫效应细胞，如T细胞和巨噬细胞，以了解免疫细胞内体的特性，但这不能代替对NK细胞的专门评估。内体酸化在人类Jurkat T细胞中被报道比常用的评估阳离子聚合物基因递送的HeLa人类细胞系慢且不如其稳健（在摄取后240分钟内从pH 6缓慢下降至pH 5.2），而HeLa细胞系在摄取后120分钟内pH值下降至5.0，原代T细胞显示出更高的内体pH（>pH 6）。也有报道称巨噬细胞的早期内体和循环内体具有中性pH，这促进了瞬时受体电位muclipin 2（TRPML2）的活性；TRPML2是位于溶酶体隔室的钙通透阳离子通道，参与质膜蛋白的循环。TRPML2也在CD57+ NKG2C+ NK细胞中表达，被推测涉及调节激活NK细胞中的趋化因子分泌。因此，可以推断NK细胞中的内体也可能在早期内体隔室中具有更高的pH（pH>6），但需要研究来确认这一点。考虑到NK细胞的细胞毒性主要通过含有穿孔素和颗粒酶的专门分泌溶酶体或溶解颗粒来执行，因此这种溶酶体机制的存在可能会影响转染后的内体运输和逃逸。如果NK细胞的内体pH接近中性，如T细胞和巨噬细胞一样，那么这可能对需要更低pH值来触发内体逃逸的递送系统构成问题，需要进一步调查以优化针对NK细胞的递送系统设计。 7.3.避免NK细胞中的模式识别受体（PRR）激活 在感染期间，NK细胞通过PRR检测病毒或细菌病原体相关分子模式（PAMPs）的存在，PRR是NK细胞介导的先天免疫反应的重要组成部分。NK细胞表达多种PRR，包括Toll样受体（TLR）1-10、RIG1、NOD2和MDA5，这些在激活时参与诱导细胞毒性。TLR3、7、8在内体中表达并检测双链RNA（TLR3）、单链RNA（TLR7和8）和CpG DNA（TLR9）。这种核酸感应有助于病毒检测和抗病毒免疫反应。这样的PRR被认为是NK对基于病毒的转导产生抵抗力的原因之一。实际上，抑制PRR活性可以增加NK细胞中VSV-G假型慢病毒载体的转导效率。作者用BX795，一种TBK1/IKKe复合体的抑制剂，该复合体作用于PRRs RIG-I、MDA5和TLR3的下游，预处理新鲜分离的PB NK细胞，结果使慢病毒转导效率增加了3.8倍。在NK-92细胞系中也观察到在BX795存在下转导显著增强。 因此，PRR的核酸感应是NK细胞基因递送的一个障碍。mRNA或DNA货物的递送可能会激活PRRs，触发抗病毒NK过程，导致转染NK细胞的存活率差。可能可以利用修饰的mRNA来避免NK细胞中的PRR识别。核苷替换已被证明在减少PRR检测和改善mRNA翻译方面具有显著意义。常见的修饰包括用类似核苷如假尿嘧啶（ψ）或N-1-甲基-假尿嘧啶（m1ψ）替换尿嘧啶，以及用5-甲基胞嘧啶替换胞嘧啶。在“基于脂质的NK细胞递送”一节中讨论的研究包括两个使用修饰mRNA递送到NK细胞的例子。Doukas等人用LNPs递送了5-甲氧基尿嘧啶（5moU）修饰的mRNA，而McKinlay等人递送了5-甲基胞嘧啶修饰的mRNA。两项研究都没有评论他们选择使用修饰mRNA的决定或选择特定修饰的原因。在mRNA疫苗领域，尤其是假尿嘧啶修饰的mRNA产生了更好的翻译，归因于减少了与RNA依赖蛋白激酶的结合。然而，需要进一步的研究来确定CAR递送到NK细胞的最佳核苷修饰。 如果要递送基于DNA的货物，例如在转座子系统中，那么应该考虑限制CpG含量。在CAR结构递送的背景下，这一点尤其重要，考虑到要递送的CAR构建物的较大尺寸。DNA迷你圈技术已被用于SB转座子系统，以帮助减小货物大小并提高转染效率。TcBuster系统使用了专门针对T和NK细胞CAR结构递送设计的“纳米质粒”技术。 8.结论和未来方向 总之，这篇综述详细分析了当前CAR-NK疗法和非病毒工程化NK细胞的状态，强调了CAR-NK作为一种有前景的癌症免疫治疗方法的潜力，以及实现这一潜力需要克服的挑战。CAR-NK疗法的使用仍处于早期阶段，但在多种癌症类型的前临床和早期临床试验中已显示出强大的抗肿瘤活性。增强的安全档案和更可扩展、成本效益更高的“现成”CAR-NK疗法的潜力将增加患者的可及性；改善患者的治疗结果和生活质量。需要开发针对NK细胞的高效非病毒工程策略，以改善CAR-NK疗法的制造过程，以支持对先进疗法日益增长的需求。到目前为止，理想的非病毒递送系统尚未开发出来，该系统能够高效地将CAR转基因递送到NK细胞中，而不会影响细胞的活性或受体状态；考虑到受体状态对NK细胞功能的重要性。有必要进一步研究新的递送系统和临床试验，以充分释放CAR-NK细胞的治疗潜力，并将这些发现转化为常规临床实践。 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疫苗企业正集体蛰伏，等待困境反转。 资深分析师：尧今 编审：苏叶 开始害怕，甚至恐慌的人越来越多。 杨力是其中一员，2023年失业后他开始看医药股，但因为不是科班出身，他在一个叫熊市狙击手的牛散那里获知，新人可以从CXO、药店、中药、疫苗这些容易理解的板块上手，并被告知：千万不要碰创新药。 杨力是个很乖、很爱学习，但运气差了一点的“韭菜”。一年多里，他看了很多研报，最终决定“抄底”CXO、中药和疫苗。结果，买的CXO暴跌，中药龙头稳一些基本没亏，疫苗是重仓但亏得也最狠。杨力的疫苗情节始于帮女朋友预约九价HPV疫苗，当时他排了一个多月。 故事讲完该到正文了，尽管你我或许皆杨力。 三季报结束了，投资者还在“半等国家发钱，半看基本面”的状态里犹豫仓位增减。结果最牛疫苗股智飞生物，却发出了一份大跌眼镜的成绩单——净利上市以来首度转亏。 紧随其后的“小弟”们，沃森生物、百克生物、万泰生物、金迪克也全线下跌，这使得疫苗赛道成为CXO之后，又一业绩集体暴雷的——舆论戏称“2024最大雷”。 疫苗股业绩整体爆雷背后，导火索是自上半年盛行的“疯狂价格战”，但面对内卷整个行业都没给出答案。投资人的共识是，必然会卷死一波，恐慌氛围一直存在。 然而，在这波颓势中，康泰生物却稍显例外。好的一点是，第三季度实现了营收增长。 即便如此，康泰生物所面临的形势也并不乐观，业绩层面反转不断，剧情稍显扑朔迷离。2022年首度转亏，2023年恢复增长，2024年上半年再度滑坡，如今又有恢复信心之势。落到资本市场来看，相较市值最高点近1800亿元，康泰生物也已大幅缩水至目前的200亿元左右，市值跌没了近1600亿，股价跌幅接近90%。 背后，固然有行业大背景原因，但也脱离不了企业本身沉疴，错失先机、战略激进、研发进展过慢……而当回到疫苗行业核心竞争力——技术和研发能力上来看，康泰生物似乎又有种厚积薄发之感。 目前，康泰生物实际经营状况究竟如何？作为市值仅为200余亿元的疫苗龙头企业之一，究竟该如何评估康泰生物的价值？带着问题，CM10医药研究中心将从行业稀缺值、财务健康度、业务健康度、综合建议等多个方面，来一一回答。 ▲康泰生物股价走势 危机与转机 评估一家企业发展，首先得清楚它位于产业链何种位置，竞争力几何。那么，在一众疫苗企业中，康泰生物究竟处于何种地位？ 要回答这一问题，仍需审视行业面整体情况。 在中国，《疫苗管理法》将疫苗管理工作提升至国家层级管理，从疫苗研发、生产、流通及接种等环节皆受到严格监管。 疫苗按国家政策可分为两类，一类疫苗是指政府免费向公民提供，公民应当依照政府的规定接种的疫苗如乙肝疫苗、百白破疫苗、脊髓灰质炎减毒活疫苗等；二类疫苗是指专家建议接种，由公民自费并且自愿受种的其他疫苗如Hib疫苗、水痘疫苗、肺炎疫苗等。 其中，康泰生物曾是四大二类疫苗上市公司之一，与智飞生物、沃森生物、长春高新“齐名”。 但你可能没想到，康泰生物成立时间甚至要比智飞生物、沃森生物、长春高新都早。官网显示，康泰生物成立于1992年；长春高新成立于1993年；沃森生物成立于2001年，智飞生物则更晚了些，直到2002年才成立。 然而，康泰生物的前期发展相较平平无奇，其上市时间也远落后于其余三者。长春高新早在1996年就登陆了深交所，智飞生物和沃森生物则同于2010年深交所挂牌上市。相比之下，康泰生物直到2017年才在深交所上市，成为华南地区首个上市的疫苗企业。而今，最新市值也低于前三者。 为何，康泰生物总是“慢”了一步？这背后，又发生了什么？ 这就得回到康泰生物企业发展本身来看。实际上，前十年，公开能查询到康泰生物的官方披露资料，相对较少。 康泰生物前身由深圳广信、香港广信和国原投资成立，主要目的就是承接美国默克转让的乙肝疫苗。公开资料显示，1986年，默克公司推出基因工程乙肝疫苗，1987年被卫生部引进。签订合同得到全套技术后，基因工程乙肝疫苗在北京（天坛生物）和深圳（康泰生物）两地生产。 由此，前十年，康泰生物靠乙肝疫苗起家，逐渐成为国内最大的乙肝疫苗生产企业。但问题也恰恰在此，那时康泰生物只有这款乙肝疫苗，这就导致了产品过于单一，再加上缺乏独有专利技术、设备老化等因素、康泰生物市场竞争力逐年降低。 情况所迫，这家老国企打算通过重组，扭转不利局面。 这就来到了康泰生物第二阶段。自2002年后，康泰生物经过一系列股权挪腾，逐渐褪去国有外衣。尤其是2008年战略重组收购北京民海，民海生物实控人杜伟民入局，将康泰生物收入囊中，形成“北民海，南康泰”的战略格局。由此，康泰生物股权挪腾大戏落幕。 此后的10余年发展，杜伟民堪称康泰灵魂人物，经营得风生水起。 最直观的体现就在于，打破对单一产品的依赖。2010年，在早年间引进基因工程乙肝疫苗技术基础之上，康泰生物实现技术创新，成功研制出全球首款60μg重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母），用于低、无应答人群，填补了市场空白，阻断乙肝病毒传播。之后，又紧接着进军麻风联合、四联苗等多联疫苗；并在2017 年公司在创业板上市后，快速推进23价肺炎疫苗、13 价肺炎疫苗、冻干人用狂犬病疫苗（人二倍体细胞）的研发。 一组数据可直观窥见变化。2018年，其四联苗收入已然超过昔日乙肝疫苗收入。根据2018年财报，康泰生物四联苗收入11.60 亿元，占疫苗产品总收入 57.60%，第二大品种乙肝疫苗收入5.17 亿元，占比 25.66%。 由此，康泰生物依赖单品、研发薄弱的过往，终于告一段落。 起了个大早，赶了晚集 不过，杜伟民接手后的几年，康泰生物发展并非一帆风顺，甚至几度经历“生死劫”。 一是2013年底，湖南、深圳等多地出现婴幼儿注射乙肝疫苗致死案件，多家疫苗企业牵涉其中，由于致死案件最多，康泰生物成为漩涡靶心。虽后续官方调查后，认为康泰生物等国产乙肝疫苗质量无问题，但仍一度未能全面打消民众顾虑。 二是，2018年，长生生物狂犬疫苗造假被曝光，由于董事长杜伟民此前曾在长生生物任职，再次牵扯到康泰生物。不过，最后有惊无险。 随着这一系列事件渐渐隐去，康泰生物靠着陆续推出的疫苗，尤其是搭上新冠疫苗概念后，开始走向了市值巅峰，2020年顺利突破千亿大关，成为一支大牛股。 彼时，康泰生物是国内最早启动新冠疫苗研发的企业之一。经查询，早在2020年疫情爆发不久，康泰生物就入场了，当年一口气押注了4种技术路线——自研灭活疫苗(Vero细胞)、重组VSV病毒载体疫苗、与苏州艾棣维欣合作开发DNA疫苗、引进阿斯利康的腺病毒疫苗。如今看来，颇有种“豪赌”之感。 然而，好景不长。 在争分夺秒的疫苗研发大战中，康泰生物妥妥上演了“起了个大早，赶了个晚集”戏码。直到2021年5月，康泰生物的新冠灭活疫苗才在国内获批紧急使用。彼时，全球范围内已有16款新冠疫苗获批上市或紧急使用。市场的蛋糕渐被瓜分，康泰生物所能分得的份额自然有限。 这位疫苗白马股业绩也开始走下坡路，一朝回到解放前。2022年净亏1.33亿元，交出了上市以来首份亏损的年报。那年，情况惨烈亦可从人均创利窥见，这一指标直接由2021年的超50万元转为2022年的负指标，也就是说人均还亏了6万多；研发费用也异常突出，直接飙升至8.02亿元，较前一年增长了一倍多。销售费用2022年同样近乎翻倍，达10.86亿元。 背后原因则直接指向了——费尽心力研发的新冠疫苗，最终未能带来预期回报。另由于2022年新冠疫苗销量下滑，导致库存量大幅上升，康泰生物不得不对此计提资产减值准备合计9.36亿元。从而，康泰生物也因此被外界质疑研发进展偏慢、策略稍显激进。 当然，这并非康泰生物一家面临的困境，尤其随着疫情形势的变化，曾经热火朝天的新冠疫苗企业们，不得不直面业绩变脸。 但归根结底，新冠疫苗的研发终究是“过客”，一切仍将回到对常规疫苗的钻研，康泰生物就是如此。 除了业绩上的困境，康泰生物还因实控人杜伟民的离婚事件而备受争议。2020年，杜伟民宣布离婚，并将其持有的约1.61亿股公司股份分割予前妻。此次离婚分割股份的市值高达235.54亿元，创下A股历史最高的“分手费”。这一事件受到不少诟病，更让不少投资者对其产生了“假离婚、真套现”的质疑。 再加上疫苗行业这两年，正经历一场前所未有的“内卷”风暴，价格战愈演愈烈，使得多家企业陷入业绩下滑的泥沼。 这一系列事件，使康泰生物股价大幅缩水。要说2020年8月最高逼近1800亿元，而今大幅缩水至200亿元左右，股价跌幅接近90%。 在经历2022年最低谷后，康泰生物逐渐从新冠产品资产减值的阴影中走出，2023年实现扭亏。然而，今年Q1由于市场竞争和降库存等因素影响，康泰生物又遭遇营利同比双降。 不过，把维度放至今年前三季度，些微可见好转态势，康泰生物第三季度实现营收8.16亿，同比增长11.21%，实现净利润1.86亿，环比增长66.94%。这兜兜转转的业绩变化，也让投资者持续揪心。 但最终，康泰生物能否维系态势，重回增长，还得回到潜力产品竞争力及接下来的放量情况而言。 周身皆刃，没一把利？ 在这种形势下，企业唯有通过创新、技术提升和国际化布局，才能在残酷的竞争洪流中杀出一条血路。 实际上，回到疫苗行业核心竞争力——技术和研发实力上来看，康泰生物算是名列前茅。 翻开该公司产品管线，不少重磅疫苗产品出自该公司。其中，自主研发的用于乙肝疫苗无应答特殊人群的“60µg 重组乙型肝炎疫苗 （酿酒酵母）”和“双载体 13 价肺炎球菌多糖结合疫苗”属全球首创；自主研发的无细胞百白破 b 型 流感嗜血杆菌联合疫苗（四联苗），是联合疫苗数量最多的国产疫苗；冻干人用狂犬病疫苗（人二倍体细胞）是国内首个获批的“四针法”人二倍体细胞狂犬病疫苗。 然而，光芒背后，是更为激烈的战场。 疫苗行业，大单品为王，逐渐成为不争事实，HPV便是典例。康泰生物倒是没有布局HPV疫苗领域，但是除此之外的全球十大畅销疫苗，几乎都有布局。其中，最受关注的两款已上市明星产品，分别为13 价肺炎球菌多糖结合疫苗和人二倍体细胞狂犬病疫苗。 ▲截图来自康泰生物财报 先看13价肺炎疫苗。 实际上，在全球疫苗市场中，在新冠疫苗问世之前，13价肺炎疫苗就稳坐“疫苗之王”的宝座，由辉瑞研发，自2010年获批上市以来，连续多年蝉联全球最畅销疫苗品种。2018年，其全球销售额接近60亿美元大关，使其成为了当年全球销售额前十的药品中唯一一款疫苗产品，彼时其销售额远超排名第二的9价HPV疫苗。 国内市场空间同样巨大。业内数据预计，随着渗透率的提升，2030年中国肺炎球菌疫苗市场将达到438亿元，其中13价肺炎疫苗市场份额将占59.8%。 目前，全球仅有三款13价肺炎疫苗上市。除了辉瑞，剩下两位均来自国产选手，一位则是康泰生物，旗下13价肺炎疫苗已于2021年9月获批，成为全球第三款、国产第二款获批的13价肺炎疫苗。 不过，它需要直面的不仅是辉瑞这位强劲对手，更需要面对沃森生物这位国产先行者。早在2019年12月，沃森生物的13价肺炎疫苗获批，成为全球第二个、中国第一个自主研发的13价肺炎疫苗。 显然，康泰生物要想实现“后来居上”，最直接的方式莫过于降价，抢下沉市场。其“低价”策略成效显著，每剂定价458元，远低于辉瑞的698元和沃森生物的598元。不过，接下来，康希诺和智飞生物亦即将加入13价肺炎疫苗的战斗中，届时该领域竞争或更为激烈，至于是否会步HPV疫苗后尘，还有待观察。 在肺炎疫苗的布局上，康泰生物还上市了一款23价肺炎疫苗。今年上半年，按照23价肺炎疫苗批签发批次来看，康泰生物占比34.38%，成都所占比31.25%，智飞生物旗下的智飞绿竹占比18.75%。但智飞生物在9月也打响了该产品的价格战。 康泰生物押注的另一款明星产品是——人二倍体狂苗。 弗若斯特沙利文预测到 2030 年，国内狂犬病疫苗市场规模将升至172亿元，其中人二倍体细胞狂犬病疫苗市场规模有望达到 101.8亿元。 2023年下半年，康泰生物冻干人用狂犬病疫苗（人二倍体细胞）获批了“5针法”和“2-1-1”（四针法）两种免疫程序，是国内首个获批的“四针法”冻干人用狂犬病疫苗（人二倍体细胞）。2024年4月，已实现上市销售。 这款产品的竞争格局则更为清晰了。在康泰生物的二倍体狂苗上市前，相关市场一直被康华生物垄断，长达十年之久。而今，康泰生物的人二倍体狂苗获批上市，则需挑战前者地位。如何从一位“霸榜者”手中抢占更多市场份额，仍需下不少功夫。而今，还难言具体放量情况，可拭目以待。 可喜的是，由于乙肝疫苗市场趋于成熟稳定，新生儿数量陷入低谷，2023年乙肝疫苗和四联苗的增长基本处于停滞或小幅增长态势。好在，虽然一个在卷价格，一个尚在抢地盘，但肺炎疫苗和人二倍体狂苗仍有望接替增长接力棒。 未来，康泰主要研发方向，朝着多联多价疫苗、成人疫苗及创新疫苗冲击，以建立更丰富的产品梯队。某种程度上，未来几年，凭借其产品线的梯度布局与多样化优势，康泰生物似乎正迎来一段可预期的、确定性较高的业绩高速增长期。 但跨越竞争丛林，下半场怎么走？这不仅是留给康泰生物的课题，也是留给所有疫苗企业的课题。 出海逐渐成为国内疫苗企业的打法。目前，康泰的出海布局算是走在一众企业的前面，目前已与印度尼西亚、巴基斯坦、沙特、孟加拉、埃及、巴林、尼加拉瓜等十多个国家就 13 价、23 价肺炎球菌多糖疫苗、水痘减毒活疫苗、无细胞百白破b型流感嗜血杆菌联合疫苗（四联苗）等产品在海外市场的注册、推广、商业化销售、技术转移等方面达成合作协议。 但要想在国际市场上与疫苗巨头们同台竞争，这更加考验产品质量、价格和市场策略了。 “  任何伟大的变革都是痛苦的。我们已经见证了，诸多仿制药企走向创新药企历经的黑暗与迷茫岁月。我们已经看见了，一些蜕变，和新价值的诞生。E药经理人旗下CM10医药研究中心致力于上市公司的价值发现、挖掘与诊断。” 免责声明：本文章是基于上市公司的公众公司属性、以上市公司公开披露的信息（包括但不限于临时公告、定期报告和官方互动平台等）为核心依据的独立第三方研究；CM10医药研究中心力求报告(文章)所载内容及观点客观公正，但不保证其准确性、完整性、及时性等：本报告(文章)中的信息或所表述的意见不构成任何投资建议，CM10医药研究中心不对因使用本报告（文章）所采取的任何行动承担任何责任。 一审| 黄佳 二审| 李芳晨 三审| 李静芝 精彩推荐 CM10 | 集采 | 国谈 | 医保动态 | 药审 | 人才 | 薪资 | 榜单 | CAR-T | PD-1 | mRNA | 单抗 | 商业化 | 国际化 ｜ 猎药人系列专题 | 出海 启思会 | 声音·责任 | 创百汇 | E药经理人理事会 | 微解药直播 | 大国新药 | 营销硬观点 | 投资人去哪儿 | 分析师看赛道 | 药事每周谈 | 医药界·E药经理人 | 中国医药手册 创新100强榜单 | 恒瑞 | 中国生物制药 | 百济 | 石药 | 信达 | 君实 | 复宏汉霖 ｜翰森 | 康方生物 | 上海医药 | 和黄医药 | 东阳光药 |  荣昌 | 亚盛医药 | 齐鲁制药 | 康宁杰瑞 | 贝达药业 | 微芯生物 | 复星医药 ｜再鼎医药｜亚虹医药 跨国药企50强榜单 | 辉瑞 | 艾伯维 | 诺华 | 强生 | 罗氏 | BMS | 默克 | 赛诺菲 | AZ | GSK | 武田 | 吉利德科学 | 礼来 | 安进 | 诺和诺德 | 拜耳 | 莫德纳 | BI | 晖致 | 再生元

阿尔兹海默症的资本热度早已毋庸置疑，直指万亿美元市值的礼来也依靠它的加持。在中国，通化金马的资本故事已经讲得差不多，接下来这“透支”的100亿预期，就要看产品的真本事了。 资深分析师：长路 编审：苏叶 医药资本市场，有两个“一点就燃”的全市场概念。一个是减肥药，另一个是阿尔兹海默。只不过，想在这两个领域做出成绩，境遇却是一个天上，一个地下。GLP-1已经进入了研发竞速期，而阿尔兹海默症（AD），却还陷在发病机制不明确的研发“天坑”里。 但即便失败率接近100%，AD市场的金山仍吸引着无数药企前赴后继。据艾昆纬预计，全球AD市场到2030年将达2.54万亿美元。 投资人更多的是赌徒心理——以较小的成本套中最大的奖品。这就导致了，阿尔兹海默症概念股很多，成了妖股的却不多。 通化金马独一份，自从搭上AD概念，金马曾经短短3个多月股价涨近300%，化身“妖马”。但“妖马”也必须接受天地板的待遇，一天内从涨停到闪崩都会是常态。 通化金马股价走势（来源：百度股市通） 更“妖”的是，引爆金马股价的是一款20年前的老药，琥珀八氢氨吖啶片。自从通化金马宣布这一产品能治疗AD并且完成临床数据审核准备揭盲起，和这一项目有关的“风吹草动”，都是通化金马拉扯股价的药引子。 资本市场的拉扯游戏，这家上市于1997年的药企在一夜之间被贴上“妖股”的标签。更让人看不透的是，在今年6月的通化金马2023年年度股东大会上，董事长线上参会、到场的外部股东只有两三名，没有机构投资者参与。公司在走完常规流程后，股东大会便结束收场。 穿上了阿尔兹海默症概念叠加“自主研发的新药”外衣的通化金马还能“飞”多久？究竟是真的稀缺爆款，还是一场游戏一场梦？CM10医药研究中心将从行业稀缺值、财务健康度、业务健康度、综合建议等多个方面，来一一回答。 AD概念黑马？ 医药行业跑出黑马的逻辑并不复杂，无外乎业绩驱动或预期驱动。 纵然没有亮眼的业绩成绩单，但只要给足投资者预期：在一个广阔赛道释放管道的独特性、领先性，前置产品的商业前景，股价飞起的案例不胜枚举。最有名的是“南香雪，北金马”。 资本市场的拉扯游戏，这家上市于1997年的药企在一夜之间被贴上“妖股”的标签。并且自揭盲以来，至今市值已经涨了100亿元，相当于投资人提前支付了这款产品的预期。更让人看不透的是，在今年6月的通化金马2023年年度股东大会上，董事长线上参会、到场的外部股东只有两三名，没有机构投资者参与。公司在走完常规流程后，股东大会便结束收场。 曾经E药资本界分析过，香雪制药如何靠TCR-T细胞治疗新药飞升。现在，我们想拉出“北金马”遛一遛，他到底是马还是骡子？ 不妨先来看看，这让投资者着迷的AD新药（阿尔兹海默症新药）琥珀八氢氨吖啶片是何方神圣，临床试验数据又如何。 据通化金马称，这是完全自主知识产权、新化学分子结构、境内外均未上市的1类新药，对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶均表现出较强的抑制能力，通过抑制胆碱酯酶，提高脑内乙酰胆碱含量，治疗轻、中度阿尔茨海默病。 在去年9月的揭盲发布会上，通化金马称，该项目经过双盲、双模拟、随机、安慰剂/阳性平行对照III期临床试验，达到主要临床试验终点，试验呈阳性结果，认为试验药物对阿尔茨海默病评估量表-认知量表（ADAS-cog）的改善具有明显的临床意义。 一张20年前的“老方子”，转瞬间成了炙手可热的AD赛道新贵。搁在谁眼前，都需要再仔细掂量掂量。 通化金马也理解，毕竟前面出过GV-971，为了增强可信度，金马陆续透露了临床试验的许多“细节”，如2021年8月全部患者就完成入组，公司与协办方按照临床试验方案、GCP规范及CFDA的有关法规，对III期临床试验开展了扎实而严谨的自查和整改工作…… 有这些，投资人也愿意用真金白银去赌个未来。在公布数据后的三个多月里，通化金马的股价累计上涨超过270%，成为了当时的“妖马”。 当然通化金马不是独苗，只是运气好一点。尽管AD新药研发难度极高，但大赛道里永远不缺乏钻研者，除了这款药，国内已进入临床阶段的阿尔茨海默病新药就有34款，康缘药业、先声药业、海正药业、东阳光、恒瑞医药等也都在研发大军里。但多年来，中国未有原创的治疗轻、中度阿尔茨海默病的新型胆碱酯酶抑制剂化学1类新药上市。 除了好运气，玩概念通化金马也是一把好手。在资本市场要想“酒香不怕巷子深”，必须得学会蹭热点，懂得传播，或公告或新闻。 将时间拉回2023年8月，21日日本厚生劳动省的专门小组会批准了由卫材和渤健共同开发的AD新药Lecanemab（仑卡奈单抗）的制造和销售。资本市场迎来一场久违的AD概念股狂欢。 几乎同一时间，通化金马开启了琥珀八氢氨吖啶片的预热活动，先是在20日公告举行了盲态数据审核会，28日公告III期临床试验揭盲预备会，30日公告完成III期临床试验盲态数据审核。 多轮“预热”下来，通化金马股价半个月翻了一倍。那时，在通化金马的股票交易异常波动公告中，尚未提及新药研发的相关风险，而“自主研发”“具有独家专利”“圆满完成盲态数据审核”却是被反复提及的。 事实上，琥珀八氢氨吖啶片并非通化金马自主研发，而是来自于其全资子公司长春华洋。 据此前消息，2016年1月，通化金马以增资5550万元的方式收购了长春华洋60%股权，并直接出资2250万元收购江苏神尔洋（长春华洋的全资子公司）的30%股权。被收购的两家公司共同拥有琥珀八氢氨吖啶片的全部知识产权，江苏神尔洋是琥珀八氢氨吖啶片对应的专利技术的专利权人。 直到琥珀八氢氨吖啶片宣布揭盲前的半个月，通化金马完成对长春华洋剩余40%股权的收购，这是为尽快落实通化金马获得药品上市许可持有人资质及药品注册证书等目标。 至此，通化金马终于穿上了阿尔兹海默症概念叠加“自主研发的新药”的外衣。鉴于琥珀八氢氨吖啶片尚在审评审批之中，就让“金马”再飞一会儿。 “妖股”背后的资本局 自主研发一款新药或许不是通化金马的强项，但“玩概念”却是操盘这家公司的大佬的拿手好戏。 从如今的阿尔兹海默症概念算起，通化金马近年来频繁涉及多个热门概念，还包括工业大麻、流感、肝炎等，以提升公司股价和吸引投资者关注。若再往前追溯，通化金马早在20年前就把自己包装成了“伟哥概念股”。 可以说，虽然公司经营起起伏伏、实控人频繁变更，但通化金马有两个基因，始终没变过。一个是爱造概念，另一个是大举并购却无序经营。 早在31年前的1993年，通化金马改制成立，1997年登陆深交所，产品以中成药、化学药为主。2015年以后，通化金马实控人变动颇为频繁，每隔几年其实控人都会出现变更，公司发展更是几经起落。 如今已涉足阿尔兹海默症新药，管线中覆盖的产品也包括了抗肿瘤、微生物、心脑血管、清热解毒、消化系统、骨骼肌肉系统、妇科系统、神经系统等多个领域，其经营规模之大、产品种类之多，通过资本运作的买买买不无关系。 回溯通化金马的过往，可谓跌宕起伏。自1997年上市后到2000年的三年时间里，凭借资本的力量推动了销售收入的快速增长，2000年时，收入就达到5.04亿元，较上市当年实现了翻倍式的跨越发展，一时风头无两。 也正是那时起，通化金马的“并购基因”被激活了。2000年5月，闫永明成为通化金马的董事长兼任总经理，此后他花了3.18亿元竞得一款被炒作上天的“奇圣胶囊”。其既不是一款新药，也不是一款已在市场销售很好的药，但号称对男子性功能障碍具明显疗效，而且起效时间较快。闫永明也由此被塑造为“中国伟哥第一人”。 而通化金马的第一个低谷也接踵而来。2001-2004 年，由于股权结构变更和经营管理层发生动荡，治理问题的黑洞吞蚀了业绩，造成收入大幅下滑，营业利润出现较大亏损，2003年因两年持续亏损被深交所ST。 第二次上升期发生在2006年。通化金马通过股权分置改革进行了重组，债务得到豁免，公司得以轻装上阵重新发展。 只是，公司经营始终没有起色，营收在此后十年几乎一直维持在 1.5亿元~2亿元之间，利润也在1000万-2000万之间徘徊，2012年更是遭遇了“毒胶囊”事件导致业绩大幅波动，主营业务亏损。 “毒胶囊”事件后，公司原国有控股股东采取公开征集受让方的方式转让上市公司控股权，北京晋商联盟投资管理有限公司（以下简称“北京晋商”）在 2013 年 5 月成为公司新的控股股东，并与其控股股东晋商联盟控股股份有限公司（以下简称“晋商联盟”）一起在随后开展了持续的资产并购和重组，通化金马进入了全新的发展阶段。 刘成文家族控制的北京晋商”入主通化金马后，开启了“买买买”的收购模式。2015年8月，通化金马斥资26.8亿元收购哈尔滨圣泰生物制药有限公司（以下简称“圣泰生物”）。 此后，北京晋商还进行了对长春华洋及江苏神尔洋的收购。通化金马官网显示，2016年5月，通化金马设立两家投资公司，成立三家基金公司，其中的医疗并购基金规模达50亿元。 2016年7月，通化金马出资4.14亿元收购成都永康制药有限公司（以下简称“永康制药”）100%股权。2016年8月～2019年3月，通化金马六次出手，合计以约20.39亿元收购多个资产。 大刀阔斧的扩张确实给通化金马带来了新生。 通化金马曾在官网中表示：“此前，通化金马在资本市场表现强差人意，连续几年净利率低于3%，处于微利状态，徘徊在破产边缘。北京晋商入主后给通化金马重新注入了活力。”北京晋商入主以来，“通化金马市值在最高位时由20亿元上升至230亿元，3年时间（2016年～2018年）增长1050%，在全国165家医药上市公司中市值排名第26位”。 只是好景不长，北京晋商自身因所持上市公司股票质押融资等问题，出现流动性风险。到2019年7月时，北京晋商持有的通化金马股份全部处于质押状态，且相应股份市值不能覆盖其对应的债务负担。 也就在这时，张玉富以零元的对价受让北京晋商的96.97%股权，并对北京晋商提供不低于25亿元的现金支持。至此，通化金马的控股股东仍为北京晋商，但实际控制人变更为张玉富，其合计控制通化金马29.88%的股权。此外，张玉富的好搭档于兰军也在这场交易中受让通化金马19.66%的股权，转让价格为5.94元/股，总对价约为11.29亿元，于兰军就此成为公司第二大股东。 公开资料显示，这并非张玉富、于兰军首次携手入主同一家上市公司。 2018年年底，张玉富和于兰军有意入主恒康医疗（现证券简称为“新里程”），拟以承接债务的形式受让*ST恒康实际控制人阙文彬所持*ST恒康全部股份，但后来因相关各方无法达成一致意见，张玉富和于兰军入主*ST恒康未果。 2022年6月，通化金马公告称，北京晋商因身陷质押式证券回购纠纷，其持有的通化金马限售流通股3943万股股票作价约1.76亿元，用于抵偿债务。因此，于兰军被动成为通化金马新实际控制人。值得一提的是，此前，于兰军曾在简式权益变动报告书中出具《不谋求上市公司控制权的声明》。 到2023年7月，通化金马发生工商信息变更，张玉富再次成为公司法定代表人，其同时继续担任董事长一职。 回看这一路的起起伏伏，爱买买买，被称为“剁手党”的通化金马，受并购扩表影响，营收从2015年的不到2亿元，短短三年就翻了10倍，到2018年时就超过20亿元。但没有持续的经营能力，并购只能维持表面的光鲜，内部却会“一地鸡毛”。2019年，通化金马业绩爆雷，几番并购累积20的多亿商誉全部计提减值，导致当年巨亏20.42亿。叠加此后疫情影响，通化金马的收入几乎减半。 虽然随着疫情影响退散，但通化金马的业绩也再难回到当年。 远水难解近渴 通化金马未来的想象力，是靠“AD概念股”来保住“金身”吗？这事儿不妨先从阿尔兹海默症为何能如此牵动投资者的心弦看起。 “每3秒，全球就有1位新发痴呆症患者，全世界约有5000万痴呆症患者，其中有60%-70%为阿尔茨海默病患者。”这是《世界阿尔茨海默病2018年报告》中所披露的数据。据艾昆纬预计，全球用于痴呆症的费用到2030年将达到2.54万亿美元。 若将目光聚焦到中国，早在2013年中美合作进行的认知障碍流行病学研究就显示，中国65岁以上老人中，3100万人患有轻度认知损害，900万人患有老年痴呆症，600万人患有阿尔茨海默病。此后，更是有数据显示，中国的患者数量约占全球的1/4。 正因此，一款行之有效的药物解决方案成为了迫切的需求。上一个成功靠阿尔兹海默症新药起飞的绿谷药业，核心产品971虽然市场上有争议，但据消息已经卖过了10亿元。 只是，成功研发并上市一款新药并不容易，而阿尔茨海默病的新药研发更是难上加难。在过去几十年，诸如强生、辉瑞、罗氏、礼来等一众跨国药企在攻克阿尔茨海默症的路上花费了海量的真金白银。美国药物生产与研发协会数据显示，全球累计在阿尔兹海默病上的研发投入超过6000亿美元，失败的临床药物超过300种，失败率达到99.6%。 但目前全球市场相关上市药物仅有十余款，于近20年获批的更是一只手就能数的出来。如今在国内上市的阿尔兹海默症药物能叫得出名字的，仑卡奈单抗算一个，971算一个。曾有传闻绿谷制药的GV-971在2022年销售额为7亿元，2023年为12亿元，并预计到2026年达到40亿元。 中国患者数量多，但渗透率极低，可能不足10%。市场空间决定了，即便药企、投资人看透阿尔兹海默症的研发天坑，也想要赌一赌，即“套圈心理”，通化金马屡屡因琥珀八氢氨吖啶片而股价起飞就是切中这一心理。只是能“飞”多久，还要看琥珀八氢氨吖啶片能否顺利上市，上市后的疗效与市场空间了。 除了阿尔兹海默症概念外，通化金马的业绩疲态尽显，产品涉及生化药、中成药等多个领域。主要产品包括复方嗜酸乳杆菌片、风湿祛痛胶囊、清肝健脾口服液、芩石利咽口服液等，缺乏想象空间。 “  任何伟大的变革都是痛苦的。我们已经见证了，诸多仿制药企走向创新药企历经的黑暗与迷茫岁月。我们已经看见了，一些蜕变，和新价值的诞生。E药经理人旗下CM10医药研究中心致力于上市公司的价值发现、挖掘与诊断。” 免责声明：本文章是基于上市公司的公众公司属性、以上市公司公开披露的信息（包括但不限于临时公告、定期报告和官方互动平台等）为核心依据的独立第三方研究；CM10医药研究中心力求报告(文章)所载内容及观点客观公正，但不保证其准确性、完整性、及时性等：本报告(文章)中的信息或所表述的意见不构成任何投资建议，CM10医药研究中心不对因使用本报告（文章）所采取的任何行动承担任何责任。 一审| 黄佳 二审| 李芳晨 三审| 李静芝 精彩推荐 CM10 | 集采 | 国谈 | 医保动态 | 药审 | 人才 | 薪资 | 榜单 | CAR-T | PD-1 | mRNA | 单抗 | 商业化 | 国际化 ｜ 猎药人系列专题 | 出海 启思会 | 声音·责任 | 创百汇 | E药经理人理事会 | 微解药直播 | 大国新药 | 营销硬观点 | 投资人去哪儿 | 分析师看赛道 | 药事每周谈 | 医药界·E药经理人 | 中国医药手册 创新100强榜单 | 恒瑞 | 中国生物制药 | 百济 | 石药 | 信达 | 君实 | 复宏汉霖 ｜翰森 | 康方生物 | 上海医药 | 和黄医药 | 东阳光药 |  荣昌 | 亚盛医药 | 齐鲁制药 | 康宁杰瑞 | 贝达药业 | 微芯生物 | 复星医药 ｜再鼎医药｜亚虹医药 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